La inmunohistoqumica y la espectrometra de masas directa Actualmente

los nicos mtodos que se pueden utilizar para analizar el complemento de

protenas
de tejido intacto. Otros tipos de anlisis de protenas que requieren
las protenas primero ser liberados desde el tejido (1).
La liberacin de protenas eficiente requiere de picar carne, o de
homogeneizacin,
el tejido de manera que la superficie expuesta al disolvente se ampla.
Una variedad de mtodos de homogeneizacin existe, incluyendo handheld
o homogeneizadores accionados por motor, sonicacin, clula de presin
francesa,
rectificado con almina o arena, vrtex cuenta de vidrio, detergente
1. Introduccin
Joakim Dillner (ed.), Mtodos de Biobancos, Methods in Molecular Biology, vol.
675,
DOI 10.1007 / 978-1-59745-423-0_17, Springer Science + Business Media,
LLC 2011308 Ericsson y Nister
lisis, o tejido congelado de trituracin (2). En base a los estudios, estamos a
favor de
congelar trituracin en un aparato de molino de bolas congeladas, tales como
el Mikrodismembrator
(S. B. Braun Internacional). Aplastamiento Freeze implica
agitando la muestra congelada en un criotubo tapado con un congelado
bola de acero. La contencin en un criotubo durante esta fase
reduce el riesgo de prdida de muestra y el riesgo de contaminacin.
Aplastamiento Freeze fue tan eficiente en la solubilizacin como era sonicacin,
otro mtodo de homogeneizacin muy eficiente, y tiene la
beneficio aadido de eliminar virtualmente la posibilidad de la muestra
la degradacin durante la homogeneizacin (3, 4), ya que la muestra
permanece
congelado durante la homogeneizacin.
Como las clulas trituradas se descongelaron despus de homogeneizar,

La contencin en un criotubo durante esta fase

reduce el riesgo de prdida de muestra y el riesgo de contaminacin.
Aplastamiento Freeze fue tan eficiente en la solubilizacin como era sonicacin,
otro mtodo de homogeneizacin muy eficiente, y tiene la
beneficio aadido de eliminar virtualmente la posibilidad de la muestra
la degradacin durante la homogeneizacin (3, 4), ya que la muestra
permanece
congelado durante la homogeneizacin.
Como se descongelan las clulas trituradas siguiente homogeneizar, para
su posterior procesamiento, las proteasas endgenas y otros degradantes
enzimas obtienen acceso a las protenas que normalmente no acceso,
lo que resulta en el potencial para la degradacin de la protena (5). Este riesgo
es
minimizado en esta etapa mediante el uso de una temperatura ms baja por
encima de
congelacin como sea posible y trabajando rpidamente. El uso de la proteasa
y otros inhibidores enzimticos tambin deben ser considerados en este
punto, pero slo como un ltimo recurso para fines especficos, como lo hacen
tienen inconvenientes. Los inconvenientes son que la proteasa covalente
inhibidores, tales como AEBSF, alteran el patrn de migracin de algunas de
las protenas que estn destinadas a preservar y que peptidelike
inhibidores de la proteasa pueden interferir con el anlisis de pptidos (6).
Una gua para la proteasa racional y seleccin inhibidor de la fosfatasa
est disponible (1).
Dos de las formas ms eficaces para solubilizar insoluble en agua
subunidades de protenas es utilizar el SDS detergente inico (7, 8) o
la urea caotropo (9). Ambos trabajan por desnaturalizar las protenas
(aunque por diferentes mecanismos) y liberndolos en solucin.
Desde desnaturalizacin impide protenas a partir de plegado en funcional
estructuras, las protenas se desactivarn. Por lo tanto,
estudios funcionales no son normalmente posible en el material solubilizado

por aqu. En lugar de identificacin y cuantificacin de los beneficios

de la solubilizacin ms completa a continuacin, que se puede lograr
en comparacin con la extraccin hidrfilo. Para los estudios funcionales, es
preferido para extraer y solubilizar el material con hidrfila
tampones (1).
Como no existe ninguna manera de cuantificar la cantidad inicial
de protena en un pedazo de tejido, se utiliza por ciento de solubilizacin como
una
medida de la integridad de la extraccin y solubilizacin. la
cantidad total de protena se mide a continuacin, en el extracto.
La misma eficiencia de SDS (o urea) solubilizacin sugiere
que puede ser utilizado como un "universal" protena normalizado
solubilizacin para la identificacin y cuantificacin (pero no
para estudios funcionales). Mientras que varias tcnicas protemicas
principales,
tales como 2-D, LC-MS y matriz de anticuerpos (10-12),
no toleran el 2% SDS presente en tampn de muestra de SDS-PAGE,
y lo hacen tolerar pequeas cantidades de SDS. Procedimientos de extraccin
de protenas de tejido slido 309
diluir los procedimientos SDS o de cambio de amortiguacin para reducir el
Concentracin de SDS puede ser utilizado para hacer SDS extrae compatible
con mtodos analticos sensibles aguas abajo. un aadido
beneficio para la extraccin de SDS es que SDS desnaturaliza e inactiva
muchas enzimas degradantes, ayudando as a preservar un intacta
proteoma. Utilizamos tumor cerebral y material de cerebro de ratn de
evaluar el potencial de una extraccin de protenas a base de SDS y
procedimiento de solubilizacin (3).
1. trituradora Freeze (Mikro-desmembrador SB Braun Internacional).
2. Tubos Cryo (Corning Incorporated, # 2028).
3. Tubos de Eppendorf (Treff Lab AG, # 96.8668.9.01).
4. Estrechar bloque trmico (Eppendorf, Thermomixer compacto,

