1

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE MICROORGANISMOS DE INTERS

COMO Acetobacter aceti Y Saccharomyces cerevisiae.
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF MICROORGANISMS OF INTEREST AS
Acetobacter aceti AND Saccharomyces cerevisiae.

Leidy Yulieth Castellanos Madero1

Mara Alejandra Jimnez Orjuela2
Luz Jakelyne Martnez Daz3
Dayerly Ximena Silvera Bejarano4

RESUMEN

Las levaduras y bacterias juegan un

papel importante en la elaboracin de
productos alimenticios entre ellos la
produccin de vinagre. En este artculo
se describe procedimientos, para

levaduras Saccharomyces cerevisiae y

bacterias
acticas
del
gnero
Acetobacter aceti para la obtencin de
vinagre. Para el aislamiento de dichos
microorganismos se realiz lavado y
esterilizado de todo el material que se
us para la preparacin de los medios
de cultivo y que entro en contacto con
las muestras.

1 Leidy Yulieth Castellanos Madero, Servicio Nacional de Aprendizaje- SENA, Qumica

Aplicada a la industria, Bogot, Colombia. lycastellanos896@misena.edu.co Ficha 809153 Grupo
52TGQID.
2 Mara Alejandra Jimnez Orjuela, Servicio Nacional de Aprendizaje- SENA, Qumica
Aplicada a la industria, Bogot, Colombia. majimenez572@misena.edu.co Ficha 809153 Grupo
52TGQID

3 Luz Jakelyne Martnez Daz, Servicio Nacional de Aprendizaje- SENA, Qumica Aplicada a la
industria, Bogot, Colombia. ljmartinez94@misena.edu.co Ficha 809153 Grupo 52TGQID4 Dayerly
Ximena Silvera Bejarano, Servicio Nacional de Aprendizaje- SENA, Qumica Aplicada a la
industria, Bogot, Colombia. dxsilvera@misena.edu.co Ficha 809153 Grupo 52TGQID

Tanto para levaduras y bacterias

acticas se identific el tipo de colonia
de acuerdo con su color, tamao y
apariencia teniendo en cuenta su
morfologa
como;
color, bordes,
tamao,
textura
y
forma,
posteriormente
de
su
prueba
macroscpica, se realiz un frotis y
tincin de Gram, para su identificacin
microscpica. para el aislamiento de
las bacterias se tom una muestra de
vinagre de pia, que se haba
mezclado 10g de la muestra, en 90 mL
de caldo de enriquecimiento durante
siete das, se realiz el aislamiento y
siembra por medio de la tcnica de
estra o tcnica de siembra por
agotamiento, que consiste en trazos
de estras sobre una placa de agar
permitiendo el posterior crecimiento de
colonias totalmente aisladas,
en
medio de cultivo GYC (glucosa,
extracto de levadura y Carbonato de
calcio) y medio Carr, que se encuentra
compuesto por extracto de levadura,
verde bromocresol, etanol y agar-agar.
Para confirmacin de Acetobacter
aceti
se
realizaron
pruebas
bioqumicas como superoxidacin de
etanol dando positivo, pruebas de
movilidad, prueba de oxidasa y
catalasa
dando
como
resultado
negativos
para
confirmacin
de
Acetobacter aceti y obteniendo otro tipo
de microorganismo.
Para el aislamiento de levadura se
sustrajo la muestra a partir de chicha
comercial, realizndose en diluciones,
empezando con 10-1 hasta 10-4 y
posteriormente su siembra en medio
YGC (Extracto de levadura, glucosa y
clorofenicol) teniendo en cuenta la
temperatura y tiempo de incubacin,

posteriormente
se
realiz
su
aislamiento en recuento en placas,
para identificar sus caractersticas
morfolgicas.
Se realizaron pruebas bioqumicas para
la confirmacin de Saccharomyces
cerevisiae como fermentacin de
azucares y tolerancia al etanol
comprendidas entre el 2%,4%,6% y
8%, en donde se puedo observar a
travs de los resultados que su
capacidad
de
supervivencia
y
reproduccin es alta, ste tipo de
microorganismo tolera concentraciones
de etanol elevadas.
Para la fermentacin de azcares, no
se obtuvieron resultados satisfactorios
para confirmacin de la levadura,
indicndonos que el microorganismo
que obtuvimos no era Saccharomyces
cerevisiae.
.
ABSTRACT
The yeasts and bacteria play an
important paper in the production of
food products between them the
production of vinegar. In this article
procedures are described, for yeasts
Saccharomyces cerevisiae and acetic
bacteria of the kind Acetobacter aceti
for the obtaining vinegar. For the
isolation of the above-mentioned
microorganisms, wash was realized
and sterilized of the whole material that
was used for the preparation of the
means of.
Both yeast and acetic bacteria colony
type according to their color, size and
appearance was identified considering
their morphology as; color, borders,
size, texture and shape, then your
gross test, a smear and Gram stain for

