AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE ADN CON EL KIT THERMO FISHER

SCIENTIFIC INC
Lorduy Hernndez, Sara2; Muoz Londoo, Melissa3;
2
slorduy@eafit.edu.co,3mmunozl@eafit.edu.co,
Universidad EAFIT, Escuela de ciencias bsicas y humanidades
Departamento de ciencias bsicas, Laboratorio de Biologa.
Medelln noviembre 2014
RESUMEN: El ADN es una estructura molecular que es
caracterstica de cada especie. Su estudio es pertinente para
una mayor comprensin de las especies y su evolucin a nivel
molecular. Los desarrollos tecnolgicos que se generan a partir
de esto ayudan en varios mbitos la vida humana. Por esto se
realiz una prctica investigativa donde se buscaba aislar ADN
y estudiar los factores que pueden hacer de este un proceso
ms eficiente, con esto se identificaron diversas causas de
error y se lleg a resultados concluyentes. Se obtuvieron
concentraciones de 55.1 y 14.1 ng/uL de muestra pura para
ADN y para RNA respectivamente.
ABSTRACT: DNA is a molecular structure different for each
species. Its study
is considered relevant for a coarser
understanding of the species and their evolution on a
molecular level. The technology developed from this, can be
useful in various scopes of human life. Based on this was made
a research, in which the final goal was to isolate DNA and
determine the factors that could help improve the efficiency of
the process, diverse causes of error were identified and this
made possible to acquire conclusive results. Concentrations of
55.1 and 14.1 ng / uL sample of pure DNA and RNA were
obtained respectively .
PALABRAS CLAVE: ADN, cido desoxirribonucleico, bases
nitrogenadas, thermo fisher scientific inc, aislamiento y
purificacin ADN.

1. INTRODUCCIN
El ADN o cido desoxirribonucleico,
es la base que define las formas de
vida que habitan la tierra; puesto
que es el indicador de las
reacciones que se llevaran a cabo
en los organismos y por lo tanto los
rasgos que los caracterizan. A partir
de este es posible transmitir

informacin gentica entre distintos

individuos y se logra la evolucin.
Cada parte de este o nucletido,
est formado por un azcar, una
base nitrogenada y un grupo
fosfato; al unir varios de estos se
obtiene un gen. Existen 3 tipos de
bases
nitrogenadas,
bases
isoaloxoazinicas,
bases
purinas,
como la adenina y la guanina, y

bases pirimidinas, como la timina y

el uracilo (National Institute of
Health, 2014). [1]
En los organismos con clulas
eucariotas el ADN se encuentra
principalmente en el interior del
ncleo, donde se dobla y se
comprime en paquetes llamados
cromosomas, el cual puede llegar a
desdoblarse
dependiendo
del
estadio o ciclo en que se encuentre
la clula. En las clulas procariotas
este se puede encontrar el rededor
del citoplasma. (Genetic science
learning center, University of Utah,
2014)[2]
Es por el gran papel que tiene este
arreglo molecular en posibilitar la
vida y el desarrollo de esta, que se
considera importante su estudio.
Para lograr una mirada ms clara de
este debe inicialmente aislarse de
los
dems
componentes
moleculares de la clula, para
proceder a otras tcnicas en las que
se pueda codificar y utilizar la
informacin que se guarda en l.
Debido a la pertinencia de este
estudio se consider relevante
realizar un proceso investigativo en
el que se siguen una serie de pasos
para aislar el ADN y as lograr
comprender que factores pueden
influir en que esta prctica sea
exitosa.
Para esto se utiliz un kit thermo
fisher scientific inc que permite el
aislamiento y purificacin del ADN a
partir de una muestra celular. Este
procedimiento se lleva a cabo con
intervalos de centrifugado a bajas
temperaturas y reacciones con una
solucin ltica, una solucin de
precipitacin
y
NaCl.
(Fisher
scientific inc, n.d.)[3]

2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO

GENERAL

Extraer ADN de un cultivo de

bacterias con ayuda de un nuevo
mtodo y kit de extraccin de
ADN: Thermo Fisher Scientific
Inc.

