UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

SEGUNDA ESPECIALIDAD EN LABORATORIO CLINICO Y
BIOLGICOS

INFORME

TEMA: RADIOINMUNOENSAYO
DOCENTE
Dr. Edgar Romero Espinoza
ALUMNAS
Mblga. Rubi Jackeline Espinola Aguirre
Mblga. Emma Natividad Javes
TRUJILLO PERU
2015
1

NDICE
I.

Introduccin
.3

II.

Antecedentes...
4

III. Concepto y
Definicin.6
IV.

Elemento del
RIA...7

V.

Clasificacin..1
1

VI. Separacin de fases ligadas y no ligadas..

17
VII. Contaje de la Radiactividad20
VIII. Calculo y interpretacin del RIA...21
IX. Caractersticas del
RIA.23
X.

Ventajas.2
3

XI. Desventajas
24
XII. Aplicaciones26
XIII. Tipo de Cuadro clnicos.30
XIV. Reacciones adversas...31
XV. Bibliografa.32
XVI. Anexos ..35

INTRODUCCIN
Los Inmunoensayos son pruebas que usa complejos de anticuerpo y antgeno como
medio para generar un resultado perceptible. Un complejo anticuerpo-antgeno tambin es
conocido como inmunocomplejo.
Inmuno se refiere a una respuesta inmunolgica que hace que el cuerpo genere
anticuerpos, y ensayo se refiere a una prueba. Entonces, un inmunoensayo es una prueba
que utiliza inmunocomplejos cuando se unen los anticuerpos y los antgenos.
Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas de laboratorio, como
las pruebas colorimtricas, ya que usan complejos anticuerpo-antgeno para generar una
seal que pueda medirse. En oposicin, la mayora de las pruebas de rutina de qumica
clnica utilizan reacciones qumicas entre el reactivo (solucin de sustancias qumicas u
otros agentes) y la muestra del paciente para generar un resultado de la prueba.
Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son los que
se basan en la especificidad de la unin antgeno-anticuerpo.
La propiedad que tienen las inmunoglobulinas de unirse a un antgeno, la
especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por fenmenos de
precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluorescena, con
radiostopos o con enzimas) hacen que stos mtodos se utilicen de forma muy amplia.
Aunque el principio es idntico en todas las tcnicas (unin antgeno-anticuerpo)
hoy en da se emplean diversos mtodos, basados cada uno de ellos en un procedimiento
distinto para visualizar la unin: uno de ellos es el radioinmunoensayo.
Hasta la introduccin del radioinmunoensayo por Yallow al principio de los aos
sesenta, la valoracin de hormonas sexuales slo se haca en orina. Se valoraba la hCG por
3

mtodos biolgicos y los estrgenos totales y el pregnandiol por mtodos qumicos. Ello
reduca mucho las posibilidades. Hoy en da esta tcnica ha quedado obsoleta y
reemplazada por la tcnica enzimainmunoensayo (ELISA). Pero en algunos otros pases el
radioinmunoensayo todava la utilizan para deteccin y diagnstico de algunas
enfermedades.

I. ANTECEDENTES

Esta tcnica fue desarrollada por Rosalyn Yalow

y Solomon Aarn Berson en 1950; para determinar la
concentracin de insulina en el plasma sanguneo1.
Trabajaron en el Hospital afiliado a la Sinai School of
Medicine Mount Bronx Veterans Administration2.
Posteriormente, en 1968; Miles y Hales
establecieron deteccin de anticuerpos mediante el
anlisis isotpico etiquetados radiacin antgenos y
radioinmunoensayo para la diferencia, por lo que se
llama tcnica de ensayo inmuno (ensayo inmuno,
IRMA)3.
En 1977, el Dr. Yalow recibi el Premio Nobel de Medicina en
reconocimiento a su aportacin al estudio de las hormonas peptdicas y por haber
desarrollado junto con Solomon Berson la tcnica de radioinmunoensayo (RIA). Lo
habra podido ganar antes, pero la
muerte de Berson, en 1927, hizo que
no

prosperara

Determinaron

la

propuesta4.

tambin

la

concentracin de insulina, en plasma

sanguneo:

medicin

precisa

de

pequeas cantidades de una hormona,

tales revolucion el campo de la
4

endocrinologa. Al permitir la medicin precisa de los niveles sanguneos de

hormonas el mecanismo de enfermedades de deficiencia de la hormona podra ser
identificado, y mejor tratado. Yalow y Berson se neg a patentar el ensayo, porque
pensaban que debera ser de libre acceso al campo de la medicina 2. Para ellos
patentar era privar a la gente de los descubrimientos con el fin de ganar dinero. La
sencillez y facilidad de la metodologa permitieron su uso extensivo en pases
desarrollados4. Para el comit Nobel, Berson era el cerebro y Yalow las manos, pero
es evidente que estaba equivocado 2.
Con esta tcnica, la
separacin del antgeno unido
del

no

unido

Inicialmente,

el

es

crucial.

mtodo

de

separacin empleado fue el uso

de un segundo "anti-anticuerpo"
dirigido contra el primero para
la

precipitacin

centrifugacin. El uso de la
suspensin de carbn para la precipitacin se ampli, pero reemplazado ms tarde
por los Dres. Werner y Acebedo en la Universidad de Columbia por RIA de T3 y T4.
Un ARI ultramicro de TSH humana fue publicada en BBRC por los Dres. Acebedo,
Hayek et al 2.
De acuerdo con Li, A y colaboradores lleg a la conclusin, a partir de la
tecnologa RIA creado hasta ahora, de acuerdo con grandes avances en la tecnologa
puede ser dividido en cinco generaciones3.

La primera generacin (1959-1964) tecnologas RIA y el mtodo de ensayo

de la protena de unin competitiva (CPBA) fue pionero.

La segunda generacin (1965 a 1970) que muchos estudiosos han hecho
mucho por la tecnologa RIA estudio experimental, la tecnologa RIA CPBA
y avanz a nivel de prctica clnica. En 1968 estableci el uso de anticuerpos

marcado con un radionucleido detectar antgenos anlisis radiolgico

(IRMA).
Tercera generacin (1971-1980) la tecnologa RIA es ampliamente utilizado

para la deteccin de compuestos de molculas pequeas.

La cuarta generacin (1981 a 1995) del ratn anticuerpos anti-eritrocitos
ovinos monoclonales (AcMo). La aparicin del nuevo anticuerpo RIA,

tcnicas de radioinmunoensayo tal sensibilidad, especificidad mejorada.

Quinta generacin de tecnologas RIA, est siendo desarrollado y utilizado
actualmente, que se basa en las partculas magnticas combinadas con RIA o
IRMA caracterizado. Dimetro de partcula magntica es pequea, incluso
con los grupos activos de superficie y otras caractersticas, de modo que el
paquete es homogeneidad, reactividad, etc. debe ser superior a los mtodos
clsicos de anlisis3.
Hoy en da, el radioinmunoensayo todava se utiliza en los ensayos en los que

se

requiera

una

gran

sensibilidad4,

siendo

utilizada

para detectar

cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeas y mezcladas

con muchas otras. Es por tanto una tcnica muy sensible y muy especfica.
Utilizando anticuerpos de gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de
antgeno. (1 pg = 10-12 g) 1.

II. CONCEPTO Y DEFINICIN

El radioinmunoensayo, o RIA (Radio Inmuno Assay), utiliza istopos
radiactivos en vez de enzimas como conjugados de los anticuerpos 5, entre ellos
encontramos como radiacin beta: Tritio, C14 y Radiacin gamma I125, I131. Siendo el
yodo-125 (I125) el ms utilizado como sistema de deteccin, ya que las protenas se
pueden yodar con facilidad sin alterar su especificidad5.
Es una tcnica competitiva en la que la molcula antignica 6 (reaccin
antgeno anticuerpo), uno marcado con un istopo radiactivo y otro sin marcar que
se quiere determinar7, compiten por unirse a un anticuerpo especfico con un
trazador radiactivo6.
6

RIA, tiene una alta sensibilidad y especificidad, requiere cantidades pequeas

de muestras para anlisis y no es contaminante, ya que la prueba se hace en tubos de
ensayo y no se administra material radiactivo a los animales6.

III. ELEMENTOS DEL RIA

Los elementos principales que intervienen en el RIA son, por tanto, la
sustancia a medir, el antgeno fro, el trazador radiactivo (antgeno marcado), el
anticuerpo, y el medio de separacin de la fraccin unida de la fraccin libre, que
se aplique para separar los dos trminos de la ecuacin, los complejos antgenoanticuerpo formados y las formas disociadas6.
III.1. Sustancia a medir
Adems de las hormonas, es posible analizar una gran variedad de compuestos
tales como drogas, antibiticos, neurotransmisores y vitaminas, entre otros.
Incluso, se puede detectar la presencia de microrganismos patgenos. Estos
compuestos pueden estar en plasma, suero, leche, orina, saliva, linfa, lquido
amnitico y heces6.
III.2. Antgeno fro
El antgeno fro es la molcula que se va a determinar por RIA
compitiendo con el trazador radiactivo por unirse al anticuerpo. El antgeno
interviene en el RIA en tres acciones diferentes: como antgeno en la obtencin
del anticuerpo, como sustancia pura en la preparacin de la curva patrn, y
frecuentemente tambin como sustrato en la reaccin de marcaje para la
sntesis del trazador radiactivo6.
En la preparacin de la curva patrn se necesita que el antgeno est
altamente purificado, tanto en isomera, si posee ismeros pticos o de
posicin, como en estructura molecular en el caso de que tenga estructura muy
compleja, etc6.
Las soluciones para realizar la curva patrn, con cantidades conocidas de
antgeno, se pueden preparar en diferentes solventes segn naturaleza de las
7

muestras que se vayan a analizar (tampn adecuado, suero o plasma sanguneo,

sangre completa, orina, etc.) para que la curva patrn y los problemas sean
semejantes y la reaccin del RIA se produzca en las mismas condiciones en
ambos casos6.
Las soluciones controladas para la curva patrn se preparan a partir de una
solucin madre concentrada, por diluciones sucesivas, en un solvente
apropiado, preparando cada una a partir de la anterior, o mejor an por
diluciones directas crecientes, evitando de esta forma que los posibles errores
cometidos en la preparacin de la solucin patrn ms concentrada se
transmitan a las dems disoluciones, con lo que el error del mtodo
aumentara6.
La pureza qumica y estructural del antgeno es necesaria para evitar las
reacciones cruzadas con el anticuerpo que pueden inducir las molculas de
estructura muy semejante a la del antgeno6.
III.3. Trazador (antgeno marcado)
Es la sustancia a medir (antgeno) unida a una partcula radiactiva. La
mayora de los RIA iniciales utilizaron el tritio (H 3). Este istopo tiene la
ventaja de poseer una larga vida media (12.3 aos). Los antgenos tritiados son
muy estables y el riesgo de exposicin radiactiva es baja. Sin embargo, la
medicin del H3 tiene una eficiencia entre el 15% y 40%; por lo tanto, se debe
utilizar en altas concentraciones. El conteo de compuestos marcados con tritio
es oneroso y, en consecuencia, poco usado en la actualidad6.
Lo antgenos marcados con I125 posibilitan el diseo de protocolos donde
una de las fracciones se queda en el tubo de ensayo y puede ser contada
directamente, disminuyendo el costo del material y aumentando la precisin de
la prueba. Entre las desventajas se pueden mencionar la corta vida media del
istopo (60 das), la baja estabilidad del compuesto que puede reducir la
sensibilidad del ensayo, y el mayor riesgo de contaminacin radiactiva para el
personal6.

III.4. Anticuerpo
El anticuerpo es una inmunoglobulina, generalmente una Ig. Capaz de
reaccionar con la sustancia a medir y de alta especificidad y afinidad 7. Tambin
se obtiene especficamente contra el antgeno que se quiere determinar 6. El
antgeno, por sus caractersticas puede ser un antgeno verdadero, capaz de
inducir la formacin de anticuerpos especficos y reaccionar con ellos, o tener
solo capacidad haptnica, es decir, que reacciona con el anticuerpo pero no
tiene tamao suficiente para inducir su formacin, sino que hay que ligarlo a
una molcula de mayor tamao para que el hapteno adquiera capacidad
antignica6.
Los antgenos verdaderos son las macromolculas de peso molecular
superior a 10.000, que inducen fcilmente la respuesta inmune cuando se
inyectan en una especie animal diferente a la de procedencia6.
Por su parte, los haptenos son molculas que no tienen tamao suficiente
para inducir la respuesta inmune, aunque pueden reaccionar con el anticuerpo
ya formado. En este caso, para obtener anticuerpos, hay que unir el hapteno a
una molcula portadora que aumente el tamao de este y pueda desencadenar
la respuesta inmune. Como molculas portadoras pueden emplearse diversas
macromolculas (protenas, lipopolisacridos), partculas (slice, liposomas),
etc. La respuesta inmune se exalta mediante el empleo de agentes
coadyuvantes6.
Cuando se estima una adecuada produccin de anticuerpos se sangra al
animal productor, se separa el suero y se titula el antisuero obtenido6.
En numerosas ocasiones la produccin de un anticuerpo en un animal
provoca un aumento en la concentracin del hapteno. Un ejemplo es la
produccin de anticuerpos anti- hormonas tiroideas, que tienen la misma
estructura en las diferentes especies animales y se regulan por un circuito feed
back. El conjunto de hormona molcula portadora induce la produccin de
anticuerpos, de forma que el anticuerpo formado se unir a la hormona del
animal activndola y estimulando su produccin. Las molculas de anticuerpo,
por tanto, irn unidas a molculas de hapteno, por lo que en estos casos es
imprescindible la purificacin del antisuero para eliminar las molculas de
hapteno y poder utilizado en el RIA con un buen rendimiento6.
9