microscopic identification was made. for

isolation of bacteria a sample of vinegar
pineapple, which was mixed 10g of the
sample in 90 mL of enrichment broth for
seven days was taken, the isolation
was performed and sowing by means of
the technique of spline or technical
seed depletion, consisting of lines of
grooves on an agar plate allowing
further growth of isolated colonies fully
in GYC medium (glucose, yeast extract
and calcium carbonate) and Carr
medium, which is composed of yeast
extract, bromocresol green, ethanol and
agar.
For confirmation "Acetobacter Aceti"
biochemical tests-oxidation of ethanol
giving positive evidence of mobility,
oxidase and catalase giving negative
result for confirmation of Acetobacter
aceti
and
obtaining
other
microorganism were performed.
For the isolation of yeast sample was
subtracted from commercial chicha,
performing at dilutions, starting at 10-1
to 10-4 and then planting in YGC
medium (yeast extract, glucose and
clorofenicol) taking into account the
temperature and incubation time later
isolation in plate count was performed
to
identify
morphological
characteristics.
Biochemical tests for the confirmation
of "Saccharomyces cerevisiae" as
fermentation of sugars and ethanol
tolerance between 2%, 4%, 6% and 8%
were conducted, where I observed
through the results your survivability
and reproduction is high, this type of
microorganism
tolerates
high
concentrations of ethanol.
for fermentation of sugars, no
satissfactorios results were obtained for
confirmation of yeast, indicating that we
obtained the microorganism was not
Saccharomyces cerevisiae.
Palabras Clave

Fermentacin actica, fermentacin

alcohlica, oxidasa, catalasa, vinagre.
INTRODUCCIN
El vinagre es el producto que se
obtiene luego de dos etapas de
fermentacin, la primera etapa consiste
en una etapa de fermentacin
alcohlica en donde el azcar es
transformado en alcohol en ausencia
de oxgeno, en la segunda etapa ocurre
una fermentacin actica en la que el
alcohol es oxidado y transformado en
cido actico en presencia de oxgeno.
En las siguientes pginas vamos a
centrarnos en las levaduras y bacterias
acticas como responsables de las
etapas de fermentacin necesarias
para la produccin de vinagre
( Colquichagua , 1998 )
De igual manera, se describirn los
medios de cultivo
usados, su
preparacin y alistamiento de material,
se darn a conocer los clculos
realizados para cada medio, los
montajes de tcnica para aislamiento
de Saccharomyces cerevisiae
y
Acetobacter aceti, el montaje para
caracterizacin
macroscpica,
microscpica
e
identificacin
bioqumica. As mismo, la lectura e
interpretacin
de
los
resultados
obtenidos
OBJETIVOS
Objetivo General:
Aislar y caracterizar microorganismos
de inters como Acetobacter aceti Y
Saccharomyces cerevisiae.
Objetivos especficos:
Realizar pruebas bioqumicas para
identificar
si
las
caractersticas

coinciden con las colonias presuntivas

de Acetobacter aceti y Saccharomyces
cerevisiae

peptona y se agregaron al agua

destilada y finalmente se disolvi la
solucin.

Aislar a partir del vinagre casero de

pia bacterias acticas y a partir de la
chicha comercial levaduras.

CALDO DE ENRIQUECIMIENTO: Para

su preparacin se utiliz extracto de
levadura 20g/L; etanol 20mL y cido
actico 10mL

MATERIALES Y MTODOS
Operaciones previas.
Para el aislamiento de bacterias
acticas Acetobacter aceti y levaduras
Saccharomyces
cerevisiae
se
prepararon medios de cultivo con
medio Carr, medio GYC, medio YGC,
Caldo de enriquecimiento y agua
peptonada; Tal como se observa en la
tabla 1.
Clculos.
MEDIO CARR: Se prepararon 300mL
del medio, as: Se tomaron 294mL de
agua destilada, luego se agregaron 9g
de levadura, 3x10-3mL de verde de
bromocresol y de Agar-Agar 4.5g.
Posteriormente se calent en plancha
de calentamiento, despus de auto
clavar se agregaron ,6mL de etanol al
medio y finalmente se adicionaron
20mL a cada caja de Petri.
MEDIO GYC: Para ste medio se
prepararon 300mL, as: Se midieron
294mL de agua, luego se pesaron 1.5g
de CaCO3; 3g de levadura; 6g de AgarAgar y 15g de glucosa y se disolvieron
en el agua, se puso la solucin en
plancha de calentamiento, despus de
auto clavar se agregaron 6mL de etanol
y finalmente se sirvieron los medios de
cultivo en las cajas de Petri.
AGUA PEPTONADA: Se tomaron
100mL de agua destilada, luego se
pesaron 0.85g de NaCl y 0.1g de