2.2. OBJETIVOS

ESPECFICOS

Aprender los pasos y tcnicas

para extraer ADN de un cultivo
especfico.

Cuantificar el ADN con ayuda del

nanodrop 2000.

Analizar los factores externos

que pudieron interferir y afectar
el proceso de obtencin de ADN.

3. METODOLOGA
3.1. Preparacin

y extraccin
de la muestra

La extraccin de ADN se realiz con

la
muestra
de
una
bacteria
previamente inoculada, con ayuda
de
unas
pipetas,
donde
primeramente se homogenizo para
romper las clulas de los tejidos y
liberar el contenido celular, en el
cual se encuentra los cidos
nucleicos.
3.2.

Degradacin y Lisis

La muestra de ADN se ubic se en

un tubo Eppendorf, donde se mezcl
con 400 L de lisis y 200 L de
buffer TE. La lisis ayuda a romper
las estructuras de mayor tamao,
esta
sustancia
contiene
el
detergente inico dodecil sustrato

de sodio (SDS) que neutralizar las

cargas negativas que inicial la
precipitacin de los cidos nucleicos
y el buffer TE solubiliza el ADN
mientras que lo protege de la
degradacin [4]. En esta fase se
tuvo en cuenta el cambio de las
puntas de cada pipeta para la
extraccin de las sustancias y luego
se incub el tubo a 65C al bao
Mara durante 5 minutos.
3.3.

Centrifugacin

Una vez haya pasado el tiempo

requerido el tubo fue expuesto al
vortex y a la resuspencin como se
muestra en la figura 1, con el fin de
que
la
mezcla
quede
suficientemente disuelto. Adems
se aadieron 600 L de cloroformo
agitando suavemente el tubo por 2
minutos para anestesiar la mezcla
hecha anteriormente y nuevamente
se centrifug a 10.000 rpm durante
2 minutos.

800 L de una solucin preparada

previamente con 80 L de solucin
10X de precipitacin y 720 L de
agua desionizada. Posteriormente
se centrifugo a 10.000 rpm durante
2 minutos para obtener una buena
mezcla
y
produciendo
una
deshidratacin de la solucin.
Luego se extrae el sobrante sin que
quede completamente seco y se
disolvi a partir de la tcnica vortex,
100 L de NaCl que ocaciona la
precipitacin
de
los
acidos
nucleicos.
3.5. Precipitacin
Se aadieron 300 L de etanol
expuesto a -20C por 10 minutos y
centrifugado a 10.000 rpm durante
4 minutos. Los cidos nucleicos al
no
ser
solubles
en
alcohol,
precipitan en direccin a la capa de
alcohol. [5]
3.6 Recuperacin y medicin de
DNA
Se extrajo el etanol que quedo en el
tubo, conservando el pellet en fondo
y al instante en el vortex se disolvi
con etanol fro en 100 L de agua
desionizada. Finalmente el resultado
del ADN se midi en el instrumento
de absorbancia nanodrop2000.

4. RESULTADOS
Figura 1 Centrifugacin

3.4.

Purificacin

Pasado los 2 minutos se retir la

fase acuosa de la parte superior,
resultado
del
centrifugado,
calculando de no extraer la fase
liquida. La fase acuosa extrada se
reubic a otro tubo Eppendorf con

Para cuantificar el ADN extrado, se

us
el
espectrmetro
Thermo
Scientific NanoDrop 2000 quien con
solo 1 uL midi la absorbancia (Esta
se define como la relacin entre la
energa de la luz transmitida a
travs de una solucin problema (I)
y la energa transmitida a travs de
una solucin de referencia o blanco
(I0) [6]) de la muestra. El software
del equipo arroj los resultados
descritos en la figura 2, y se
analizaron los resultados usando el

Figura 2 cuantificacin de la muestra

T042TECHNICAL BULLETIN [7] del

espectrmetro usado.

medida en ng/uL fue mayor a la

arrojada por el blanco (a excepcin
de la muestra 2).
Es notable la ineficiencia del mtodo
usado para extraer una muestra
pura de ADN (lo que se desea),
debido a que para todas las
muestras la relacin 260/230 fue
menor a 2.0-2.2 lo que significa que
todas las muestras pueden tener
fenoles residuales.