# 5350 000,013).
5. Eppendorf de centrfuga (centrfuga 5415 D, # 5425 000,219).
6. Preparacin de la muestra (Amersham Biosciences 2-D Clean-Up
Kit: cdigo de producto 80-6484-51)..
7. ensayo de concentracin de protena: BIO-RAD, Protein RC DC
Ensayo # 500 a 0.119.
8. Shimadzu BioSpec-1601 E espectrofotmetro.
9. 1 tampn de muestra SDS (8): 0.125 M Tris-HCl (pH 6,8), 2%
dodecil sulfato de sodio, 10% de glicerol, 0,001% de bromofenol
azul, 5% de 2-mercaptoetanol.
1. Un patlogo debe inspeccionar todas las muestras humanas, y seguro
partes representativas para el diagnstico. El material sobrante se utiliza para
este trabajo (vase la nota 1). Cubos de ejemplo, con un lado sobre
5 mm, se deben colocar en bolsas de plstico selladas y, posteriormente,
se congelaron instantneamente por inmersin en nitrgeno lquido (N2
(l)) y almacenados a -80 C hasta su uso.
2. desintegracin de la muestra se realiza mediante el uso de molino de bola
congelada
molienda (Mikro-Dismembrator SB Braun International) en
un tubo criognico con una bola de acero, seguido de agitacin en SDS
tampn de muestra en un tubo Eppendorf. Las muestras deben ser
se enfri en N2
(l) antes y despus de la desintegracin de la muestra,
y mantenerse congeladas durante todo el procedimiento de desintegracin
(ver Notas 5.2).
2. Materiales
3. Methods310 Ericsson y Nister
3. La solubilizacin del contenido de protenas se realiza en Eppendorf
tubos por la adicin de 1 SDS tampn diez veces el peso
del tejido congelado y posterior incubacin a 70 C y

agitacin a 1.400 rpm durante 10 min (ver Notas 6-8). cualquier restante
residuo slido se sediment a 13,2 103 g durante 5 min a
temperatura ambiente. El sobrenadante se transfiere a continuacin a una
nuevo tubo etiquetado y la concentracin de protena medido.
4. Despus del calentamiento, la muestra se centrifuga para concentrar
el lquido y sedimento cualquier material slido restante.
No debe haber ningn sedimento visible en este punto, lo que indica
solubilizacin completa. La fraccin solubilizada puede ser
determinada pesando el tubo antes y despus de solubilizacin
la muestra y eliminar el sobrenadante. cualquier aadido
peso correspondera a un residuo de tejido slido. Divida este
peso por el peso en hmedo inicial para obtener la fraccin NO
solubilizado.
5. La concentracin de protena se determina, usando un comercial
ensayo y utilizando albmina de suero bovino como el estndar (ver
Nota 9).
6. Las muestras de protenas solubilizadas deben ser congeladas y
almacenadas
a -20 C hasta su uso (Nota 10).
7. Las muestras de protena pueden en algunos casos ser diluidas, o purificada
por precipitacin, seguido de la resolubilizacin, en el
tampn apropiado para la aplicacin aguas abajo.
1. Las muestras clnicas deben ser manejados con el supuesto de que
que pueden contener contagios conocidos o desconocidos. Por lo tanto,
utilizar una barrera de proteccin, formalizado mediante, por ejemplo, el NIH
Precauciones Universales (http://www.niehs.nih.gov/odhsb/
biosafe / univers.htm).
2. Las muestras pueden ser pesados mientras congelado de modo que la
correcta
cantidad de tampn de solubilizacin se puede aadir despus de la
congelacin

aplastamiento. Trabaje con rapidez y utilizar equipo esterilizado.

3. Es importante que las muestras se mantuvieron congeladas en todo
momento,
ya que la congelacin y descongelacin se romper las membranas celulares
y dar enzimas degradantes de acceso a sustratos que no puede
ver in vivo.
4. PreCool los criotubos y bolas de acero para la trituracin de congelacin
en nitrgeno lquido.
5. Es probable que sea necesario para titular la frecuencia y la hora de
aplastamiento. La muestra debe convertirse en un polvo fino, como en polvo
azcar. El color blanco es una indicacin de que la muestra tiene
4. NotesProtein Extraccin de tejido slido 311
sido suficientemente triturado, seguido por inspeccin visual cuidadosa
del tamao de grano. Frecuencia o tiempo resultados muy altos en daos
al tubo, y el potencial de perder o contaminar el
muestra. Un protocolo tpico es para una frecuencia de 2000 Hz y
un tiempo de 60 s.
6. Despus de la trituracin, ya sea centrfuga las muestras o les toque, a
recoger el polvo en la parte inferior de la criotubo.
7. Aadir 1 tampn de muestra SDS a la muestra para iniciar la extraccin de
y solubilizacin. Inmediatamente vrtice y confirmar que el
la muestra se ha dispersado mediante inspeccin visual. continuar vrtex
y la inspeccin hasta que se dispers la muestra. esto debera
tener menos de 1 min. Si no, encontrar y solucionar el problema.
8. Calor y agitar la muestra dispersada en un calor agitando
bloque.
9. Es mejor para medir la concentracin de protenas en la FDS
en s de la muestra solubilizada, en lugar de en una muestra paralelo sin
SDS. , Existen pocas de esas, SDS-tolerantes procedimientos. Le sugerimos
utilizando el protocolo RC DC dado, como una alternativa.

10. Guarde la muestra se congel a -20 C o menos. No hace

parece existir ningn estudio sistemtico universalmente reconocidos de
la integridad de las protenas y las modificaciones postraduccionales
en SDS y a -20 C. A la espera de este tipo de estudios que recomendamos
las condiciones de almacenamiento anteriormente de manera rentable y en
de acuerdo con la experiencia adquirida