Se obtienen dos tipos de anticuerpos. Los Ac policlonales que se obtienen

inyectando sustancias antignicas en animales de laboratorio. Este antgeno
desencadena una respuesta inmunolgica que produce anticuerpos contra
distintos componentes antignicos de su molcula. El conjunto de anticuerpos
producidos contra el suero del animal inmunizado se le denomina antisuero.
Por otro lado, los Ac monoclonales son producidos por hibridomas, clulas
resultantes de la fusin de clulas especficas del bazo (de animales
previamente inmunizados) con clulas tumorales de mieloma. Los hibridomas
retienen las propiedades de las clulas esplnicas de producir anticuerpos y de
las clulas tumorales de reproducirse en condiciones in vitro6.
La estructura de las hormonas pptidas, a diferencia de las hormonas
esteroides, difieren entre especies, de modo que los anticuerpos producidos
contra ellas son caractersticos para cada especie. Esto es importante, toda vez
que los kits comerciales para determinacin de hormonas pptidas estn
diseada es para uso en humanos., estos kits no pueden ser utilizados para
medir hormonas en amnales domsticos, a menos que sean validados para la
especies en cuestin y, an as slo pueden ser utilizados para determinar
cantidades relativas y no absolutas6.
III.5. Separacin de las fracciones unidas y libres
El RIA requiere de un eficiente sistema de separacin del complejo
antgeno- anticuerpo o fraccin unida (AgAc y Ag*Ac) del antgeno libre (Ag
y Ag*). Existen diferentes mtodos de separacin, entre ellos la asociacin de
anticuerpos a polmeros insolubles; la precipitacin qumica de la fraccin
unida (sulfato o polietilenglicol); la adsorcin de la fraccin libre (carbn
recubierto con dextrn); el inmunolgico (usando un segundo anticuerpo que
reacciona contra el primer anticuerpo); y la fase slida donde se utilizan tubos
de ensayo o una matriz recubierta con el anticuerpo6.
IV.

CLASIFICACIN
Se clasifican en:
1. Directo o competitivos (RIA):
El RIA directo se basa en la reaccin antgeno anticuerpo, en la que un
antgeno se une a su anticuerpo especfico sin establecer enlaces qumicos, sino
10

que se unen por fuerzas dbiles tales como atracciones electrostticas, fuerzas
hidrofbicas, etc., de forma que al cabo de un tiempo se alcanza un equilibrio entre
el complejo antgeno- anticuerpo que se forma y el que se disocia6.

Antgeno + Anticuerpo
Complejo Antgeno- Anticuerpo
Si en este sistema antgeno anticuerpo en equilibrio se introduce una
molcula de estructura similar a la del antgeno (Ag) pero marcada con un
radionclido (Ag*), el anticuerpo (Ab) no la puede distinguir y reacciona con ella
igual con el antgeno inicial, hasta que finalmente se alcanza un nuevo equilibrio,
formndose los dos complejos antgeno anticuerpo, el radiactivo y el no
radiactivo o fro6:

Antgeno marcado
Anticuerpo

Complejo antgeno-anticuerpo radiactivo

Anticuerpo no marcado
Complejo antgeno - anticuerpo
Si se mantienen constantes las cantidades de trazador y de anticuerpo en este

sistema en equilibrio, en una serie de tubos de ensayo, el que se forme mayor o

menor proporcin del complejo antgeno anticuerpo fro o radiactivo
depender nicamente de la cantidad de antgeno fro6.
La base del RIA consiste en la inhibicin competitiva 8 del antgeno fro y
el trazador por unirse con el mismo anticuerpo, de forma que ausencia de antgeno
todo el complejo que se forma es radiactivo6, y a medida que aumenta la
concentracin de antgeno "fro", ms de lo mismo se une al anticuerpo,
desplazando la variante radiomarcado, y la reduccin de la relacin de antgeno
11

radiomarcado unido al anticuerpo al antgeno radiomarcado libre. Los antgenos

unidos se separan entonces de los no unidos queridos, y la radiactividad del
antgeno libre que queda en el sobrenadante se mide usando un contador gamma2.

Antgeno
Antgeno no
Antgeno-Anticuerpo
Radiactivo
radiactivo

Anticuerpo

Complejo

Separacin

Recuento de
Radiactividad
+

En la figura se muestra el anticuerpo (Ab) contra el antgeno (Ag), se satura con antgeno radiactivo (Ag*) usando
un exceso de Ag*. Si se aade Ag no radiactivo junto con Ag*, a medida que aumenta la relacin Ag/Ag*, se
encontrar menor cantidad de AG* en el complejo antgeno. Anticuerpo (es decir, se producir un aumento en la
cantidad de Ab Ag y una disminucin en la de Ab Ag*). Por ejemplo, si Ag/Ag*=1, solamente podr unirse la
mitad de la cantidad total de AG* al anticuerpo; si Ag/Ag*= 2, solamente podr unirse una tercera parte, etc. Por lo
tanto, si puede separarse fsicamente el complejo Ab Ag* de Ag*, podr determinarse la cantidad total de Ag8.

Mtodo directo de RIA

12

Se aade hormona
marcada

Anticuerpo

Se aade muestra o
Estndar

Bajo este principio se puede determinar la concentracin del antgeno en

muestras complejas de fluidos biolgicos con suficiente sensibilidad y
especificidad si se cumplen los siguientes requisitos:
El trazador es altamente radiactivo y por lo tanto puede colocarse en
concentraciones infinitesimales, pero cuantificables.
El anticuerpo es altamente especfico, posee muy alta finalidad y se halla en
muy baja concentraciones8.
De esta forma, con cantidades conocidas de antgeno se podr preparar una
curva patrn al aadir cantidades conocidas y crecientes de antgeno en la anterior
serie de tubos y con esa curva patrn se podrn comparar las muestras problema
con cantidades de antgeno desconocidas6.

Esquema de radioinmunoensayo directo para medir hormonas (progesterona)

Se incuba

13

Se aade
antgeno
Fro

Se aade el anticuerpo
(Limitante)Separar la fraccin
libre de la unida

Antgeno
inmovilizado

Contar y
Calcular

2. RIA de inhibicin:
El RIA de inhibicin tambin sera una tcnica competitiva de anlisis pero lo
que se une a la fase slida es una cantidad fija de antgeno. Para el proceso de
inhibicin se incuba una concentracin fija de anticuerpo marcado frente a una
serie de diluciones de la muestra que contiene el antgeno9.
Se procede cuando no se puede marcar el antgeno.
1. Se inmoviliza una cantidad constante de antgeno en un soporte slido. Se
suele saturar con BSA, leche en polvo o casena para que no se una nada ms
al soporte.
2. Se aade una cantidad constante de Anticuerpo marcado y el antgeno fro a
medir (o de calibrado). En este paso se establece una competencia en la que
el Ac se une al Ag fijo al soporte o al problema10.
3. Se eliminan el anticuerpo no inmovilizado y el antgeno soluble y se
determina la cantidad de anticuerpo marcado que se ha inmovilizado10.
4. Se construye una curva de calibrado representando la cantidad de anticuerpo
marcado inmovilizado frente a la concentracin de antgeno soluble aadida
o bien se interpola la radiactividad medida en esta curva de calibrado10.

Se incuba
Lavado

Mtodo de Inhibicin de RIA

14

Contar y
Calcular

3. IRMA inmunoradiometra (no competitivo o sndwich ):

El IRMA es una tcnica analtica basada en el empleo de un trazador
radiactivo, pero es no competitiva. La muestra, o la solucin calibrada, se
Se aade
antgeno
Se agrega
incuba
en un tubo de ensayo
que posee el anticuerpo unido a la pared del tubo,
(Muestra
Anticuerpo
y a continuacin se aade un Marcado
segundo anticuerpo marcado con un radionclido,
Problema)

normalmente I125. As se forma un sndwich en el que la cantidad de trazador

retenida aumenta con la presencia de antgeno. Por ello la tcnica es no
competitiva6.
En el IRMA los reactivos que se aaden a la muestra estn en exceso, de

Anticuerpo
en exceso

forma que la cantidad de radiactividad empleada en cada tubo es notablemente

mayor que en el RIA. Por ello tras la incubacin es necesario lavar varias
veces el tubo para eliminar el exceso de radiactividad que no ha reaccionado,
ya que al tener esa radiactividad por tubo, una cantidad pequea retenida puede
representar un error significativo6.
Al ser una tcnica no competitiva la curva de calibracin del IRMA es
inversa a la del RIA, ya que la fraccin de radiactividad ligada aumenta con la
cantidad de antgeno presente en la muestra6.
En el orden prctico el IRMA no ha significado una mejora sustancial
respecto a los logros del RIA6.

Se incuba

Contar y
Calcular

B%

Antgeno

15

Mtodo de Sndwich

/
V. SEPARACIN DE LAS FASES LIGADA Y NO LIGADA
Tras la reaccin antgeno-anticuerpo, en el tubo de reaccin encontraremos:
Las fracciones libres, constituidas por antgeno fro y antgeno marcado.
Las fracciones ligadas formadas por complejos antgeno-anticuerpo y
antgeno marcado-anticuerpo11.
Sin embargo, la radiactividad total en el tubo permanece constante antes y despus
de la reaccin, por lo que hay que separar la fase ligada de la no ligada y contar la
radiactividad en una de ellas, sin interferencia de la otra11.
Hay diferentes mtodos de separacin estn basados en las distintas propiedades del
antgeno libre y del complejo antgeno-anticuerpo11:
V.1. Adsorcin: Con carbn activo, dextrano o resinas. Adsorben (se unen)
especficamente la fase libre (antgenos fro y caliente) pero no se unen a los
complejos antgeno-anticuerpo que quedaran en solucin. Tras centrifugacin,
el carbn sedimenta en el fondo del tubo con la fase no ligada mientras que la
fase ligada queda en el sobrenadante, que se aspira o decanta. Este mtodo se
utiliza cada vez menos11. El carbn activo tiene la propiedad de adsorber una
gran variedad de sustancias y pequeas molculas y lo realiza casi
16

instantneamente. Aunque de modo algo ms lento y en menor grado tambin

es capaz de adsorber protenas y los complejos antgeno anticuerpo. Sin
embargo, cuando recubren las partculas de carbn activo con una ligera capa
de un polisacrido como el dextrano, que presenta uniones covalentes entre sus
cadenas formando una malla (un tamiz molecular por el cual no pueden pasar
molculas de gran tamao), ni Ac no Ac- Ag* pueden adsorberse a dichas
partculas de carbn activo. Por lo tanto, si se aade carbn activo recubierto
de dextrano a una mezcla de Ag* libre y Ac- Ag*, al centrifugar
inmediatamente despus se obtiene como resultado la sedimentacin de la
fraccin radiactiva no unida a AC (es decir, Ag*) y la radiactividad
correspondiente a Ac- Ag* permanece en el sobrenadante6.

= Ac
= Ag*
= Ac + Ag*
= = Dextrano

Slo

Centrifugacin

en el sobrenadante

V.2. Precipitacin qumica: Hay substancias como el etanol, el propilenglicol o

el sulfato amnico que alteran la solubilidad de las protenas provocando su
precipitacin. Precipitan los complejos ligados. Tras centrifugacin, quedan los
complejos ligados en el sedimento y la fraccin libre en el sobrenadante, que
se elimina por aspiracin o decantacin11.
V.3. Precipitacin inmunolgica: Se utiliza un segundo anticuerpo contra el
anticuerpo del sistema. La unin del segundo anticuerpo al complejo antgenoanticuerpo da lugar a un complejo de gran tamao, en general insoluble y
fcilmente precipitable. Tras incubacin y centrifugacin, la fase libre queda
en el sobrenadante y se separa por aspiracin o decantacin. Este mtodo es
17

muy utilizado en RIA11. El anticuerpo se prepara normalmente en un conejo;

dado que la - globulina del conejo es un antgeno en otros animales, estos
anticuerpos se utilizan para la produccin de - globulinas anticonejo en cabra,
oveja, caballo y vaca. La adicin de suero anticonejo de cabra a - globulina
de conejo, da como resultado la formacin de precipitados que pueden ser
recogidos por centrifugacin. En consecuencia, puede utilizarse el siguiente
procedimiento. A cada uno de los tubos utilizados para obtener la curva patrn
y a los tubos de la muestra (que han sido incubados previamente todos ellos el
tiempo suficiente para formar los complejos Ac- Ag*), se les aade Ac
anticonejo de cabra en la cantidad adecuada al punto de equivalencia de la
reaccin de la precipitina. A continuacin, se incuban las mezclas (usualmente
por un perodo de tiempo que oscila entre las 16 y las 48 horas) y, despus de
la incubacin, se someten a centrifugacin. Los complejos Ac- Ag* quedarn
en el sedimento y el Ag* libre en el sobrenadante. Este mtodo resulta, en
general, altamente satisfactorio, pero requiere mantener animales de gran
tamao para obtener el antisuero6.
Ac (g) = - globulina anticonejo de cabra.
Ac ( r) = Antiantgeno de conejo
Ac (r ) + Ag*
Exceso

Ac (r ) Ag*

+ Ag*
En menor
Cantidad

Ac (g) aadido
+ Ag*
Ac(g) [Ac(r )

Centrifugacin

Ac(g) [Ac (r )Ag*] en sedimento

Ag* en sobrenadante
V.4. Fase slida: Consiste en inmovilizar al anticuerpo a un soporte slido, que
puede ser la propia pared del tubo, bolitas de vidrio, partculas de Sephadex
(polmero). La separacin se consigue simplemente aspirando el medio de
incubacin. Este mtodo tiende cada vez ms a utilizarse por ser sencillo,
prctico, ms corto y requiere menos manipulacin, e incluso permite su
automatizacin11.
18

VI. CONTAJE DE LA RADIACTIVIDAD

Para proceder al clculo del RIA para determinar la concentracin de antgeno
en las muestras problema se cuenta la radiactividad retenida en cada tubo. El contaje
de la radiactividad se realiza en contadores apropiados segn el tipo de emisin del
radionclido, contador gamma (), si el istopo utilizado para el marcaje es I 125, o
contador Beta () en el caso de haber marcado con tritio (H3)6.
Los contadores de radiactividad ms comunes son los de centello, stos no
detectan directamente la presencia de un radioistopo sino que la muestra radiactiva
se halla dispersa en el centelleador 6. Consta fundamentalmente del contador, est
compuesto por una sustancia fluorescente y un tubo fotomultiplicador asociado. La
sustancia fluorescente o centellador es una sustancia apropiada con la que
interacciona la radiacin emitiendo un destello luminoso, es decir, transforma la
radiacin absorbida en impulsos luminosos. El fotomultiplicador asociado posee un
fotoctodo que libera electrones por la accin de la luz emitida por el centelleador, y
un sistema de dnodos que ampla la respuesta electrnica hasta un rango adecuado6.
Como centelleadores se emplean cristales de NaI activado con TI en la
deteccin de radiacin (centelleo slido), y para la radiacin se emplean lquidos
orgnicos fluorescentes como terfenilo, antraceno o xileno, en los que se disuelve la
muestra a contar (centelleador lquido)6.
Para aumentar el rendimiento de contaje del contador de centelleo slido, su
eficiencia, el detector generalmente no es plano, sino que posee un orificio en el que
se introduce el tubo a contar y as poder detectar la radiactividad emitida en casi
todas las muestras y realizar clculos con el resultado del contaje6.
Existen tambin contadores especficos para la lectura de muestra de RIA, que
disponen de una serie de detectores independientes capaces de leer muchos tubos
simultneamente dispuestos en gradillas de plstico especiales. El contador,
previamente programado, reconoce la funcin de cada tubo por la posicin que
ocupa para establecer la curva patrn y dar el resultado de las muestras
directamente6.
VII. CLCULO Y INTERPRETACIN DEL RIA
Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la
concentracin de hormonas, hay que construir una curva patrn que relacione estos
19

parmetros. La curva patrn se prepara al mismo tiempo que el anlisis de las

muestras problema, aplicando la tcnica a una serie de tubos que contienen
cantidades conocidas de la hormona a determinar (antgeno no marcado patrn) y
las mismas cantidades de antgeno marcado y de anticuerpo que se usan en el
anlisis11:
- En el primer tubo no hay antgeno no marcado, por lo que todos los centros de
unin del anticuerpo sern ocupados por el antgeno marcado. A este punto de
mxima unin del antgeno marcado se llama B 0 o Bmx, que representa la
-

radiactividad mxima que se puede unir11.

Los siguientes tubos tienen concentraciones conocidas cada vez mayores de
hormona, a mayor concentracin de antgeno no marcado menor formacin de
complejos antgeno marcado-anticuerpo, ya que ambos antgenos compiten por
unirse al anticuerpo11.
Los resultados obtenidos nos permiten construir una curva patrn

representando grficamente la radioactividad obtenida ( el % sobre B o) en estos

tubos (eje de ordenadas, eje Y), frente a las concentraciones conocidas de antgeno
no marcado contenida en cada uno de los tubos (eje de abscisas, eje X)11.
Ejemplo de curva patrn: (100 de Ag*)

La concentracin de hormona en las muestras problema se calcula interpolando en

esta curva patrn la medida de radiactividad obtenida para cada tubo problema. La
curva patrn se puede representar grficamente como una recta utilizando un papel
semilogartmico, lo que facilita la lectura de los resultados11.
Como se ha indicado anteriormente, la cuantificacin del RIA se realiza
normalmente en base a la fraccin de trazador que queda retenida por el anticuerpo
en forma de complejo antgeno- anticuerpo radiactivo. La cantidad de antgeno
presente en las muestras problema se determinar por comparacin con la fraccin
de radiactividad ligada por el anticuerpo en las soluciones patrn. La comparacin
20

de las muestras desconocidas con la curva patrn debe hacerse siempre por
interpolacin entre concentraciones calibradas conocidas, nunca por extrapolacin,
ya que no se puede predecir el comportamiento de la reaccin fuera de los puntos
conocidos6.
La representacin y cuantificacin del RIA necesita relacionar la fraccin de
radiactividad ligada al anticuerpo con la concentracin de antgeno. Esta relacin se
puede establecer de varias formas: relacin lineal, escala logartmica o

Logit
B

%B

%B

semilogartmica, transformacin logit, etc6.

Ag

Log Ag

Log Ag
Figura. Diversas formas de representar la curva patrn del radioinmunoensayo
(RIA): representacin decimal
(A), semilogartmica (B) y transformacin logit (C). Al ser un mtodo competitivo, la fraccin de trazador
radiactivo unido al anticuerpo disminuye al aumentar la cantidad de antgeno presente en el tubo6.

VIII.

CARACTERSTICAS DEL RIA

Alta especificidad, gran avidez por el antgeno y elevado ttulo11.

El anticuerpo debe ser utilizado en una concentracin conocida y limitada, para

que la reaccin se mantenga en la llamada zona de equivalencia. Si el
anticuerpo es levantado con el mismo antgeno que se va a detectar, y el
antgeno marcado tambin, se considera un ensayo homlogo, en el caso
contrario, es un ensayo heterlogo11.

Mtodo de gran sensibilidad.

Gran auge en sus comienzos (dcada 60).

En la actualidad de empleo ms restringido.

21

Muchas aplicaciones han sido sustituidas por otras tcnicas que ofrecen ms
ventajas.

Son las ms sensibles de las tcnicas.

Los equipos se usan para su medicin son sumamente sensibles12.

IX.

VENTAJAS
Radioinmunoensayo anlisis de un nmero de otras ventajas sin precedentes3.
-

Tiene una alta especificidad de la respuesta inmune, y la alta sensibilidad de

las mediciones radiactivas, por lo tanto se puede medir con precisin una
variedad de actividad inmune muy pequea cantidad de material3.

1. Anlisis general qumica de alta sensibilidad, el lmite de deteccin de 10 -10 g,

y RIA es por lo general 10 (nanogramos, ng), 10 g (picogramos, PG), o 10 g
(femtogramos, fg), 10 g (microgramos ligeramente, ag)3.
2. Debido especificidad de antgeno - anticuerpo respuesta inmune fuerte
especificidad, el analito debe ser antgeno correspondiente. Buenas anticuerpos
de especificidad pueden identificar la estructura qumica de material muy
similar, o incluso para identificar estereoismeros3.
3. Amplia gama de aplicaciones, segn estadsticas incompletas, hay por lo
menos 300 tipos de sustancias bioactivas se han establecido RIA. Se puede
aplicar a casi todas las hormonas (incluyendo hormonas peptdicas y
esteroides), pero tambin para una variedad de protenas, antgenos tumorales,
antgenos virales, antgenos bacterianos, antgenos de parsitos, y pequeas
molculas (tales como el anillo-ncleo ciclasa, etc.) y las drogas (como la
digoxina, glucsidos digitlicos, etc.) de anlisis, el campo de aplicacin
todava est en expansin. En los ltimos aos, debido a la tcnica de
22

preparacin de anticuerpos pequea molcula de hapteno tiene gran desarrollo,

se predijo que la casi totalidad de las sustancias activas biolgicas, como
mucho, ya que no es menor que el lmite de deteccin de RIA, puede crear el
mtodo RIA apropiada3.
4. Simples reactivos de RIA requiere mucha variedad, se puede hacer kit
completo; procedimiento de pipeteado es simple una vez capaz de analizar un
gran nmero de muestras, la cantidad de muestra es tambin menor, el tiempo
de reaccin no es largo, la medicin y de procesamiento de datos fcil de
automatizar; RIA un ensayo in vitro la tecnologa, los pacientes sin ningn
peligro de radiacin3.
5. Los emisores utilizados para el RIA son de tipo o .
6. Vidas medias adecuadas, una gran produccin de energa, ser fciles de obtener
y no se acomplejen durante su acoplamiento a la molcula ligando.
7. La corta vida media es ventajosa in vivo para reducir los efectos secundarios
de radioactividad en el paciente.
X.

DESVENTAJAS
-

La sensibilidad de RIA est restringida, principalmente, por la constante de

equilibrio de la reaccin antgeno- anticuerpo y por los errores tcnicos del

manejo de los reactivos (pipeteo y separacin).

Este mtodo requiere siempre la elaboracin de una curva estndar para la

lectura.
Debido a la utilizacin de agentes biolgicos, su estabilidad se ve afectada por
muchos factores, la necesidad de un conjunto de medidas de control de calidad

para garantizar la fiabilidad de los resultados3.

Las complicaciones inherentes a manipulacin y deshecho de los materiales

radiactivos en el laboratorio clnico.

Costosa y peligrosa.
Requiere un equipo especial que es el contador gamma para medir la
radiacin8.
23

Mide slo en las sustancias activas de respuesta inmune inmune, pero la

prdida de la sustancia biolgicamente activa es inmunorreactiva indetectable.
Por lo tanto los resultados RIA pueden ser incompatibles con los resultados de

los bioensayos3.
Sensibilidad por el mtodo en s funciona, las restricciones en el cuerpo de

ciertas sustancias con niveles especialmente bajos an no se determina3.

Como el radioinmunoensayo es una reaccin competitiva, el objeto medido y
la sustancia estndar no estn todos los implicados en la reaccin, los valores
medidos son relativos en lugar de la cantidad absoluta de la capacidad3.
A pesar de estas deficiencias existe RIA, pero es despus de que todos los

mtodos de anlisis cuantitativos y tecnologas avanzadas. Con el avance de la

ciencia y la tecnologa, la tecnologa radioinmunoensayo ser ms amplio y
profundo desarrollo3.

XI. RADIOISTOPOS UTILIZADOS

Elemento

Istopo

Vida Media
Aprox.

Radiacin
mayor

Carbono

C14

5600 aos

Beta

Investigacin en metabolismo, edad

por carbono.

Hidrgen
o

H3

12 aos

beta

Investigacin en biologa celular

Fsforo

P32

14 das

Beta

Investigacin de cidos nucleicos,

tratamiento de policitemia.

Yodo

I125

60 das

Gamma

Cncer de prstata

Yodo

I131

8 das

Gamma

Tratamiento de hipertiroidismo y
cncer de tiroides.

24

Aplicaciones importantes

Cromo

Cr51

28 das

Gamma

Diagnstico de la cintica de
Glbulos rojos

Tecnecio

Tc99

6 horas

Gamma

Experimentos del flujo sanguneo;

gammagrafas

Radio

Ra226

1600 aos

Gamma

Implantacin intersticial para el

tratamiento de cncer

Cobalto

Co60

5.3 aos

Gamma

Teleterapia para cncer

Cesio

Cs137

30 aos

Gamma

Teleterapia para cncer

XII. APLICACIONES
Diagnstico de tumores: Algunos tumores producen especiales que pueden ser
hallados en la sangre o en la orina. En ciertos casos, por ejemplo, la
gonadotropina corinica humana, la hormona lactgena placentaria humana y la
fosfatasa alcalina placentaria. Los antgenos no se encuentran normalmente en
la sangre, aunque s en el suero de un cierto porcentaje de pacientes con
determinados tipos de carcinoma6.
Cuando un tumor afecta a un tejido que normalmente controla o produce una
hormona, a menudo tiene lugar un incremento en el nivel de dicha hormona,
por ejemplo, elevada cantidades de insulina en sangre pueden ser debidas a un
tumor pancretico. Cada una de estas sustancias pueden ser detectadas por
mtodos de radioinmunoensayo con una sensibilidad mucho mayor que con
otros ensayos qumicos y biolgicos conocidos6.
Deteccin y diagnstico de tumores: alfa-fetoprotena (AFP), el antgeno
carcinoembrionario (CEA), antgeno carbohidrato (CA19-9), antgeno de la
glicoprotena (CA-125, CA15-3), 2-microglobulina (2-MG) ferritina (SF), el
antgeno prosttico especfico (PSA)3.