Para este informe se tomaron las

muestras
Para este informe se tomaron las
muestras nmero 4 y 9 que fueron
realizadas por los autores de este
informe. Para la muestra 4 se
obtuvo 55.1 ng/uL, la concentracin
ms alta obtenida de todas las
muestras. La relacin 260/280 fue
de 1.75 que segn el T042 es un
resultado aceptable para pureza de
ADN, para la relacin 260/230 el
resultado obtenido fue menor al
aceptado para pureza, lo que
significa que la muestra puede estar
contaminada por ejemplo con
fenoles residuales. Para la muestra
9, se obtuvo una concentracin de
14.1 ng/uL donde la relacin
260/280 fue de 2.14 un resultado
aceptable para concentraciones de
RNA, para la relacin 260/230 el
anlisis es igual al de la muestra 4.

5. CONCLUSIONES
La extraccin de AND de una
bacteria usando el kit de extraccin
de ADN Thermo Fisher Scientific Inc.
fue exitosa porque para la mayora
de las muestras la concentracin

Es importante resaltar que para

ninguna
muestra
la
relacin
260/230 fue mayor a 2.0-2.2 lo que
demuestra que el blanco usado
como referencia fue el correcto.
Debido a que un valor mayor puede
ser resultante de usar un solvente
inequvoco como blanco o alguna
irregularidad con este.
Las
contaminaciones
pueden
deberse a que no se desarroll bien
la toma de sobrenadante y se
extrajo muestras de diferentes
compuestos que no fueron DNA
como RNA o protenas.

REFERENCIAS
[1] Fisher scientific inc. (s.f.).
Thermo Scientific.
Recuperado el 13 de 11 de
2014, de
http://www.thermoscientificbi
o.com/nucleic-acidpurification/dna-from-cellsand-tissue/genomic-dnapurification-kit/
[2] Genetic science learning center,
University of Utah. (2014).
Learn.Genetics. Recuperado
el 13 de 11 de 2014, de
http://learn.genetics.utah.edu
/content/molecules/dna/

[3] National Institute of Health. (17

de Julio de 2014). National
human genome research
institute. Recuperado el 14 de
11 de 2014, de
http://www.genome.gov/2552
0880
[4] Microbial,La extraccin y
purificacin del ADN para el anlisis
de PCR,2009,Espaa. [Citado el 17
de Noviembre del 2014] [Disponible
en internet]: http://www.microbialsystems.com/web/docs/Newsletter_
Microbial_03.pdf.
[5] Mara Merc Sanz,Extraccion
sencilla de ADN,2012,Estados
Unidos. [Citado el 17 de noviembre
del 2014] [Disponible en internet]:
http://www.formacionprofesionalqui
mica.com/index.php?
option=com_k2&view=item&id=146

%3Aprotocolo1&Itemid=120&lang=gl.
[6] UNAD,Transmitancia y
Absorbancia,2009,Colombia. [Citado
el 17 de noviembre del 2014]
[Disponible en internet]:
http://datateca.unad.edu.co/conteni
dos/401539/exe-2%20de
%20agosto/leccin_3_transmitancia_
y_absorbancia.html.]
[7]Thermo Scientific,T042TECHNICAL BULLETIN,2011,Estados
Unidos.[Citado el 17 de noviembre
del 2014] [Disponible en internet]:
http://www.nanodrop.com/Library/T0
42-NanoDrop-SpectrophotometersNucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf.