REA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL
GRUPO
QU- 304
MATERIA
MICROBIOLOGA AMBIENTAL
TTULO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA
ASESORA
Dra. ROSA RICO MATA
DATOS DE IDENTIFICACIN DE LOS ANALISTAS
Fecha de inicio del anlisis: 1 de Julio del 2015
Fecha de termino: 9 de Julio de 2015
Nombre
Mara Guadalupe Regina Salas Padilla

Cargo
Responsable

Vctor Manuel Guadalupe Pia Cardona

Administrador

Andrs Ramrez Snchez

Laboratorista 1

No Miguel ngel Pedroza Daz

Laboratorista 2

Jorge Rentera Aldana

Laboratorista 3

GENERACIN: 2014-2016

MICROBIOLOGA AMBIENTAL UTL

ASESORA:

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DATOS DEL SITIO EN ESTUDIO

1.- Breve descripcin del estatus ambiental del sitio de estudio: La muestra para el anlisis microbiolgico se
tom de la planta tratadora de aguas residuales de la Universidad Tecnolgica de Len, en la cual llegan
descargas de aguas a diario, las mismas que despus del proceso en el que se someten son utilizadas para las
reas verdes y para el drenaje de la misma universidad, de esta manera haciendo de esta una simbiosis
ambiental.
Nombre

Ubicacin
/coordenadas GPS

Planta Tratadora de
agua residual de la
UTL

21.062997,101.582700.

Imagen de mapa satelital

SITIO DE
MUESTREO

Fecha:30 de Junio del 2015

Hora:10:40 a.m.

2. Evidencia fotogrfica del sitio

Fecha:30 de Junio del 2015
Hora:10:45 a.m.

DATOS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR

1. Identificacin
Hora de toma de muestra:10:40
Hora de siembra:11:00 a.m.
a.m.
Punto de Muestreo (ubicacin /coordenadas GPS):
Tiempo de exposicin (aplica solo para muestra de
aire)
Nombre del/ los analistas que tomaron la muestra:No Nombre del/ los analistas que sembr la
Miguel ngel Pedroza Daz
muestra:Andrs Ramrez Snchez
Matriz ambiental:Agua

2.Parmetros Fisicoqumicos
Color:Caf

Temperatura (oC) ambiental: 20 CpH:5

Olor: Materia orgnica en descomposicin y heces

Describir condiciones climatolgicas:Soleado
fecales.
3. Evidencia fotogrfica del sitio de toma de muestra

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ASESORA:

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Justificacin del proceso para la identificacin bacteriana
La identificacin de una bacteria que interviene en un ciclo biogeoqumico es de suma importancia ya que se
estudia su proceso metablico, que nos permite conocer la manera en la que asimila los nutrientes
proporcionados por el micromedi ambiente en donde se encuentre, sobre todo a conocer que mecanismos
metablicos utiliza para degradar o transformar sustancias orgnicas o inorgnicas que se encuentran disueltas
en el agua y cuya funcin del microorganismo es retirarlas de dicha matriz como un proceso de depuracin de
agua, y por lo tanto se debe de aislar en un medio selectivo para poder hacer las pruebas correspondientes
para su identificacin, para despus poder implementar el microorganismo en un proceso de Biorremediacin
si es que sus propiedades metablicas pudiesen favorecer al mismo.
2. Dos medios de siembra (Nombre y Composicin)
Agar Triple Azcar de Hierro
Agar Kliger de Hierro
gr/lt
gr/lt
1.- Extracto de Carne. 30 g
2.- Pluripeptona .. 20 g
3.- Cloruro de Sodio 5 g
4.- Lactosa 10 g
5.- Sacarosa. 10 g
6.- Glucosa ....1 g
7.- Sulfato de Hierro y amonio .0.2 g
8.- Tiosulfato de Sodio ...0.2 g
9.- Rojo de Fenol .. 0.025 g
10.-Agar

Morfologa Colonial (Medio 1)

Descripcin
Crecimiento de colonias de una forma
puntiforme, con bordes ondulados, y una
superficie convexa lisa y cremosa.
Imagen

1.- Peptona de Carne . 13 g

2.- Cloruro de Sodio . 5 g
3.-Lactosa .10 g
4.-Tripteina 10 g
5.-Glucosa ... 1 g
6.-Citrato de Hierro y Amonio 0.5 g
7.-Tiosulfato de Sodio 0.3 g
Morfologa Colonial (Medio 2)
8.-Rojo de Fenol Descripcin
0.025 g
Crecimiento de colonias de una forma
9.-Agar

15 g y
puntiforme,
con bordes ondulados,
una superficie convexa lisa y cremosa.
Imagen

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3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y composicin)