25

 Ensayo de sustancias clnicamente importantes en nios o en general,

cuando slo se dispone de ellas en pequeas cantidades6.
Muchas sustancias clnicamente importantes pueden ser ensayadas en grandes
muestras de sangre mediante pruebas qumicas convencionales. Sin embargo, al
tratarse de lactantes, nios de corta edad, pacientes en estado grave o animales
de pequeo tamao, la cantidad de muestra requerida puede llegar a ser mayor
de la que podra extraerse sin peligro. En estos casos, el radioinmunoensayo
evita el problema gracias a su gran sensibilidad6.
Determinacin de dmeros de pirimidina en DNA irradiado con luz
ultravioleta. En los estudios in vivo sobre los mecanismos de reparacin de
DNA irradiado, siempre es necesario medir el nmero de dmeros de pirimidina
(el principal producto de la radiacin ultravioleta del DNA). Esto puede
realizarse por cromatografa en papel o electroforesis, si el DNA intracelular
puede marcarse con H3 a una elevada actividad especfica. Sin embargo, esto no
es posible cuando se utilizan clulas animales y vegetales. Adems, es difcil
detectar pequeas cantidades de dmeros, por ejemplo: 1 x 108 pares de bases;
por los mtodos convencionales, mientras que s puede realizarse por
radioinmunoensayo6.

26

Deteccin de dmeros de timina (TT) en DNA por radioinmunoensayo, utilizando un

anticuerpo contra DNA irradiado con ultravioleta, es decir, anti TT. Se mezcla anti TT
y DNA iodado e irradiado con ultravioleta, y se mide la cantidad de iodo radiactivo
precipitado por el suero anticonejo de cabra. Se mide as la disminucin que
experimenta la radiactividad precipitada en funcin de la cantidad de DNA irradiado
con ultravioleta. Realizando una curva patrn puede relacionarse el porcentaje de
inhibicin con el nmero de dmeros de timina. En la figura se representan las grficas
para el DNA de dos bacterias distintas. El DNA de Micrococcus luteus posee un
contenido de timina menor que el de Proteus vulgaris y, por tanto, requiere una dosis
de UV mayor para conseguir el mismo nmero de dmeros de timina.

Funcin de las prostaglandinas en el hombre. En el hombre, la sangre venosa

contiene de 10 a 100 picogramos por mililitro de varios cidos grasos
poliinsaturados, que reciben el nombre genrico de prostaglandina. La
incapacidad de titular cuantitativamente estas sustancias, y con una elevada
sensibilidad, ha sido un serio obstculo para investigar su significado en el
cuerpo humano; el radioinmunoensayo ha eliminado este problema y ha
facilitado, adems el anlisis de un gran nmero de muestras en un corto
perodo de tiempo6.
Deteccin y cuantificacin de antgenos y anticuerpos en laboratorios de
Bioqumica.
Hematologa: determinaciones de vitamina B12, cido flico, etc.
Deteccin de Inmunoglobulina (IgE)
Virologa: determinaciones de marcadores de hepatitis B y C.
Farmacologa y toxicologa: determinaciones de frmacos en sangre, detectando
posibles sensibilizaciones de los organismos ante las alergias.
27

 En la endocrinologa para cuantificar hormonas:

- En las hormonas gonadales hipfisis: la hormona folculo estimulante (FSH),
hormona luteinizante (LH), testosterona (T), estradiol (E2), la progesterona
(P), prolactina (PRL), la vida hormona de crecimiento (HGH), la
gonadotropina corinica humana (HCG), lactgeno placentario humano (HPL)
y as sucesivamente.
- Hormonas de la glndula tiroides.
Radiorreceptor Anlisis: los receptores estn presentes en la superficie celular,
citoplasma o el ncleo de la sustancia activa biolgica, y su funcin es la de
molculas de seal extracelular (ligandos) de unin especfica, los efectos
biolgicos de los cambios en la informacin3.
Anlisis de radiorreceptor (ensayo de radiorreceptor, RRA) o ensayo de unin
de radioligando del receptor (ensayo de unin de radioligando, RBA) se basa en
la reaccin de unin entre el ligando radiomarcado del receptor, que es las
molculas receptoras El anlisis cuantitativo del estudio y la localizacin
sensible y una tecnologa fiable. Clnicamente el ms comn es TRAb anlisis
radiorreceptor, TRAb sricos de hipertiroidismo y el hipotiroidismo diagnstico
etiolgico tiene un significado importante. Adems, el diseo biolgica, el
mecanismo de accin de los frmacos, los efectos biolgicos e investigar la
causa de la enfermedad, el diagnstico y el tratamiento de tales aplicaciones se
ha desarrollado en gran medida3.
Anlisis microbiolgico de radiacin (ensayo de radiomicrobiologic) a los
microbios especficos como un aglutinante, tal como la determinacin de cido
flico en algunos microorganismos3.

XIII. TIPO DE CUADROS CLNICOS

Pruebas inmunolgicas: Para la deteccin del antgeno del serogrupo I de

Legionella pneumophila en muestras de orina de paciente de neumona14.
28

Infecciones vricas como los Calicivirus; el diagnstico etiolgico en

deposiciones puede realizarse mediante radioinmunoensayo, siendo sus
sntomas: gastroenteritis leve o moderada y de curso limitado, 1 a 2 das de
duracin. Puede manifestarse con alguno o la totalidad de los siguientes
sntomas: nuseas, vmitos, cefalea, mialgias, fiebre moderada, dolor
abdominal y diarrea. Cabe destacar que los sntomas gstricos son ms
frecuentes que en otras infecciones virales entricas15.

El cuadro clnico asociado a elevaciones plasmticas de vipoma (sndrome

de diarrea acuosa) por radioinmunoensayo, son diagnsticos del vipoma.
Otras pruebas son hipocalcemia, acidosis, azotemia prerrenal, disminucin
de la secrecin de cido clorhdrico, hipercalcemia, aumento de
prostaglandina E, elevacin de gonadotropina corinica e hipomagnesema16.

Deteccin de antgenos: el uso de las tcnicas de radioinmunoensayo (RIA)

y ELISA y el empleo de Acs policlonales han permitido detectar, en
pacientes con histoplasmosis, la presencia de antgenos de tipo polisacrido
en

muestras

de

fluidos

corporales

como

orina,

suero,

lavados

broncoalveolares y lquido cefalorraqudeo17.

La cuantificacin de T4 total, T3 total y T4 libre circulantes por

radioinmunoensayo son datos muy importantes en el diagnstico de
disfuncin tiroidea. Dado que los valores de T4 y T3 totales en suero
dependen no slo de su tasa de secrecin por el tiroides, sino tambin de las
concentraciones de TBG y otras protenas a las que se ligan para su
transporte, es muy importante el conocimiento de las variaciones de estas
protenas trasportadoras: por ello, la medicin de T4 libre da una informacin
adicional indicadora de la tasa de secrecin tiroidea, ya que no es
dependiente de las concentraciones de protenas transportadoras. Poca
utilidad tiene la cuantificacin de T3 reversa (rT3) en el diagnstico clnico
habitual de funcin tiroidea. La cuantificacin de T3 libre no aporta
informacin adicional a la que se obtiene con la medicin de T4 libre18.
29

XIV.REACCIONES ADVERSAS
Los estrgenos pueden aumentar la globulina transportadora de hormonas
tiroideas (TBG, por sus siglas en ingls) lo que lleva a un incremento en
hormona tiroidea total circulante, medida por yodo unido a protenas (PBI, por
sus siglas en ingls), niveles T4 por columna o radioinmunoensayo o niveles T3
por radioinmunoensayo19.

XV. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Gonzales J. 2013. Radioinmunoensayo. Departamento de Bioqumica y
Biologa Molecular de la Universidad del Pas Vasco Euskal Herriko
Unibertsitatea. Espaa.
2. La Salud Familiar. 2014. Las respuestas de los expertos de Salud.
Radioinmunoensayo,

mtodo,

historia.

Disponible

en:

http://lasaludfamiliar.com/caja-de-cerebro/conocimiento-10065.html
3. Conocimiento

enciclopdico

Disponible

del

en:

mundo.

2015.

Radioimmunoassay.

http://es.swewe.net/word_show.htm/?

53000_2&Radioimmunoassay
4. Aliaga B. 2009. Rosalyn Yalow desarroll el radioinmunoensayo para
analizar

molculas

biolgicas.

30

Colombia.

Disponible

en:

http://alumnatbiogeo.blogspot.com/2009/02/rosalyn-yalow-desarrolloel.html
5. Hernndez A. 2012. NTP 611: Agentes biolgicos: anlisis de las muestras.
Instituto nacional de seguridad e higiene en el trabajo. Ministerio de trabajo
y

asuntos

sociales

Espaa.

Disponible

en:

http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/N
TP/Ficheros/601a700/ntp_611.pdf
6. Mallol J. 2011. Manual de Radiofarmacia. Ediciones Daz Santos S.A.
Madrid.

Disponible

en:

http://www.editdiazdesantos.com/wwwdat/pdf/9788479788544.pdf
7. Freifelder D. 2003. Tcnicas bioqumica y Biologa molecular. Serie de
Biologa Fundamental. Facultad de ciencias de la Universidad de Barcelona.
Editorial Revert S.A. Barcelona- Espaa. Disponible en:
8. Angarita

L.

Radioinmunoensayos

(RIA).

2008.

Disponible

en:

http://es.scribd.com/doc/3288542/RADIOINMUNOENSAYOs
9. Caldern R. Inmunoqumica. Instituto de Biotecnologa. Universidad
Autnoma de Mxico. Cuernavaca, Mxico. 2007. Disponible en:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
10. Garca-Segura, J. et al. Mtodos Radioinmunomtricos, en Tcnicas
instrumentales de anlisis en Bioqumica. Madrid. Enciclopedia Quimica.es.
2002.

Disponible

en:

http://www.quimica.es/enciclopedia/Radioinmunoensayo.html
11. Cauelo A. Procedimientos bioqumicos y fisiolgicos en las alteraciones
de la salud, Mtodo para el estudio d hormonas. Departamento de
bioqumica y biologa molecular. Barcelona- Espaa. 2012. Disponible en:
http://www4.ujaen.es/~esiles/ENDOCRTema6.pdf
12. Prez L. Bioqumica clnica par tecnologas de la salud. Libro de autores
cubanos. Ciudad de la Habana- Cuba. 2013.
31

13.

Pereira

J.

Anticuerpos

marcados.

2012.

Disponible

en:

http://es.scribd.com/doc/112753669/ANTICUERPOS-MARCADOS-2012
14. Giono S, Aparicio G. Bases para el Diagnstico de Legionella. Mxico.
Revista de Patologa Clnica. [en lnea]. 1997. [citado el 29 de Julio del
2015]; 44(4), p. 207. Disponible en: https://books.google.com.pe/books?
id=uGKKPcjxsT0C&pg=PT16&lpg=PT16&dq=tipos+de+cuadros+cl
%C3%ADnicos+en+radioinmunoensayo&source=bl&ots=EthbUld5x2&sig
=U9fvzl_1f6956PRlqeTNIqWns&hl=es&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q
&f=false
15. Vivo A, Herrera M, Fernndez J y cols. Diagnstico de brotes por virus
esfricos de pequeo tamao, en especial calicivirus "Norwalk-like".Centro
Nacional de Epidemiologa, Instituto de Salud Carlos III. Gastroenteritis
vricas. Boletn epidemiolgico del Ministerio de Sanidad y Consumo de
Espaa

1999;

7(11):p.

117-118.

Disponible

en:

http://epi.minsal.cl/evigant/Numero17/evigia/html/actual/dactu4.htm
16. Jaramillo J. El Cncer Fundamentos de oncologa. Editorial de la
Universidad de costa Rica. San Jos- Costa Rica. [en lnea]. 1991. [citado el
29

de

Julio

del

2015];

Tomo

2.

Disponible

en:

https://books.google.com.pe/books?
id=aA20DpccGKUC&pg=PA508&lpg=PA508&dq=cuadro+cl
%C3%ADnicos+en+radioinmunoensayo&source=bl&ots=fVVlm8gkMe&si
g=rmNYLClc07Tg0DwQKqToeIqPngg&hl=es&sa=X&redir_esc=y#v=one
page&q=cuadro%20cl%C3%ADnicos%20en
%20radioinmunoensayo&f=false
17. Muoz C, Cano L, Gonzales A. Deteccin e identificacin de Histoplasma
capsulatum por el laboratorio: de los mtodos convencionales a las pruebas
moleculares. [on line]. 2010. [citado el 30 de julio del 2015]; 14(2), p. 145158.

Disponible

en:

http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0123-

93922010000600007&script=sci_arttext
32

18. Casanueva F et al. Endocrinologa clnica. Ediciones Daz de Santos.

Madrid. Espaa. [on line]. 1995. [citado el 30 de Julio del 2015].
Disponible

en:

https://books.google.com.pe/books?

id=Qgf262eChy0C&pg=PA83&lpg=PA83&dq=tipo+de+cuadro+cl
%C3%ADnicos+es+
%C3%BAtil+en+radioinmunoensayo&source=bl&ots=ZU5nXUZcia&sig=
U0Jf8s0rLrl0v7RqBqmEc0P4dQ&hl=es&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&
q=tipo%20de%20cuadro%20cl%C3%ADnicos%20es%20%C3%BAtil
%20en%20radioinmunoensayo&f=false
19. PREMARIN.

Medicamentos.

Disponible

http://www.medicamentos.com.mx/DocHTM/27878.htm

ANEXOS
33

en:

34

35