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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA


CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA


ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGA E INGENIERA
PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS

305689 - BIOTECNOLOGA
FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES
(Director Nacional)

GLEATHER JHON FLOREZ


Acreditador

PASTO
Julio de 2012

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CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA

INDICE DE CONTENIDO
UNIDAD 1 : : ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOGA

CAPITULO 1. Contextualizacin de la Biotecnologa

Leccin 1. Definicin de Biotecnologa

Leccin 2: Historia de Biotecnologa

Leccin :3 Divisin y tipos de Biotecnologa

Leccin 4:

Impacto de la Biotecnologa en el contexto colombiano

Leccin 5: Tendencias de la Biotecnologa

CAPITULO 2 : BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES

13

Leccin 1: Nutricin microbiana

13

Leccin2: Metabolismo energtico

15

Leccin 3: Aspectos generales de los procesos biosintticos

19

Leccin 4 : Crecimiento microbiano

23

Leccin 5: Modelos matemticos que explican el crecimiento microbiano

23

CAPITULO 3 : SISTEMAS DE FERMENTACIN

23

Leccin 1: Tipos de fermentacin

26

Leccin 2: Productividad y velocidad especfica de produccin

28

Leccin 3: Coeficientes de rendimiento

29

Leccin 4: Biorreactores

29

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Leccin 5: Transferencia de O2 y fermentacin a gran escala

31

UNIDAD 2 : BIOCATALISIS E INGENIERA GENTICA APLICADA A LA


BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA

33

CAPITULO UNO : BIOTECNOLOGA ENZIMTICA

33

Leccin 1 : Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica

37

Leccin 2: Naturaleza de las enzimas

40

Leccin 3: Clasificacin de enzimas segn la naturaleza de la reaccin y


cofactores

41

Leccin 4: Cintica enzimtica

41

Leccin 5: Produccin de enzimas

43

CAPITULO DOS : PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA


BIOTECNOLOGA

44

Leccin 1: Tcnicas utilizadas en la manipulacin gentica in vitro.

46

Leccin 2: Tecnologa del ADN recombinante

47

Leccin 3: La reaccin en cadena de polimerasa ( PCR)

47

Leccin 4: Mutagnesis , Mutagnesis dirigida por oligonucletidos

47

Leccin 5: Mutagnesis en casette o interrupcin gnica

47

CAPITULO 3 : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE EN LA INDUSTRIA


ALIMENTARIA

49

Leccin 1: Animales transgnicos

50

Leccin 2: Plantas Transgnicas

51

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Leccin 3: Alimentos genticamente modificados

54

Leccin 4: Alimentos funcionales

54

Leccin 5: Prebiticos

59

UNIDAD 3 : PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS DE INTERES ALIMENTARIO

60

CAPITULO 1: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE


PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA
FERMENTATIVA.

60

Leccin 1: Bebidas alcohlicas

61

Leccin 2: Biologa de las fermentaciones con levaduras y condiciones de la


fermentacin

66

Leccin 3: Compuestos organolpticos

70

Leccin 4 : Alimentos basados en soja fermentada

71

Leccin 5 : Productos crnicos fermentados

72

CAPTULO DOS:
ALIMENTARIA

78

OTROS PRODUCTOS DE INTERS EN LA INDUSTRIA

Leccin 1: Produccin de levadura


Leccin 2 : Vinagre

81

leccin 3 : acido Lctico

81

leccin 4: acido Actico

81

Leccin 5 : Produccin de acido ctrico

83

CAPITULO 3 : BIOPOLIMEROS MICROBIANOS

83

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Leccin 1 : Polisacridos microbianos y PHAs

84

Leccin 2: Poli hidroxibutirato

86

Leccin 3: Los alginatosy Gelanos

88

Leccin 4: Xantano

88

Leccin 5: Dextranos

lEC

BIBLIOGRAFIA

104

LIISADO DE TABLAS
Nombre

Pgina

Tabla 1

Productos derivados de la fermentacin

34

Tabla 2:

Produccin total de una fermentacin


continua

38

Tabla 3:

Tamao de fermentadores para varios


procesos

41

Tabla 4

Produccin de enzimas microbianas

49

Tabla 5

Enzimas utilizadas
alimenticia

Industria

50

Tabla 6

Caractersticas
de
la
industrial de cido ctrico

produccin

96

en

la

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LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS


Tabla
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6

Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23
Figura 24
Figura 25
Figura 26
Figura 27
Figura 28
Figura 29
Figura 30
Figura 31

Nombre
Fases del metabolismo microbiano
Curva de crecimiento microbiano
Fermentacin continua en quimiostato
Efecto de la velocidad del flujo sobre la concentracin de
sustrato
Productividad total y productividad mxima
Productividad en relacin a la concentracin de cidos
grasos en un proceso de produccin de protena de origen
unicelular
Esquema de un reactor aerobio con agitacin mecnica
Esquema de un reactor tipo Air lift
Enzimas complejos
Ejemplo de cofactor
Enzimas de oxido-reduccin
Transferasas
Hidrolasas
Liasas
Ejemplo de isomerizacin
Ligasas
Cintica enzimtica
Curva : Velocidad enzimtica/concentracin de la enzima
Curva de enzimas alostricas
Esquema para la produccin de enzimas por fermentacin
Clasificacin deformas de obtencin de enzimas
La separacin de los cidos nucleicos
Procedimientos bsicos del ADN recombinante
Replicacin del ADN, utilizando (PCR)
Mutagnesis
Mutagnesis dirigida
Mutacin por casette
Mejoramiento gentico en bovinos
Ejemplo de plantas genticamente modificadas
Alimentos basados en soja fermentada
Ruta de la produccin de citrato

Pgina
34
36
39

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El contenido didctico del curso acadmico: Biotecnologa_305689


fue diseado inicialmente en el ao 2007 por FEDRA LORENA ORTIZ
BENAVIDES, docente de la UNAD, ubicado en el CEAD de Pasto. Se ha
desempeado como tutor de la UNAD desde el 2005 hasta el ao 2008,
en este momento es Docente Auxiliar de la escuela de Ciencias Bsicas,
tecnologa e Ingeniera y ha sido catedrtico de la Universidad de
Nario.
El contenido didctico ha tenido tres actualzaiciones: dos
desarrolladas por la misma profesora Ortiz en los aos 2008 y 2009
El Doctor Gleather Jhon Flrez, tutor del CEAD Jos Celestino
Mutis - Bogot, apoy el proceso de revisin de estilo del contenido
didctico e hizo aportes disciplinares, didcticos y pedaggicos en el
proceso de acreditacin del material didctico desarrollado en el mes de
Julio de 2009.

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INTRODUCCIN
Aunque la utilizacin de organismos vivos para obtener productos comerciales se
remonta a la antigedad, cuando el hombre sin saberlo utilizaba microorganismos para
obtener el vino, o pan, los acontecimientos cientficos en las ltimas dcadas han
revolucionado el panorama industrial con productos de diversa ndole obtenidos a travs
de la manipulacin o transformacin de los organismos vivos.

El desarrollo de la biologa en las ltimas cuatro dcadas, ha hecho posible el desarrollo


de sofisticados, procedimientos para el aislamiento, manipulacin y expresin de
material gentico, lo que ha llevado consigo al avance de una nueva disciplina: L a
Bi o tecn o l o g a. , la cual tiene aplicaciones tanto en la investigacin bsica, como en la

aplicada. Las tcnicas de esta ciencia se han utilizado para estudiar los mecanismos de
la replicacin y expresin gnicas en procariotas, eucariotas y sus virus. Algunos de los
ms importantes descubrimientos bsicos de la gentica se han realizado utilizando
tcnicas ingenieriles. En cuanto a la investigacin aplicada, la Biotecnologa permite el
desarrollo de cultivos microbianos capaces de fabricar productos valiosos, tales como la
insulina humana, la hormona humana del crecimiento, interfern, vacunas y enzimas
industriales. La aplicacin industrial de la Biotecnologa, parece tener un potencial
ilimitado.

La Biotecnologa, se ha convertido en la herramienta para un nuevo desarrollo social,


basado en el conocimiento del funcionamiento de la vida y sus posibilidades de
manipularlo y transformarlo. Su impacto en la Medicina, la agricultura, el mejoramiento de
las especies, la evolucin, la industria alimenticia y la farmacologa, dan muestra de la
importancia que tiene esta disciplina, que se ha convertido sin lugar a dudas en la base de
la revolucin tecnolgica que ha acaparado la atencin de los cientficos y gobiernos
como posible estrategia para encontrar soluciones a los problemas que aquejan a la
humanidad.

Nuestro pas, tiene un desafo de gran envergadura ante fenmenos tales como la
globalizacin neoliberal, el deterioro ambiental, la crisis financiera y otras amenazas que

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pueden afectar seriamente sus potencialidades de desarrollo futuro. Como una estrategia
para hacer frente a los retos de la post - modernidad es necesario aprovechar los
recursos naturales, utilizar racionalmente la biodiversidad y desarrollar proyectos
productivos.

Las expectativas se centran en el acceso a nuevas fuentes de diversidad biolgica, con


un suministro adecuado y oportuno de informacin sobre sus aplicaciones potenciales.
Sin embargo, en la revista colombiana de Biotecnologa 1se advierte de la urgencia de
incorporar valor agregado a la biodiversidad mediante el conocimiento generado a travs
de la investigacin, porque la oportunidad que nos da el hecho de ser un pas
megadiverso va a desaparecer si no actuamos a favor de nuestro futuro.
Es por eso que consideramos que este es un curso de gran importancia que sin lugar a
dudas les brindara a los estudiantes de la UNAD, los conocimientos que los llevaran a la
reflexin de utilizar nuestra diversidad como fuente de progreso y desarrollo individual y
social.

En consecuencia, el programa de Biotecnologa pretende desarrollar en los estudiantes


actitudes cientficas as como brindarles las bases conceptuales y procedimentales para
hacer uso sostenible del potencial bitico que ostenta nuestro pas a lo largo y ancho de
su geografa.

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UNIDAD 1
CAPITULO 1. CONTEXTUALIZACIN DE LA BIOTECNOLOGA

Leccin 1. Definicin de Biotecnologa

Leccin 2: Historia de Biotecnologa

Leccin :3 Divisin y tipos de Biotecnologa

Leccin 4:

Impacto de la Biotecnologa en el contexto colombiano

Leccin 5: Tendencias de la Biotecnologa

CAPITULO 2 : BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES

13

Leccin 6: Nutricin microbiana

13

Leccin 7: Metabolismo energtico

15

Leccin 8: Aspectos generales de los procesos biosintticos

19

Leccin 9 : Crecimiento microbiano

23

Leccin 10: Modelos matemticos que explican el crecimiento microbiano

23

CAPITULO 3 : SISTEMAS DE FERMENTACIN

23

Leccin 11: Tipos de fermentacin

26

Leccin 12: Productividad y velocidad especfica de produccin

28

Leccin 13: Coeficientes de rendimiento

29

Leccin 14: Biorreactores

29

Leccin 15: Transferencia de O2 y fermentacin a gran escala

31

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UNIDAD 1: ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOGA.

Introduccin: La siguiente unidad ha sido dividida en tres captulos: en


el primero, se pretende que los estudiantes se apropien del concepto de
biotecnologa, los fundamentos bsicos que caracterizan esta disciplina
para luego identificarlos y diferenciarlos de otros procesos. En el
segundo captulo, se pretende que los estudiantes a travs del
conocimiento bsico del metabolismo celular sean capaces de proponer
el mejor ambiente para que la respuesta celular sea la ms eficiente
para la obtencin de productos y o servicios en la industria alimentaria.
Por ltimo en el tercer captulo se hace una introduccin sobre sistemas
de fermentacin que les permita conocer a los estudiantes las tcnicas,
procesos y procedimientos que se realizan a nivel industrial para la
obtencin de un producto derivado de la fermentacin.

Objetivos de la unidad
Contextualizar el estudio de la Biotecnologa
alimentaria
analizar su impacto en la sociedad contempornea

Consolidar conceptos bioqumicos esenciales para aproximarse y


comprender la complejidad de reacciones metablicas que se
traduce en la produccin de biomasa en la sntesis de sustancias
Adquirir bases tericas que respaldan los procesos de produccin
de biomasa y metabolitos.
Estudiar dispositivos empleados en la produccin de biomasa y
metabolitos
Obtener bases tericas para produccin y purificacin de enzimas
microbianas de aplicacin comercial.
Obtener una visin de la importancia del control de la produccin
para asegurar calidad de los productos

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CAPITULO 1. CONTEXTUALIZACIN DE LA BIOTECNOLOGA.


Leccin 1. Definiciones de Biotecnologa
Existen diversas definiciones de Biotecnologa provenientes de diversos
enfoques y puntos de vista, que van desde conceptos ms generales
hasta particulares. Por ejemplo: La biotecnologa, se ha definido como
la aplicacin de organismos, componentes o sistemas biolgicos para la
obtencin de bienes y servicios. Sin embargo, se considera que este
enunciado es muy amplio y engloba todas las operaciones de la biologa
aplicada desde la agricultura hasta la ciencia culinaria.

En un sentido mucho ms estrecho, la palabra biotecnologa se refiere a


veces, para definir la utilizacin de la manipulacin gentica con el fin de
obtener la expresin correcta a altos niveles de un gen clonado en
clulas husped.
As como tambin la aplicacin de la biologa
molecular en direcciones que se esperan sean de utilidad como el uso de
marcadores
moleculares
para
identificar
microorganismos
de
importancia agrcola. Este enfoque, supone confundir los aspectos de
moda con los principios de la biotecnologa y se debe ms a la filosofa
de las agencias de publicidad y medios de comunicacin que a la
industria.

Segn la OTA-USA (1981), la OECD (1982) y la CEPA-Canad (1985),


la biotecnologa es la aplicacin de la ciencia y la ingeniera en el uso
directo o indirecto de organismos vivos o parte de ellos, en sus formas
naturales o modificadas, en una forma innovadora para la produccin de
bienes y servicios o para la mejora de procesos industriales existentes.
Desde este punto de vista se evidencia una integracin entre las
ciencias bsicas con las ciencias aplicadas puesto que se pretende
emplear de forma controlada y deliberada agentes biolgicos sencillos
como clulas vivas o muertas, o componentes celulares en operaciones
tcnicamente beneficiosas, bien sea de fabricacin de productos o
como operaciones de servicios.
Para responder a los planteamientos de la anterior definicin la
biotecnologa debe considerarse como un rea del conocimiento
intensamente interdisciplinar, caracterizada por la reunin de conceptos

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y metodologas procedentes de numerosas ciencias para aplicarlas tanto


a la investigacin bsica como a la resolucin de problemas prcticos y
la obtencin de bienes y servicios.
Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnologa
son: La Microbiologa, Embriologa, Bioqumica, Gentica, Biologa
celular, Qumica, Mecnica, Electrnica, Informtica. Entre otras.
En conclusin, la biotecnologa surge como un espacio de recombinacin
de conocimiento de diversas reas del conocimiento que pretende dar
soluciones a los problemas relacionados con la medicina, la agronoma,
zootecnia, la agroindustria, la ingeniera de alimentos, problemas
ambientales, entre otros campos. Es as entonces, que el aporte de la
biotecnologa se produce en dos etapas, en la primera, segn Cruz
Lage (2004) la investigacin cientfica bsica que se coloca por delante
de la innovacin tecnolgica, exponiendo todo su valor predictivo y
transformador, adems de su capacidad explicativa. No hay desarrollo
en esta rama sin investigacin cientfica. La segunda fase, se caracteriza
por el desarrollo de un sistema estandarizado de mtodos secuenciales
entre los cuales se identifican claramente las relaciones y
procedimientos operacionales que condicionan el xito del proceso.

AUTOEVALUACIN.

Realice un mapa conceptual sobre el concepto de Biotecnologa

Leccin 2: Historia de la biotecnologa


La Biotecnologa como ciencia interdisciplinar, surge desde diversas
reas del conocimiento y de la aplicacin espontnea para la obtencin
de bienes y servicios desde sus primeras pocas, por lo tanto mucho de
su desarrollo est ntimamente ligado con el desarrollo e historia de las
Ciencias. Como La biologa, la microbiologa, la bioqumica y obviamente
al desarrollo tecnolgico.
Si bien es cierto, en las primeras etapas de la historia de la humanidad
se
utilizaron los seres vivos o productos derivados de ellos para
atender las necesidades del hombre tales como el vino y el pan, entre
otros; estos productos no pueden considerarse como un resultado de
procesos biotecnolgicos, puesto que en este estadio de desarrollo las
fermentaciones son procesos naturales que no involucran la

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manipulacin de los sistemas biolgicos para modificar o controlar las


propiedades del producto obtenido. Sin embargo, esta es una larga
etapa de prembulo caracterizada por las ideas vitalistas o animistas
que desde un enfoque dialctico motivan el desarrollo de mtodos
experimentales que buscan predecir, explicar y transformar los
fenmenos biolgicos para obtencin de bienes y servicios, que finaliza
con la consolidacin de la moderna Biotecnologa en el siglo XX I.

Para comprender la historia de la Biotecnologa es preciso dividirla en


cuatro fases.
Primera poca o era precientfica: corresponde a la poca anterior a
Pasteur y sus comienzos se confunden con los de la humanidad. En esta
poca, se realizan prcticas empricas de seleccin de plantas y
animales y sus cruzas, y fermentaciones como un proceso para
preservar y enriquecer el contenido protenico de los alimentos. Este
perodo se extiende hasta la segunda mitad del siglo XIX y se
caracteriza como la aplicacin artesanal de una experiencia resultante
de la prctica diaria. Era tecnologa sin ciencia subyacente en su
acepcin moderna. Como ejemplos concretos cabe mencionar las
aplicaciones en :
La domesticacin de plantas y animales ya comenz en el perodo
Neoltico.
Las civilizaciones Sumeria y Babilnica (6000 aos a.C.) ya
conocan cmo elaborar
cerveza.
Los egipcios ya saban fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000
a.C.
Antes de la escritura del libro del Gnesis, se disfrutaba del vino en el
Cercano Oriente: recurdese que, segn la Biblia, No "sufri" (o
disfrut) accidentalmente los efectos de la fermentacin espontnea del
mosto de la uva (primera borrachera con vino)
Se podra afirmar que esta era pre-cientfica termina en el siglo XVIII
cuando cobra cuerpo la idea de que la materia viva puede ser estudiada
como la materia inanimada, es decir, usando el mtodo experimental,
con lo que se inicia el lento declive de las ideas vitalistas (creencias
errneas de que "la vida depende de un principio vital irreducible a otras
ramas de la ciencia"), que an daran sus ltimos estertores casi al final
del siglo XIX.

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Segunda poca
El trabajo preliminar de los
primeros microscopistas, como van
Leeuwenhoek y Hooke (siglo XVII), facilit un par de siglos ms tarde,
la comprensin, de la verdadera importancia de las clulas procariticas
y eucariticas, en procesos relacionados con la fermentacin y en el
origen de las enfermedades infecciosas.
Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia
microbiolgica fue el establecimiento de la relacin que une ciertas
transformaciones qumicas que se dan en las infusiones con el
crecimiento de los grmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en
1836, y Schwann y Ktzing en 1837 haban sugerido que las levaduras
eran las causantes de la fermentacin alcohlica por la que el azcar
pasa a alcohol etlico y dixido de carbono, pero se encontraron con la
crtica adversa de los grandes qumicos de la poca (Berzelius, Wohler y
Liebig). Liebig, hacia 1840, haba realizado importantes confirmaciones
a la "teora mineral" sobre la nutricin de las plantas, enfrentndose a la
"teora del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas
vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las
levaduras como plantas microscpicas, se supona que los procesos de
fermentacin y putrefaccin se deban a fenmenos qumicos de
descomposicin y muerte encuadrables en el marco de la teora mineral
de la fisiologa vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se
poda explicar en trminos de qumica y fsica retras por algn tiempo
la adscripcin de estos fenmenos a clulas vivas.
Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades
pticas de los cristales de tartrato, vena suponiendo que estos
compuestos tenan un orgen orgnico) quien de nuevo intervino en el
debate de forma decisiva. En 1857 demostr que los agentes de la
fermentacin lctica eran microorganismos, trabajando sobre un
problema que haba surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus
cubas la fermentacin alcohlica se vio sustituida por una indeseable
fermentacin lctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que
habra de durar hasta 1876, en los que Pasteur identific distintos
microorganismos responsables de diferentes clases de procesos
fermentativos. As, en 1860 adscribe inequvocamente la fermentacin
alcohlica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus tudes sur le
vin resume sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiologa
Aplicada, una de las primeras derivaciones prcticas no empricas
emanadas de la Biologa. A finales del siglo XIX eminentes bilogos
como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su
actividad en industrias y destileras.

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Trabajando sobre los agentes de la fermentacin butrica, Pasteur


descubri la presencia de microorganismos que se desarrollaban en
ausencia de oxgeno, lo cual desmenta la creencia de que todas las
formas de vida necesitan aire para crecer. Acu los trminos aerobiosis
y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia
y en ausencia de oxgeno.
Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendi
las distintas implicaciones energticas subyacentes a la utilizacin de
sustratos orgnicos en presencia y en ausencia de oxgeno,
demostrando que, en el segundo caso el rendimiento (medido como
crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la
degradacin total de las correspondientes sustancias.
Una profundizacin en los fenmenos de fermentacin lleg cuando en
1897 Buchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparacin enzimtica
(zimasa) que era capaz de realizar la misma transformacin de
"fermentacin" que las clulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba
las propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia
de los enfoques qumico y biolgico: las fermentaciones eran procesos
qumicos catalizados por enzimas presentes dentro de clulas vivas, que
podan ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioqumica,
nacida como una rama de la qumica fisiolgica, que se vena
especializando en la enzimologa, encontr una alianza fructfera y
duradera con la joven Microbiologa, estableciendo las bases enzimticas
y metablicas de muchos procesos de fermentacin. De esta forma se
desarrollaron
procedimientos industriales para producir enzimas
(invertasa, proteasas, amilasas, etc.). y el siguiente descubrimiento por
parte de Buchner de la capacidad de las enzimas, extradas de las
levaduras, de convertir azcares en alcohol.

Tercera poca
En la historia de la biotecnologa se caracteriza por desarrollos en cierto
sentido opuestos, ya que por un lado la expansin vertiginosa de la
industria petroqumica tiende a desplazar los procesos biotecnolgicos
de la fermentacin, pero por otro, el descubrimiento de la penicilina por
Fleming en 1928, sentara las bases para la produccin en gran escala
de este antibitico con el fin de satisfacer las demandas generadas en la
II Guerra Mundial, en esa poca, la produccin de penicilina es el
resultado de avances importantes en tcnicas de esterilizacin a gran
escala, mejora de las instalaciones de fermentacin, comprensin y
control de procesos de fermentacin (incluyendo temperatura, pH,

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aireacin), entre otros. A partir de entonces se disearon estrategias


para mejorar genticamente las cepas microbianas industriales.
Desde esa poca, las tcnicas de ingeniera qumica, aliadas a la
microbiologa y a la bioqumica, permiten la produccin masiva de
antibiticos, cidos orgnicos, esteroides, polisacridos y vacunas.

Estos desarrollos dieron un gran impulso a la aplicacin de las tcnicas


de fermentacin en la industria alimenticia y al desarrollo industrial de
productos como las levaduras, los cidos ctricos y lcticos y,
finalmente, al desarrollo de una industria qumica para la produccin de
acetona, "butanol" y glicerol, mediante el uso de bacterias. Las dcadas
de los 60 y 70 vieron la mejora de procesos de obtencin de pequeos
metabolitos como nuclesidos, aminocidos y vitaminas.

Los procesos de fermentacin experimentaron mejoras con las tcnicas


de inmovilizacin de clulas y enzimas en soportes, y con la
fermentacin continua para obtener protena de clulas sencillas
(biomasa microbiana). As mismo los polmeros microbianos como
xantanos y dextranos se obtuvieron industrialmente, con aplicaciones en
el campo de la alimentacin (como aditivos). Y se abri la posibilidad de
cultivar cada cepa microbiana sin mezclas con otras: cultivos puros en
medios de cultivo de laboratorio
Cuarta poca.
Es la actual. Se inicia con el descubrimiento de la doble estructura axial
del cido "deoxi-ribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953,
seguido por los procesos que permiten la inmovilizacin de las enzimas,
los primeros experimentos de ingeniera gentica realizados por Cohen y
Boyer en 1973 y aplicacin en 1975 de la tcnica del "hibridoma" para la
produccin de anticuerpos "monoclonales", gracias a los trabajos de
Milstein y Kohler.(1983). Estos importantes descubrimientos han dado
lugar a numerosos trabajos de mejoramiento gentico tanto en plantas
como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a partir de
clulas madre, y el importante acontecimiento de la aparicin de la
oveja Dolli en el contexto cientfico, que dio un vuelco total al concepto
de Biotecnologa.

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Autoevaluacin: La Biotecnologa evidencia como una integracin


entre las ciencias bsicas con las ciencias aplicadas puesto que se
pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes biolgicos
sencillos como clulas vivas o muertas, o componentes celulares en
operaciones tcnicamente beneficiosas, bien sea de fabricacin de
productos o como operaciones de servicios.
Segn lo anterior:

Se puede afirmar, qu la fabricacin de vino en la poca


antigua es Biotecnologa?

Cules son los ejes tericos que sustentan la Biotecnologa.


La obtencin de azcar a partir de la caa, se podra
considerar un proceso de Biotecnologa? Cules seran
los puntos a tener en cuenta para considerar esta
prctica como tal.

Leccin 3:

Divisiones y tipos de la Biotecnologa

En la historia de la Biotecnologa se puede apreciar que las tcnicas y


procedimientos utilizados han tenido una aplicacin rpida en reas tan
diversas como la agricultura, la industria alimenticia, la farmacutica,
los procesos de diagnstico y tratamiento mdico, la industria qumica,
la minera y la informtica, Como se puede apreciar existe una amplia
gama de campos de aplicacin y en todos ellos se han generado un
amplio nmero de productos y servicios. Sin embargo, es de sealar que
todos los procesos de innovacin tecnolgica se caracterizan
generalmente por presentar tres ncleos cientficos John Smith (1996):
1. obtencin del mejor catalizador biolgico para una
funcin o proceso especfico: En la mayora de los casos,
el catalizador biolgico son clulas vivas, sobre todo
microorganismos. Por ello, uno de los pilares de la
biotecnologa es precisamente la microbiologa (entendiendo
esta en sentido amplio de biologa microbiana). Parte de lo
que hemos aprendido sobre el manejo de microorganismos
se puede aplicar, con modificaciones, al manejo de clulas
de animales y plantas, que cada vez son ms importantes en
la biotecnologa. Varias son las caractersticas que hacen
atractivos a los microorganismos:

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2. obtener el mejor ambiente para la funcin de ese


catalizador biolgico, mediante una serie de diseos
tcnicos en los que es fundamental la ingeniera qumica El
segundo componente o ncleo de las biotecnologas estriba
en el entorno industrial en que ponemos a funcionar las
clulas o las enzimas. Esto nos lleva al concepto de
biorreactor, un entorno cerrado y controlado para que
nuestros catalizadores biolgicos hagan lo que queremos con
la mxima eficiencia. En esta parte de la biotecnologa se
requiere la colaboracin estrecha entre los bilogos y los
ingenieros de bioprocesos, incluyendo los ingenieros
qumicos. Se trata de disear biorreactores o fermentadores,
especies de cubas cerradas diseadas para controlar
diversos parmetros que condicionan la buena produccin:
temperatura, aireacin, pH, etc

3. procesamiento del material, consistente en separar y


eventualmente purificar el material biolgico producido:
quizs esta es el rea ms desconocida y compleja, el
procesamiento de la biomasa o de la sustancia producida:
separacin de las clulas respecto del medio acuoso en que
han funcionado, recuperacin eficiente del producto
buscado, purificacin, entre otros procedimientos.
Atendiendo a los planteamientos anteriores la biotecnologa la podemos
clasificar bajo dos enfoques, el primero, de acuerdo con el nivel de
tecnologa utilizado en la obtencin de productos, y el segundo, segn el
campo de aplicacin del producto o servici
De acuerdo al primer enfoque, las nuevas biotecnologas generalmente
se agrupan en tres categoras bsicas:
Tcnicas para el cultivo de clulas y tejidos.
Procesos biotecnolgicos, fundamentalmente de fermentacin, y
que incluyen la tcnica de inmovilizacin de enzimas. (Osorio M.
2005)
Tcnicas para la manipulacin, modificacin y transferencia de
materiales genticos (ingeniera gentica).
Aunque estos tres grupos se complementan entre s, existe una
diferencia fundamental entre los dos primeros y el tercero. Los primeros
se basan en el conocimiento de las caractersticas y comportamiento de

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los microorganismos y en el uso deliberado de estas caractersticas (de


cada organismo en particular), para el logro de objetivos especficos
como la obtencin
de nuevos productos o procesos. La enorme
potencialidad del ltimo grupo se deriva de la capacidad de manipular,
las caractersticas estructurales y funcionales de los organismos y de
aplicacin prctica de esta capacidad para superar ciertos lmites
naturales en el desarrollo de nuevos productos o procesos.

A diferencia de la primera clasificacin, que seala las tcnicas


propiamente tales, la segunda se refiere tambin a las actividades
econmicas en las que se hace uso de dichas tecnologas. La nueva
biotecnologa crea nuevos procesos y nuevos productos en diversas
reas de la economa. Como estos procesos se basan en los mismos
principios, ya sea que se apliquen en un sector econmico o en otro, ello
introduce cierto grado de flexibilidad, ya que permite la movilidad entre
diferentes sectores. Por ejemplo, los procesos de fermentacin pueden
aplicarse para la produccin, en gran escala, de alcohol o de antibiticos
como la penicilina, o en escalas menores para la produccin de
aminocidos en la industria farmacutica. Esto facilita la, movilidad de
factores productivos y tiene impacto sobre la calificacin de la mano de
obra, la cual, aun cuando deber adaptarse a este nuevo perfil
tecnolgico (tanto en trminos, cuantitativos como cualitativos)
posiblemente logre al mismo tiempo una mayor facilidad de empleo.

Tipos de Biotecnologa: Dependiendo del campo de aplicacin del


servicio o producto obtenido la biotecnologa se ha clasificado en:
Biotecnologa Microbiana: La biotecnologa microbiana o como se
llamaba anteriormente microbiologa industrial se refiere a los procesos
donde participan los microorganismos para la obtencin de productos o
metabolitos de inters humano.
La microbiologa industrial comenz con los procesos de fermentacin
alcohlica por ej. La fermentacin del vino y de la cerveza. Ms tarde se
desarrollaron los procesos microbianos para la produccin de agentes
farmacuticos como los antibiticos, la produccin de aditivos
alimentarios como los amino cidos, para la produccin de enzimas y
sustancias qumicas industriales como el butanol, el acido ctrico, entre
otros.
En la actualidad estamos en una nueva era de la tecnologa microbiana
con el advenimiento de la tecnologa de genes. La tecnologa gentica

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permite que un microorganismo procesado genticamente fabrique


sustancias que normalmente no sera capaz de producir, es as como
utilizando ingeniera gentica se ha podido producir insulina por una
bacteria introduciendo el gen de la insulina humana en la bacteria
Escherichia coli.
Podemos dividir a la biotecnologa microbiana en dos fases distintas:
1) La tecnologa microbiana tradicional, que implica la fabricacin a gran
escala de productos que los microorganismo son capaces de fabricar
normalmente. En este caso la tarea del microbilogo consiste en
modificando el organismo o el proceso para aumentar el rendimiento del
producto deseado.
2) La tecnologa microbiana con organismos alterados mediante
procesos de ingeniera, es decir microorganismos en los cuales se ha
insertado genes extraos. En esta nueva tecnologa el microbilogo
industrial trabaja estrechamente asociado con el ingeniero gentico en
el desarrollo de un organismo adecuado que no solo produzca el
producto de inters, sino que tambin pueda ser cultivado en la escala
necesaria para su explotacin comercial. (Brook y Scaligan ,2002)
Biotecnologa Agrcola vegetal: Con las tcnicas de la biotecnologa
moderna, es posible producir ms rpidamente que antes, nuevas
variedades de plantas con caractersticas mejoradas, produciendo en
mayores cantidades, con tolerancia a condiciones adversas, resistencia a
herbicidas especficos, control de plagas, cultivo durante todo el ao.
Problemas de enfermedades y control de malezas ahora pueden ser
tratados genticamente en lugar del uso de qumicos. Una planta
modificada por ingeniera gentica, que contiene ADN de una fuente
externa, es un organismo transgnico. Un ejemplo de planta transgnica
es el tomate que permite mantenerse durante ms tiempo en los
almacenes evitando que se reblandezcan antes de ser transportados
Algunos pases desarrollados como Estados Unidos y a sus
multinacionales, defienden el uso de la biotecnologa y pone de relieve
la importancia de su industria, que crea nuevos puestos de trabajo y
fomenta la innovacin tecnolgica y podra acabar con el hambre del
mundo. En Europa, los casos de Soja y Maz transgnicos resultan de
especial relevancia. La soja se utiliza en un 40 a 60% de los alimentos
procesados: aceite, margarina, alimentos dietticos e infantiles,
cerveza, etc. Espaa importa de EEUU 15 millones de toneladas, el
cuarto pas importador detrs de Japn, Taiwan y Holanda.
La comercializacin del maz transgnico est autorizada en EEUU,
Canad, Japn y tambin en la Unin Europea desde Enero de 1997.

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China planea plantar tomates, arroz, pimientos y patatas por lo menos


en la mitad de todas sus tierras de labor (500.000 kilmetros
cuadrados) en el plazo de cinco aos. Sus investigadores analizaron el
efecto de los pimientos y los tomates transgnicos en ratas de
laboratorio, comparando el peso y el estado de los mismos con los de
otros no alimentados, y no observaron diferencias significativas.
Para profundizar en este tema haga clic aqu:
alimentacin y la agricultura

La biotecnologa en la

Biotecnologa animal: Esta ha experimentado un gran desarrollo en


las ltimas dcadas. Las aplicaciones inciales se dirigieron
principalmente a sistemas diagnsticos, nuevas vacunas y drogas,
fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento,
entre otros procedimientos. Los animales transgnicos como el "ratn
oncognico" han sido muy tiles en trabajos de laboratorio para estudios
de enfermedades humanas.

Existen tres reas diferentes en las cuales la biotecnologa puede influir


sobre la produccin animal:
-El uso de tecnologas reproductivas
-Nuevas vacunas y
-cultivos celulares que producen hormonas.
En animales tenemos ejemplos de modelos desarrollados para evaluar
enfermedades genticas humanas, el uso de animales para la
produccin de drogas y como fuente donante de clulas y rganos, por
ejemplo el uso de animales para la produccin de protenas sanguneas
humanas o anticuerpos.
Para las enfermedades animales, la biotecnologa provee de numerosas
oportunidades para combatirlas, y estn siendo desarrolladas vacunas
contra muchas enfermedades bovinas y porcinas, que en los ltimos
tiempos han hecho mella en estos animales.
Biotecnologa Humana Las tcnicas del ADN estn siendo utilizadas
para determinar relaciones familiares en litigios de paternidad, para
confrontar donantes de rganos con receptores en programas de
trasplante, unir sospechosos con la evidencia de ADN en la escena del
crimen (biotecnologa forense).

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El desarrollo de tcnicas para el diagnstico de enfermedades


infecciosas o de desordenes genticos es una de las aplicaciones de
mayor impacto de la tecnologa de ADN. Al utilizar las tcnicas de
secuenciacin de ADN los cientficos pueden diagnosticar infecciones
vricas, bacterianas o mapear la localizacin especfica de los genes a lo
largo de la molcula de ADN en las clulas.
El primer tratamiento exitoso en terapia gnica fue en 1990, cuando se
trat una enfermedad del sistema inmune de nios llamada "Deficiencia
de ADA". Clulas sanguneas con los genes correctos de ADA fueron
inyectadas al cuerpo del paciente donde produjeron suficientes clulas
normales que permitieron mejorar el sistema inmune.
Hoy, la terapia gnica esta tratando enfermedades tales como tumores
cerebrales malignos, fibrosis qustica y HIV. Con esta tcnica se
pretende tambin reparar rganos, como por ejemplo un hgado
cirrtico a partir de las pocas clulas sanas que le quedan, un par de
ventrculos nuevos para reemplazar los efectos devastadores de un
infarto, la regeneracin de una mano amputada o disponer de una
fuente inagotable de neuronas para corregir los efectos de
enfermedades tan graves como el Alzheimer o el mal de Parkinson.
Leccin 4.
colombiano.

Impacto

de

la

Biotecnologa

en

el

contexto

Su impacto ha alcanzado varios sectores productivos: agricultura,


industria de alimentos, industria farmacutica, bioindustria, entre otros.
Aumentando la productividad y la competitividad con la generacin de
nuevos productos, por lo cual se han convertido en parte clave del
crecimiento de la economa en la mayora de los pases industrializados
y algunos pases en desarrollo. En general, el alto valor agregado que se
genera con la moderna Biotecnologa, particularmente
a nivel
farmacutico, est determinado por su novedad y especificidad de uso
en consumo humano. Osorio, (1995)
En Colombia el avance de la moderna biotecnologa en los ltimos diez
aos ha comenzado a generar algunos productos, particularmente en el
sector agrcola. Existen cerca de 70 instituciones entre estatales y
privadas, que involucran biotecnologa en sus procesos de investigacin
y/o produccin.
En el sector agrcola se ha avanzado en tcnicas de cultivo de tejidos
vegetales in vitro, en el estudio y uso sostenible de microorganismos
con el fin de buscar alternativas de control biolgico de enfermedades y
plagas y se estn realizando algunos trabajos en mejoramiento gentico
de plantas de papas, pasifloras, entre otros basados en el ADN

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recombinante. Se observan trabajos escasos a nivel de estudios de


diversidad gentica en especies silvestres del pas, los cuales se
desarrollan para identificar nuevos genes tiles en el mejoramiento de
variedades comerciales y para aumentar la eficiencia y calidad de los
bancos de germoplasma existentes en el pas.
En el sector pecuario, la aplicacin de la biologa se limita a la
produccin de vacunas y a la bsqueda de razas mejoradas mediante la
implantacin de embriones. Actualmente se estn realizando trabajos de
investigacin en la estandarizacin de kits de diagnstico de
enfermedades serolgicas y moleculares, vacunas sintticas y aplicacin
selectiva de microorganismos relacionados con la nutricin animal
mejorada. A nivel de diversidad gentica de especies nativas los
trabajos son discontinuos y aislados.
En el sector de la salud humana se desarrollan proyectos de
investigacin con produccin de kits serolgicos y moleculares para el
diagnstico rpido de enfermedades
tropicales y se estudian los
espectros de variabilidad existentes por ejemplo, enfermedad de
Chagas.
En el sector agroindustrial y de la alimentacin animal, la Biologa es
aplicada para generar productos lcteos, bebidas fermentadas,
destilacin de fermentaciones etanlicas para la elaboracin de licores,
produccin de levaduras por fermentacin y produccin de materias
primas como cido ctrico y solventes orgnicos. Este sector utiliza
fundamentalmente mtodos biotecnolgicos tradicionales.
En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel
del tratamiento de aguas residuales industriales como lodos activados y
biofiltros, mtodos de descontaminacin de los derramamientos de
petrleo mediante el uso de microorganismos nativos o transformados
genticamente. Algunos trabajos de investigacin cientfica se estn
realizando sobre biodigestores de alta calidad. Sin embargo, el
desarrollo nacional en este sector es todava discreto.

La diversidad biolgica de Colombia es una ventaja comparativa que al


ser usada sosteniblemente puede apoyar el desarrollo del sector
productivo. As mismo constituye una respuesta a problemas de
seguridad alimentaria, sostenibilidad de aguas, suelos y aire, as como
un elemento de negociacin poltica internacional y fortalecimiento de la
soberana. Por estas razones, su conocimiento, conservacin y uso
sostenible es prioritario. Sin embargo, como se observa con el estado de
la biotecnologa en Colombia, los avances en estos campos son muy

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pequeos comparativamente con otros pases de Amrica Latina como


Costa Rica, Brasil y otros del mundo .
Con relacin a los bio-recursos, Colombia es un pas privilegiado ya que
se encuentra entre uno de los pases de mayor diversidad biolgica del
planeta por rea. Sin embargo, para aprovechar ese potencial, el pas
debe desarrollar la capacidad cientfica y tcnica que le permita
explorar, conocer, estudiar, investigar, valorar, conservar y desarrollar
esos biorrecursos como un patrimonio altamente productivo y no
simplemente como una diversidad ecolgica, social y econmicamente
improductiva.
Leccin 5: Tendencias de la Biotecnologa
A nivel mundial el inters por la biotecnologa es indudable, como se ve
a travs del, frecuente abordaje de tales temas en los peridicos, libros
y medios de comunicacin.
Algunos descubrimientos tiles sern una consecuencia directa del uso
de las tcnicas de ingeniera gentica que logren transferir determinados
genes (a veces incluso genes humanos) a un determinado
microorganismo apropiado, para hacer el producto que es precisamente
requerido en el mercado. Determinadas protenas humanas y algunos
enzimas requeridos en Medicina se conseguirn de esta forma, en el
futuro. Otros muchos beneficios, sern el resultado de la fabricacin
mediante tcnicas de fermentacin, de anticuerpos especficos para,
fines analticos y teraputicos. Estos anticuerpos monoclonales se
producirn mediante el
uso de microorganismos en grandes
fermentadores, como por ejemplo la produccin de antibiticos como la
penicilina.
Se estn desarrollando en la actualidad, importantes descubrimiento y
aplicaciones comerciales en cada uno de los campos de la Biotecnologa,
incluyendo las que tienen lugar en las industrias de fermentacin, la
biotecnologa de los enzimas y clulas inmovilizadas, el tratamiento de
residuos y la utilizacin de subproductos. Aquellos procesos que resulten
productivos sern tiles a la sociedad, atractivos para la industria por
motivos comerciales y en algunos casos recibirn el apoyo de los
respectivos gobiernos.

Una gran potencialidad de la biotecnologa se da en el campo de la


investigacin y el desarrollo cientfico, ya que proporciona herramientas
que permiten una mejor comprensin de los procesos fisiolgicos, por
ejemplo, del sistema inmuno-defensivo, o que reducen, en forma

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considerable, los plazos de la I y D, facilitando as los procesos de


innovacin tecnolgica. A su vez, con el advenimiento de nuevas
tcnicas en el campo biolgico, la actividad de la I y D en este campo
tiende a hacerse cada vez ms cientfica y menos emprica,
acentundose as las caractersticas de intensidad cientfica propias de la
biotecnologa.
Resulta claro que siendo la biotecnologa un sistema de diversas
innovaciones cientfico-tecnolgicas interrelacionadas, no todas ellas
evolucionan al mismo ritmo. Las condiciones de mercado, las
expectativas de beneficios, aspectos organizativos y de gestin, entre
otros, favorecen la rpida puesta en marcha y difusin de algunas de
estas tecnologas, relegando a otras. La literatura sobre la innovacin
tecnolgica acostumbra distinguir entre aquellas innovaciones que
surgen como respuesta a una situacin de mercado, y a expectativas de
beneficios econmicos, de aqullas que se originan en el rea de I y D
como resultado de un proceso continuo y acumulativo de desarrollo
cientfico-tecnolgico. En el primer caso se habla de "demand or marketpull" y en el segundo, de "technological-push". Ha sido frecuente, en los
ltimos tiempos, sealar el lser y la biotecnologa como ejemplos del
segundo tipo de innovacin. Es decir, descubrimientos cientficos a los
que se arriba sin una aplicacin especfica predeterminada en mente,
pero que luego encuentran una gama considerable de aplicaciones
prcticas.

Sin embargo, pareciera ms correcto considerar ambos actores, el


inherente proceso cientfico-tecnolgico y aqul que corresponde a
incentivos econmicos, como complementarios. As, en el caso de la
biotecnologa, aun cuando sta nace e el mbito de la I y D, de las
muchas aplicaciones posibles, las que se desarrollan primero son
aquellas que ofrecen expectativas de importantes beneficios econmicos
en un plazo ms menos breve.

En la agricultura, la biotecnologa se orienta a la superacin de los


factores limitantes de la reduccin agrcola a travs de la obtencin de
variedades de plantas tolerantes a condiciones ambientales negativas
(sequas, suelos cidos), resistentes a enfermedades y pestes, que
permitan aumentar el proceso fotosinttico, la fijacin de nitrgeno o la
captacin de elementos nutritivos. Tambin se apunta al logro de
plantas ms productivas y/ o ms nutritivas, mediante la mejora de su
contenido protenico o aminocido.

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Un desarrollo paralelo es la produccin de pesticidas (insecticidas,


herbicidas y fungicidas) microbianos. Las tcnicas que ya se emplean, o
que estn desarrollndose, van desde los cultivos de tejidos, la fusin
protoplasmtica, el cultivo in vitro de "meristemas", la produccin de
ndulos de "rhizobium" y "micorizas", hasta la ingeniera gentica para
la obtencin de plantas de mayor capacidad fotosinttica, que puedan
fijar directamente nitrgeno, resistentes a plagas y pestes, etc. El
cultivo de tejidos consiste en la regeneracin de plantas completas a
partir de una masa amorfa, de clulas, que se denomina "callo".
En su forma ms general, se aplica a todo tipo de cultivo "in vitro",
desde simples unidades indiferenciadas hasta complejos multicelulares y
rganos. El proceso consiste en la incubacin, en condiciones
controladas y aspticas, de una clula o parte de un tejido vegetal
(hoja, tallo, raz, embrin, semilla, "meristema", polen, etc.) en un
medio que contiene elementos nutritivos, vitaminas y factores de
crecimiento (Osorio, 2005)

La magnitud del mercado potencial agrcola para la biotecnologa es, en


gran medida materia de especulacin debido precisamente a la falta de
un conocimiento detallado de muchas de estas condiciones locales. En
este campo, la biotecnologa est orientada a la utilizacin en gran
escala de "biomasa" para la produccin de materias primas orgnicas,
que
actualmente
se
obtienen
mediante
procesos
qumicos
convencionales. Las ventajas son que la "biomasa" es un recurso
altamente subutilizado y relativamente barato., ya que en gran parte
esta constitudo por residuos y desechos de plantaciones forestales y de
cultivos en gran escala. Es adems un recurso renovable. Las principales
fuentes potencialmente disponibles para la produccin tanto de etanol
como de otros productos qumicos a granel son (aparte de las melazas
de la caa) cultivos como la yuca, el sorgo, las papas y el maz; los
sueros de la industria de la leche; los residuos de las plantaciones de
caf y, en general, todo tipo de residuo celuloso.

Actualmente la biotecnologa est siendo aplicada en gran escala en la


produccin de alcohol (etanol), como combustible sustituto del petrleo,
fundamentalmente en el Brasil y en menor medida en Estados Unidos y
la India. En el Brasil, la produccin se logra a partir de melazas de la
caa de azcar, mientras que en Estados Unidos se usa el maz. Otro
producto importante es el cido ctrico. Los principales productores son

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los Estados Unidos, Italia, Blgica y Francia que utilizan como materia
prima melazas de remolacha. La importancia que tiene cada una de las
aplicaciones mencionadas es incuestionable desde el punto de vista
econmico.
A pesar que en el siglo XX, cuando la Gentica haba resuelto el misterio
de la naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que haba
para actuar sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y
animales de la misma especie (o de especies similares), seleccin de los
individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y
lento), mutaciones con agentes fsicos (rayos UV, rayos X) o qumicos,
con ulterior bsqueda (seleccin o rastreo -screening) de alguna
variante de inters (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc.
Debimos esperar a la dcada de los 70 para que surja un conjunto de
tcnicas de laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten
"tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la vida. Son tcnicas y
herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a
diseos previos y objetivos concretos (de ah el nombre popular de
Ingeniera Gentica).
La Ingeniera Gentica (I.G.), mejor llamada tecnologa del ADN
recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y
empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando
nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones
que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos
hospederos, para nuestro provecho.
Teniendo en cuenta lo anterior se puede inferir que las tendencias
cientficas mundiales a todos los niveles y clasificacin de la
Biotecnologa, se han concentrado en seis aspectos:
-

Cultivos de tejidos y clulas para: la rpida micropropagacin "in


vitro" de plantas, la obtencin de cultivos sanos, el mejoramiento
gentico por cruza amplia, la preservacin e intercambio de
"germoplasma", la "biosntesis" de "metabolitos" secundarios de
inters econmico y la investigacin bsica.

Metabolomica La manipulacin del metabolismo para inhibir unas


rutas biosinteticas o favorecer otras sin afectar la economa celular
con el propsito de obtener una mayor produccin del producto de
inters.

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El uso de
conservacin
determinados
separacin de

enzimas o fermentacin microbiana, para la


de materia primas definidas como sustratos en
productos, la recuperacin de estos productos, su
los caldos de fermentacin y su purificacin final.

Tecnologa del "hibridoma", que se refiere a la produccin, a partir


de "clones", de anticuerpos de accin muy especfica que reciben
el nombre de anticuerpos "monoclonales".

Ingeniera de protenas Proteomica, que implica la modificacin


de la estructura de las protenas para mejorar su funcionamiento o
para la produccin de protenas totalmente nuevas.

Ingeniera gentica o tecnologa del "ADN", que consiste en la


introduccin de un "ADN" hbrido, que contiene los genes de
inters para determinados propsitos, para capacitar a ciertos
organismos en la elaboracin de productos especficos, ya sean
estos enzimas, hormonas o cualquier otro tipo de protena u
organismo.

Bioinformtica, que se refiere a la tcnica basada en la utilizacin


de protenas en aparatos electrnicos, particularmente sensores
biolgicos y "bioships"; es decir, "microchips" biolgicos, capaces
de lgica y memoria.

A todo esto tenemos que aadir que un factor importantsimo en el


desarrollo de la biotecnologa es la evaluacin de la seguridad del
producto, sometida a controles rigurosos segn normativas nacionales e
internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede
convertir en limitante, de modo que las regulaciones estrictas
desincentivan ciertos desarrollos biotecnolgicos. Por todo ello, es
importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan ms de lo
que la evidencia cientfica sugiere, manteniendo en todo momento la
preservacin de la salud y el medio ambiente. A su vez, las regulaciones
reflejan la percepcin pblica de los riesgos y promesas de la
biotecnologa. Por ejemplo, hoy en Europa la percepcin pblica ha
logrado prcticamente una parada en las plantas transgnicas, a pesar
de los informes cientficos que dicen que en la mayor parte de los casos,
sus riesgos son similares a las plantas convencionales. La creacin o
elaboracin de este tipo de alimentos depende del nivel de desarrollo del
pas, de los intereses polticos del mismo y del grado de presin que
ejerzan las grandes industrias privadas del sector. Hay un gran debate
en torno a la conveniencia o no de este tipo de organismos.
Habr que llegar a un dilogo racional entre los diversos actores
(cientficos, empresas, consumidores, ecologistas, entre otros) para

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asegurar el correcto empleo de estas tecnologas, que por un lado no


impida aplicaciones benficas sin riesgos, y por otro regule
adecuadamente aquellos mbitos donde las dudas razonables hagan
recomendables ms restricciones. El ideal sera permitir todo aquello
que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de
prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados,
en buena parte imaginaciones y tergiversaciones de grupos de presin
que pueden esconder agendas polticas ocultas.

ACTIVIDADES DE AUTOEVALUACIN
Lectura 1. Aplicando el mtodo de Lectura Auto regulada IPLER;
Realice un ensayo de la siguiente lectura.
Los beneficios de la biotecnologa alimentaria
La biotecnologa ya nos est ayudando de muchas maneras:
Proteccin del medio ambiente. Los cientficos lograron que algunos
alimentos, como la papaya y la papa, sean ms resistentes a las plagas.
Estos cultivos necesitan ahora menos productos qumicos para estar
protegidos de insectos o virus dainos, lo que es mucho mejor para el
agua y la vida silvestre. Otros cultivos estn protegidos de los herbicidas
que se usan para controlar a las malezas. El mejor control de las
malezas permite que los agricultores conserven el suelo ya que no
tienen que arar la tierra con tanta frecuencia.
Mayores rendimientos. Los agricultores tambin usan la biotecnologa
para ayudar a las plantas a sobrevivir. Por ejemplo, las nuevas
variedades de maz y algodn rechazan a los insectos dainos, y la soya
mejorada puede tolerar los herbicidas. Los agricultores pueden esperar
mayores rendimientos de la cosecha en estas plantas ms resistentes.
Alimentos con mejor sabor y ms frescos. Pimientos ms dulces y
tomates que maduran ms despacio son slo dos ejemplos de cmo la
biotecnologa puede producir alimentos ms frescos y de mejor sabor.
El futuro de la biotecnologa
En el futuro, la biotecnologa podr ayudarnos a:
Cultivar ms alimentos en menor superficie. En la actualidad hay 6,000
millones de personas viviendo en la Tierra. Para el ao 2050, seremos
9,000 millones. Al usar la biotecnologa, los agricultores podrn
producir mayores cosechas en la misma superficie que utilizan en la

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actualidad. Si podemos obtener los alimentos que necesitamos de estos


cultivos, ya no tendremos que destinar ms superficie al cultivo. Los
pases en desarrollo sern los que ms se beneficien con esta tecnologa
moderna ya que en ellos se producir el mayor crecimiento de la
poblacin.
Mantener alimentos que sean seguros para comer. Los cientficos
podrn detectar con mayor precisin cules son los virus y bacterias
dainas que pueden hallarse en los alimentos. Por lo tanto, correremos
menos riesgos de contraer enfermedades transmitidas por los alimentos.
Obtener alimentos ms saludables. Mejorar algunos alimentos por
medio de la biotecnologa nos podr ayudar a disminuir nuestro riesgo
de contraer enfermedades crnicas como el cncer y afecciones
cardacas. Por ejemplo:
o Algunas frutas y verduras contendrn ms antioxidantes, Vitamina C y
Vitamina
E.
o Los aceites para cocinar se obtendrn de plantas que contendrn
menos
grasas
saturadas.
o Los cacahuates podrn contener menos cantidad de las protenas que
causan alergias.
Mantener seguros los alimentos para los animales. Algunos tipos de
hongos que se hallan en las sustancias que libera el maz pueden daar
a los animales que lo consumen. Estas sustancias ya estn reguladas en
los Estados Unidos y la biotecnologa representa otra herramienta que
ayudar a reducir la cantidad de estas sustancias presentes en el maz.
Elecciones: Arroz enriquecido
Muchas de las personas que viven en los pases en desarrollo raramente
consumen las vitaminas que necesitan. Por lo tanto, es posible que
tengan problemas de salud. Por ejemplo, la falta de Vitamina A causa
ceguera, y la falta de hierro puede ser daina para la salud de las
mujeres y los nios. Sin embargo, gracias a la biotecnologa, los
cientficos han descubierto una manera de agregar mayores cantidades
de Vitamina A y hierro al arroz. En los pases en que el arroz es uno de
los alimentos principales de la dieta, esta nueva variedad del cereal
puede llegar a proteger a la poblacin de la ceguera y de otros
problemas de salud.
La seguridad de la biotecnologa alimentaria
La Administracin de Alimentos y Frmacos (FDA) revisa la seguridad de
todos los alimentos que estn en el mercado. La FDA, la Agencia de

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Proteccin Ambiental (EPA), el Departamento de Agricultura de los


Estados Unidos (USDA) y la comunidad cientfica en general estn de
acuerdo en afirmar que los alimentos producidos aplicando la
biotecnologa son seguros. Los alimentos producidos utilizando mtodos
biotecnolgicos o convencionales deben satisfacer los mismos
estndares de seguridad.
La FDA regula los alimentos desarrollados utilizando la biotecnologa de
la misma manera en que regula los alimentos producidos por otros
mtodos.
La FDA garantiza la seguridad de estos alimentos y requiere un
etiquetado especial si es que el contenido nutricional del alimento se
modifica o si se adiciona una sustancia que puede causar alergias.
El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y la EPA tambin
ayudan a regular la biotecnologa agrcola para garantizar la seguridad.
Adems, despus de una completa revisin de la ciencia en 2002, la
Sociedad de Toxicologa lleg a la conclusin de que los alimentos
producidos aplicando mtodos biotecnolgicos son tan seguros como los
alimentos tradicionales.
Elecciones: Maz seguro para el medio ambiente
El maz mejorado biotecnolgicamente para que contenga menos fitato,
uno de sus componentes del mas, ayudar a reducir el impacto que
tienen los animales de granja en el medio ambiente. El maz con bajo
contenido de fitato puede reducir la cantidad de fsforo no deseado en
las deposiciones de los animales, lo que representa una potencial
amenaza para la calidad del agua.
Para ms informacin:
Usted puede obtener ms informacin sobre los alimentos y cmo se
producen de los profesionales de la salud, dietistas, nutrilogos,
agentes de informacin, agricultores locales y programas universitarios
que se dedican a estos temas. En los sitios de Internet que se
mencionan a continuacin hallar la informacin que necesita:
Servicio de Inspeccin de Salud de Animales y Plantas, Servicios
Regulatorios de Biotecnologa del Departamento de Agricultura de los
Estados Unidoshttp://www.aphis.usda.gov/brs/
Centro de Seguridad de los Alimentos y Nutricin Aplicada de la
FDAhttp://www.cfsan.fda.gov/
Agencia de proteccin ambiental (EPA) http://www.epa.gov

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La Asociacin Diettica de los Estados Unidos http://www.eatright.org


Consejo de Ciencia y Tecnologa Agrcola http://www.cast-science.org
Instituto de Tecnlogos de Alimentos http://www.ift.org
Sociedad de Toxicologa http://www.toxicology.org/
IFIC Foundation http://ific.org/food/biotechnology

CAPITULO 2: BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES

Leccin 6: Nutricin microbiana.


Las clulas contienen grandes cantidades de pequeas molculas as
como de macromolculas. La clula puede obtener la mayora de las
pequeas molculas que necesita del exterior o sintetizarlas a partir de
molculas ms simples. Las macromolculas, por el contrario, son
siempre sintetizadas en la clula.
Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son
utilizadas con fines energticos o plsticos se denominan como
nutrientes, en cualquier caso, los nutrientes deben suministrase en los
diferentes medios de cultivo.
Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes,
los que son requeridos en grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3)
factores de crecimiento que lo son solamente en pequeas cantidades.
Empezaremos

por

los

macronutrientes

mayoritarios:

carbono

nitrgeno
Macronutrientes: Prcticamente la totalidad de la masa celular est
formada por sustancias con cuatro tipos de tomos: Carbono, oxgeno,

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hidrgeno y nitrgeno. Estos cuatro elementos constituyen el esqueleto


de las macromolculas as como las molculas orgnicas pequeas.
La mayora de los procariotas requieren un compuesto orgnico de algn
tipo como fuente de carbono. Estudios nutricionales han demostrado
que muchas bacterias pueden asimilar varios compuestos de carbono
orgnico y utilizarlos para fabricar material celular. Un incontable
nmero de compuestos tales como aminocidos, cidos grasos, y
compuestos aromticos pueden ser usados por una bacteria u otra. En
peso seco, una clula tpica consta de aproximadamente 50% de
carbono

su

vez

este

es

el

elemento

mayoritario

de

las

macromolculas.
Despus del carbono, el siguiente elemento ms abundante en la clula
es el nitrgeno. Una bacteria tpica contiene aproximadamente el 12%
de nitrgeno (peso seco) y a su vez el nitrgeno es un componente
mayoritario de protenas, cidos nucleicos y otros constituyentes
celulares. El nitrgeno se encuentra en la naturaleza tanto en forma
orgnica como inorgnica. Sin embargo, la globalidad del nitrgeno
utilizable est en forma inorgnica, bien como amonaco (NH3), nitrato
(NH3-) N2. La mayora de las bacterias pueden utilizar amonaco y
muchas adems nitrato. El nitrgeno molecular (gas), sin embargo,
puede ser fuente de nitrgeno para un reducido grupo de bacterias
(bacterias fijadoras de nitrgeno).
Otros macronutrientes: P,S,K,Mg,Ca,Na,Fe
El fsforo acontece en la naturaleza en forma de fosfatos orgnicos o
inorgnicos y es

requerido por la clula para la sntesis de cidos

nuclecos y fosfolpidos. El azufre es fundamental por ser un elemento


estructural en los aminocidos cistena y metionina y porque est
presente en vitaminas tales como la tiamina, biotina, cido lipoico as

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como coenzima A. El potasio es necesario en todos los organismos. Una


gran diversidad de enzimas, incluyendo varias implicadas en la sntesis
de protenas, lo requiere especficamente. El magnesio estabiliza los
ribosomas, las membranas celulares, los cidos nucleicos y se requiere
tambin

para la actividad de muchas enzimas. El calcio (que no es

nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos),


ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y juega un papel
fundamental en la termorresistencia de la endospora bacteriana. El
sodio es requerido por algunos, pero no todos, microorganismos y
cuando lo es, es debido a la naturaleza qumica de su hbitat. El hierro
es requerido por las clulas en mayores cantidades que otros metales
traza y por ellos debe ser considerado como un macronutriente. El
hierro juega un papel fundamental en la respiracin celular, siendo un
componente clave de los citocromos, y de las protenas que contiene
hierro y azufre implicadas en el transporte de electrones. Debido a que
la mayor parte de las sales inorgnicas son altamente insolubles,
muchos microorganismos producen agentes que unen el hierro de una
manera muy especfica, denominados siderforos, que solubilizan las
sales de hierro trasportndolo al interior celular.
Micronutrientes (elementos traza)
Aunque

los

micronutrientes

son

requeridos

en

muy

pequeas

cantidades son, sin embargo, tan importantes como los macronutrientes


para la funcin celular. Los micronutrientes son metales, muchos de los
cuales forman parte de enzimas que son los catalizadores celulares.
Entre los micronutrientes ms importantes de sistemas vivos, que son
necesarios para el funcionamiento de enzimas estn: Cromo, Cobalto,
Cobre, Manganeso, Molibdeno, Nquel, Selenio, Tungsteno, Vanadio,
Zinc, Hierro.
Factores de crecimiento

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Estos son compuestos orgnicos que, como los micronutrientes, son


requeridos en muy pequeas cantidades y slo por algunas clulas. Los
factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminocidos, purinas y
pirimidinas. Aunque la mayora de los microorganismos son capaces de
sintetizar estos compuestos, otros microorganismos

requieren tomar

uno o ms compuestos preformados del medio ambiente.


Medios de cultivo
En microbiologa industrial se usan dos grandes grupos de medios de
cultivo: Los qumicamente definidos y los indefinidos (complejos).
Los medios qumicamente definidos se preparan aadiendo al agua
destilada cantidades precisas de compuestos orgnicos o inorgnicos
altamente purificados. Por ellos se conoce la composicin qumica
exacta. En muchos casos, sin embargo, el conocimiento exacto de la
composicin qumica no es crtico. En estas ocasiones los medios
complejos pueden ser suficientes, e incluso presentar ventajas sobre los
definidos. Los medios complejos emplean lisados de casena (protena
de la leche), de carne, de soja, de levadura o cualquier otra sustancia
altamente nutritiva (qumicamente indefinida): Tales lisados estn
disponibles comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados rpidamente
y disueltos en agua destilada para dar lugar a un medio. Sin embargo, cuando se
utilizan medio complejos hay que tener en cuenta que no se conoce la
composicin de nutrientes.
El metabolismo es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el
interior de la clula y que da lugar a la sntesis de material celular a partir de
sustancias nutritivas.
El metabolismo puede dividirse, para su mejor estudio, en tres aspectos diferentes
pero ntimamente ligados (figura 1) : el catabolismo (Metabolismos energtico) que
es la suma de reacciones exergnicas que permiten liberar la energa contenida
en los nutrientes o estratos y ser acumulada en forma de ATP u otros compuestos,

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el anfibolismo o metabolismo intermediario, que es el conjunto de reacciones en


que los productos de hidrlisis del catabolismo y algunos nutrientes son
transformados en cidos orgnicos , esteres fosfricos y otros compuestos como
aminocidos; el anabolismo o metabolismo biosinttico que es la parte del
metabolismo implicado en la sntesis de macromolculas-cidos nucleicos,
protenas sustancias de reserva y otros . Martinez, 1998: Madigan et al, 1999
Figura 1: Diferentes fases del metabolismo microbiano:

Leccin 7: Metabolismo energtico


Es tradicional agrupar a los microorganismos en clases metablicas
dependiendo de la fuente de energa que utilicen. Todos los trminos
utilizados para describir estas clases emplean la terminacin trofo que
deriva del griego y significa alimentarse. As, lo organismos que utiliza
luz como fuente de energa se llaman fototrofos (foto es luz en griego) y
los organismos que utilizan productos qumicos como fuente de energa
se denominan quimiotrfos. La mayor parte de los organismos que
estudia la microbiologa utilizan compuestos orgnicos como fuente de

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energa; pertenecen por tanto a los quimiotrfos y se denominan


quimiorganotrofos. Los organismos capaces de utilizar compuestos
inorgnicos como fuente de energa se denominan quimiolitotrofos
Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de
reacciones de oxidacin reduccin que implican compuestos orgnicos,
pueden contemplarse en dos grandes grupos: (1) Fermentacin, en
que los procesos de oxido reduccin ocurren en ausencia de aceptores
terminales de electrones aadidos; y (2) respiracin, en que el
oxgeno molecular u otros oxidantes sirven como aceptores terminales
de electrones.
Naturaleza de la fermentacin:
La fermentacin es el mecanismo ms simple y quizs el ms antiguo
desde el punto de vista evolutivo, de los procesos de obtencin de
energa. Se suponen que en las condiciones del mundo primitivo, donde
no exista oxgeno libre, ni los rayos del sol llegaban a su superficie, los
primero organismos solo podan obtener la energa a partir de la
contenida en los compuestos orgnicos.
Se puede definir entonces, la fermentacin como el proceso metablico
de generacin de ATP, en el cual los donantes y los aceptores de
electrones

son

molculas

orgnicas.

(Martinez,

J;

1995)

Los

compuestos que llevan acabo estas dos funciones son usualmente dos
metabolitos diferentes derivados de un sustrato fermentable simple
(como azcar, por ejemplo). En la fermentacin el sustrato da lugar a
una serie de compuestos, unos ms oxidados y otros ms reducidos; en
el proceso fermentativo mantiene un estricto balance O-R. El nivel de
oxidacin promedio de los productos finales es muy cercano al del
sustrato. De ah que la generacin de ATP asociada a la fermentacin se

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denomina fosforilacin a nivel de sustrato. la fermentacin posee tres


caractersticas:
1. En la fermentacin, tanto donantes como aceptores de electrones
son molculas orgnicas; en ocasiones es la misma molcula la
que se oxida y se reduce.
2. El proceso ocurre en ausencia de oxigeno
3. Existe un riguroso balance de C, O e H entre los sustratos y los
productos

Un ejemplo de fermentacin es el catabolismo de la glucosa por una


bacteria del cido lctico:

Glucosa

(C6H12O6)

2 lactatos +2 H+

2(C3H4O3- + 2CO2)

Ntese que sta es una reaccin balanceada y que los productos, lactato
ms protones, tienen la misma proporcin de tomos de hidrgeno y
oxgeno que la glucosa. Esta reaccin puede analizarse desde tres
puntos de vista: Termodinmicamente, por la energa de enlace y por el
metabolismo intermediario.
Desde el punto de vista termodinmico, las fermentaciones se
caracterizan por ser una suma de reacciones, al final de las cuales los
productos poseen un contenido energtico menor que el inicial. Si
analizamos la fermentacin a travs de la energa de enlace, tendremos
que en ella se producen reordenamientos moleculares en los que se
pasa de funciones de mayor contenido a funciones de menor contenido
energtico. As, en la mayora de las fermentaciones se pasa de grupos
carbonilo e hidroxilo a grupos carboxilo de menor contenido energtico.

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Existen tres rutas bsicas empleadas por los microorganismos para el


aprovechamiento energtico de los sustratos.
La va fructosa difosfato (FDP) tambin conocida como gliclisis
o va de Embden-Meyerhof
La va de las pentosas fosfato (PP) o de Warburg-Dickens
Horecker
La va de Entner-Doudorff p KDPG

Cada una de estas vas tiene funciones y unidades especficas para los
microorganismos. Las dos primeras vas son comunes tanto a
organismos
respiratorios
como
fermentativos,
procariontes
o
eucariontes. La tercera se halla restringida a procariontes. Al existir
diferentes vas de fermentacin se obtienen tambin diferentes
productos: Algunos productos derivados de la fermentacin se observan
en la siguiente tabla:
Tabla 1. Productos derivados de la fermentacin

Tipo de fermentacin

Producto(s)

Fermentacin lctica

Lactato

Fermentacin

etanol, CO2

alcohlica
Fermentacin

cida- Etanol,

succinato,

mixta

lactato, CO2, H2

Fermentacin

Butilnglicol, CO2

acetato,

formiato,

butirato,

butanol,

butilngliclica
Fermentacin
butrica

aceto- Acetato,

acetona,

etanol, CO2, H2

Fuente: Martnez, J. 1995

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Naturaleza de la respiracin: La respiracin es un mecanismo metablico


de generacin de ATP en el que, a diferencia de la fermentacin, sirven
como donantes de

electrones tanto compuestos orgnicos como

inorgnicos (oxidndose). Generalmente el aceptor electrnico final es el


oxigeno molecular. A diferencia de la fermentacin, los electrones son
transferidos a travs de una cadena transportadora de electrones
al final de la cual existe un aceptor exgeno oxidado (A), que se reduce.
Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiracin aerobia; Si el
aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiracin
anaerobia.
En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la direccin
de mayor potencial redox positivo, con la consiguiente liberacin de
energa libre. Como veremos enseguida, esta energa libre se va a
traducir en un potencial electroqumico de protones, cuya disipacin a
travs de ATP-asas de membrana origina ATP, conocindose este
proceso como fosforilacin oxidativa
Leccin 8: Aspectos generales de los procesos biosnteticos
Diversas reacciones catablicas producen unidades para la biosntesis,
pero otras pueden ser tomadas desde exterior y un tercer grupo de
unidades, al igual que las coenzimas, son el resultado de las vas
biosintticas

que

han

sido

denominadas

reacciones

metablicas.

Finalmente, en la sntesis de macromolculas los productos mayoritarios


son protenas y cidos nucleicos. Tambin son importantes, e incluso
pueden ser mayoritarios otros tipos de molculas de gran tamao, entre
los que se encuentran los polisacridos y lpidos complejos. El tipo de
estructura de estos dos ltimos variar mucho de un organismo a otro, y
tiene especial inters en las bacterias.

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La mayor parte de peso seco de la bacteria est constituidos por


macromolculas

de

cuatro

tipos:

cidos

nucleicos,

protenas,

polisacridos y lpidos complejos. Estas macromolculas son polmeros


formados por unidades estructurales de bajo peso molecular que tiene
que formarse como precursores. Ya sabemos que las subunidades
estructurales de los cidos nucleicos son 8 tipos distinto de nucletidos,
las de las protenas 20 aminocidos diferentes, las de los polisacridos,
unos 15 azucares diferentes, y que para la formacin de los lpidos se
requieren cidos grasos, polialcoholes, azcares, aminas y aminocidos
que constituyen tambin unos 20 tipos diferentes de molculas
orgnicas. Adems se requieren sintetizar unas 20 coenzimas y
transportadores de electrones.
Un tipo ms interesante y bastante ms complejo de proceso microbiano
industrial es aquel en el que el producto deseado no es producido
durante la primera fase de crecimiento, sino poco despus que se inicie
la fase estacionaria. Metabolitos producidos durante la fase estacionaria
son llamados metabolitos secundarios y son algunos de los ms
comunes e importantes metabolitos de inters industrial. Los mejor
conocidos y los ms extensamente estudiados metabolitos secundarios
son los antibiticos. Se han reconocido las siguientes caractersticas de
los metabolitos secundarios:
Cada metabolito secundario se forma nicamente a partir de
relativamente pocos organismos.
La

formacin

de

metabolitos

secundarios

es

sumamente

dependiente de las condiciones de crecimiento, en particular de la


composicin del medio. Es frecuente la represin de la formacin
de metabolitos secundarios.

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Los metabolitos secundarios no son indispensables para el


crecimiento y la reproduccin.
Los metabolitos secundarios se suelen producir como un grupo de
sustancias estrechamente relacionadas. Por ej. una sola cepa de
Streptomyces ha llegado a producir 32 antibiticos de antraciclina
diferentes, pero relacionados.
Leccin 9: Crecimiento Bacteriano
Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el
incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese
sistema,

lo

cual

implica

un

aumento

de

la

masa

celular

que

eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos


pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao
del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o
por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los
microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no
se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce en aumento
de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos
estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y a escala
poblacional. Para efectos prcticos, esta seccin nos centraremos al
estudio del crecimiento poblacional. El cual en cultivo cerrado atraviesa
por las siguientes fases:
Fases del crecimiento en un sistema cerrado en medio lquido:
En sistema de produccin cerrado, en el cual la adicin de sustancias y
microorganismos solo se realizan al inicio de la fermentacin se pueden
identificar 6 fases de crecimiento. (Figura 2)
Figura 2: Curva de crecimiento microbiano

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Como se puede constatar en el anterior grfico, el crecimiento en un


sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:
1) Fase de latencia: Es el perodo de tiempo durante el que el inoculo
se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha
sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Su duracin
depende de varios factores:
Tamao del inoculo
Estado fisiolgico del inoculo:
Si las clulas estn daadas por algn agente, la fase de latencia
tambin es larga, ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los
daos.
Si las clulas del inoculo se tomaron de un cultivo previo en fase
exponencial, la fase de latencia es ms corta.
Medio de cultivo del que procede el inoculo:
Si el medio es similar al medio fresco, la fase de latencia es ms
corta; Si el medio del inoculo era un medio rico y el medio fresco es ms

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pobre, la fase de latencia se hace ms larga, porque las bacterias


necesitan un tiempo adicional para activar la sntesis de las enzimas
biosintticas que estaban reprimidas en el medio rico.
2) Fase de transicin, de crecimiento acelerado, que conduce a la
siguiente fase
3) Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase se produce
un

crecimiento

balanceado

no

restringido

durante

unas

pocas

generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generacin (g)


es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:
El valor del tiempo de generacin (g) depende de:

composicin

del

medio, temperatura, pH, osmolaridad (tonicidad), etc.


Los microorganismos hetertrofos suelen crecer ms rpidamente en los
medios complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos
ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos
microorganismos

tienen,

su

temperatura

ptima

tiempos

de

generacin muy cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen
ms lentamente, con tiempos de generacin que pueden ser de varias
horas o incluso das.
4) Fase de aceleracin negativa, de crecimiento desequilibrado, que
conduce a
5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente
neto de crecimiento se hace nulo ( = 0), pero an existe crecimiento.
Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes
celulares.

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En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan


sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse
inadecuado para el crecimiento celular.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de
aceleracin negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va
recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminocidos
como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).
6) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva,
exponencial, del cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energa.
Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas
(formas fantasmas, ghost). La pendiente de esta parte de la curva
depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entricas es suave,
mientras que en Bacillus es ms acentuada)
Leccin 10: Modelos Matemticos del crecimiento microbiano
Para muchos propsitos en biotecnologa microbiana es necesario
conocer el nmero de generaciones, la poblacin de bacterias con el fin
de estimar el estado fisiolgico de la poblacin microbiana y establecer
relaciones con los sustratos del medio de cultivo o los productos de
biosntesis.

En los organismos unicelulares la clula se divide por fisin binaria


dando lugar a dos clulas hijas, cada una de las cuales se divide
nuevamente produciendo dos clulas nuevas, por lo que en cada periodo
e divisin la poblacin se duplica. Esta multiplicacin representa una
progresin geomtrica en la cual hay una relacin directa entre el
nmero de clulas iniciales y

la cantidad de clulas en otro tiempo

determinado. La expresin matemtica que representa esta relacin es:

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N = No2n Donde:
N= numero final de clulas,
No = nmero inicial de clulas
N = nmero de generaciones

Para explicar la anterior ecuacin en trminos de n

se aplica una

transformacin logartmica cuyo resultado es:

El tiempo de generacin (G) de la poblacin es:

donde,
t = horas o minutos de crecimiento exponencial
Una expresin alternativa del crecimiento se deriva de asumir que la
velocidad de incremento en la masa celular o densidad celular (dx/dt)
en un tiempo (t) es proporcional a la densidad celular en dicho tiempo.
Por consiguiente:

de donde:

x = nmero de clulas o algn componente (protena)constante de


velocidad de crecimiento instantneo
Integrando se obtiene:
ln X1 = ln Xo + t
Tomando el antilogaritmo a cada lado se obtiene

et

X1 = Xo

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Considerando que despus de un tiempo la poblacin se duplica (td)


entonces:
X1 = 2Xo por tanto, la duplicacin de la poblacin celular se puede
expresar as: X1/Xo = 2 reordenando los valores en la penltima
ecuacin se obtiene:
2=e

aplicando antilogaritmo a cada lado se obtiene:

Entonces:

= 0.693/td

Ejemplo explicativo:
A continuacin se muestran los datos de un experimento de crecimiento bacteriano de E. colli el
cual se realizo durante 5 horas. El numero de celulas fue cuantificado por unidades formadoras de
colonia por cajas petri. Con los datos de la tabla calcular el numero de generaciones, el tiempo
generacional y la velocidad especifica de crecimiento ().

Debido a que el crecimiento bacteriano es una progresin geomtrica, existe una relacin directa
entre el nmero de clulas presente en el momento inicial y el habido en un momento determinado
del crecimiento exponencial de modo que:

N= N2n

Donde N = nmero final de clulas, No= nmero inicial de clulas y n = numero de generaciones,
por tanto despejando la ecuaciones anteriores tenemos que:

n= ( logN-logNo) / log 2
n =( log N log No ) / 0,301; remplazando tenemos

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n= log 108 log (2 x 107 ) / 0.301, resolviendo :


n= (8 7,301) /0,301
n = 2,32
G = t/n
G= 5hr/2.32 generaciones
G= 2.15 horas

ln 2 /td
= 0.693/td
0.6931/ 2.15
0.3223

Una aplicacin especialmente importante de la constante de velocidad


instantnea, es el quimiostato, el cual es un dispositivo de cultivo
continuo donde el Volumen es constante y el nutriente entra con la
misma velocidad con la que sale. En este equipo el tamao de la
poblacin y la velocidad de crecimiento pueden mantenerse constantes,
puesto

que

la

velocidad

de

crecimiento

es

una

funcin

de

la

concentracin de nutrientes. Monod propuesto la siguiente ecuacin


para representar esta relacin:

Donde mx. es la velocidad de crecimiento a saturacin de nutriente, S


es la concentracin de nutriente, y K es una constante de saturacin
que es numricamente igual a la concentracin de nutriente a la que
= de max La ecuacin anterior es formalmente equivalente a la
ecuacin de Michaelis- Mente usada en el anlisis de la cintica
enzimtica. La determinacin de los parmetros desconocidos max y Ks

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se puede hacer representando 1/sobre el eje y frente a 1/S sobre el eje


X. Se obtendr una lnea recta que corta al eje Y, y el valor en el punto
de intervenciones 1/ max .La pendiente de la recta es Ks/mx y como se
conoce

mx

se puede calcular Ks. En general los valores de Ks son muy

bajos.
Capitulo 3:

SISTEMAS DE FERMENTACIN

Leccin 11: Tipos de fermentacin


1) Fermentacin discontinua Una fermentacin discontinua (en
batch) puede ser considerada como un sistema cerrado. A tiempo
cero t = 0, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con
microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no
se aade nada, excepto oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio
de cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de
metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado del
metabolismo de las clulas. Despus de la inoculacin de una solucin
nutritiva estril con microorganismos y su cultivo en condiciones
fisiolgicas se observan cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de
latencia, fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte

2) Proceso de fermentacin alimentada (fed-batch)


En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir,
todos los substratos se aaden al principio de la fermentacin. Una
mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentacin alimentada,
que se utiliza en la produccin de substancias como la penicilina. En los
procesos alimentados los substratos se aaden escalonadamente a

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medida que progresa la fermentacin. La formacin de muchos


metabolitos secundarios est sometida a represin catablica por altas
concentraciones de glucosa, por otros carbohidratos, o por compuestos
nitrogenados. Por esta razn en el mtodo alimentado los elementos
crticos

de

la

solucin

de

nutrientes

se

aaden

en

pequeas

concentraciones al principio de la fermentacin y continan aadindose


a pequeas dosis durante la fase de produccin.

Puesto que generalmente no es posible medir la concentracin del


substrato directa y continuamente durante la fermentacin a fin de
controlar

el

proceso

de

alimentacin,

tienen

que

ser

medidos

parmetros indirectos que estn correlacionados con el metabolismo del


substrato crtico. Por ejemplo, en la produccin de cidos orgnicos, el
valor del pH puede ser utilizado para determinar la velocidad de
alimentacin de la glucosa. En fermentaciones con valores osmticos
crticos la alimentacin puede ser regulada controlando el valor de pO2 o
el contenido en CO2, en los gases que se liberan.

3) Fermentacin continua.
En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin
nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor y una cantidad
equivalente

de

solucin

utilizada

de

los

nutrientes,

con

los

microorganismos, se saca simultneamente del sistema. Entre las


distintas clases de fermentaciones continuas pueden ser distinguidos
dos tipos bsicos:
a. Birreactor mezclado homogneamente. Este es utilizado como
un quimiostato o como un turbidostato. En el quimiostato en

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estado de equilibrio, el crecimiento de las clulas se controla


ajustando la concentracin de un substrato (Fig. 3.A). cualquier
substrato que se requiera (carbohidrato, compuesto nitrogenado,
sales, a,) puede ser utilizado como substrato limitante. En el
turbidostato el crecimiento de las clulas se mantiene constante
utilizando la turbidez para controlar la concentracin de biomasa y
la velocidad de alimentacin de la solucin de nutrientes se ajusta
de forma apropiada (Fig. 3).
Figura 3: Fermentacin continua en quimiostato A), Turbidostato B) y Fermentador de flujo de
tapn

Fuente: Crueger y Crueger, Manual de Microbiologa industrial. 1993

b. Reactor de flujo de tapn. En este tipo de fermentacin continua la


solucin de cultivo fluye a travs de un reactor tubular sin mezclado. La
composicin de la solucin de nutrientes, el nmero de clulas, la
transferencia de masa (suministro de O2) y la productividad varan en
distintas posiciones dentro del sistema (Fig. 3C). A la entrada del
reactor las clulas deben aadirse continuamente junto con la solucin
de nutrientes (generalmente como un flujo que revierte de una

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desviacin desde la salida del fermentador o desde una segunda


fermentacin continua).
En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la prdida de clulas
debida al fluido que sale debe ser balanceada por el crecimiento del
microorganismo

La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumtrico


(que entra y sale) a travs del volumen del fermentador.
Utilizando la ecuacin de Monod que describe la dependencia de la
velocidad especfica de crecimiento sobre la concentracin de substrato
limitante pueden ser determinados en el biorreactor la constante de
rendimiento biomasa/substrato (Y

X/S),

la densidad de las clulas (X) y

la concentracin de substrato (S).

A velocidad ms baja de flujo el substrato es casi completamente


agotado por las clulas (S O). La concentracin de clulas es
entonces X = So/Y. Si D aumenta, X desciende lentamente, al principio
en forma lineal y luego a D = m cae bruscamente hasta O. S aumenta
lentamente al principio y se aproxima a So a D = m. Cuando X es cero

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en la ecuacin que explica el sustrato (S), se alcanza el punto de lavado


Dm.

Por encima de Dm no es posible un estado de equilibrio. Si la velocidad


de flujo es slo ligeramente ms baja que D" el sistema es muy sensible
a las influencias externas. Pequeas desviaciones en la alimentacin
pueden originar cambios extremos en la biomasa o en la separacin de
las clulas. La Figura 4 muestra la interdependencia de la velocidad de
flujo, la concentracin de substrato, la concentracin de clulas y la
velocidad de formacin de clulas (m = 1 h-1 Ks = 0,2 g/l Y = 0,5).

Figura 4. Efecto de la velocidad de flujo sobre la concentracin de substrato (5), la


concentracin de clulas (X). Tiempo de duplicacin (1,) y velocidad de fermentacin
de clulas (D * X)

Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiologa industrial

La velocidad especfica mxima de crecimiento en los procesos


industriales se escoge de forma que se obtenga el rendimiento ms alto
en el volumen ms pequeo de fermentador y en el tiempo ms corto.

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El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentacin


continua a velocidades muy bajas o muy altas de dilucin. A velocidades
medias de dilucin la relacin molar entre la biomasa producida y el CO 2
que se desprende es constante. A bajas velocidades de dilucin la
proporcin de CO2 se hace ms grande. Esto se debe a que se utiliza
ms fuente de energa para el mantenimiento de la estructura celular,
para la regulacin osmtica o para la motilidad. Por otra parte, a
velocidades altas de flujo una parte del carbono aadido es oxidado
incompletamente

(a

productos

como

piruvato,

acetato

cidos

tricarboxlicos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas


velocidades de flujo, con nitrgeno como substrato limitan te, se forman
materiales de reserva, como polisacridos, lo que resulta en un aumento
en el tamao de la clula y por tanto de la biomasa.
Leccin 12: Productividad y velocidad especfica de produccin
La productividad de una fermentacin se define como
Productividad P

Concentracin de producto / I = unidades


Tiempo de fermentacin

hxL

Para evaluar la economa de un proceso deben ser considerados varios


factores, el tiempo de produccin de la fermentacin, el tiempo
requerido para limpiar y poner a punto el fermentador, el tiempo de
esterilizacin y la duracin de la fase de latencia. En la Figura 5 la
pendiente de la tangente de la curva de formacin del producto es una
medida de la productividad mxima y la pendiente de la lnea recta, al
final de la curva de formacin de producto, indica la productividad total.
Que el proceso de fermentacin termine al tiempo de la productividad
mxima o ms tarde depende de los costes de operacin, que incluyen
la energa, gastos generales, costes de mano de obra, gastos en
personal y la capacidad del sistema. Utilizando una grfica como la de la
Figura 5 se puede hacer una estimacin de como optimizar el proceso.
En fermentaciones a tiempo corto (8-70 h) el tiempo para la puesta a
punto es significativo, mientras que en fermentaciones largas (>3 das)
el tiempo de puesta a punto es menos crucial.

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Las condiciones de fermentacin afectan directamente la productividad.


La Figura 6 muestra la productividad de un proceso para la obtencin de
protena de origen unicelular en relacin al contenido del substrato
(hidrocarburo). Existe un aumento lineal de [a productividad a medida
que el contenido del substrato aumenta, hasta que se alcanza la
concentracin a la que el hidrocarburo se convierte en la fase continua
(aceite y agua no son miscibles). Por encima de esta concentracin la
productividad decrece.
Figura 5. Productividad total y productividad mxima

Fuente: Crueger y Crueger, Manual de Microbiologa industrial. 1993

En fermentaciones continuas la productividad puede ser expresada


como:
P = D * X (g/l *h)
Cuando se utiliza la relacin de la ecuacin sobre sustrato (S) resulta la
siguiente ecuacin
P=D*Yx/y (S0 D*Ks/m-D)

Figura 6. Productividad en relacin a la concentracin de cidos grasos en un proceso


de produccin de protena de origen unicelular.

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Fuente: Crueger y Crueger, Manual de Microbiologa industrial. 1993

En fermentaciones continuas la productividad mxima es igual a la


productividad total ya que el tiempo de establecimiento y la fase de
latencia pueden ser despreciados. Por ejemplo, si el tiempo inicial de
puesta a punto requiere 24 h Y la propia fermentacin continua funciona
durante 24 horas con una velocidad de flujo de O,1 h-l, 24 h con 0,15 hl Y al menos 72 h con 0,2 h-l, la productividad total para el producto X
se calcula como se muestra en la Tabl
Tabla 2:
Periodo de
tiempo: h
0-24
24-48

Velocidad de flujo
: h-1
Discontinuo
0,1

Productividad
total X(g/l). D(h-1)
-X .0,05

Productividad total de una fermentacin

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48-72
>72
300
1000
5000

0,15
0,2
0,2
0,2
0,2

X.0,08
X
X.0,171
X.0,191
X.0,198

Fuente: Cruger y Cruger. Manual de Microbiologa industrial. 1993

La velocidad especfica de produccin qp deriva de la ecuacin 1 de la


siguiente forma:

El valor P1 es la concentracin de producto y la velocidad especfica de


produccin qp es equivalente a la velocidad especfica de crecimiento
en la ecuacin 1. Sin embargo, en los procesos de tipos II y IlI no hay
correlacin directa entre y qp
Leccin 13: Coeficientes de rendimiento
Monod defini originalmente el coeficiente de rendimiento Y como la
relacin de clulas producidas a substrato consumido:

Hoy

los

coeficientes

generales

de

rendimiento

se

utilizan

para

caracterizar los procesos de fermentacin, es decir las relaciones de las


clulas producidas a los substratos individuales convertidos o a la

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energa liberada o energa consumida. Sin embargo, los coeficientes de


rendimiento no son constantes, ya que dependen de parmetros
biolgicos (X, ) y de parmetros qumicos (pO2 relacin C/N, y
contenido en fsforo del medio.
Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos. El
primer grupo de coeficientes (Ys Y02 Ykcal) da informacin acerca de los
procesos tcnicos y por tanto acerca de la economa. El segundo grupo
(Yc Yp YN Yave) describe el catabolismo, anfibolismo y anabolismo.
El tercer grupo incluye YATP un coeficiente que describe las relaciones de
energa de las clulas (Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores
utilizan otros coeficientes de rendimiento que deben ser propiamente
designados, como muestra:

Leccin 14: Biorreactores


Como ya se dijo, el equipo donde se realiza el proceso se denomina
biorreactor o fermentados. El mismo provee todos los servicios que son
necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatizacin,
suministro de oxgeno, entradas para adicin de nutrientes, control del
pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o,
tambin, mtodos de cultivo, se hace referencia al modo de operar el
biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. En esta fase nos
ocuparemos de los birreactores.

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El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la


microbiologa industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su
diseo debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para
los microorganismos. Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden
resumirse del siguiente modo:
Mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el
volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentacin o la
flotacin.
Mantener constante y homognea la temperatura.
Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes.
Suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una
vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente
sembrado con el microorganismo deseado.
Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el
biorreactor est provisto de un sistema de agitacin, a dems para el
punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el cultivo.

Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy


difundido: el tanque agitado y al "air lift". En el primero de ellos
(Figura 7) la agitacin se realiza mecnicamente mediante un eje
provisto de turbinas accionado por un motor.

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Figura 7. Esquema de un reactor aerobio con agitacin mecnica

Fuente: De Chisti y Moo-Young, 1993

El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una
corona que posee pequeos orificios espaciados regularmente. El chorro
de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la
turbina inferior generndose de este modo miles de pequeas burbujas
de aire, desde las cuales difunde el O2 hacia el seno del lquido. El
sistema de agitacin se completa con cuatro o seis deflectores que
tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que
imprimen las turbinas al lquido, generando de este modo mayor
turbulencia y mejor mezclado. El tanque est rodeado por una camisa
por la que circula agua, lo que permite controlar la temperatura. Para
tanques mayores que 1000 2000 litros este sistema ya no es eficiente
y es reemplazado por un serpentn que circula adyacente a la pared
interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a medida que es mayor
el volumen de cultivo tambin lo es la cantidad de calor generado, por lo
que se hace necesario una mayor rea de refrigeracin. Los tanques son

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de acero inoxidable y estn pulidos a fin de facilitar la limpieza y


posterior esterilizacin.
Figura 8. Esquema de un reactor tipo Air lift.

Fuente: De Chisti y Moo-Young, 1993

El aire que ingresa al biorreactor debe estar estril, lo que se consigue


hacindolo pasar por un filtro cuyo dimetro de poro es de 0,45
micrones, que impide el paso de microorganismos y esporas. En los
reactores de tipo "air lift" (Figura 8) es el mismo aire inyectado al cultivo
lo que promueve la agitacin. Bsicamente consiste en dos cilindros
concntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior, se
inyecta aire. De este modo se genera una circulacin de lquido
ascendente en el comportamiento interno y descendiente en el externo,
lo que favorece el mezclado.

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Leccin 15: Transferencia de O2

Fermentacin en gran escala.

La velocidad de transferencia de 0 2,

R02, desde el seno de la fase

gaseosa (burbujas) hasta la fase lquida est dada por la siguiente


ecuacin:

Donde KLa es el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno, C


la concentracin de 02 disuelto en el seno del lquido y C* la
concentracin de 02 disuelto que estara en equilibrio con la presin
parcial de oxgeno de la fase gaseosa. El KLa depende del diseo del
biorreactor, de las condiciones de operacin (caudal de aire, agitacin) y
de la viscosidad del cultivo. A mayor viscosidad menor K La. El KLa es
una medida de la capacidad que posee un biorreactor para sumnistrar
O2 y el rango de valores usuales est comprendido entre 50 h-1 y 1000
h.
Es til en este punto retomar el ejemplo visto al final del y calcular el
KLa necesario para que la velocidad de transferencia de 0 2 sea igual a la
de consumo; esto significa que R02 deber ser igual a 1,526 mg 1-1 h1. Asumiendo que C* = 7,8 mg 1 -1 y C = 0,5 mg 1 -1, resulta Por
tanto valores de KLa iguales o superiores al calculado asegurarn, que el
cultivo no est limitado por 02. Cuando la velocidad de consumo del
oxgeno vara con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo
"batch", el clculo de KLa necesario se realiza empleando el mximo
valor de RO2 esperado, a fin de asegurar un adecuado suministro de 02
durante todo el cultivo.

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Caractersticas de la Fermentacin en gran escala.


El fermentador donde se lleva a cabo los procesos industriales pueden
variar en tamao de la escala pequea de laboratorio 5-10 litros a la
enorme escala industrial de 400.000 litros. Las dimensiones dependen
del proceso y de cmo opera. Los procesos manejados en lote o batch
requieren fermentadores ms grandes que los manejados en forma
continua o semicontinua.

Tabla 3. Tamao de fermentadores para varios procesos


Tamao del fermentador
(litros)

Producto

1-20.000

Enzimas
sustancias
molecular

para
diagnstico,
para
biologa

40-80.000

Algunas enzimas, antibiticos

100- 150.000

Penicilina, antibiticos aminoglicsidos, proteasas, amilasas,


transformaciones de esteroides,
amino cidos

450.000

Amino cidos ( cido glutmico)

Fuente: Cruger y Cruger. Manual de Microbiologa industrial. 1993

11.1 Control y monitoreo del proceso.


Debido a los elevados costos de produccin, los fermentadores
industriales estn cuidadosamente controlados. No solo se necesita

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controlar el crecimiento y la formacin del producto, sino que se deben


controlar otros factores ambientales a medida que el proceso se efecta.
Los factores ambientales controlados ms frecuentemente son: la
concentracin de oxgeno, pH, masa celular y concentracin del
producto. Tambin es necesario en muchos casos controlar la espuma
dentro del fermentador y ajustar la temperatura. En la actualidad se
utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentacin ya
sea en la obtencin de datos que reflejen los cambios que tienen lugar
durante el proceso de fermentacin o en el control de varios factores
ambientales que se deben ajustar o alterar durante la fermentacin. La
obtencin de datos a medida que el proceso de fermentacin tiene lugar
se llama adquisicin inmediata y tiene un valor especial cuando estos
datos se puedan procesar para convertirlos en cifras que puedan
interpretarse
computadoras

en

trminos

tambin

microbiolgicos

permiten

graficar

o
los

bioqumicos.
datos

Las

obtenidos

permitiendo al operador del fermentador tener una representacin visual


del progreso de la fermentacin. Finalmente la computadora nos permite
almacenar los datos en forma legible de modo que estos datos se
puedan traducir a otro sistema, o analizar en forma mas sofisticada.

Un uso ms sofisticado de las computadoras es el control inmediato del


proceso de fermentacin por ej. cambiando los parmetros ambientales
a medida que la fermentacin progresa o agregando un nutriente a la
velocidad de equilibrio exacto del crecimiento, en esta forma el nutriente
es aadido cuando se necesita evitando en algunos casos que el mismo
sea metabolizado a productos indeseables.

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Finalmente, las computadoras pueden ayudar a modular los procesos de


fermentacin, para ello se debe desarrollar un modelo matemtico del
proceso de fermentacin, el cual incorpora ecuaciones diferenciales para
describir el crecimiento microbiano y la formacin del producto. El valor
del uso de una computadora para modelar el proceso de fermentacin
es que se puede ensayar el efecto de varios parmetros sobre el
crecimiento y sobre la formacin del producto en forma rpida e
interactivamente, y entonces hacer modificaciones en los parmetros
para ver como afectan al proceso. De esta forma se pueden estudiar con
gran economa muchas variaciones de la fermentacin en la Terminal de
la computadora y no en forma ms costosa en la planta piloto o en la
planta industrial.
Escalamiento del proceso de fermentacin. Uno de los aspectos
ms importantes y complicados de la microbiologa industrial es la
transferencia de un proceso del equipo de laboratorio a pequea escala,
al equipo comercial a gran escala, procedimiento que se llama
escalamiento. Es sumamente importante comprender los problemas del
escalamiento ya que es raro que un proceso microbiano se comporte de
la misma forma en fermentadores a gran escala que en un equipo de
laboratorio a pequea escala. La mezcla y la aireacin son mucho ms
eficientes en el matraz de laboratorio pequeo que en el fermentador
industrial grande. A medida que cambia el tamao del equipo, cambia la
relacin superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho
mayor para un rea superficial determinada. Como la transferencia del
gas y la mezcla dependen de la superficie expuesta ms que del
volumen del fermentador, es obvio que sea ms difcil mezclar el
contenido del tanque grande que del matraz pequeo. Como la mayor
parte de las fermentaciones industriales son aerbicas, es indispensable
una transferencia efectiva del oxigeno. Con el medio de cultivo rico que
se utiliza en los procesos industriales se obtiene una alta biomasa, que

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origina una gran demanda de oxigeno. Si se reduce la aireacin, aun


durante

un

periodo

corto,

anaerobiosis

parcial,

con

el

cultivo

serias

puede

consecuencias

experimentar
en

trminos

una
de

rendimiento del producto.


El escalamiento en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero
bioqumico, quien esta familiarizado con la transferencia de gases, la
dinmica de fluidos y la termodinmica. El papel del microbilogo
industrial en el proceso de escalamiento es trabajar estrechamente con
el ingeniero bioqumico para asegurar que se han abarcado los
parmetros necesarios para una fermentacin exitosa y que se dispone
de las cepas microbianas apropiadas para una fermentacin en gran
escala.
Las distintas etapas que deben realizarse para llegar de un proceso de
laboratorio a un proceso industrial son las siguientes:
1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la
primera indicacin que es posible un proceso de inters industrial.
2) El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequea,
generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el
fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio
de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos tanto
en el equipo como en los medios de cultivo.
3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de
300 a 3000 litros. Aqu las condiciones se acercan mas a la escala
industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el
fermentador

de

una

planta

piloto

es

deseable

una

cuidadosa

instrumentacin y un control con computadora, de modo que las


condiciones que

se

fermentador industrial.

obtengan

sean lo ms similares a las del

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Actividades:
Investigue en su localidad los sustratos o subproductos que pueden
utilizarse como fuente de Carbono, nitrgeno y fsforo. Enuncie sus
caractersticas relacionadas en cuanto a

produccin mensual del

sustrato, estabilidad del sustrato y concentracin de los nutrientes.


Investiga sobre mtodos de cuantificacin del crecimiento microbiano,
realiza un foro con tus compaeros y compara las diferentes tcnicas.
Establece las ventajas e inconvenientes de la produccin de metabolitos
intracelulares con los metabolitos extracelulares.
Bibliografa:
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UNIDAD 2
CAPITULO CUATRO : BIOTECNOLOGA ENZIMTICA
Leccin 16 : Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica
Leccin 17: Naturaleza de las enzimas
Leccin 18: Clasificacin de enzimas segn la naturaleza de la reaccin y cofactores
Leccin 19: Cintica enzimtica
Leccin 20: Produccin de enzimas
CAPITULO CINCO : PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA
BIOTECNOLOGA
Leccin 21: Tcnicas utilizadas en la manipulacin gentica in vitro.
Leccin 22: Tecnologa del ADN recombinante
Leccin 23: La reaccin en cadena de polimerasa ( PCR)
Leccin 24: Muta gnesis , Muta gnesis dirigida por oligonucletidos
Leccin 25: Muta gnesis en casette o interrupcin gnica
CAPITULO SEIS : APLICACIONES
INDUSTRIA ALIMENTARIA

DEL

Leccin 26: Animales transgnicos


Leccin 27: Plantas Transgnicas
Leccin 28: Alimentos genticamente modificados
Leccin 29: Alimentos funcionales
Leccin 30: Prebiticos

ADN

RECOMBINANTE

EN

LA

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UNIDAD 2: BIOCATALISIS E INGENIERA GENTICA APLICADA A


LA BIOTECNOLOGA
INTRODUCCIN: La siguiente unidad ha sido dividida en tres
captulos: en el primero, se pretende que los estudiantes se apropien del
concepto de biocatlisis, los fundamentos bsicos que caracterizan esta
disciplina para luego identificarlos y diferenciarlos de otros procesos. En
el segundo captulo, se pretende que los estudiantes a travs del
conocimiento bsico de biologa molecular sean capaces de identificar
los procesos biolgicos ambiente para que la respuesta celular sea la
ms eficiente para la obtencin de productos y o servicios en la industria
alimentaria. Por ltimo en el tercer captulo se hace un anlisis del
impacto de la utilizacin de estas tcnicas en la Industria alimentaria.

Objetivos
Consolidar conceptos de Biologa molecular esenciales para
aproximarse y comprender las transformaciones genticas en
los seres vivos que se pueden traducir en la obtencin de
nuevos alimentos mejoramiento de procesos de inters en la
industria alimentaria.
Adquirir bases tericas que respaldan los procesos de ingeniera
gentica aplicada a la industria alimenticia.
Analizar y discutir las oportunidades y desventajas que ofrece
la Biotecnologa en la alimentacin mundial
Obtener una visin holstica del debate que se ha planteado a
cerca de las ventajas y desventajas sobre la introduccin de
alimentos transgnicos en la alimentacin mundial.
Capitulo CUATRO: BIOTECNOLOGA ENZIMTICA
Leccin 16: Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica
El choque entre dos molculas produce energa que puede ser absorbida
por las molculas mismas, o puede ser disipada bajo forma de calor en
el medio.
Si la energa absorbida por el substrato (S) es suficiente para franquear
la barrera de potencial, llamada energa de activacin, el substrato se

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puede transformar y conducir a la formacin de un producto (P), es


decir llegar a un estado final, diferente del estado inicial.
Esta energa de activacin generalmente es elevada y no es compatible
con las condiciones del medio en el cual se deben desarrollar las
reacciones del metabolismo de los organismos vivientes: pH vecino de la
neutralidad, temperatura comprendida entre O y 40C, presin vecina a
la presin atmosfrica. Por tanto, la realizacin de esas reacciones
necesita de catalizadores bioqumicos, las enzimas cuya accin consiste,
como la de todo catalizador abatir la energa de activacin lo que tiene

por efecto acelerar la reaccin, cuya velocidad se encuentra multiplicada


por un factor del orden de 1012-1020.
Al final de cada ciclo de reaccin, la enzima permanece inalterada.
E+S

ES

E+P

Las enzimas son pues, catalizadores biolgicos de naturaleza protdica


que intervienen en todas las reacciones metablicas energticamente
posibles, que ellas aceleran por activacin especfica. Permiten alcanzar
rpidamente el estado de equilibrio de la reaccin sin modificarlo. Son
las llaves tiles de la biotecnologa y de la bioindustria. Son ellas las que
en la ingeniera microbiolgica, catalizan las reacciones metablicas
puestas en juego y aseguran su regulacin. Son ellas igualmente las que
conducen la ingeniera gentica para realizar las modificaciones del
equipamiento enzimtico de ciertos microorganismos con vista a
hacerlos aptos para la biosntesis de metabolitos interesantes
El conocimiento de las enzimas, de su naturaleza y de sus propiedades,
as como de la cintica de las reacciones que catalizan es fundamental
en biotecnologa
Leccin 17: Naturaleza de las enzimas
Todas ellas son macromolculas que corresponden a la clase de las
protenas globulares. Algunas son holoprotenas constituidas nicamente
por un encadenamiento de cidos aminados; otras son heteroprotenas,
que poseen una parte no protenica, el cofactor, necesario para la
actividad cataltica y asociado ms o menos fuertemente a la protena.
Especificidad de la catlisis enzimtica sitio activo:

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Una de las caractersticas ms importantes de la catlisis enzimtica


reside en su especificidad, mucho ms marcada que la especificidad de
la catlisis qumica.
Esta especificidad presenta un doble aspecto:

Especificidad de reaccin. Una enzima no puede catalizar sino un


solo tipo de reaccin, por ejemplo: hidrlisis de enlaces
glucosdicos o hidrlisis de enlaces steres (liplisis), etc. Esta
especificidad sirve de base a la clasificacin de estos catalizadores
bioqumicos.

Especificidad en cuanto al substrato. Esta propiedad resulta


delhecho, plenamente establecido, de que toda reaccin
enzimtica implica la fijacin del substrato en puntos bien precisos
de la protena enzimtica. Esta fijacin se hace por el
establecimiento de enlaces de tipo del de hidrgeno, hidrfobos o
de Van der Waals.

La conformacin de la protena enzimtica es tal, que no reconoce sino


un tipo de substrato. Ciertas enzimas presentan una especificidad
estricta y son capaces de asociarse a un nico substrato; ste es el caso
de la fumarasa (EC. 4.2.1.2) que transforma el L-malato en fumarato y
que no tiene accin sobre el D-malato o sobre ningn otro compuesto
relacionado. Otras enzimas, por el contrario, se pueden fijar a
substratos diferentes, pero de la misma naturaleza y provocar un mismo
tipo de reaccin qumica.
La enzima, despus de haber fijado el substrato, lo transforma en
seguida. Para esto, su estructura espacial es tal, que en la vecindad y a
las distancias adecuadas se encuentran grupos funcionales en donde las
acciones diferentes y complementarias realizan la reaccin. La pequea
porcin de la enzima, implicada en la fijacin y posicionamiento del
substrato, as como en la reaccin de catlisis, delimita un volumen
denominado "sitio activo".
En las enzimas holoprotenicas, stos son principalmente los
agrupamientos funcionales libres situados en los radicales de algunos
cidos aminados que intervienen al nivel del sitio activo (funcin OH de
la serina, ncleo imidazol de la histidina, funcin fenol de la tirosina,
funcin COOH de los cidos asprtico o glutmico, funcin tiol de la
cistena).

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En lo que concierne a las enzimas del tipo heteroprotenico, la fijacin


al substrato se hace sobre la parte protenica, la apoenzima, mientras
que la catlisis de la reaccin es hecha por la parte no protenica, el
grupo prosttico o el cosubstrato.
La parte "apoenzima" de la molcula enzimtica que lleva el sitio de
fijacin al substrato es por consiguiente responsable de la especificidad
en cuanto al substrato de esa enzima. Pero tambin puede intervenir en
la especificidad de la reaccin e inducir un tipo particular de reaccin.
As es, por ejemplo, que en el metabolismo de los cidos aminados, el
fosfato depiridoxal puede, de acuerdo a la apoenzima con la cual est
combinado, catalizar reacciones, sean de transaminacin, sean de
descarboxilacin, de desaminacin, o de racemizacin.
La actividad de las enzimas es funcin directa de su estructura terciaria
o de la cuaternaria. En estas condiciones, todo tratamiento que
modifique la conformacin de la enzima (calentamiento, modificacin del
pH), es decir estorbando o impidiendo, la fijacin del substrato a la
enzima o cambiando la estructura del sitio activo, alterar las
propiedades catalticas de la enzima y por tanto su funcin.

Grfico 9:

Enzimas complejos

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php

Leccin 18: Clasificacin de enzimas segn la naturaleza de


reaccin y cofactores
Las enzimas heteroprotenicas utilizan diversos tipos de cofactores:
algunos son iones metlicos (Mg++, Fe++, eu++, Mo+++, Zn++), Fig.
otros cofactores son orgnicos (heme, nicotinamida, flavina, coenzima
A, fosfato de piridoxal, tiamina, etc.). Este tipo de enzima adopta

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diversas formas de funcionamiento, lo que con frecuencia entraa una


confusin en la terminologa de estos cofactores. En efecto, algunos
estn combinados fuertemente a la apoenzima por intermedio de enlace
covalente; son parte integrante de la enzima y no se le separan: se les
designa con el nombre de grupos prostticos. Otros, por el contrario,
son co-substratos; se fijan en un primer tiempo sobre la apoenzima,
provocando la transformacin del substrato sufriendo una modificacin
en su estructura qumica; despus se separan de la apoenzima: se les
denomina coenzimas. Regresan a su estado inicial en el transcurso de
una segunda etapa enzimtica fijndose sobre otra apoenzima.
Para ilustrar esta distincin, tomemos el caso de dos enzimas responsables de la oxidacin de cidos aminados: la L-aminocido-oxidasa y la
glutamato deshidrogenada.
La primera (EC. 1.4.3.2) es una flavoprotena en la cual el cofactor, la
flavina adenosina dinucletido (FAD) se comporta como un grupo
prosttico. Permaneciendo fija a la apoenzima provoca la oxidacin por
deshidrogenacin y desaminacin del cido aminado y se reduce a F
ADH:z. La enzima regresa a su estado inicial cediendo los dos
hidrgenos, fijados transitoriamente, a un segundo substrato, oxidante
ms potente, que provoca la reoxidacin del F ADH:z a F AD.
A la inversa, la glutamato deshidrogenasa (EC. 1.4.1.2) cataliza una
reaccin del mismo tipo, la oxidacin del cido glutmico a cido 2oxoglutrico con ayuda de la coenzima nicotinamida adenina
dinucletido (NAD). Esta se encuentra reducida. Abandona la superficie
de la apoenzima. En seguida ser reoxidada a expensas de otro
substrato que es reducido por otro sistema enzimtico del medio. El
NAD se comporta en estas dos reacciones sucesivas como un substrato.
Figura 10: Ejemplo de cofactor

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-efuncoes1.php, 2007

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La nomenclatura y la clasificacin de las enzimas han sido normalizadas


por la Comisin sobre Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica,
creada en 1955 antes de solucionar la confusin que haba y el-riesgo
de que la situacin se agravara con el rpido progreso del conocimiento
acerca de las enzimas.
Los objetivos que fueron asignados a esa Comisin sobre Enzimas desde
su creacin fueron:

Hacer un inventario de las enzimas identificadas y caracterizadas,


precisando para cada enzima la naturaleza exacta de la reaccin
catalizada.

Establecer, a partir de este inventario, una clasificacin de las


enzimas.

Definir, con base en esta Clasificacin, reglas de nomenclatura


que permitan designar, sin ambigedad, a una enzima dada,
proporcionando la mayor informacin posible sobre la
naturaleza de la reaccin catalizada.

Para cada enzima es preciso:

La reaccin catalizada.

Su nombre sistemtico en nomenclatura normalizada.

Y sobre todo su nmero de identificacin que define sin ninguna


ambigedad, el lugar de la enzima en la clasificacin normalizada.
Este I nmero contiene 4 cifras o nmeros, separados por puntos,
cada uno de ellos corresponde a los elementos siguientes:
a) La primera cifra indica la clase a la cual pertenece la enzima.
Estas clases, en nmero de 6 se definen de acuerdo a la
naturaleza general de la reaccin catalizada. Hay: loxidorreductasas, 2-Transferasas, 3-Hidrolasas, 4-Liasas, 5Isomerasas, 6-Ligasas (o sintetasas). I
b) La segunda y la tercera cifras designan la subccase y la subsub- I clase, definiendo en cada clase, segn ciertos criterios
que se precisarn ms adelante.

c) La cuarta cifra da el nmero de orden de la enzima en la subclase considerada

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La regla general adoptada para designar a una enzima de acuerdo a


la nomenclatura sistemtica es que el nombre de una enzima se
forme de dos partes:
La primera lleva el nombre del substrato; o en el caso de reacciones
bimoleculares, los nombres de los dos substratos separados por "dos
puntos".
La segunda parte indica la clase a la cual pertenece la enzima; el nombre de la clase puede. Precisarse por un prefijo que precede al tipo
exacto de reaccin catalizada.
OXIDORREDUCTASAS: Catalizan las reacciones de oxido-reduccin:
transferencia de hidrgeno o de electrn(es) de un donador, que est
oxidado, a un receptor, que est reducido.(Fig. 5) En esta clase, que
lleva la cifra, se reagrupan todas las enzimas llamadas: oxidasas,
reductasas, deshidrogenasas y peroxidasas.
Los nombres comunes que se han retenido son del tipo "donador: deshidrogenasa" o "receptor: reductasa". El trmino oxidasa no se ha
conservado salvo cuando el receptor es el oxgeno.

Fig. 11. Enzimas de oxido reduccin

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php
. 2007

TRANSFERASAS
Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de
agrupamientos (metilo, hidroximetilo, carboxilo, acilo, glucosilo, amino,
etc.).
En esta clase, que lleva la cifra 2, se reagrupan las transferasas,
fosforilasas, cinasas, entre otras Las sub-clases se definen por la

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naturaleza del agrupamiento que es transferido (agrupamientos de un


carbono, de dos carbonos, nitrogenados, etc.).
El nombre sistemtico est formado segn el modelo: donador: receptor
o grupo transferido: transferasa.

Fig. 12: TRANSFERASAS

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php

HIDROLASAS
Provocan la hidrlisis de diversos tipos de enlaces: ster, acetal
(osdico), amida (peptdico), (Fig. 13)
Las subclases son definidas por la naturaleza general del enlace que es
hidrolizado. El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo
"substrato hidrolasa", un prefijo que precisa la naturaleza del grupo
eliminado cuando la enzima es especfica para este enlace.
El nombre comn que se recomienda es, en la mayor parte de los
casos, formado por el nombre del substrato al cual se adiciona el sufijo
"asa". En general las hidrolasas son holoprotenas. Algunas pueden
tener un grupo prosttico, por ejemplo el fosfato de piridoxal.
Fig.13 HIDROLASAS

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-efuncoes1.php, 2007

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LIASAS
Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u algn otro,
por medios diferentes a la hidrlisis o a, la oxidacin, con formacin de
un doble enlace en alguno de los dos fragmentos. Cuando ellas actan
en sentido inverso -condensacin de dos molculas con desaparicin de
un doble enlace se les designa con el nombre de sintetasas.
Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub.
clases precisan la identidad de la fraccin eliminada: CO2, aldehdo,
amoniaco, etc. El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo,
substrato: fraccin eliminada-liasas.

Fig. 14: Liazas. Condensacin de molculas con desaparicin de doble enlace

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-efuncoes1.php, 2009

ISOMERASAS
Catalizan las reacciones de isomerizacin: racemizacin, epimerizacin,
isomerizacin
cis-trans,
o
tambin
originan
modificaciones
intramoleculares tales que transfieren un agrupamiento o producen
oxidorreduccin.
Para su nomenclatura se retiene el principio "substrato. . .asa", pero el
trmino isonerasa se reserva a ciertas subclases; un prefijo hace
precisa la naturaleza de la isomerizacin, por ejemplo cis-trans
isomerasa.

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Fig. 15: Ejemplo de Isomerizacin

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-efuncoes1.php, 2009

LIGASAS O SINTETASAS
Son enzimas que catalizan la reaccin de unin de dos molculas,
acopladas a la ruptura, sin intervencin del agua, de un enlace
pirofosfrico en el ATP o eventualmente en un nucletido trifosfrico del
mismo tipo.
Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - , C S, C - N, C - C) y la sub-subclases se refieren a la naturaleza del producto formado (amida, pptido, etc.) o a la reaccin que es catalizada.
El nombre sistemtico es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa
(formando ADP), X Y , son los dos substratos que se condensan; el
producto formado a partir del nucletido trifosfrico implicado .en la
reaccin (ADP o AMP) se indica entre parntesis.
Para darle nombre comn se utiliza, en general, el nombre del producto
formado seguido del trmino "sintetasa".
Fig. 16: Ligazas

Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-efuncoes1.php, 2009

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Leccin 18:

Cintica enzimtica

El objeto de la cintica enzimtica es el estudio de las enzimas en su


funcionamiento. Se propone, en particular, establecer las relaciones que
existen entre la velocidad de la reaccin enzimtica y las
concentraciones del substrato (S) y de la enzima (E), as como la
influencia de algunos factores: pH, temperatura, presencia de efectores
y eventualmente, actividad del agua.
La Comisin sobre Enzimas ha definido una unidad internacional de
actividad enzimtica, el katal, cantidad de enzima que transforma un
mol de substrato por segundo bajo las condiciones experimentales
estndar. Esta es una unidad de valor elevado: por ello se utilizan ms
corrientemente sub. mltiplos de ella: microkatal (JLkat), nanokatal
(nkat) y picokatal (pkat), que valen, respectivamente 10-6, 10-9 y 1012 katal (kat).
Las enzimas se pueden presentar bajo la forma pura, o bajo la forma de
preparaciones enzimticas, ms o menos purificadas. Con frecuencia es
interesante determinar la actividad enzimtica de una cantidad unitaria
de preparacin enzimtica no purificada o de una enzima purificada. Se
refiere entonces la actividad, sea a 1 kilogramo de protena, sea a una
molcula gramo, as se define una actividad especfica, katal por kg de
protenas y una actividad molar, katal por mol de enzima.

Enzimas Michaelianas
Principales hechos experimentales: Debemos subrayar, como un
prembulo, la necesidad absoluta de que las enzimas sean puras y
desprovistas de actividad parsita.
Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes
generales de la cintica enzimtica son:
a) El substrato, S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario
transitorio ES. Este complejo resulta de una complementaria de la
estructura entre el sitio activo de la enzima y la molcula del substrato.
b) La velocidad de la reaccin en el tiempo t, es decir la velocidad de
dS/dP desaparicin del substrato, o de aparicin del producto, dt/dt
que se representa por la pendiente de la tangente a la curva, P o S =

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f(t) no es constante para las concentraciones dadas en enzima o en


substrato (fig.9), y disminuye en funcin del tiempo debido a la
desaparicin del substrato en el curso de desarrollo de la reaccin.
Siempre, al principio de la reaccin, se puede considerar que la
tangente a la curva se confunde con aqulla en que la velocidad permanece constante.
Los estudios de cintica enzimtica corresponden siempre a esta parte
lineal de la curva; lo que implica el trabajar a velocidades inciales. En
estas condiciones, al principio de la reaccin, la concentracin en
producto es muy dbil; puede despreciarse, as como la reaccin inversa
de transformacin del producto en substrato. Entonces se puede escribir
k1
E + S

k3
ES

E + P

k2

Figura 17:

Cintica enzimtica

Fig. 9. Curva de aparicin del producto en funcin del tiempo

Fuente: Scriban, Biotecnologa, 1992

c) Por otra parte, para una concentracin dada de substrato, el estudio


de las variaciones de la velocidad inicial de reaccin en funcin de la
concentracin de enzima (fig. 18) muestra que esta variacin no es
lineal. La curva presenta un trazo hiperblico correspondiente al hecho
de que para una cierta concentracin de enzima, la totalidad del
substrato se encuentra bajo la forma de complejo enzima-substrato; lo
que resulta que la velocidad inicial, funcin de la concentracin de este
complejo, permanece constante. Para los estudios cinticos, es
1985

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necesario situarse en las condiciones que corresponden al principio de la


curva, donde es lineal, es decir a concentraciones bajas de enzimas.

Fig. 18. Curva que representa la velocidad enzimtica en funcin de la concentracin de


la enzima

Fuente: Scriban, Biotecnologa, 1985

En otros trminos, la cantidad de enzima debe ser pequea en


comparacin a la concentracin del substrato, de tal manera, que la
formacin del complejo enzima-substrato, ES, no modifica, o modifica
poco la concentracin del substrato,

Hiptesis de Michaelis-Menten: Al establecer la ecuacin de la


velocidad, Michaelis y Menten toman como principio de que la velocidad
de transformacin del complejo ES en E + P es muy lenta, con relacin a
la velocidad de la ruptura del complejo que vuelve a dar E + S.
Esta hiptesis significa que k3 ~ k2 Y que E y ES estn en equilibrio,
sea:

Hiptesis del estado estacionario de Briggs y Haldane: Estos autores


consideraron que la hiptesis de Michaelis-Menten es demasiado

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restrictiva y que es preferible postular un estado estacionario, estado


para el cual la velocidad de formacin del complejo ES es igual a su
velocidad de descomposicin en todas las direcciones (formacin de
productos y aumento del substrato).
Velocidad de formacin de ES = k1 [E] [S]
Velocidad de desaparicin de ES = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3)
[ES]
El estado estacionario se describe entonces:

Al escribir que la cantidad de enzima que se ha puesto en el medio de


reaccin [ET] se reparte en una fraccin libre [E], y una fraccin que
forma un complejo [ES], se tiene:
[ET] = [E] + [ES]
Al sustituir E por su valor, se obtiene:

La velocidad de formacin del producto est dada por: v = k3 [ES], la


ecuacin general es de la forma:

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Ecuacin de Michaelis-Menten: Cuando la concentracin en substrato


cambia al infimito; la velocidad inicial tiende hacia k3 [Er], o sea hacia
la velocidad mxima V m; toda la enzima se encuentra entonces bajo la
forma ES.
La ecuacin es en su forma ms simple:

Esta es la ecuacin de Michaelis-Menten, segn la cual la velocidad de la


reaccin enzimtica es una funcin hiperblica de la concentracin del
substrato.
Los resultados experimentales en el caso de las enzimas michaelianas
con un solo substrato corroboran la validez de esta ecuacin.
Significacin de Km Y de Vm: Vm representa la velocidad mxima que
puede alcanzar la reaccin: toda la enzima se encuentra bajo la forma
compleja ES.
Cuando la velocidad de la reaccin alcanza la mitad de la velocidad
mxima, v = 1/2 Vm, Km es entonces igual a (S].
Si kz > k3, Km = kz/k1 que es la hiptesis de Michaelis-Menten : [E] +
[S] y [ES] estn en equilibrio y la formacin del producto representa
una ligera fuga. En este caso, Km puede ser asimilada a la inversa de la
afinidad de las enzimas por el substrato. Mientras ms pequea sea Km,
mayor ser la afinidad y viceversa.
Si kz < k3, la hiptesis de Michaelis-Menten no tiene validez y Km ya no
tiene relacin con la afinidad de la enzima por el substrato. Tambin es
preferible considerar Km como una constante emprica igual a la
concentracin del substrato para la cual la velocidad inicial es igual a V
m/2en las condiciones experimentales definidas.
Reversibilidad y relacin de Haldane: En distintos puntos de la curva las
reacciones enzimticas son reversibles, es decir las enzimas pueden
catalizar la reaccin inversa:

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Keq = constante de equilibrio de la reaccin global. Como


se explica en la siguiente grfica:
Representacin grfica de la cintica michaeliana de un substrato: La
representacin de Michaelis-Menten, v en funcin de S.

Figura 11: Representacin grfica de


Michaelis-Menten

Fuente: Scribian, Biotecnology, 1990

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Esta relacin resalta la interdependencia de la constante de equilibrio y


de los parmetros cinticos de una reaccin enzimtica reversible y
muestra que no es posible olvidar la reaccin inversa en la que los
productos se acumulan.
Enzimas alostricas
Las enzimas con mltiples subunidades tienen estructura cuaternaria.
Una consecuencia de las subunidades mltiples es que cada subunidad
cataltica individual tiene su propio centro activo. Esto significa que una
enzima con estructura cuaternaria puede unir ms de una molcula de
sustrato. Alostrico significa "forma diferente". Las enzimas alostricas
cambian de forma entre las formas activas e inactivas como resultado
de la unin de los sustratos en el centro activo y de las molculas
reguladoras en otros sitios. En el caso simple de una enzima alostricas
con una forma activa e inactiva, el cambio en la velocidad de reaccin
con el incremento de la concentracin de sustrato es tpicamente una
curva de forma "S".
El significado de la curva de forma S para una enzima alostricas A
bajas concentraciones de sustrato, la enzima est en la forma inactiva
(conformacin inactiva). Cuando la concentracin de sustrato aumenta,
el sustrato se une a la enzima y provoca un cambio de conformacin a
la forma activa de la enzima. Despus de que el primer sustrato este
unido, la segunda y siguientes molculas de sustrato se unen con mayor
afinidad. Este fenmeno es lo que se llama "cooperatividad", y la forma
S de la curva indica la unin cooperativa del sustrato. El resultado del
cambio a la forma activa es un fuerte incremento en la unin de los
otros sustratos, y como resultado, la velocidad de reaccin aumenta
muy rpidamente en un estrecho margen de concentracin de sustrato.
Cuando todos los centros activos de una enzima alostricas estn
ocupados con sustrato, la velocidad de la reaccin es constante y se
alcanza la meseta de la Vmax.
Figura 19: Curva de enzimas alostricas

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Leccin 20: Produccin de enzimas


La produccin mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5
millares de millones de dlares, 60% de ellos con utilizacin en las
industrias agroalimentarias.
Las enzimas que se utilizan en procesos agroalimentarios son objeto de
una reglamentacin estricta, en lo que concierne a su produccin, su
pureza qumica y microbiolgica. En su presentacin comercial, sea bajo
la forma ms o menos diluida, fijada sobre soportes inertes, o diluyentes
estn tambin igualmente reglamentadas. Las enzimas, biocatalizadores
utilizados en la bioindustria o en otras diversas industrias (farmacia,
textiles, pieles...) pueden provenir de varias fuentes, especialmente:
De origen vegetal, de origen animal y de origen microbiano. Cada una
de estas fuentes se estudiar tomando en cuenta slo algunos ejemplos.
Enzimas de Origen Vegetal
Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por
orden decreciente de inters tecnolgico, una de las ms importantes
enzimas vegetales de uso industrial se encuentran: la papana que
proviene de una planta ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la
bromelina, extrada de la pifia (Ananas comosus Merr) y la ficina
proveniente del higo (Ficus carica).

La preparacin de papana industrial ms pura (papana refinada) ha


sido desarrollada en 1969 por Baudard en Zaire (Jones y Mercier, 1974).
El ltex fresco es guardado en fro, agitado, diluido, centrifugado,
filtrado sobre kieselgur y a travs de placas esterilizantes, a fin de
eliminar toda impureza y finalmente atomizada al vaco a 50C. Se debe
obtener un polvo blanco y evitar por un lado cualquier obscurecimiento
debido a la oxidacin y el empleo de temperaturas anormales, adems
evitar toda infeccin microbiolgica (Escherichia co/i, Salmonella, . . .).
El ltex fresco contiene alrededor de 12% en peso de papana.

Son numerosas las aplicaciones de la papana industrial (alrededor de


300 ton.), de las cuales se usa 75% en la industria cervecera para la
estabilizacin coloidal de la cerveza; 10% en la industria de la carne
(ablandamiento), 5% en la fabricacin de hidrolizados de pescado
destinados a la alimentacin animal, 2% en la industria farmacutica,

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entre otros. La tasa de utilizacin puede variar seriamente en funcin de


la legislacin alimentara de cada pas. El desarrollo de la papana
industrial es ciertamente interesante de seguir, pues puede sufrir
fluctuaciones por razones diversas (produccin, acontecimientos
polticos, cambios de tecnologas). En los ltimos aos se han
introducido exigencias muy estrictas sobre la calidad del producto.
Enzimas de origen animal
Un ejemplo importante de este tipo de enzimas en la pepsina, esta
enzima es producida industrialmente a partir de la mucosa gstrica del
cerdo donde se encuentra en forma de un precursor, el pepsingeno,
de una masa molecular de 42,000. La preparacin industrial de la
pepsina se puede hacer de acuerdo a varios mtodos: en general se
practica la auto digestin de mucosas gstricas de cerdo, raspadas y
trituradas, en medio acuoso. acidificado con cido clorhdrico, en
presencia de cloroformo. Despus de flltracin se efecta una
concentracin por liofilizacin. La pepsina purificada es blanquecina y
soluble en agua.
Su actividad enzimtica es ms elevada entre pH 1 Y 4 con un mximo a
valores de 1.8 y vara segn la naturaleza del substrato; es
termosensible en solucin arriba de los 55C, lo que limita su utilizacin
en tecnologa.
Sin embargo, puede ser utilizada en bebidas refrescantes, en cervecera
en el transcurso de la estabilizacin coloidal durante la pasteurizacin en
botellas (Trolle, 1949) en razn de su actividad en medio cido (pH de la
cerveza = 4 a 4.5). Tiene, como la papana, la propiedad de precipitar
las protenas o los polipptidos en medio lquido (leche, cerveza.)
(efecto "coagulante ").
Finalmente es necesario advertir que la pepsina puede provocar la
hidrlisis de enzimas como las amilasas, la tripsina, la papana
industrial, lo que debe tenerse en cuenta para su uso tecnolgico
ocasional.
Enzimas de Origen Microbiano
Desde que el desarrollo de la microbiologa ha permitido comprender
mejor los sistemas que condicionan la sntesis de enzima s en los
microorganismos, la produccin industrial de enzimas se ha orientado
hacia los procesos de fermentacin. Las principales ventajas de las
enzimas en la fermentacin con relacin a las enzimas en la extraccin
son las siguientes:

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- Una produccin independiente de restricciones estacinales o geogrficas.


- La posibilidad de utilizacin de materias primas de fcil adquisicin.
- Los rendimientos en la produccin se pueden aumentar en proporcin
importante al mejorar las capas microbianas y aplicar las pti mas
condiciones de fermentacin.
Por otro lado, las enzimas de origen microbiano presentan propiedades y
especificidades diversas.
Estas ventajas predominan sobre los inconvenientes propios de las
industrias de fermentacin (fuertes inversiones, consumo de energa,
riesgos de contaminacin...) y en el transcurso de los ltimos treinta
aos se han desarrollado un nmero importante de fermentaciones
productoras de enzimas.
Las principales producciones se presentan en la Tabla 1.
Tabla 4: Produccin de enzimas microbianas
Enzima

Toneladas
de
enzima pura/ao

PROTEASA

500

GLUCOAMILASA

300

AMILASA

300

GLUCOSA
ISOMERASA

50

AMILASA FNGICA

10

PECTINASA

10

PROTEASA FNGICA

10

RENINA
MICROBIANA

10

Fuente: Aunstrup y col., (1979)

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La fundamentacin de la produccin de enzimas microbianas exocelulares es muy simple: un microorganismo es cultivado en un medio
apropiado, a partir del cual es extrada la enzima (para las enzimas
endocelulares es necesario Un tratamiento previo de la biomasa). Los
problemas radican en los detalles de proceso.
En la Industria alimentara, existe una gran variedad de enzimas de
mucha importancia. En el cuadro (2) se muestran algunos ejemplos:
Produccin Industrial de enzimas
En la produccin industrial de las enzimas se consideran las siguientes
etapas. (Scriban, 1985)
A. Definicin de la enzima que se busca
La produccin de una enzima industrial que responda, en principio, a
una exigencia potencial de quienes la pueden utilizar, hace necesario
determinar las propiedades que esta enzima pueda tener.
Prioritariamente, de acuerdo a Sicart (1980):
- La especificidad: Aunque en la industria las enzimas sean utilizadas
para la hidrlisis de macromolculas complejas en las cuales los sitios de
acoplamiento con, frecuencia se desconocen, el efecto global que se
busca involucra, generalmente, la utilizacin de un tipo preciso de
enzima. En ciertos casos, como sucede con la pectinasa, una enzima
asocia tres actividades diferentes, y se debe precisar estrechamente la
relacin entre estas tres actividades de acuerdo al producto que se vaya
a tratar.

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Tabla 5: Enzimas utilizadas, en la industria alimenticia.

Fuente: http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_54.asp,
(2008)

- El valor ptimo de pH: Este factor tiene una influencia variable segn
las enzimas; algunas de ellas, como la proteasa alcalina an son activas
a pH = 10, en tanto que las enzimas fngicas funcionan an a pH = 3.
- El valor ptimo de temperatura: Generalmente, quienes utilizan enzimas se interesan en poder disponer de enzimas que soporten temperaturas elevadas, ya que estas temperaturas conservan en parte la
esterilidad del medio de fermentacin.
Despus, es necesario definir el sistema que se adoptar para medir su
actividad, pero conviene disociar la nocin de actividad que se aplica a
la cantidad de enzima presente en una preparacin, la que se puede
determinar mediante un mtodo de laboratorio, de la nocin de eficacia
que caracteriza el comportamiento de la misma preparacin colocada en
las condiciones industriales en las que vaa utilizarse. (Sicart, 1980).

B. Seleccin de una cepa microbiana

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Los microorganismos que son capaces de producir enzimas de


degradacin de ciertos compuestos se localizan generalmente en donde
abundan esas substancias. Por ejemplo, los microorganismos que
secretan celulosas son numerosos en el suelo de los bosques.
Inicialmente, las cepas se han aislado del suelo o de elementos
naturales.

Los mtodos de aislamiento que se utilizan son los mtodos clsicos, el


ms importante es el cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub
cultivo en un medio selectivo. En el medio selectivo ideal, el substrato
de la enzima es la nica fuente de uno de los elementos vitales. Por
ejemplo, el almidn como nica fuente de carbono. para aislar a los
microorganismo s que tienen una amilasa.
Las tcnicas de difusin en agar se han desarrollado para la deteccin
de la actividad enzimtica. Esta prueba, en las condiciones estndar,
puede dar informacin de orden cualitativo. Para que la cepa aislada sea
retenida definitivamente debe presentar algunas caractersticas, de
acuerdo a Aunstrup y col. (1979) y Sicart (1980):

- Desarrollarse sobre un medio sencillo fcilmente asequible.


- Producir el menor nmero posible de metabolitos secundarios, como
antibiticos, por ejemplo.
- Excretar la enzima en forma que se facilite su separacin y su purificacin. .
- No originar contaminantes diversos
- No ser patgena ni producir compuestos txicos.
Con los progresos de la gentica, las posibilidades de mejoramiento de
las cepas son, tericamente, ilimitadas; por una 'parte por una
mutacin, por otra parte, mediante la nueva va de la ingeniera
gentica.
En cualquier forma, la gentica de los microorganismos que se utilizan
en la produccin industrial de enzimas (Bacillus, Aspergillus) an est
mal conocida para que puedan realizarse las aplicaciones de la
ingeniera gentica y son las mutaciones las ms utilizadas.

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Las cepas industriales deben ser protegidas contra la degeneracin, la


prdida de viabilidad y las contaminaciones. Los medios ms seguros
son la liofilizacin o la conservacin a temperatura del nitrgeno
lquido. Estas tcnicas permiten conservar las cepas casi indefinidamente.

C. Produccin industrial de la enzima


Tradicionalmente, las enzimas microbianas eran producidas por cultivo
en superficie, en una delgada capa de medio lquido o de medio
semislido. Esta tcnica es an utilizada para algunas producciones, en
particular de enzimas de origen fngico, tales como las amilasas de
Aspergillus, las proteasas de Aspergillus y de Mucor o las pectinasas de
Penicillium. Pero existen varios problemas en el control de la
temperatura, de la aireacin y de la humedad, por ello se prefieren los
cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos en medio
lquido, profundos, agitados, son mejor adaptados a los diferentes
controles mediante mtodos modernos y reducen los riesgos de
contaminacin. Adems se prestan mejor a las operaciones de
extrapolacin y de optimizacin necesarias para el paso del fermentador
piloto de laboratorio al fermentador industrial.
Preparacin del inculo
En esta etapa de preparacin del inoculo, la capacidad de produccin
de la cepa debe conservarse y eliminarse todo riesgo de
contaminacin. Para ello es necesario evitar que haya un nmero
excesivamente grande de cultivos sucesivos. Es preferible el sembrar
directamente un matraz de medio gelosado, a partir de la cepa
liofilizada, despus, a partir de este cultivo se sembrar un nico
fermentador que servir el mismo de inculo para el fermentador
industrial. El volumen del inoculo representa generalmente de 3 a 10%
del volumen del fermentador de produccin y la composicin del medio
para la preparacin del inculo se aproxima bastante a la del medio de
produccin. El tiempo de permanencia en el fermentador vara de 10 a
80 horas segn el procedimiento, la cepa, las condiciones de cultivo, .
. . (Aunstrup y col., 1979)
D. Composicin del medio de cultivo
El medio de cultivo debe contener la fuente de carbono, la fuente de
nitrgeno y los principales factores de crecimiento necesarios para la
cepa microbiana. Se pueden adicionar ciertos factores para abreviar la
fase de latencia. De todas formas, la produccin de enzima puede no

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tener lugar a pesar de que el medio sea el conveniente para un buen


desarrollo. Hay que tomar en cuenta la necesidad de un inductor, de las
represiones posibles debida a algn componente del medio, de la
represin catablica producida por la glucosa. Esta represin puede ser
evitada reemplazando la glucosa por glcidos fermentables lentamente
o por almidn parcialmente hidrolizado.
Para aumentar la productividad, se utilizan medios concentrados, pero
esta concentracin puede igualmente -ser causa de aumento en la
presin osmtica y dificultar la aireacin.
A menudo se adicionan sales para complementar la cantidad de
nitrgeno en el medio
E. Fermentacin y equipo necesario
Vincent y Priestley (1975) han detallado las condiciones de fermentacin
que deben mantenerse para producir una enzima.
Los fermentadores utilizados habitualmente contienen volmenes de
100 a 200 m3. Deben estar equipados de un sistema de agitacin de
gran potencia, capaz de agitar medios relativamente viscosos, ya que
pueden contener hasta 350 g/lt. de materia seca (Sicart, 1980).
Los fermentadores estn equipados de una corona clsica de aereacin,
ya que la mayor parte de las fermentaciones productoras de enzimas
tienen una fuerte demanda de oxgeno. Generalmente, estas
fermentaciones son conducidas en condiciones limitadas de oxigenacin.
Para la glucoamilasa, la productividad est limitada a la transferencia de
oxgeno (Aunstrup y col., 1979).
Los equipos de medicin y de control del fermentador permiten seguir y
regular los parmetros del cultivo. Los controles se ejercen
generalmente sobre el pR, la temperatura, el oxgeno disuelto, la
espuma y la evolucin de la concentracin de ciertos nutrientes. Adems
la medicin de la aparicin de la actividad enzimtica se efecta a
intervalos regulares por el laboratorio de control. An no existen
reguladores que permitan hacer esas mediciones en forma continua.
(Sicart, 1980). Esta medicin es importante porque de ella depende la
decisin de detener la fermentacin.
Para la produccin de enzimas, son necesarias condiciones rigurosas de
asepsia, por una parte para obtener un buen rendimiento, por otra parte
para no tener el riesgo de secrecin de substancias txicas como
contaminantes. Esta asepsia es difcil de mantener, siendo el medio muy
rico y el pH cercano a la neutralidad.

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Se necesita tomar precauciones a nivel de la construccin del fermentador y para la eleccin de las instalaciones y los equipos colaterales.
Durante toda la fermentacin, una ligera supresin de aire en el
fermentador impide la penetracin de contaminantes, esta precaucin la
refuerzan las protecciones de vapor en todos los puntos de
comunicacin con el exterior (fig. 20).
An no se ha establecido el modelo cintico general para la sntesis de
enzimas, pero, ya se ha estudiado la regulacin de la formacin de
algunas enzimas. Algunas enzimas se forman durante la fase
exponencial de crecimiento, pero la mayor parte aparecen en la fase
postexponencial. Segn sean las enzimas y los procedimientos, la
fermentacin dura de 30 a 150 horas. La cantidad de protena -enzima
en el medio, al final de la fermentacin, representa de 1 a 5% de la
materia seca inicial, en tanto que la biomasa celular puede alcanzar de 2
a 10%.
La calidad de las enzimas producidas est en estrecha relacin a la
forma en que se condujo la fermentacin. La seleccin de las materias
primas, el mtodo de esterilizacin, el procedimiento para regular la
formacin de espuma, la aireacin y la agitacin, as como la duracin
de la fermentacin afectan, no solamente al rendimiento y al costo de
produccin, sino tambin al color, olor y a la estabilidad de la enzimas
Fig. 20: Esquema para una produccin de fermentacin
para la produccin de enzimas

Fuente: Aunstrup, 1979

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Utilizado este biocatalizador. En la prctica, la mayor parte de las


operaciones industriales se realizan de forma discontinua, en lotes,
con la renovacin de la enzima al principio de cada ciclo.
Para los enzimlogos, la fijacin sobre un soporte realiza un modelo
cercano a las condiciones de la clula viviente, en donde las enzimas
se encuentran con frecuencia asociadas a la membrana a organelos
intracelulares.
Desde 1916, Nelson y Griffin haban demostrado que la invertasa
adsorbida sobre carbn activo, conservaba su actividad. Pero de
cualquier modo hubo que esperar hasta la dcada de los 50's para que
aparecieran las primeras aplicaciones de esta tcnica, en particular con
los trabajos de Grubhofer y Schleith.
Despus de 1960, las investigaciones se han intensificado y bajo el
impulso de los equipos de Katchalski en Israel y de Manecke en
Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales de las
enzimas inmovilizadas. En1969 Chibata y sus colaboradores
desarrollaron en Japn el primer reactor industrial con enzima fijada,
una L-aminocidos a partir de la correspondiente mezcla racmica.
Esta tcnica permitira, segn los autores, disminuir el precio de costo
a menos del 40% con relacin al procedimiento convencional.
En la actualidad, se han desarrollado numerosos mtodos de fijacin de
inters para ms de 100 enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como
en escala piloto y se ha abierto un campo de experimentacin, despus
de algunos aos, para la inmovilizacin de clulas intactas, vivas o
muertas. Esta multiplicacin de trabajos ha dado lugar a una abundante
literatura cientfica.
Inmovilizacin de enzimas
La actividad de las enzimas est ligada al mantenimiento de la
integridad de su conformacin temaria, en particular al nivel de su sitio
activo. Los procedimientos de inmovilizacin deben, por consiguiente,
ser mtodos suaves, bien regulados, que respeten la estructura nativa
de la protena, que los enlaces que se crean entre el soporte y la
enzima, excluyan los cidos aminados involucrados directamente en la
reaccin cataltica..
Se han propuesto diversos tipos de mtodos y en 1971, en la primera
conferencia de Ingeniera Enzimtica de Henniker (E.U.A.) se defini una
clasificacin de enzimas inmovilizadas, segn el mtodo de fijacin
utilizado.

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Figura 21: Clasificacin de formas de obtencin de enzimas

En esta clasificacin, las enzimas inmovilizadas se consideran como un


caso particular de las enzimas modificadas. Despus apareci la tcnica
de reticulacin (enlazamiento cruzado) en el cual las molculas
enzimticas son polimerizadas por intermedio de un ligando
polifuncional.
- Propiedades de las enzimas inmovillzadas
Los efectos de la inmovilizacin sobre la actividad de las enzimas
resultan de la interaccin de diferentes factores:
a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a
causa
de tensiones durante la fijacin.
b) Modificaciones
electrostticas.

del

microambiente:

pH

local,

interacciones

c) Fenmenos disfusionales en el interior del complejo.


d) Impedimentos estricos.
Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y
la estabilidad de la enzima.
- Medicin de la actividad

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Las condiciones ptimas de accin de las enzimas inmovilizadas difieren


a menudo de las de las enzimas en solucin y deben ser perfectamente
conocidas para evitar todo riesgo de error de interpretacin. As para la
ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de pH 7.7 no alcanza sino a
75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de 100% a pH
7.1.17
La Comisin Internacional de Hennicker en 1971,ha propuesto caracterizar la actividad de los complejos por la velocidad inicial de reaccin
expresada en microkatales (JIkat): cantidad de producto formado en
micromoles por segundo y por mg (materia seca) o por unidad de
superficie del soporte; precisando las condiciones de determinacin de la
materia seca, el tenor en protenas fijadas y la actividad especfica de la
enzima antes de la inmovilizacin.
Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilizacin entraa con
frecuencia una prdida de actividad, muy variable segn sea la
naturaleza de la enzima y el modo de fijacin; pero tambin se han
sealado algunos casos en los que hay aumento de actividad. Estas
variaciones en un sentido o en otro podran explicarse por una
modificacin estrica del sitio activo de la enzima bajo el efecto de un
cambio de conformacin de la cadena polipeptdica.
Gracias a la gran especificidad en su accin, las enzimas constituyen
una herramienta de fabricacin y de anlisis indispensable en
numerosos sectores de la investigacin, del control y de la produccin
industrial.
La introduccin de las tcnicas de insolubilizacin de los
biocatalizadores suscita un inters considerable en razn de las ventajas
que presenta: tratamientos en continu, control automatizado,
mejoramiento de los rendimientos por unidad de enzima, obtencin de
derivados ms puros, disminucin de requerimientos energticos. . . y
los recientes desarrollos de los mtodos de inmovilizacin de clulas
enteras han abierto nuevas perspectivas.
A pesar de los numerosos trabajos de investigacin, las instalaciones de
produccin industrial son an muy limitadas. Es necesario buscar la
causa en la complejidad del funcionamiento de los reactores, en donde
la matriz es a menudo muy delicada y en la gran inestabilidad de los
catalizadores biolgicos; sin olvidar las limitaciones debidas a
regulaciones legales.
La obtencin de nuevas fuentes de enzimas ms estables, el desarrollo
de sistemas multienzimticos, la recuperacin y la re utilizacin de

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cofactores de. Las enzimas son las vas de investigacin susceptibles de


ampliar el campo de las aplicaciones actuales:
AUTOEVALUACIN
1. Realice un Glosario, del captulo estudiado:
2. Realice una investigacin bibliogrfica sobre las enzimas ms
importantes en la industria alimenticia, escoja una de ellas y realice un
diagrama de flujo para la produccin de la misma.
3. Para mayor comprensin lea el articulo de Miguel Arroyo en el
siguiente link: Inmovilizacin de enzimas: Fundamentos, mtodos y
aplicaciones. Y realice una comparacin de los diferentes mtodos
teniendo en cuenta sus ventajas y desventajas.

CIBERGRAFIA:
http://www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html.
Sitio
que
informacin acerca de las enzimas, su funcin y caractersticas.

incluye

http://minnie.uab.es/~veteri/21264/t4_els_enzims.pdf. Las enzimas en


los alimentos
Biotecnologa de los alimentos. Introduccin. ILSI International Life
Sciences Institute. Serie de monografas concisas de ILSI Europa.
http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/
Alimentos y tecnologa de modificacin gentica. Salud y seguridad en el
consumidor. ILSI International Life Sciences Institute. Serie de
monografas concisas de ILSI Europa. http://www.ilsi.org/ y en
Argentina http://argentina.ilsi.org/

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CAPTULO 11: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA


BIOTECNOLOGA

El principal objetivo de la ingeniera gentica en el campo de la


Biotecnologa es alterar la composicin gentica de los seres vivos de
importancia industrial, con el fin de incrementar la eficiencia global del
proceso para el que se emplea dicho ser vivo. Aunque el objetivo
principal es incrementar el rendimiento de un producto especfico, es
interesante tener en cuenta otros parmetros, particularmente los que
se refieren a las mejoras en las caractersticas de crecimiento y la
eliminacin de subproductos perjudiciales. (Wiseman, A,1986)

El desarrollo de organismo sper productores, se considera el principal


objetivo de este campo de la biotecnologa, aunque se podran aadir
otros dos: en primer lugar, la obtencin de nuevas especies que
produzcan productos nuevos o modificados y en segundo lugar, el
conocimiento de las rutas biosintticas que conducen a la produccin de
metabolitos de inters comercial, as como mecanismos de control que
regulan estas rutas. (Wiseman, A. 1986)
La estructura y funcin bsica de los genes se conoca desde finales de
los aos sesenta. Ms an, la labor de los bioqumicos haba producido
un gran cmulo de conocimientos respecto de los conjuntos de
reacciones qumicas que ocurren dentro de los seres vivos. Las vas
metablicas fundamentales para la generacin de energa y la
biosntesis de la mayora de los compuestos esenciales para la vida ya
estaban establecidas. (Saberon, 1997)
Este conocimiento se basaba en la aplicacin inteligente de mtodos de
ensayo y purificacin de enzimas clave, y de la identificacin y anlisis
de sus sustratos y productos. Al mismo tiempo, otras disciplinas como
la inmunologa y la gentica, realizaban avances y eran actividades de
gran complejidad y finura.
La biologa molecular, sin embargo, se encontraba en un punto en el
que su desarrollo se haba hecho muy lento. Una vez sentadas las bases
fundamentales de la replicacin y expresin de la informacin gentica,
el siguiente paso era desentraar; en forma detallada, los mecanismos
de regulacin de la expresin gentica.

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Todas las vas metablicas, la expresin de anticuerpos, la actividad de


los virus, en fin, todas las manifestaciones del fenmeno viviente, estn,
en ltima instancia, orquestados por la expresin ordenada y regulada
de los genes, por medio de la produccin de protenas especficas.
El extraordinario proceso por el cual una sola clula, el huevo
fecundado, da origen a un organismo complejo, es decir; las etapas de
diferenciacin celular; constitua un reto extremadamente atractivo,
pero a la vez formidable. Un descubrimiento clave inici el cambio
dramtico que conocemos hoy como ingeniera gentica o ADN
recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel Nathans descubren una
enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias especficas,
que les vali el Premio Nobel de fisiologa o medicina, compartido con
Werner Arber, en 1978.
Este descubrimiento (consecuencia de un hallazgo accidental, en el que
los investigadores profundizaron con gran sentido) dio origen a una
sucesin de nuevos descubrimientos y potenci el desarrollo de toda una
serie de otras disciplinas y metodologas. En este captulo revisaremos
los fundamentos de algunas de las ms importantes.

Leccin
21: TCNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIN
GENTICA IN VITRO.

Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o


rompen el ADN. Estos sistemas, llamados de modificacin-restriccin,
son anlogos a un sistema inmune, los cuales probablemente
evolucionaron
como
un
mecanismo
de
proteccin
de
los
microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las bacterias, por
ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacterifagos, que inyectan
su propio ADN en la clula bacteriana para despus controlar su
maquinaria celular y redirigirla hacia la sntesis de sus propios
componentes, dando como resultado final la ruptura de la clula y la
liberacin de cientos o miles de nuevos virus. En algunas bacterias el
ADN propio est modificado en ciertas secuencias. Una enzima de
modificacin se desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa
con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce un pequeo
grupo qumico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de
restriccin, tambin se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la
secuencia GAATTC, corta el ADN en esa posicin. La enzima, sin
embargo, no corta el ADN modificado, por lo que efectivamente es

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capaz de degradar el ADN extrao que puede entrar a la clula, sin


alterar el ADN propio.

Hoy en da se conoce miles de diferentes enzimas de restriccin,


provenientes de otros tantos distintos microorganismos. Ms de cien
distintas
secuencias
pequeas
de
ADN
pueden
ser
rotas,
especficamente, por medio del uso de la adecuada enzima de
restriccin. Otra interesante propiedad de las enzimas de restriccin es
que, en general, reconocen secuencias palindrmicas, es decir;
secuencias que son iguales si se leen en una direccin, o en la direccin
contraria. Por ejemplo:
5GAATTC3
3CTTAAG5

Es una secuencia palindrmica. Cuando acta la enzima que reconoce y


corta esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con
extremos que se proyectan fuera de la doble cadena:
5G AATTC3
3CTTAA G5
Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a
aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de
ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con
otro extremo generado por la misma enzima. Los descubridores de las
primeras enzimas de restriccin pronto se dieron cuenta de que su
accin sobre el ADN (comnmente llamada "digestin") produca un
conjunto definido de diferentes segmentos.
Sbitamente, el ADN dej de ser una sustancia montona y frgil,
donde purificar un segmento especfico resultaba una tarea ardua o
imposible. Al poder generar segmentos especficos, con las enzimas de
restriccin, la molcula de la vida qued a merced del bilogo molecular
y por lo tanto nos facilit el camino para manipular la secuencia del
ADN, de cualquier especie. Este, entonces se convirti en la nueva
herramienta de la Biologa moderna y por lo tanto de la
BIOTECNOLOGA.

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Figura 22. La separacin de los cidos nucleicos


Cuando se utiliza la electroforesis, es posible
visualizar la accin de las enzimas de restriccin. Si
se colocan muestras que contienen ADN de
diversos tamaos en los pozos de un gel en forma
de placa, y se aplica corriente elctrica, la diferencia
de velocidad de migracin de estas molculas las
distribuir, por separado, al cabo de un tiempo,
dentro del gel. Si despus se agrega una sustancia
que se hace luminosa al interaccionar con el ADN y
baarse con luz ultravioleta, directamente se puede
observar el patrn de distribucin de las bandas
constituidas por las molculas de diversos tamaos,
por medio del cual es factible deducir sus
respectivas dimensiones

Fuente: Saberon Maneiro, 1997

Al usar diferentes enzimas de restriccin, se generan


diferentes segmentos. Por ejemplo, si la secuencia
reconocida por la enzima Sall aparece en la molcula
del ejemplo una vez, cortara el segmento en dos
partes. Si la secuencia reconocida por EcoRI,
aparece dos veces, generara tres pedazos. Al usar las
dos enzimas simultneamente, se produciran cuatro
segmentos.

Leccin 22: Tecnologa del ADN recombinante.


Como se menciono anteriormente, los fragmentos generados por las
enzimas de restriccin tienen adems la propiedad de reasociarse unos
con otros, por medio de sus extremos cohesivos. La importancia de
manipular este procedimiento(tambin conocido como tecnologa del
ADN recombinante) es la que nos permite en primer lugar evitar los
mltiples mecanismo que restringen la transferencia de genes entre
organismos no relacionado y, en segundo lugar, que se lleven a cabo
manipulaciones precisas y sutiles aprovechando estas caractersticas del
proceso de recombinacin Este procedimiento consite, entonces, en
cortar el ADN en fragmentos especficos utilizando enzimas llamadas
endonucleasas de restriccin y ligar los fragmentos a un vector, es
decir, una molcula de ADN que es capa de ser incorporada y replicada
por la clula hospedadora..
En resumen,
los elementos esenciales de la tcnica de
recombinante (vase la figura 2): son los siguientes

ADN

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1. Obtencin de
restriccin).

fragmentos

especficos

de

ADN

(enzimas

de

2. Ligacin (o reasociacin covalente) de las molculas para obtener


hebras continas de ADN (enzima ligasa).
3. Mecanismo para introducir al interior de clulas vivas el ADN
recombinante (transformacin).
4. Mecanismo para asegurar la replicacin e identificacin de la
molcula recombinante dentro de la clula (vehculo molecular).
El primer experimento en el que se puso en prctica este concepto,
realmente simple, que se conoce como clonacin molecular se logr al
utilizar plsmidos bacterianos como vehculos y ADN, tambin
bacteriano, como pasajero. (Fig.23)
El producto de la digestin del ADN con endonucleasas de restriccin
est constituido por muchos fragmentos especficos, cuyos extremos son
compatibles o cohesivos unos con otros. Estos fragmentos se ligan
despus a un segmento especial de ADN, el vehculo de donacin
(usualmente un plsmido), que fue cortado con la misma enzima. Las
molculas recombinantes resultantes contienen un ADN vehculo o
vector y un ADN pasajero, constituyendo una nueva molcula circular
continua.
Estas molculas se introducen a clulas bacterianas y se seleccionan por
medio de "genes marcadores" presentes en el vehculo de donacin.
Dentro de su secuencia de ADN los vehculos de donacin contienen
seales que inducen la replicacin del ADN, y otras que producen,
tpicamente, resistencia a algn antibitico. As, las clulas que reciben
una molcula recombinante la perpetan en su interior, y se pueden
detectar porque sta confiere a la clula la capacidad de sobrevivir en
presencia del antibitico

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Fig. 23. Los procedimientos bsicos del ADN recombinante

Fuente: Raven, J. 2002

A. Corte y ligadura del ADN


Hasta el momento hemos mencionado a la ADN ligasa, una importante
enzima que permite ligar o unir molculas de ADN. La investigacin
sobre la fisiologa de los cidos nucleicos ha proporcionado, adems,
una serie de enzimas que se utilizan ampliamente para manipular los
cidos nucleicos en el tubo de ensayo, y que forman parte importante
de las herramientas del ADN recombinante. Cada una de estas enzimas,
al igual que las endonucleasas de restriccin, cumple un papel dentro de
la clula viva, para alterar el material gentico (por ejemplo, para

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repararlo, replicarlo, degradarlo, recombinarlo, etc.). en el laboratorio se


pueden usar estas enzimas, despus de purificarlas de sus fuentes
naturales, para efectuar transformaciones tiles a los propsitos del
experimentador. Por ejemplo, la enzima transcriptasa reversa, que
naturalmente producen ciertos virus para invadir el genoma de sus
clulas blanco, se utiliza ampliamente para clonar genes a partir de sus
ARN mensajeros
Dado que el propio desarrollo del ADN recombinante , ha potenciado, a
su vez el desarrollo de herramientas moleculares, hoy en da contamos
con un enorme nmero de enzimas y reactivos que permiten gran
versatilidad en la manipulacion del ADN.

B- SECUENCIACIN DEL ADN


Una consecuencia inmediata de la clonacin molecular es que permite
disponer de cantidades ilimitadas de cantidades especficos de ADN
pasajero se encuentra formando parte de un plsmido, es factible
separarlo fcilmente del resto del ADN celular, que se encuentra en el
cromosoma bacteriano, una molcula mucho ms grande. A partir de un
cultivo de E. coli, se puede separar suficiente ADN plasmdico para
caracterizarlo. Una vez que se dispuso de genes individuales purificados,
el escenario estaba listo para la siguiente etapa.
Walter Gilbert, en la Universidad de Harvard, y Frederic Sanger, en
Cambridge, Inglaterra, se dieron a la tarea de desarrollar tcnicas para
determinar la ms importante caracterstica del ADN, su secuencia de
bases. Pocos aos despus lograron su objetivo, y compartieron el
Premio Nobel de qumica en 1980. Las tcnicas de secuenciacin
actuales (vase el recuadro II.5) son usadas abundantemente e,
inclusive, han sido automatizadas. A la fecha, genes de las ms diversas
fuentes han sido secuenciados, acumulando una base de datos que
representa cientos de millones de nucletidos: Esta cantidad crece a
paso inexorable y se espera que lo haga cada vez ms aceleradamente .

C. Vectores para el clonaje


Adems de las enzimas que hacen posible la transformacin y
manipulacin del DNA, hay otro elemento indispensable para el trabajo
del ingeniero gentico: los vectores. Los vectores no son ms que los
portadores del fragmento de DNA que se quiere aislar o clonar.

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Se usan tres tipos de vectores diferentes:


Plsmidos
Fagos
Csmidos
Plsmidos: Son molculas de DNA circular de doble cadena
extracromosomales presentes en bacterias que son capaces de
autoreplicarse.
Fueron descubiertos en bacterias, quienes adems de sus
cromosomas principales de 4x 106 bp, poseen estos elementos de
pequeo tamao (~103 bp). Ellos fueron descubiertos como
elementos portadores de la resistencia a antibiticos. El hecho de que
estos genes de resistencia a antibiticos fueran hallados en plsmidos
no fue una casualidad ya que la resistencia a antibiticos requiere de
grandes cantidades de enzima que neutralice quimicamente los
antibiticos. Al estar presentes en un No. De copias mayor que lo que
estuvieran representados en el cromosoma principal.
-

En la naturaleza existen una amplia diversidad de estas molculas.


Ellos especifican:
Resistencia a antibiticos
Resistencia a metales pesados
Sensibilidad a mutgenos
Sensibilidad o resistencia a fagos
Produccin de enzimas de restriccin
Produccin de aminocidos raros
Catabolismo de sustancias complejas

La replicacin de los plsmidos puede o no requerir de protenas


codificadas por ellos y puede o no estar sincronizada con la del
cromosoma bacteriano.
Ya en la dcada de los 70, en los primeros trabajos de Biologa
Molecular y de I.G. se construyeron muchos plsmidos naturales para
ser usados como vectores

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Todos los plsmidos que se usan como vectores poseen tres


caractersticas comunes:
1. Un sitio replicador
2. Un marcador de seleccin
3. Un sitio de clonaje (Polylinker o Multiple cloning site)

Sitio replicador: El replicador es el segmento de DNA que


contiene el sitio a partir del cual se comienza a replicar el DNA
usualmente llamado origen de replicacin: ORI. Este sitio incluye
los genes que codifican para las protenas y RNAs que se
requieren para la replicacin. El nmero de copias de un plsmido
puede ser alto o bajo en dependencia del control al que estn
sometido los replicadores. Este control puede ser de dos tipos:
relajado o restringido
Control relajado: La replicacin del plsmido no depende de las
protenas sintetizados al comienzo del ciclo celular bacteriano:
protenas de la iniciacin de la replicacin. Por tanto estos
plsmidos se pueden amplificar aun cuando se trate la cepa
bacteriana con inhibidores de la sntesis de protenas
(cloranfenicol). Produce un nmero de copias alto del plsmido
(>20 copias por clula en condiciones determinadas)
Control restringido: La replicacin precisa de la sntesis de
protenas inestables que participan en la iniciacin de la
replicacin y por tanto est sincronizada con el ciclo celular o sea
con la replicacin del cromosoma bacteriano. Produce un bajo
nmero de copias (<20 copias por clula)

Marcadores de Seleccin: Los marcadores de seleccin ms


usados sobre todo en bacteria son genes que codifican para la
resistencia a determinados antibiticos.
Los antibiticos son
sustancias qumicas que
producen
la muerte
de
los
microorganismos pero son relativamente poco txicos a las clulas
eucariticas.
Los vectores plasmdicos o de fagos portan genes para la
resistencia a estos antibiticos. Estos genes son normalmente
dominantes y por lo tanto las clulas que los contengan pueden
ser identificadas por su capacidad de crecer y formar colonias en

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presencia del antibitico. Los plsmidos que contienen tales genes


le confieren a las clulas donde son isertados la capacidad de vivir
en presencia de tales sustancias.
Los antibiticos se aaden usualmente a medio slido recin
autoclavado antes que la temperatura haya disminuido por debajo
de 50 oC. En casos de emergencia se pueden aadir directamente
a placas ya preparadas, dando tiempo para que el antibitico
pueda difundir (~60 min). Se deben guardar a 4 oC pues los
antibiticos pierden potencia a RT. Algunos como la Tet y la
Rifampicina deben guardarse en la oscuridad pues son sensibles a
la luz En levaduras se emplea la auxotrofia a determinados
aminocidos como marcadores de seleccin.

Sitio de Clonaje: Es una regin donde un nmero diverso de


enzimas de restriccin tienen sitios de reconocimiento y por tanto
pueden insertarse el DNA forneo sin causar interferencias ni con
la habilidad del plsmido de replicarse ni con su capacidad de
conferirle a la cepa hospedera la resistencia a antibiticos.
Usualmente se le conoce con el nombre de Multiple Cloning Site o
Polylinker

Leccin 23: La Reaccin en cadena de Polimerasa (PCR)

Otro de los avances metodolgicos ms importantes es la reaccin en


cadena de polimerasa (PCR, siglas en ingles polymerase chain reaction).
Este procedimiento constituye un ejemplo sumamente interesante de la
importancia de la metodologa en el desarrollo cientfico. Tambin ilustra
la manera como ocurren muchos de los descubrimientos: a partir de
intuiciones que integran conocimientos que han estado disponibles
durante cierto tiempo.
En efecto hacia 1985 con el ADN recombinante ya plenamente
establecido como una tcnica aplicada rutinariamente por cientos de
laboratorios en el mundo, Kary Mullis, quien a la sazn trabajaba para
la compaa Cetus, en San Francisco, California, tuvo una sbita
inspiracin mientras manejaba su auto y se diriga hacia una cabaa en
la que se dispona descansar el fin de semana. Como muchos otros
investigadores, Mullis se encontraba desarrollando aplicaciones para los
oligos sintticos. Concibi entonces la idea de que combinando el uso de
los oligos con varios ciclos de replicacin in vitro se poda amplificar, es

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decir; obtener en gran cantidad, un segmento de ADN especfico (por


ejemplo, un gene en particular).
En esencia la idea consiste en que la enzima ADN polimerasa participa
en la replicacin del ADN (Ver fig. 3) . Para convertir una molcula de
ADN de doble cadena en dos molculas idnticas, la enzima requiere
que las cadenas de la molcula inicial se separen, para as tener un
molde disponible.
Adems, la enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre,
que sirve para cebar o iniciar la reaccin de replicacin y los nucletidos
precursores. Si se colocan estos sustratos en un tubo de ensayo, la ADN
polimerasa
puede
incorporar
uno
por
uno
los
nucletidos
correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar T en
la cadena creciente; frente a G, C, etc.
En realidad, ste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde
mucho antes de que se concibiera la tcnica de la PCR. Lo original de la
idea de la concepcin de Mullis fue pensar qu sucedera si se aplica
este procedimiento en ciclos sucesivos, en una reaccin en cadena. Los
oligos sintticos, en virtud de su propiedad de hibridacin de los cidos
nucleicos, definen los puntos de partida para el copiado de las cadenas
de ADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia define los extremos de
un segmento determinado de ADN, se hacen hibridar con las hebras del
molde, previamente separadas, y se someten a una reaccin con ADN
polimerasa, de lo que resultarn dos molculas cuyos extremos estn
definidos por los oligos y que corren en sentido opuesto. Las cadenas
resultantes son complementarias entre si: existen ahora el doble de
molculas con la secuencia que demarcan los oligos. , por lo tanto s el
proceso se replica cclicamente entonces, la replicacin del ADN, ser
exponencial. En el siguiente ciclo de separacin de cadenas, hibridacin
con los oligos y reaccin con ADN polimerasa, se obtendrn cuatro
molculas de la regin entre los oligos. Los ciclos subsiguientes
generarn 8, 16, 32, 64 molculas, y as sucesivamente. (Fig. 24 )

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Fig. 24: Replicacin del ADN, utilizando (PCR)

Fuente: Raven, J. 2002

As, con la tcnica de la PCR se pueden amplificar segmentos especficos


de ADN para crear muchos millones de molculas a partir de unas
cuantas, o incluso de una sola. Para esto se requiri adaptar el concepto
bsico haciendo uso de ADN polimerasas provenientes de
microorganismos termfilos (que crecen a temperaturas de ms de 70

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grados en manantiales termales). De otra manera, la enzima se


inactivaba cada ciclo, pues se requiere aplicar calor para separar las
molculas del ADN molde. Hoy da un ciclo puede tomar cinco minutos o
menos, por lo que el proceso de amplificacin se lleva a cabo en menos
de dos horas (normalmente 20 o 30 ciclos son suficientes).
La aplicacin de la PCR, en s misma, constituye
revolucionario en la investigacin biolgica moderna.

un

avance

Leccin 24: Mutagnesis


La tecnologa del DNA recombinante ha abierto todo un nuevo campo de
mutagnesis. Mientras que los mutgenos convencionales actan al
azar, mediante el uso de DNA sinttico y las tcnicas del DNA
recombinante es posible introducir mutaciones en sitos determinados
con toda precisin en los genes. Este proceso se denomina mutagnesis
dirigida. Es de esperar que las protenas fabricadas a partir de cepas que
cuyas mutaciones tengan propiedades diferentes de las protenas de las
cepas silvestres, propiedades que pueden predecirse al conocerse la
estructura de la protena. A continuacin se esquematiza los
procedimientos bsicos utilizados en esta tcnica (Fig. 25)

Figura 25: Mutagnesis

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Leccin 24: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos


Consiste en sintetizar un corto oligo desoxirribonucleotido que contenga
el cambio de bases deseado y dejar que se hibride con un ADN
monocatenario que contenga el gen de inters.

Fig. 26 Mutagnesis dirigida, utilizando


cortos fragmentos de oligo
desoxirribonucetido

El procedimiento completo de mutagenesis dirigida, ha


sido modificado continuamente, encaminadas a
incrementar la tasa de mutantes obtenido, se debe
empezar con el gen de inters clonado en un ADN
monocatenario. Un vector ampliamente utilizado para la
mutagnesis dirigida es el bacterifago M13que tiene
propiedades tiles en la tecnologa del ADFN
recombinante. El AFN diana se clona en M13. Como las
clulas infectadas con este fago permanece viva, se
dispone de una fuente continua de ADN

Esta tecnologa puede utilizarse para obtener un gen


completo. Insertado en la localizacin deseada. Aunque es
difcil sintetizar el gen de una sola pieza, se lo puede
obtener por partes y luego unirlo para producir el gen
completo. Aadiendo sitios adecuados en los extremos del
gen, ste puede unirse luego a un vector y ser clonado. Las
posibilidades de este mtodo son prcticamente
ilimitadas.

Fuente: Brock, Biologa de los microorganismos,


1998

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Leccin 25: Mutagnesis en Casette o interrupcin gnica


Fig. 27 Interrupcin de un gen utilizando la
mutacin por casette: (a) Un plasmado
que contiene una copia clonada del gen X
del tipo silvestre se corta con la enzima de
restriccin EcoRi u se mezcla con un
fragmento de ADN (la casette dela
kanamicina
y que se ha obtenido
utilizando la misma enzima de restriccin.
Se ligan el plsmido cortado y la casete. (b)
El producto dela unin es un plsmido que
ahora contiene la casette de la kanamicina
como una mutacin por insercin dentro
del gen X. (c) La clula transformada
contiene el plsmido linealizado con un
gen X interrumpido y su propio
cromosoma con una copia del gen del tipo
silvestre.

Fuente: Brock, Biologa de los microorganismos, 1998

CAPITULO 6: APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE:

Sin lugar a dudas, estas tcnicas han revolucionado la forma obtener


productos y su comercializacin, sin embargo existen todava muchos
inconvenientes de costos y ticos que aun no se han resuelto. Una de
las mayores controversias se ha suscitado ha raz de la obtencin de
animales y vegetales transgnicos con fines teraputicos y /o
alimenticios.

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Leccin 26: Animales Transgnicos


Las investigaciones con sistemas de microinyeccin y cultivo de
embriones, en la actualidad, permiten introducir genes a varias especies
en forma estable, entre las que se encuentran entre otros animales
como las ovejas.. A partir de las ovejas se obtienen grandes cantidades
de leche, rica en protenas. En efecto, en la medida que sabemos acerca
de la expresin de los genes de la glndula mamaria, podemos pensar
en manipular este sistema para que se elaboren en ella productos
diferentes. Utilizando estos conceptos, ya existen los primeros animales
transgnicos que producen protenas de inters mdico.
La posibilidad de utilizar "granjas moleculares" en las que los animales
producen leche protenas de altsimo valor y utilidad es realmente un
triunfo maysculo de la biotecnologa moderna.( Fig7). Con gran
seguridad, en pocos aos los enfermos con deficiencias de alguna de
estas protenas, por ejemplo los hemoflicos, dispondrn de una fuente
relativamente barata para conseguirlas. Recientemente se anunci ya la
obtencin de vacas transgnicas.
Los animales transgnicos tambin pueden usarse para muchos otros
propsitos.
Fig.28. Mejoramiento gentico de
bovinos

Fuente: Raven, J. Biology, 2002

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Leccin 27: Plantas transgnicas


Las posibilidades de beneficiarnos a travs del mejoramiento gentico
de las plantas ya existentes por medio del trasplante de genes es
enorme, puesto que uno de los problemas que se han generado a partir
del cultivo intensivo es el uso exagerado de fertilizantes y pesticidas.
Debido a esto, el desarrollo de bioinsecticidas ha recibido importante
atencin en los ltimos tiempos. En particular, el microorganismo,
Bacillus thuringiensis, que naturalmente produce una protena txica
(toxina BT) para diversas especies de artrpodos (insectos y arcnidos,
por ejemplo). Estas bacterias pueden ser cultivadas y administradas a
los cultivos, y constituyen un insecticida biodegradable y seguro. El paso
siguiente consisti en introducir el gene que codifica para esta toxina a
una planta de tabaco (por supuesto fusionado a una regin regulatoria
que permitiera su expresin en la planta, particularmente en las hojas).
Las plantas transgnicas resultantes son inmunes a las larvas de
palomillas que normalmente merman este cultivo. Al cabo de consumir
un poco de la hoja, la larva se vuelve inactiva y muere, envenenada por
la toxina BT. Es importante resaltar que esta toxina es completamente
inocua para otros animales, incluido, desde luego, el ser humano.
Una caracterstica muy interesante del reino de las plantas es que para
vivir se han adaptado a ambientes extremos, ya que no pueden huir de
ellos. As, encontrarnos plantas capaces de vivir en condiciones de
sequa, salinidad, etc. Tambin los vegetales han desarrollado funciones
para defenderse de ser ingeridas indiscriminadamente. Cada especie
animal gusta slo de ciertas plantas y las puede comer sin enfermarse.(
Por encima de todo esto, los seres humanos tendemos a ser muy
selectivos en nuestra alimentacin. Algunos de nosotros slo
compramos frijol "flor de mayo", sin importarnos si nos resulta un poco
ms caro, o si sus propiedades alimenticias no son tan buenas como las
de alguna otra variedad. As que no todas las caractersticas apreciadas
se encuentran juntas en la misma planta. Tpicamente encontraremos
que unas variedades son sabrosas, otras son nutritivas, otras ms,
resistentes a las inclemencias del clima, etctera.)
La nueva biotecnologa de plantas
permitir ir introduciendo, al
principio uno por uno, los genes que se vayan identificando como
responsables de conferir ciertas caractersticas atractivas a las
variedades de plantas que son ms tiles. (Fig. 29)

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Fig. 29 .Ejemplo de plantas genticamente
modificas

Fuente: Wisseman A, Principios de Biotecnologa .1886

Leccin 28: Alimentos genticamente modificados


La demanda de alimento global ha aumentado la necesidad de cultivos
mejorados. la biotecnologa ofrece la tecnologa necesaria para producir
alimentos ms nutritivos y de mejor sabor, rendimientos ms altos de
cosecha y plantas que se protegen naturalmente contra enfermedades,
insectos y condiciones adversas.
esto permite efectuar la seleccin de un rasgo gentico especfico de un
organismo e introducir ese rasgo en el cdigo gentico del organismo
fuente del alimento, por medio de tcnicas de ingeniera gentica. esto
ha hecho posible que se desarrollen cultivos para alimentacin con
rasgos ventajosos especficos u otros sin rasgos indeseables.
Resumiendo, se puede decir que la biotecnologa tiene un amplsimo
rango de aplicacin en la industria alimenticia, ofreciendo los medios
para producir alimentos de mejor calidad en forma ms eficiente y
segura para la salud y el medio ambiente. una de las promesas de la
biotecnologa es generar innovaciones y mejoras en los alimentos
conduciendo a prcticas agrcolas ms ecolgicas, contribuyendo a una

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agricultura sustentable que utiliza con respecto los recursos del


medioambiente.
El rea de mayor aplicacin de la biotecnologa en alimentos y la ms
antigua, corresponde a las fermentaciones, de gran importancia dentro
de la tecnologa de alimentos y que abarca varios campos, como
fermentaciones alcohlicas, fermentaciones crnicas y fermentaciones
lcticas.
El rea ms reciente y de mayor proyeccin dentro de la biotecnologa
de alimentos est en el desarrollo de alimentos genticamente
modificados o transgnicos, cuyas principales ventajas se ven en
mejoras nutricionales, mayor productividad de cosechas y mayor
proteccin medioambiental. Adems, alimentos gm poseen hoy en da
gran importancia en las soluciones de graves problemas de escasez de
alimentos, desnutricin y problemas de salud pblica en general del
mundo en vas de desarrollo.
Leccin 29: Alimentos funcionales
El concepto de alimento funcional se emplea para describir a aquellos
alimentos adicionados con ingredientes de diversas clases y orgenes
que pueden ejercer efectos beneficiosos sobre quien
los ingiere. Este concepto surgido en Japn ha ido popularizndose y
expandindose hacia otros continentes como Europa fundamentalmente
debido a la preocupacin sobre la nutricin, la dieta y la salud de la
sociedad actual. Los pro biticos representan una gran rea dentro de
los alimentos funcionales y se ha intensificado la investigacin para
desarrollar productos pro biticos y profundizar en el conocimiento de
los efectos sobre la salud humana. Los pro biticos se definen como
"suplementos alimentarios microbianos vivos que afectan de forma
ventajosa al animal husped mejorando su equilibrio intestinal
microbiano". Son microorganismos que estimulan las funciones
protectoras del tracto digestivo, y tambin son conocidos como
bioteraputicos, bioprotectores o bioprofilacticos, ya que se utilizan para
prevenir
las
infecciones
entricas
y
gastrointestinales.
Un
microorganismo prebitico efectivo debe poseer una serie de
caractersticas: no ha de ser no patgeno ni toxico, debe ejercer efectos
beneficiosos sobre la salud de quien lo ingiere, tener origen humano, ha
de ser tecnolgicamente utilizable, ha de presentar un elevado
porcentaje de clulas viables, debe ser capaz de sobrevivir a la flora
intestinal, ha de permanecer viable durante su almacenamiento en
refrigeracin, y tener capacidad de adherirse a la superficie mucosa, etc.
El establecimiento de criterios de seleccin y controles de calidad para
productos pro bitico se considera una prioridad debido a la rpida

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incorporacin de estos productos en el mercado y su distribucin en el


mbito internacional sin la existencia previa de una normativa
comnmente aceptada. En los ltimos aos ha aumentado el inters por
los
productos
elaborados
con
microorganismos
pro
bitico,
perteneciente a los gneros Lactobacillus y Bifidobac.

Por otra parte, los prebiticos son ingredientes no digeribles que afectan
benficamente al hospedero estimulando selectivamente a un nmero
limitado de bacterias del colon promoviendo el crecimiento, la actividad
o los dos aspectos en estas poblaciones microbianas. Los dos prebiticos
ms estudiados son los fructo-oligosacaridos o FOS conocidos como
oligofructosa e inulina. Otras de las sustancias ms comercializadas
estn:
Fructooligosacaridos-Suntory(Japn),
Isomaltooligosacarido, Showa Sangyo(Japn)
Oligomate(galactooligosacaridos) Yakult(Japn)
Palatinosa-Sudzucker(Alemania)
polidextrosa
.Estos carbohidratos presentes en vegetales como ajo, cebolla, puerros,
esparrago, alcachofas, tomates, pltanos, entre otros.
Leccin 30: Probiticos: es de origen griego y significa "a favor de la
vida este trmino se utiliza para bacterias benficas que viven en el
cuerpo de los animales o del hombre trabajando en simbiosis con el
hospedero. Entre las bacterias que presentan esta caracterstica se
puede mencionar a Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus,
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
infantis
Este tipo de microorganismos se consideran como la primera lnea de
defensa de nuestro cuerpo contra los microorganismos potencialmente
patgenos que se inhalan o ingieren. Estas bacterias estn presentes en
la piel, la boca, el sistema digestivo y la mucosa vaginal, donde realizan
numerosas e indispensables funciones para proteger al cuerpo y los
rganos contra las bacterias patgenas. Entre los mecanismos por los
cuales actan estas bacterias se pueden mencionar: primero, la
transformacin de la lactosa en acido lctico, este ultimo compuesto

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funciona como un antisptico del sistema digestivo, segundo, el acido


lctico facilita la absorcin del calcio y fosforo contenido en la leche,
tercero, el aumento de la poblacin bacteriana benfica suministrada en
alimentos, incrementa la produccin de vitamina B6 potenciando y
fortaleciendo el sistema inmunolgico. Cuarto, Al mismo tiempo
minimizan la proliferacin de agentes patgenos peligrosos responsables
de graves enfermedades seguidas de muerte compitiendo por
alojamiento o espacio fsico en las paredes intestinales. Quinto, los
microorganismos prebiticos pueden sintetizar bacteriocinas, las cuales
son sustancias que inhiben el crecimiento de bacterias patgenas.
Un producto para que sea considerado como pro bitico debe reunir las
siguientes caractersticas:

Contienen microorganismos vivos que pueden estar refrigeradas o


en estado fresco o en productos fermentados, pueden estar en
alimentos, capsulas o pldoras)
Mejoran la salud y el bienestar de animales
(Contribuyen al crecimiento de los animales)

humanos

Pueden afectar todas las superficies mucosas del hospedero


incluyendo la boca y el tracto gastro intestinal, el tracto
respiratorio superior o el tracto urogenital
A los alimentos que contienen estos microorganismos se los denomina
como alimentos funcionales. Los cuales tienen una amplia aceptacin
en la poblacin de los pases desarrollados, lo que ha generado una
contribucin significativa a la expansin de estos productos en el
mercado. El trmino alimento funcional se origina en la dcada de los
80s en el Japn, donde los alimentos se suplementaban con otros
ingredientes que beneficiaban la salud del consumidor. Las definiciones
de alimento funcional varan considerablemente a lo largo de los aos
debido al gran desarrollo de este sector, los ingredientes de los
alimentos funcionales incluyen los pro biticos, prebiticos, vitaminas, y
minerales.

AUTOEVALUACIN
Realice un Glosario de la Unidad estudiada. Recuerde que para ello es
necesario sacar palabras o conceptos que encuentran en el texto;
organizarlos por orden alfabtico y definirlos de acuerdo a las
caractersticas esenciales de cada uno.

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Realice un mapa conceptual sobre las diferentes tcnicas de ingeniera


gentica aplicadas a la industria alimentaria. Para ello, tenga en cuenta,
las caractersticas y procedimiento de cada una.
Organice un foro con sus compaeros sobre las ventajas y desventajas
de los alimentos Gm en la alimentacin mundial, saque las conclusiones
correspondientes y presntelas en un informe. Para ello busque
informacin en pginas Web.

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UNIDAD 3
CAPITULO 7: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRODUCTOS
DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA.

Leccin 31: Bebidas alcohlicas


Leccin 32: Biologa de las fermentaciones con levaduras
fermentacin

y condiciones de la

Leccin 33: Compuestos organolpticos


Leccin 34 : Alimentos basados en soja fermentada
Leccin 35 : Productos crnicos fermentados
CAPTULO OCHO: OTROS PRODUCTOS DE INTERS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Leccin 36: Produccin de Biomasa


Leccin 37 : Vinagre
leccin 38 : acido Lctico
leccin 39: acido Actico
Leccin 40 : Produccin de acido ctrico
CAPITULO NUEVE : BIOPOLIMEROS MICROBIANOS
Leccin 41 : Polisacridos microbianos y PHAs
Leccin 42: Poli hidroxibutirato
Leccin 43: Los alginatosy Gelanos
Leccin 44: Xantano
Leccin 45: Dextranos

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UNIDAD 3: PRODUCTOS
ALIMENTARIO

BIOTECNOLGICOS

DE

INTERES

INTRODUCCIN Los microorganismos han sido utilizados durante


siglos para modificar los alimentos, y tanto stos como las bebidas
fermentadas constituyen un sector primario y extremadamente
importante de la industria aumentara. En esta Unidad se describirn
algunos procesos para la obtencin de compuestos derivados del
metabolismo energtico (fermentacin), metabolismo intermedio y
biosntesis:
Objetivos de la Unidad
Estudiar diferentes procedimientos Biotecnolgicos
obtencin de productos de inters alimentario

utilizados en la

Identificar los diferentes microorganismos y condiciones de cultivo


en cada unos de los bioprocesos utilizados para la obtencin de
productos de inters alimentario
Brindarle a los estudiantes herramientas tecnolgicas que les
permita desarrollar productos Biotecnolgicos de inters alimentario

Capitulo 7: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA


OBTENCIN DE PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO
ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA.
Leccin 31: Bebidas alcohlicas
Las bebidas alcohlicas se producen a partir de diversas materias
primas, pero especialmente a partir de cereales, frutas y productos
azucarados. Entre ellas hay bebidas no destiladas, como la cerveza, el
vino, la sidra y el sake, y destiladas, como el whisky y el ron, que se
obtienen a partir de cereales y melazas fermentadas, respectivamente,
en tanto que el brandy se obtiene por destilacin. del vino. Otras
bebidas destiladas, por ejemplo el vodka y la ginebra, se elaboran a
partir de bebidas alcohlicas neutras obtenidas por destilacin de
melazas, cereales, patatas o lactosuero Fermentados. Adems tambin
se obtienen una gran variedad de vinos de alta graduacin mediante
adicin de alcohol destilado a los vinos normales con objeto de elevar su
contenido alcohlico hasta el 15 o el 20 %; entre stos se incluyen
productos tan notables como el jerez, el aporto y el madeira.

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Un detalle comn importante en la produccin de todas estas bebidas


alcohlicas es el empleo de levaduras para convenir los azcares en
etanol. Por consiguiente, la primera parte de esta seccin se concentrar
en la biologa de las fermentaciones de levaduras y seguidamente se
discutirn los procesos concretos de obtencin de la cerveza, el whisky y
el vino.
Leccin 32: Biologa de las fermentaciones con levaduras
Aproximadamente el 96 % de la fermentacin del etanol se lleva a cabo
mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas,
particularmente S. uvarum. El etanol se produce en la ruta de EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP), en la que el piruvato producido durante la
glicosilacin se convierte en acetaldehdo y etanol. La reaccin global es
la siguiente:
Glucosa + 2ADP-2 Etanol + 2CO~ + 2ATP
El rendimiento terico de 1 g de glucosa es de 0,51 g de etanol y 0,49 g
de CO2. Sin embargo, en la prctica, aproximadamente el 10 % de la
glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento en etanol y CO 2
alcanzan el 90 % del valor terico. El ATP formado se utiliza para las
necesidades energticas de la clula.
La envoltura de la clula de levadura incluye una membrana plasmtica,
un espacio periplsmico y una pared celular constituida principalmente
por polisacridos y una pequea cantidad de pptidos. La pared tiene
una estructura semirrgida permeable al soluto que proporciona a las
levaduras una considerable fuerza compresional y tensil. Los grupos
carboxilo de los pptidos de la pared celular confieren a las levaduras
utilizadas en la elaboracin de cerveza una capacidad de floculacin
importante, lo que facilita la separacin slido-lquido despus de la
fermentacin. Se cree que la floculacin se debe a la formacin de
puentes salinos entre los iones calcio y estos grupos carboxilo de la
pared celular.
Condiciones de la fermentacin
En la fermentacin las levaduras utilizadas para la elaboracin de
cerveza (S. cerevisiae) utilizan los azcares sacarosa, fructosa, maltosa
y maltotriosa en este orden. La sacarosa es hidrolizada primeramente
por la invertasa localizada en el espacio periplsmico extracelular. Los
azcares son transportados a travs de la membrana celular por
transporte activo o pasivo mediado por permeasas producidas
constitutivamente o inducibles. La maltosa y
la maltotriosa son
hidrolizadas intracelularmente por la -glucosidasa, Saccharomyces

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uvarum (S. car/sbergensis) se distingue taxonmicamente del S.


cerevisiae en que tambin Utiliza melibiosa. El Kluyveromyces fragilis y
Kluyveromyces lactis, que a diferencia de S: cerevisiae pueden
fermentar la lactosa, tienen un sistema lactosa-permeasa para
transportar la lactosa dentro de la clula, donde se hidroliza a glucosa y
galactosa, que entran en la gliclisis. Excepto los Saccharomyces
diasraucus, que no son adecuadas para la elaboracin de cerveza todas
las levaduras Saccharomyces son incapaces de hidrolizar el almidn y
las dextrinas, y por consiguiente, el empleo de materiales basados en
almidn para la fermentacin alcohlica requieren la accin de enzimas
exgenos como las y -amilasas de la malta o enzimas microbianos
como a-amilasa, amiloglucosidasa (glucoamilasa) y pululanasa. Los
azcares mayoritarios del mosto son la glucosa y la fructosa y puesto
que el S. cerevisiae metaboliza preferencialmente la glucosa; el azcar
no fermentado que permanece en el vino resultante es la fructosa. Por
el contrario, las levaduras del vino de Saurernes fermeman la fructosa
ms rpidamente que la glucosa.
El mosto de cerveza producido a partir de malta contiene 19
aminocidos adems de otros nutrientes. Estos aminocldos son
asimilados a distintas velocidades durante la fermentacin. Un
aminocido permeasa general (GAP puede transportar todos los
aminocidos bsicos y neutros excepto la prolina. En las levaduras
existen al menos otros 11 sistemas de transpone de aminocidos ms
especficos. La proln permeasa es inhibida por otros aminocidos: por el
amonaco.
Aunque !as fermentaciones alcohlicas son en gran medida anaerbicas.
las levaduras necesitan algo de oxgeno para sinterizar algunos esteroles
y cidos grasas insaturados componentes de la membrana. El mosto de
la cerveza contiene normalmente niveles subptimos de esteroles y
cidos grasos insaturados. pero cuando el medio se suplementa con
cido oleico u oleanoico, la necesidad de oxgeno desaparece.
Muchas cepas de S. cerevisiae pueden producir concentraciones de
etanol de hasta el 12-14 Existe un cierto inters en el empleo de
levaduras tolerantes de cantidades elevadas de alcohol en los procesos
de fabricacin de cerveza con gravedad elevada y la produccin de
alcohol para la destilacin con vistas a incrementar la productividad de
la planta y disminuir los costos de destilacin. Existen cepas
seleccionadas capaces de producir hasta un 18-20 % de alcohol, aunque
la velocidad de fermentacin se ve fuertemente reducida cando la
concentracin de etanol aumenta. Los mostos con un contenido muy
elevado de azcares fermentan nicamente con levaduras osmoflicas
como Saccharomyces rouxii y S. bailli, que poseen una gran capacidad
para fermentar la fructosa.

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La composicin en fosfolpidos de la membrana plasmtica es


importante para la tolerancia del etanol, observndose un incremento
de sta cuando el contenido de cidos grasos insaturados aumenta. La
tolerancia alcohlica puede elevarse suplementando el medio de
crecimiento con cidos grasos insaturados, vitaminas y protenas. Los
factores fisiolgicos tales como la forma de aporte del substrato, la
acumulacin de etanol intracelular, la presin osmtica y la temperatura influyen en la tolerancia de las levaduras al etanol. Los
enzimas glicolticos de las levaduras, hexoquinasa, gliceraldehdo-3fosfato deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa son sensibles a la
concentracin de etanol.
.
En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la
mayora de las veces favorables al crecimiento y actividad fermentara;
esta ltima es mayor cuanto mayor sea el pH y se produce una cada
notable a valores de pH de 3-4. El pH influye en la formacin de
subproductos; por ejemplo, a valores de pH elevados se incrementa la
formacin de glicerol. El pH del mosto de uva est generalmente
comprendido entre 3 y 3,9 debido a su elevado contenido de cidos
(5-15 g/I), principalmente tartrico y mlico, de forma que, como la
mayora de las bacterias, con excepcin de las bacterias del cido
actico y lctico prefieren pH ms neutros, la susceptibilidad del mosto
de vino a la contaminacin bacteriana es reducida.
Las temperaturas ptimas de la fermentacin, la respiracin de las
levaduras y el crecimiento celular son claramente diferentes. La
velocidad de fermentacin aumenta. generalmente con la temperatura
entre los 15 y los 35C y los niveles de glicerol, acetona, buteno-2,3diol, acetaldehdo, piruvato y 2-cetoglutarato se elevan en los caldos
de fermentacin. La formacin de niveles elevados de alcohol tambin
depende de la temperatura. En los vinos blancos, la menor
temperatura de fermentacin da lugar a vinos ms frescos y afrutados,
y el riesgo de infeccin bacteriana y de produccin de cidos voltiles
como resultado es reducido. Para la produccin de vino tinto se utilizan
temperaturas ms elevadas, de 22 a 30oC, y la fermentacin con los
hollejos conduce a la intensificacin del color y a la produccin de un
rico aroma.

Leccin
33:
organolpticos:

Compuestos

En la produccin de bebidas alcohlicas deben controlarse las


fermentaciones de forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos
y otros nutrientes y se conviertan en alcohol y en compuestos con

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aromas caractersticos y deseables, y por otro lado, se minimice la


formacin de aromas y sabores indeseables. Entre los componentes del
aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del etanol,
steres, compuestos carbnicos, cidos orgnicos, compuestos
azufrados, aminas y fenoles.
Cuantitativamente, y en funcin de su papel en el aroma y sabor, los
componentes ms importantes presentes en las bebidas alcohlicas son
los alcoholes superiores, denominados tambin alcoholes de fusel o
aceites de fusel, entre los cuales los ms significativos en la cerveza Y el
vino son el alcohol amlilico, el isoamlico y el 2-fenoetanol. El vino tinto
tiene una concentracin mayor de estos compuestos que el vino blanco.
Las bebidas destiladas tienen un espectro bastante diferente de
alcoholes superiores, que incluyen butanoles y pemanoles. El glicerol,
alcohol polihdrico, est presente en casi todas las bebidas alcohlicas.
En el vino, el glicerol se encuentra a concentraciones de hasta el 1 %
(peso/volumen) y confiere cuerpo a esta bebida.
En muchas bebidas y licores, los steres constituyen un grupo
importante de compuestos voltiles debido a su penetrante aroma
afrutado. Entre ellos, el acetato de etilo est presente en muchas
bebidas a concentraciones organolpticamente importantes. Otros
steres importantes incluyen el formiato de etilo y el acetato de
isoamilo.
El acetaldehido, con propiedades organolpticas indeseables, se produce
como un compuesto intermedio durante las fermentaciones alcohlicas,
obtenindose niveles altos por tasas de levaduras elevadas o excesiva
aireacin. El diacetilo y la pentano-2,3-diona, formados fuera de las
clulas de la levadura por decarboxilacin oxidativa del -acetolato y el
-cetohidroxibmirato,
tienen
aromas
y
sabores
indeseables
caractersticos. Las levaduras pueden reducir el diacetilo y la pentano2,3-diona. La presencia de exceso de diacetilo en la cerveza se produce
cuando el -acetolactato aparece en una etapa en la que las levaduras
ya han sedimentado o han perdido su capacidad para reducir el diacetilo
a acetona o el exceso de diacetilo en la cerveza tambin puede deberse
a fa presencia de organismos que la deterioran, como Pediococcus y
Lacrobacillus.
Durante la fermentacin primaria del mosto de la cerveza se producen
cantidades considerables de SH2 provenientes de la reduccin de los
compuestos azufrados. Aunque en la cerveza pueden ser aceptables
cantidades pequeas de compuestos azufrados, y en la cerveza normal
el SO2 est usualmente presente a concentraciones por debajo de su
umbral de sabor, el exceso produce aromas y sabores. desagradables. El
dixido de azufre influye positivamente en la fermentacin alcohlica,

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puesto que se une al acetaldehido y adems inhibe algunas de las


reacciones de oxidacin indeseables. En el mosto del vino, el SO 2 inhibe
algunos microorganismos indeseables, entre ellos las bacterias del cido
lctico y cido actico, as como algunas levaduras naturales que
producen un exceso de cidos voltiles, piruvato y -cetoglutarato.
Adems la produccin del desagradable sabor del cido actico tambin
inhibe las fermentaciones de levaduras, particularmente combinado con
el etanol, Saccharomyces cerevisiae es ms susceptible a esta inhibicin
que Saccharomycoides ludwigii, Schizosaccharomyces pombe. En los
mostos cuya acidez total es baja, es muy til emplear S02 para inhibir la
fermentacin malo-Ictica por las bacterias del cido lctico, impidiendo
la disminucin posterior del nivel de cido. Una concentracin elevada
de S02 puede retrasar el comienzo de la fermentacin.
El bajo pH del mosto y del vino suministran un medio selectivo para el
crecimiento de las bacterias del cido actico y del cido lctico, aunque
la supervivencia de !as primeras sea usualmente corta debido a las
propiedades reductoras del medio. Las bacterias lcticas del vino son
anaerobias
facultativas
u
organismos
microflicos
que
son
homofermentivos (todas las Pediococcus y algunos Lactobacillus
producen cido lctico a partir de glucosa) y heterofermentivos (todos
los Leuconostoc y algunos Lactobacillus producen cido lctico, etanol y
CO2 a partir de la glucosa). Las bacterias lcticas pueden metabolizar los
cidos mlico y tartrico presentes en el vino a concentraciones
elevadas, as como al cido ctrico, presente en cantidades ms bajas.
Existen mtodos qumicos para reducir la acidez. La reduccin de los
cidos puede impedir el deterioro de los vinos de pH elevado. A pH 3,33,4, los Leuconostocoenus fermentan el cido mlico aunque los
Pediococcus no lo hacen. Los Lellconosto se adaptan bien a los pH bajos
y generalmente se prefieren siempre que se desee una fermentacin
malo-Ictica. Una fermentacin malo-lctica por Pediococcus va con
frecuencia acompaada de la formacin de diacetilo e histamina,
indeseables.
Leccin 34: Alimentos basados en soja fermentada
Las fermentaciones de productos a base de saja y otras materias primas
relacionadas se llevan a cabo desde hace muchos siglos, especialmente
en Oriente. Entre las fermentaciones ms importantes se encuentran
los procesos de produccin de salsas de saja, misa y tempeh, ilustrados
en la Figura 30

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Fuente: Crueger, Manual de Microbiologa industrial, 1989

Aunque existen diversos tipos de salsas de soja, la producida


predominantemente en Japn, denominada koikuchi, se obtiene por
fermentacin de una mezcla de saja y trigo, que da lugar a una salsa
con fuerte aroma y color marrn-rojizo oscuro. El proceso consiste
inicialmente en una fermentacin primaria de una mezcla al 50 010 de
saja cocida al vapor, empapada y trigo tostado y triturado, con un nivel
de humedad del 27 al 37 %, que se extiende en bandejas y se incuba
con Aspergillus oryzae, que tiene actividad amiloltica y proteoltica
elevada, durante 2 3 das a 25-30 oC. Despus de adherirle agua
salada, para hacer que el contenido de sodio alcance el 18 %, la masa o
moromi se transfiere a tinas grandes donde se produce la
fermentacin secundaria, con bacterias holoflicas y levaduras
osmoflicas; el proceso tiene lugar a una temperatura de 35-40 oC, con
agitacin intermitente, y el tiempo de fermentacin oscila entre 2 y 12
meses. Al finalizar esta fermentacin secundaria, se recupera la salsa
lquida y se pasteriza. Los enzimas producidos en la fermentacin
primaria o fermentacin koji hidrolizan las protenas a pptidos y

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aminocidos libres y convierten el almidn en azcares simples. Estos


productos de ruptura son a su vez metabolizados por otros
microorganismos, produciendo diversos compuestos aromatizantes y
saborizantes. Utilizando inculos de levaduras, bacterias y hongos puros
el proceso de fermentacin se controla mejor y se obtiene un producto
de calidad, aroma y sabor consistentes.
En Oriente, las pastas de soja fermentada se preparaban
tradicionalmente en casa para su utilizacin en sopas y salsas. En Japn,
el producto, denominado misa, se elabora en la actualidad a gran
escala, mediante un proceso que implica inicialmente la fermentacin
koji del arroz empapado al vapor (o cebada, o soja, con menor
frecuencia), que despus se extiende en bandejas, se inocula con cepas
seleccionadas de A. oryzae y se incuba a 28-35 oC durante aproximadamente dos das. A continuacin el material se mezcla en
recipientes con soja empapada y cocida al vapor en una relacin 1:2, y
se aade cloruro de sodio para dar una concentracin del 4 al 13 %, La
mezcla se inocula con bacterias y levaduras y se deja fermentar entre 1
y 52 semanas. Finalmente, el producto se amasa y se pasteriza,
pudiendo obtener distintos tipos de miso con diferentes grados de
dulzura, salinidad y color, variando la materia prima koji, el contenido
de sal, los edulcorantes y la duracin de la fermentacin.
La produccin de tempeh se basa en una fermentacin en bandejas de
soja remojada cocida al vapor inoculada con Rhizopus oligosporus, e
incubada a 30-38 oC durante 24 horas. El producto, que usualmente se
corta en rebanadas, se sala y se consume frito, tiene una vida corta.

Leccin 35: Productos crnicos fermentados


La mayora de los productos crnicos fermentados consisten en fiambres
(secos o semiseco), con una relacin humedad-protena que oscila entre
1,5 y 3 a 1. En general, la etapa de fermentacin microbiana tiene lugar
a una temperatura ptima, previa a la de calentamiento y/o secado.
La fermentacin microbiana, que da lugar a la formacin de cido,
ayuda al procesado de muy distintas formas, puesto que contribuye a la
estabilidad y alarga la vida del producto, facilita la posterior eliminacin
de humedad y genera aromas y sabores caractersticos. Generalmente
se recomienda que el pH del producto sea inferior a 5,3, basados en la
creencia de que dicho valor sirve para controlar los Staphylococcus
aureus. El proceso de fermentacin para reducir el pH por debajo de 5,3
deber ajustarse a las normas de seguridad temperatura/tiempo
especificadas, comprendidas entre 23,9 y 43 oC durante un perodo de

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incubacin de entre 80 y 18 horas. Con frecuencia se utilizan inculos


comerciales, como los Pediococcus, que tienen una buena capacidad
para producir cido lctico. Los Staphylococcus carnosus, especies
inocuas coagulasa negativas, se emplean de forma rutinaria en la
produccin de embutidos secos. Los nitritos influyen positivamente en la
conservacin de la carne, puesto que controlan el desarrollo de
Clostridium botulinum. Las especies de Micrococcus capaces de reducir
los nitratos a nitritos, de forma controlada, contribuyen a la curacin de
la carne as corno al control de los e boculinum. Tambin pueden
utilizarse cultivos startem en el procesado del bacon, con objeto de
eliminar cualquier nitrito residual presente, disminuyendo o anulando la
formacin de nitrosaminas, carcingenos, durante la fritura.
Se puede predecir que a partir del mayor empleo de los inculos
comerciales, los procesos de fermentacin de los productos crnicos se
caracterizarn por su elevado nivel de control del proceso, lo que dar
lugar a productos de calidad y consistencia reproducibles y manteniendo
siempre las mayores condiciones de seguridad.
Capitulo 8: Otros productos de inters alimentarios
Leccin 37: Vinagre
El vinagre es una solucin acuosa de cido actico, se obtiene mediante
la fermentacin por oxidacin de una solucin diluida de etanol. El
proceso metablico se basa en la conversin del etanol, bajo la accin
del alcohol
deshidrogenasa, en acetaldehdo y del acetaldehdo
hidratado en cido actico por la accin de la acetaldehdo
deshidrogenasa:

C2H5OHCH3CHO+H2OCH2CH OH2CH3COOH+H2O
La materia prima de la fermentacin del vinagre de alcohol (white spirit)
consiste usualmente en etanol purificado diluido. Los vinagres de vino,
sidra, malta y arroz se obtienen por fermentacin alcohlica de zumos
de uva, manzana, cebada malteada y arroz, respectivamente. La
fermentacin del vinagre requiere tambin una fuente de nitrgeno y
una combinacin apropiada de minerales y con frecuencia es necesaria
la suplementacin con nutrientes. Las modernas fermentaciones de
vinagre consisten en procesos sumergidos muy aireados. El acetator
Frings (Fig. 7.8), muy utilizado en la produccin comercial de vinagre,
es un fermentador provisto de deflectores, cuyo fondo contiene una turbina de cuerpo hueco que gira a 1.450-1.750 rpm, cuya rotacin hace

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que el aire sea succionado a travs del rotar hueco y se distribuya


radialmente a lo largo de toda la seccin trasversal del fermentador.
Los procesos comerciales tpicos, que producen cido actico del 12 al
15 OJo, se llevan a cabo de forma semicontinua. Las concentraciones de
alcohol y de cido actico al comienzo del ciclo son del 7-10 % y del 5
1110 respectivamente;
la fermentacin se efecta entre 27 y 32 e hasta que la concentracin
de alcohol desciende al 0,1-0,3 %, momento en el cual se descarga una
parte del vinagre (aproximadamente la tercera parte) y el recipiente se
vuelve a llenar con una mezcla que contiene del O al 2 % de cido
actico y del 12 al 15 % de etanol y el ciclo se repite. Un alcalgrafo
mide la concentracin de etanol y hace que las operaciones de descarga
y llenado se puedan llevar a cabo automticameme, sin interrupcin del
proceso de aireacin/mezclado de forma que impida el agotamiento
total del etanol en el caldo de fermentacin. El mezclado rpido continuo
es esencial para minimizar los gradientes de concentracin. Los tiempos
del ciclo varan de 24 a 48 horas.

Las bacterias acidoacticas, que oxidan el etanol a cido actico y


pueden existir a valores bajos de pH, pertenecen a los gneros
Acetobacter y Gluconobacter, estrechamente relacionados. Los cultivos
puros de estos organismos se caracterizan por su alto grado de
variabilidad y en las fermentaciones industriales se pueden desarrollar
posteriormente cultivos mezclados a partir de cultivos puros. Los
cultivos industriales se seleccionan en funcin de que toleren una acidez
elevada y de que las velocidades de produccin de acetato sean altas.
Estas bacterias son extremadamente sensibles y se mueren en ausencia
de oxgeno y etanol y tambin resultan daadas a gradientes de
concentracin de etanol y acetato. La sensibilidad a la falta de oxgeno
aumenta a medida que lo hace la concentracin total de cido actico
ms etanol. No obstante, con una aireacin suficiente, puede
conseguirse una utilizacin del 80 % de oxgeno sin producir efectos
adversos en la fermentacin. La sobreoxidacin, esto es la conversin
de cido actico en CO2 y H20 puede impedirse manteniendo la concentracin de cido actico por encima del 6 % e impidiendo el agotamiento
total del etanol.

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Leccin 38: cido Lctico


Aproximadamente la mitad de la demanda mundial de cido lctico se
obtiene mediante fermentacin. Sus principales usos industriales son
como acidulante alimentario (50 % del mercado), y para la manufactura
de estearoil-2-lactilato (20 %) as como en la industria farmacutica y
en otras aplicaciones.
El cido L-( + )-lctico se obtiene por fermentacin anaerobia con
Lactobacillus de/bruckii y cepas homofermentativas relacionadas. El
medio contiene aproximadamente un 15 % de sacarosa o dextrosa y
nitrgeno en forma compleja. El pH se controla en fa regin de 5,0 a 6,5
mediante neutralizacin con CaCO3 o Ca(OH)2. la temperatura se
mantiene entre 45 y 60 C y el tiempo de fermentacin es de 3 a 4 das.
con lo que se obtiene un rendimiento en cido lctico del 90 al 95 %,
basado en el contenido inicial de azcar. El proceso de fermentacin se
basa en la conversin de hexosa en piruvato por la ruta de EmbdenMeyerhof-Parnas y su conversin en L-( + )-lactato por el enzima L-lactato deshidrogenasa

Leccin 39: Acido Actico


El mercado mundial anual del acetato es de unos 2,5 millones de Tm.
Desde 1950 los mtodos sintticos han proporcionado la mayor parte
del suministro mundial de cido actico, pero, como el etileno es la
principal materia prima utilizada y su precio se ha incrementado de 6
centavos/Kg a 30 centavos/Kg desde 1970 a 1980. han ido ganando en
importancia distintas rutas de produccin alternativas, incluyendo los
mtodos biolgicos. Brasil produce cido actico por conversin qumica
de etanol, obtenido nicamente a partir de biomasa. Tambin tienen
aplicacin potencial los mtodos de fermentacin para la produccin de
acetato como materia prima qumica.
En este mismo captulo ya se ha descrito el proceso aerobio para la
produccin de vinagre. En las fermentaciones acidognicas anaerobias
se producen una gran variedad de cidos grasas voltiles. El cido
actico constituye el componente mayoritario de la mezcla, aunque
tambin se producen cantidades significativas de cido propinico y
butrico. Los Clostridium butyricum producen una mezcla de cido
actico y butrico a partir de glucosa. Los Clostridium thermocel/um y e
thermoaceticum fermentan la glucosa y la fructosa casi estequiomtricamente a acetato. En la acidognesis, es imperativo suprimir los
metangenos, asociados frecuentemente con los formadores de cido en
los cultivos mixtos, ya que convertiran el cido en metano y C0 2.

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Aunque en el proceso aerobio pueden obtenerse concentraciones de


acetato ms elevadas, el rendimiento terico en el proceso de
acidognesis anaerobio es de 1.0 comparado con el 0,66 de aquel. Las
dos molculas de C02 producidas durante la conversin de piruvato en
acetil CoA se asimilan justificando la tercera molcula de acetato
formada a partir de glucosa . Adems, las necesidades energticas para
el proceso anaerobio son menores y tambin es menor el valor de los
substratos, puesto que pueden emplearse desechos de destilera y
desechos de plantas de celulosa. En consecuencia., las fermentaciones
acetognicas anaerobias pueden llegar a ser el mtodo de eleccin para
la produccin de acetato destinado a la industria qumica.

Leccin 40: Produccin de acido ctrico


El cido ctrico, ampliamente distribuido en la naturaleza, se utiliza
desde hace tiempo en la manufactura de bebidas refrescantes como
acidulante, como auxiliar en la fabricacin de mermeladas y como
aditivo general en las industrias de repostera. Inicialmente se extrajo
del zumo de limn, posteriormente se sintetiz a partir de glicerol y de
otros compuestos qumicos y finalmente, desde 1923, se obtiene por
fermentacin industrial. En 1933, la produccin mundial anual super
las 10.000 Tm, de las cuales, ms del 80 % se obtuvieron por
fermentacin. Con la substitucin de los polifosfatos por el citrato de so
dio en los detergentes en 1970, el mercado anual creci rpidamente y
actualmente se estima que se producen exclusivamente por
fermentacin unas 300.000 Tm. Inicialmente se utilizaron mtodos de
cultivo en superficie con Aspergillus niger; despus de la segunda guerra
mundial se introdujeron procesos de cultivo sumergidos tambin con A.
niger y aproximadamente en 1977 se comercializ un' proceso de cultivo
sumergido con levaduras del gnero Candida.

En la Tabla 6 se muestran las principales caractersticas de los procesos


industriales empleados en la produccin de cido ctrico. Actualmente
an se utiliza ampliamente el cultivo en superficie con A. niger, puesto
que, aunque es un proceso que requiere ms trabajo que el de cultivo
sumergido, las necesidades energticas son menores. En los procesos
sumergidos se prefieren fermentadores agitados por aire, que permiten
utilizar recipientes de mayor tamao, ya que este producto es de un
volumen de produccin alto entre los obtenidos por fermentacin. La
materia prima ms utilizada para la produccin de citratos son las

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melasas, cuyo mayor problema consiste en la gran variabilidad del


material. En las fermentaciones sumergidas con A. niger las
concentraciones elevadas de azcar estimulan la produccin de citrato
obtenindose rendimientos bajos cuando la concentracin de azcar es
inferior a 140 kg m - 3. En general, se suministra nitrgeno a una
concentracin de 0,1-0,4 g 1 - l. La adicin de NH4- durante la
fermentacin aumenta la produccin de citrato.
Tabla 6: Caractersticas de la produccin industrial de Acido ctrico

Fuente: Crueger, Manual de Microbiologa


industrial, 1989

La produccin de cido ctrico con A. niger es extremadamente sensible


a la concentracin de iones Mn2+, de forma que su produccin se \'e ya
drsticamente reducida a un nivel de manganeso del orden de 3 mg 1 - 1.
Por tanto, es necesario pretratar las molasas con agentes que
acomplejen o precipiten este metal. por ejemplo con hexacianoferrato
(HCF) o con cobre, que contrarresta el efecto del manganeso al inhibir
su absorcin por las clulas. Las condiciones deficientes en manganeso
tambin favorecen la produccin de pequeos grnu los micelianos con
superficies lisas y compactas, caractersticos de las buenas
fermemaciones fngicas de citrato. Cuando la concentracin de

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manganeso aumenta, la morfologa fngica se vuelve fijamentosa,


incrementando drsticamente la viscosidad del cultivo y disminuyendo
rpidamente de forma concomitante la tensin del oxgeno disuelto.
Como la produccin de cido ctrico necesita oxgeno, la velocidad de
produccin de cido aumenta a medida que aumenta la cantidad de
oxgeno disuelto. Adems, una corta interrupcin del suministro d~
oxgeno puede conducir al cese irreversible de la produccin de citrato.
Para la biosntesis de citrato es esencial mantener el pH por debajo de
2.0, puesto que a pH superiores, el A. niger acumula cido glucnico en
vez de citrato.
La produccin de citrato con Candida
gullermondi difiere en varios aspectos del proceso sumergido con A.
niger. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no es un prerrequisito,
siendo innecesaria una etapa de pre tratamiento para eliminar este
metal del medio; el citrato se produce a un pH superior (3,5-5,0).
Adems, la limitacin de nitrgeno provoca la acumulacin de cido. La
principal ventaja del proceso que emplea Candida respecto al que
emplea A. niger consiste en que la productividad global de la
fermentacin es superior, ya que se pueden utilizar concentraciones de
azcar ms altas debido a la naturaleza ms osmotolerante de los
organismos y adems la fermentacin es ms rpida.

- Bioqumica de la produccin de citrato con A.


niger
El proceso metablico que conduce a la acumulacin de citrato implica
(a) la descomposicin de las hexosas a piruvato y acetil CoA, (b) la
formacin anaplertica de oxalacetato a partir de piruvato y CO2 y (c) la
acumulacin de citrato dentro del ciclo del cido tricarboxliico. En este
esquema no debera eliminarse CO2 durante la produccin de ctrato,
puesto que el CO2 liberado en la decarboxilacin oxidativa del piruvato a
acetil-CoA debera utilizarse en la conversin de piruvato en oxalacetato.
El enzima clave que cataliza esta reaccin, la piruvato carboxilasa, lo
producen intrnsecamente las especies AspergiIlus. Las concentraciones
elevadas de azcar aumentan adems la actividad de este enzima as
como la de los enzimas glicoliticas y pueden inhibir algunos de los
enzimas del ciclo del cido tricarboxilico. Para que se acumule citrato es
necesario que al menos uno de las enzimas de este ciclo resulte
inhibido. Las evidencias recientes sugieren que la principal etapa
reguladora es la de la excetoglutarato deshidrogenasa, etapa limitante
de la velocidad en el ciclo y la nica reaccin irreversible. Este enzima
se inhibe al incrementar las concentraciones fisiolgicas de oxalacetato y
NADH durante la produccin de citrato. La fosfofructoquinasa es inhibida
por el citrato, aunque esta inhibicin puede contrarrestarse con
concentraciones intracelulares elevadas de NH 4+

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La deficiencia de manganeso reduce la actividad de algunos de los


enzimas de la ruta de la pentosa fosfato (que podran desviar las
hexosas de la glicolisis y la produccin de citrato) y tambin inhibe el
ciclo del cido tricarboxilico, y adems perjudica el metabolismo
anablico en general, incluyendo el recambio de las protenas y los
cidos nuclecos. Durante estas deficiencias, se forma una proteasa
cida y la reserva intracelular de cidos nuclecos y protenas disminuye
con la produccin concomitante de pptidos, aminocidos y niveles elevados de NH4+. Por tanto, en conclusin, el principal efecto de la
deficiencia de manganeso es su impacto en el recambio proteico,
haciendo que la concentracin de iones amonio se incremente en tanto
que contrarreste la inhibicin de la fosfolactoquinasa por el citrato.
Para la re oxidacin metablica del NADH durante la produccin de cido
ctrico se necesita oxgeno. Durante la acumulacin de citrato, un
sistema respiratorio alternativo sensible al cido salicilhidroxmico
(SHAM), mantiene el sistema respiratorio con la re oxidacin del NADH,
aunque sin produccin concomitante de ATP (Fig.31). El hecho de que la
acumulacin de cido ctrico est fuertemente inhibida por el SHAM
indica la importancia de este sistema. La respiracin sensible al SHAM
depende de una tensin elevada de oxgeno y el sistema se inactiva por
una corta interrupcin de la aireacin.
La produccin de cido glucnico con A. niger est catalizada por una
glucosa oxidasa extracelular, parcialmente unida al micelio, que se
inactiva a pH inferiores a 2,0. A pH superiores, se produce cido
glucnico a partir de glucosa mediante la accin de A. niger. La glucosa
induce este enzima a pH superiores a 4,0, lo que hace necesario
mantener en las fermentaciones para la produccin de citrato un pH
inferior a 2,0.

En resumen, la produccin de citrato por A. niger se caracteriza por:

Una actividad elevada de los enzimas glicolticos y de la piruvato


carboxilasa inducida por los carbohidratos que conducen a la
sntesis de citrato.

La inhibicin de un enzima del ciclo del cido tricarboxlico que


podra causar la descomposicin del citrato.
La produccin mediada por una deficiencia de manganeso de una
concentracin elevada de NH: intracelular que contrarresta la
inhibicin de la fosfofructoquinasa por el citrato.

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Una tensin de oxgeno elevada y el suministro continuo de


oxgeno para mantener activa la respiracin sensible al SHAM para
la re oxidacin del NADH.
Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.

Figura 31: Ruta de la produccin de citrato por


Asspergillus Nger

Fuente: Crueger, Manual de Microbiologa industrial, 1989

Capitulo nueve: Biopolimeros microbianos


A travs de procesos derivados de la fermentacin es posible obtener un
numero amplio de compuestos orgnicos derivados del anabolismo entre
estos se destacan los Biopolmeros que son aplicados en diferentes campos
de la actividad humana por ejemplo: protena unicelular, enzimas, dextrano,
pululano y polihidroxialcanoatos entre otros.
Para fines prcticos en esta leccin nos centraremos en los polisacridos y
en polihidroxialcanoatos (PHAs).
Leccin 41: Polisacridos Microbianos y PHAs
Tradicionalmente, los polisacridos industriales se obtenan a partir de
plantas y algas marinas. Los polisacridos microbianos son una
alternativa viable para substituir algunos de los productos derivados de
las plantas o de las algas pero tambin para utilizar las en un amplio
rango de nuevas aplicaciones industriales. La ingeniera gentica de

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algunos de estos organismos productores y/o la regulacin de las


condiciones medioambientales en las que se lleva a cabo la
fermentacin brindan la posibilidad de manipulacin de las propiedades
y caractersticas del producto, ampliando por tanto la diversidad de
biopolmeros disponibles.
Leccin 42: POLI - HIDROXIBUTIRATO (PHB)
La principal aplicacin potencial del poli--hidroxibutirato (PHB) es como
substituto de los plsticos en casos en los que sus propiedades de
biodegradabi!idad representen una ventaja. La capacidad de las
bacterias para reoxidar el NADH llega a ser limitante a concentraciones
bajas de oxgeno, y entonces la reoxidacin da lugar a productos como
el PHB, el etanol o el butano!. De esta forma el PHB es acumulado como
material de reserva por una amplia variedad de bacterias entre ellas
Alcaligenes eutrophus, que puede llegar a almacenar el 70-80 % de su
biomasa como PHB.
En el PHB la unidad repetitiva o monmero, el -hidroxibutirato, se
sintetiza a partir de dos unidades de acetil CoA; el peso molecular ideal
del polmero oscila entre 200.000 y 300.000. La sntesis de PHB,
adems de estar influida por la concentracin de oxgeno, se ve
favorecida por la limitacin del nitrgeno o el fsforo. El proceso de
fermentacin para la produccin comercial de PHB debera consistir
probablemente en dos etapas, una de crecimiento, sin limitacin de
oxgeno o substrato, que acumule concentraciones altas de biomasa, y
otra de formacin de producto en condiciones ptimas de limitacin de
nutrientes o Aunque la glucosa es Utilizada comnmente como substrato
por los A. eutrophus, comercialmente sera deseable la posibilidad de
Utilizar substratos ms baratos que redujesen de forma significativa los
costos de produccin.
Leccin 43: Los alginatos
se obtienen a partir de algas marinas, aunque como esta fuente est
sujeta a una gran variabilidad, se ha considerado interesante a nivel industrial el substituirlos por polisacridos similares obtenidos por
fermentacin, por ejemplo el polisacrido de Azotobacter vinelandii.
Entre otros polisacridos microbianos de inters comercial se incluyen el
pululano, producido por Aureobasidium pullulans, el seleroglucano,
producido por especies de Selerotium y el gelano, producido por
Pseudomonas elodea.
Los procesos destinados a la produccin de exopolisacridos microbianos
se caracterizan por la elevada viscosidad del medio de fermentacin. Las
bajas concentraciones de producto obtenidas y los cambios

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conformacionales del polmero ocurridos durante la fermentacin. El


control de los constituyentes del medio as como de otros parrnetros de
la fermentacin es crtico para conseguir las velocidades de sntesis
deseadas. Los estudios limitados realizados indican que la modificacin
del exopolisacrido mediante manipulacin del medio de cultivo parece
influir en el grado de polimerizacin ms que en la estructura real y en
la composicin de la unidad repetitiva.
Leccin 44: La goma Xantano
Es el nico polisacrido microbiano obtenido por la fermentacin que
representa una parte significativa del mercado mundial. Su unidad
repetitiva bsica consiste en un pentasacrido que contiene glucosa,
manosa, cido glucurnico, acetato y piruvato. Esta goma tiene una
viscosidad elevada a concentraciones bajas, que es estable en un amplio
rango de pH y es independiente de la temperatura y de la presencia de
cationes. En solucin acuosa y combinada con polisacridos de las
plantas forma geles estables, por lo que se utiliza como estabilizante de
suspensiones y para controlar la viscosidad. Debido a sus propiedades
pseudoplsticas, combinadas con su estabilidad frente a la temperatura
ya los cationes, se emplea como lubricante. Tambin se utiliza junto con
surfactantes e hidrocarburos para mejorar la recuperacin de aceites.
En el caso de la produccin de goma xantano, el contenido de piruvato
como substityete se puede hacer variar del O al 75 % mediante una
seleccin adecuada de la cepa y el medio, lo que puede influir en las
propiedades reolgicas del polmero, cuando la concentracin del
polmero cambia o cuando se alteran la fuerza inica o la temperatura
del medio. Algunos medios de crecimiento para la produccin de
xantano dan lugar a la formacin de mutantes 'que no producen
polisridos, aunque esto puede evitarse mediante una eleccin adecuada
del medio limitando la cantidad de nutriente para el crecimiento. En general, en la produccin de polisacridos microbianos cargados debe
controlarse el pH; por ejemplo, el pH ptimo para la produccin de
xantano es de 7.0 cesando el crecimiento y la formacin de producto a
un pH de 5,5. A lo largo de la fermentacin, las propiedades del caldo
cambian, pasando de ser un fluido newtoniano con viscosidad baja a ser
un fluido no newtoniano con viscosidad alta, a medida que la
concentracin de exopolisacrido aumenta. Estos cambios influyen
profundamente en el mezclado yen la transferencia de masa y calor en
la fermentacin, por lo que el diseo y las condiciones de operacin del
fermentador deben optimizarse ajustndose a estas condiciones
reolgicas. La concentracin final de xantano en los caldos de los
fermentadores es de unos 50 g. 1 - 1 Y los rendimientos, basados en la
glucosa consumida, son del 50 al 60 %.

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La mayora de las sntesis de exopolisacridos bacterianos se producen


intracelularmente, mediante la va de los azcares, activados con un
nucletido. Los azcares se transfieren desde el nucletido a un lpido
transportador, activado por transferencia inicial de un azcar fosfato,
dando lugar a la formacin de la unidad repetitiva de azcar. El mtodo
exacto de elongacin de la cadena y de extensin del polisacrido es
desconocido.
Leccin 45: Los dextranos
Son polisacardos de elevado peso molecular, que consisten en unidades
de -D-glucose ligadas predominantemente por enlaces glicosdicos 1-6.
Los dextranos son formados a partir de la sacarosa durante el
crecimiento de bacterias pertenecientes a los gneros Leuconostoc,
Streptococcus y Lactobacillus, todas pertenecientes a la familia
Lactobacillacea. La mayora de los dextranos son, entretanto,
sintetizados por la bacteria de la especie Leuconostoc mesenteroides.
Los dextranos son neutros, solubles en agua, fcilmente filtrables,
biocompatibles y biodegradables.
Aplicaciones:

Aplicaciones biomdicas (agentes de contraste para imagiologia


mdica, sntesis de hidrogeles)

Industria farmacutica (en colirios, anticoagulantes, complejos con


hierro)

Industria fotogrfica (emulsiones de plata)

Uso veterinario

Industrias alimentarios

El mayor productor mundial de dextrano es Pharmacia (Suecia), sin


embargo, existen otros tales como: Fisons (Reino Unido), Meito (Japn),
Pfeiffer & Langen y UEB Sermwerke (Alemania), Polfa (Polonia),
Pharmacia (EEUU y Suecia), Knoll/Schiwa (Alemania), Abbott (EEUU),
Travenol (EEUU) y Fisons (Reino Unido).
Actividades
Investiga los procesos de produccin de cerveza y vino. Realice
comparaciones relacionadas con: Tipo de Microorganismos utilizados,
Substratos y Procesos.

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Investiga sobre metabolitos derivados del metabolismo intermedio y su


aplicacin en la Industria alimenticia.
Elabore un mapa conceptual que permita visualizar las diferentes
aplicaciones de la Biotecnologa en la industria alimenticia
Consulte un proceso Biotecnolgico, y realice un estudio de casos, a
partir del proceso que se desarrolla y sustntelo ante sus compaeros.

BIBLIOGRAFIA BSICA

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FAO: www.fao.org/biosecurity/
Bayer: www.bayervet.net/bs_index.html
Nieser: www.nieser.com.ar/esp/bioseguridad.asp
Biotecnologa de los Alimentos: IATA www.iata.csic.es/iata/dbio
Biotecnologa en Alimentacin y Agricultura
www.fao.org/biotech/index.asp?lang=es
CENTRO BIOINFO MONSANTO:
www.biotechknowledge.monsanto.com/
DIVERSIDAD BIOLGICA:
www.fao.org/biodiversity/index.asp?lang=es
GLOSARIO BIOTECNOLOGA:
www.monsanto.es/biotecnologia/glosario.html
www.fao.org/biotech/find-formalpha-n.asp

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD


ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA
CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA

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