Agar Triple Azcar de Hierro (medio 1)
Agar Mac Conkey (medio 2)
gr/ litro
gr/ litro
1.- Extracto de Carne. 30 g
2.- Pluripeptona .. 20 g
3.- Cloruro de Sodio 5 g
4.- Lactosa 10 g
5.- Sacarosa. 10 g
6.- Glucosa ....1 g
Morfologa Colonial (Medio 1)
7.- Sulfato de HierroDescripcin
y amonio..0.2 g
8.- Tiosulfato de Sodio ...0.2 g
Colonias incoloras con bordes regulares de 1,5 mm
9.- Rojo de Fenolde
..
aproximadamente
Shigella Flexneri 0.025 g
10.-Agar

Imagen

1.- Peptona .. 1.5 g

2.- peptona de gelatina..17.0 g
3.-Lactosa .. 10 g
4.- Mezcla de sales biliares .1.5 g
5.- Cloruro de Sodio . 5 g
6.-Agar
Morfologa

Colonial (Medio 2)
13.5 g
Descripcin
7.-Rojo Neutro .. 0.3 g
8.-Cristal Violeta .. 0.001 g
Colonias incoloras con bordes regulares de 1,5 mm
aproximadamente, regreso en Shigella flexneri

Imagen

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4. Procedimiento de Aislamiento
(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)

2 charolas de pesado
Materiales y equipo
1 parrilla de calentamiento
1 esptula
1 agitador de vidrio
2 matraces Erlenmeyer 250 mL
Agua destilada
2 vasos de precipitado 250 mL
3 cajas Petri
Mecheros Bunsen

Reactivos y medios de cultivo

Agar triple azcar de hierro

Preparacin de medios de cultivo:

Pesar 6.25 g de Agar Triple Azcar de Hierro y disolverlo en 100 mL de agua destilada y calentarlo
durante 1 minuto o hasta que el medio se disuelva completamente en el agua, despus llevar a
esterilizar durante 15 minutos a 120 C, en condiciones estriles distribuir el medio en las placas Petri
(Aproximadamente 33. 33 mL en cada caja), se necesitan 3 cajas; una para la siembra, otra para la
resiembra y una tercera de control. Una vez que se reparti el medio se dejan solidificar.

Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, seleccin de la colonia y resiembra):

Siembra: Una vez que se distribuy el medio en las placas, se toma la muestra de agua de la planta de
tratamiento de aguas residuales de la UTL ya previamente recolectada, con ayuda del mechero se
esteriliza el asa metlica de nicromo y se toma un poco de la muestra, despus esta se distribuye en el
medio por el mtodo de estriado, como se muestra en las siguientes imgenes y se pone a incubar a 37
C de 18 a 24 horas.

Seleccin de la colonia: Despus del periodo de incubacin se observa el crecimiento que hubo en el
mismo y verificar que la morfologa de las colonias sean las que se pretenden identificar puesto que en
un medio de cultivo pueden crecer diferentes tipos de bacterias, ya que se verific que la colonia que
se busca identificar se elige la que haya quedado aislada de las dems, de esta manera lograr un
cultivo selectivo para su resiembra.
Resiembra: Se hace una divisin en la placa seleccionada para la resiembra, esta se marca por debajo
de la misma con ayuda de un marcador, para poder hacer dos estriados y aislar dos colonias
previamente seleccionadas, cada una en su respectiva zona de la caja Petri con su crecimiento, con
ayuda del mechero se esteriliza el asa y se toman dos colonias y se siembran mediante el mtodo ya
mencionado, se incuban a 37 de 18 a 24 horas.

Asas metlicas
Equipo para esterilizacin

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5. Esquema del Perfil bioqumico (metablico )

para la identificacin del microorganismo seleccionado
Tincin de Gram
(-)

(+))
Prueba de Motilidad

Cpsula

Catalasa

Degradacin de la Casena (-)

Produccin de Indol (-)

Prueba Rojo de Metilo (-)

Vogues Proskauer (-)

Produccin de Gas (-)

Produccin de cido Sulfhdrico (-)

Degradacin de Citratos (-)

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RESULTADOS DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA)
Agar triple azcar de hierro
Agar triple azcar de hierro

2. MORFOLOGA COLONIAL OBSERVADA

Tipo de colonia 1: Descripcin

FOTO 1

Crecimiento abundante en el medio de cultivo,

las colonias son incoloras y con una morfologa de
bordes regulares y con una elevacin convexa.

Tipo de colonia 2: Descripcin

FOTO 2

La colonia seleccionada tiene un borde

ondulante, es incolora y tiene una superficie
opaca.

Tipo de colonia 3: Descripcin

FOTO 3

Su transmisin de luz es opaca y tiene

una consistencia cremosa.

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3. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO PURO ( RESIEMBRA)

FOTO 1
Agar Mac Conkey

FOTO2
Agar Mac Conkey

4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA

FOTO 1
Descripcin

La resiembra result muy favorable, esto

quiere decir que el medio de cultivo
seleccionado para la resiembra si fue el
correcto para la bacteria que se deseaba
aislar.
En la foto 1 se puede observar las colonias
aisladas en las dos partes del medio, se
puede identificar claramente el estriado
que se realiz de una manera correcta, las
colonias estn un poco pequeas porque
an les falta crecimiento, esta foto se tom
despus de 12 horas de incubacin.

FOTO 2

En la foto 2 se puede observar que las

colonias que ya crecieron un poco ms,
pues el estriado se alcanza a distinguir
claramente.
FOTO 3

La foto 3 se tom despus de 24 horas de

incubacin que necesitan este tipo de
bacterias para su crecimiento por lo tanto
las bacterias aisladas se alcanzan a ver
perfectamente.

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5. EVIDENCIA FOTOGRFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUMICO

Nombre de la
prueba

Medio de cultivo
utilizado

1. Tincin de
Gram

Resultado obtenido
(positivo/negativo)

Evidencia fotogrfica

Negativo

Fundamento de la prueba

Es un tipo de tincin diferencial empleada en la microbiologa para la visualizacin de bacterias.

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre
dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la
retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o
la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con
mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gram negativas, los lpidos de la
pared (ms abundantes que en las clulas gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el
escape del complejo de cristal violeta con yodo.

2. Prueba de
Motilidad

1.- Agar SIM

Positivo en el rea
anaerobia

Fundamento de la prueba

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms all de la lnea
de inoculacin. Esto se debe a la presencia de flagelos que le permiten desplazarse por el medio en busca de
alimento. Puede ser en medio aerbico o anaerbico.

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3.- Prueba de Cpsula

Negativo

La cpsula es una cubierta de grosor variable formada habitualmente por unidades de polisacridos, protenas o
ambos. Si est bien estructurada y se encuentra bien adherida a la clula, se le denomina cpsula; si por el
contrario, tiene estructura mal definida y su adhesin es dbil, se le conoce como glicoclix. De acuerdo a su
estructura qumica, puede ser flexible o rgida. La rigidez le confiere la caracterstica de una matriz impermeable.
Determina la adhesin a superficies (biopelculas), constituye una barrera de proteccin contra la fagocitosis y los
anticuerpos e impide la desecacin y la accin de otros agentes.

4.- Prueba de Catalasa

1.- Agua
oxigenada

Positivo

Fundamento de la prueba

La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias. Descompone el perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxgeno indica que el
microorganismo posee dicha enzima.
H2O2 + catalasa -------------------H2O + O2

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5.- Degradacin de la
casena

1.- Agar leche

descremada

Negativo

Fundamento de la prueba

Las proteasas son excretadas al medio para la degradacin de protenas, la casena es la protena de la leche que
le da el color blanco, cuando la casena es hidrolizada por las proteasas o enzimas que degradan esta protena,
desaparecer el color blanco alrededor del crecimiento bacteriano.

6.- Produccin de Indol

1.- Agua de Peptona

Negativo

Fundamento de la prueba
El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminacin reductiva del triptfano y esta reaccin es
llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Para
detectar la produccin de indol se utiliza el medio Caldo triptfano y la lectura de la prueba se realiza con el
reactivo de Kovacs, con el que el indol producido reacciona generando una coloracin rosa intensa.
C11H12N2O2+ triptofanasa ---------- C8H7N + NH3 + C3H4O3 + energa

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7.-Prueba RM-VP

1.-Caldo RN-VP

Negativo

Fundamento de la prueba
La prueba de rojo de metilo detecta la fermentacin acido-mixta, donde se acumulan acido relativamente
fuertes (actico, frmico, lctico, etc.) bajando as el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta
aadiendo un indicador (rojo de metilo) al medio de cultivo
C6H12O6 + fermentacin + rojo de metilo ------ cidos + cambio de color

8.- Vogues
Proskauer

1.- Caldo RMVP

Negativo

Fundamento de la prueba
Detecta la fermentacin butanodilica. En esta fermentacin se producen menor cantidad de cidos que en la
fermentacin cido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo (alfa-naftol y KOH) se
detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetona). La acetona en presencia
de oxigeno se oxida a diacetilo. El diacetilo origina una coloracin roja al reaccionar con los restos guanidnicos
de algunos aminocidos de la peptona del medio
C6H12O6 ---->C4H10O2 + C10H8O + KOH ----> C3H6O + O2 -- C4H6O2 + aminocidos -- coloracin roja

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9.- Produccin de
gas CO2 y H2

1.- Caldo
Lactosado

Negativo

Fundamento de la prueba
El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrgeno mientras que la lactosa es el hidrato de
carbono a fermentable. Por la fermentacin de la lactosa se produce cido y gas (CO2 y H2), el cual se evidencia
al utilizar campanas Durham).
C6H12O6 C3H4O3 + NADH + H+ C3H3O3 + CO2

10.- Produccin
de cido
Sulfhdrico

1.- Agar Kliger

de Hierro

Negativa

Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan nutrientes adecuados para el desarrollo
bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El rojo de fenol es el
indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance asmtico. Por fermentacin de azucares, se
producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio
acido. El Tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrogeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionado el tpico sulfuro de hierro de color negro.
Na2S2O3 + Tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa H2S + FeSO4 (sal de hierro) Fe2S3
Azucares + rojo de fenol cidos + color amarillo

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11.- Prueba
de
degradacin
de Citrato.

1.- Agar Citrato

de Simmons

Negativo

Fundamento de la prueba
En esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de Carbono
para su metabolismo y crecimiento. El medio de cultivo Citrato de Simmons incluye; citrato de Sodio, un anin
como nica fuente de Carbono y Fosfato de Amonio como fuente de Nitrgeno.
La citrato permeasa permiten el transporte de citrato al interior de las clulas y la enzima citrasa convierte el
citrato en cido pirvico y CO2. El CO2 liberado se combina con el sodio y agua y forman carbonato de sodio que
es alcalino cambiando el bromotimol de verde a azul intenso.
Citrato ---------------- Oxalacetato + Acetato

Piruvato + Acetato

Reaccin en pH cido

2 Piruvato ----------------- Acetato + CO2 + Lactacto

2 Piruvato -- ---------------- Acetona + 2 CO2

Reaccin en pH bsico

Citrato -------------------

CO2 + cido Frmico + 2 cido Actico

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IDENTIFICACIN DEL MICROORGANISMO AMBIENTAL

EN LA MATRIZ DE ESTUDIO: AGUA
1.- Nombre cientfico del microorganismo identificado de acuerdo a los resultados
del perfil bioqumico planteado ( genero y especie)
Shigella flexneri

2. Taxonoma del o los microorganismo identificados

Son Bacterias Anaerobias y Anaerobias facultativas.
Familia: Enterobacteriaceae
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Gnero: Shigella
Clase: Grammproteobacteria
Especie: S.flexneri
Orden: Enterobacteriales
3. Caractersticas generales

Shigella es un gnero bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de

forma bacilar, no esporulados, inmviles, pero animados de movimiento pendular (oscilacin) in situ.
Son gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin
produccin de gas; no obstante, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No
descarboxilan la lisina. No fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como nica fuente de carbono. No crecen
en el medio cianuro potsico. Su actividad bioqumica es muy reducida.

4. Conclusin parcial sobre las interacciones bacterianas en la matriz estudiada y la importancia de la

microbiologa en el rea ambiental

El perfil bioqumico de la bacteria que fue aislada de la muestra de la planta tratadora de aguas residuales de
la Universidad Tecnolgica de Len UTL, corresponde a una bacteria patgena (Shigella Flexneri), esta es una
entero bacteria Gram negativa, no esporulada, sin cpsula en su estructura celular, tiene una baja actividad
bioqumica,. Sus enzimas son muy especficas, pues bajo esta serie de pruebas slo fue identificada la catalasa
pues pudo descomponer el perxido en agua ms oxgeno, no hacen fermentaciones, algunas de ellas como lo
es la fermentacin de lactosa, y la fermentacin cido-mixta, motivo por el cual las pruebas de RM-VP
resultaron negativas, por otro lado tampoco asimila el citrato como nica fuente de carbono lo cual indica que
no posee la enzima que degrada el citrato en su batera metablica.
La identificacin de bacterias nos ayuda a entender cmo se lleva a cabo la purificacin de un efluente
contaminado al entender el metabolismo catablico de dichos microorganismos identificados y que se
encuentran en un efluente contaminado es muy importante ya que ellos son los que se encargan de degradar
la materia orgnica disuelta en el agua, como sabemos cuando hablamos de materia orgnica nos referimos a
las biomolculas como son protenas, carbohidratos y lpidos que serian la fuente de energa y los nutrientes
que necesita la bacteria para mantenerse viva y multiplicarse, al degradar esta biomolculas e incorporarlas a
su estructura celular, hace una limpieza al efluente convirtindose la materia orgnica disuelta en biomasa
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bacteriana que as ves puede ser el alimento de protozoarios que se encuentran en los lodos activados y que
entran en contacto con el efluente contaminado, realizando una interaccin microbiana benfica para el
tratamiento de aguas contaminadas.
Al identificar a un microorganismo nativo de una matriz ambiental ( suelo, el agua y el aire ) y entender su
metabolismo catablico estamos generando conocimientos que nos pueden ayudar posteriormente a una
aplicacin biotecnolgica en el rea ambiental y as poder proponer nuevos tratamientos innovadores de
biorremediacin.

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