Tabla 1. Clculos realizados para

preparacin de todos los medios de
cultivo.
MEDI
O

MEDI
O
CARR

MEDI
O
GYC

AGU
A

CALD
O DE
ENRR
IQUE
CIMI
ENTO

YGC

COMPONEN
TE

CANTID
AD

Extracto de
levadura
Verde de
bromocresol
Etanol
Agar- Agar
Carbonato
de calcio
Extracto de
levadura
Agar- Agar
Etanol
Glucosa

30 g/L

NaCl
peptona
agua
destilada
Extracto de
levadura
etanol
cido
actico
Extracto de
levadura
Glucosa
Agar-Agar
cloranfenicol

RESULTA
DO
CLCULO
S
9g

0,001
g/L
2% v/v
15 g/L
5g/L

3x10-3 mL

10g/L

3g

20g/L
2%v/v
50g/L.

6g
15g
6mL

0.85
%p/v
0.1% p/v
100mL

0.85g
0.1g
100mL

20g/L

2g

20mL
10mL.

20mL
10 mL

0.2g

0.2g

0.8 g
0.6g
0.004g

0.8 g
0.6 g
0.004g

4,5g
6Ml
1.5g

Montaje de
aislamiento
cerevisiae.

la tcnica para el
de
Saccharomyces

Y para la identificacin microscpica se

realiz el frotis y posteriormente tincin
de Gram.

Para el aislamiento de Saccharomyces

cerevisiae se realiz un proceso de
dilucin seriada (ver imagen 1) en agua
peptonada a partir de chicha, se hizo la
siembra de 0.1 ml de las diluciones
seleccionadas (10-3 y 10-4) sobre la
superficie de agar YGC, posteriormente
se llev a incubadora por 8 das.

Tincin de Gram: Se adiciono una

gota de cristal violeta sobre el frotis
por 1 minuto, se lav y adiciono una
gota de Lugol durante 1 minuto, se lav
y se adiciono alcohol acetona durante
30 segundos, se lav y se adiciono
fuscina de Gram durante 1 minuto, se
lav y dejo secar.

Imagen1. Montaje de Saccharomyces

cerevisiae.
Montaje de la tcnica para
aislamiento de Acetobacter aceti.

el

Para el aislamiento de las bacterias se

tom una muestra de vinagre de pia,
donde se mezclaron 10g de la muestra,
en 90 mL de caldo de enriquecimiento y
se llev a agitacin a 120 rpm durante
siete das, se realiz el aislamiento y
siembra por medio de la tcnica de
estra o tcnica de siembra por
agotamiento, en medio de cultivo GYC
y medio Carr.
Montaje
de
la
caracterizacin
macroscpica y microscpica.
Para la identificacin macroscpica se
utiliz un marcador, realizndose un
crculo rodeando la colonia y al lado se
marc con una letra, como (A, B y C)
Se describi morfolgicamente cada
una de las colonias identificadas,
teniendo en cuenta: Color, bordes,
tamao, textura, y forma.

Para la observacin en el microscopio

se tuvo en cuenta el objetivo de 100X,
se aadi una gota de aceite de
inmersin sobre el frotis y se procedi a
enfocar.
Montaje de las pruebas bioqumicas.
Para la tolerancia al etanol se
elaboraron 4 tubos con caldo OGY
cada uno a una concentracin diferente
de etanol (2%, 4%, 6% y 8%), se
sembr el microorganismo a evaluar en
cada concentracin y se llev a
incubadora por 5 das.
En la fermentacin de azcares se
elaboraron 6 tubos cada uno con un
azcar (glucosa, sacarosa, xilosa,
maltosa, ribosa, lactosa), se agreg
una campana de Durham para
observar la produccin de gases, se
procedi
a
sembrar
con
el
microorganismo seleccionado, se llev
a incubar por 3 das.
Para la prueba de movilidad se elabor
un tubo con 5mL de medio SIM, se
sembr el microorganismo seleccin
seleccionado y se llev a incubadora
por 3 das.
La superoxidacin del etanol se realiz
con un tubo de medio Carr, se sembr
el microorganismo seleccionado con el

tubo inclinado y se llev a incubadora

por 15 das.
Para la prueba de catalasa en una
lmina se coloc una gota de perxido,
con ayuda de un palillo se toc la
colonia y se hizo una emulsin sobre el
perxido y para la prueba de oxidasa
en un papel filtro se coloc 1% de
oxalato de dimetil-p-fenilendiamina y
con ayuda de un palillo se toc la
colonia y se adiciono al papel filtro
impregnado.

azcares debe arrojar de manera

positiva para glucosa, galactosa,
sacarosa, maltosa, trehalosa, rafinosa y
ramnosa.

Lectura de pruebas bioqumicas

De igual manera para identificar

Acetobacter Aceti se realiz prueba de
oxidasa, la cual se reporta como
positiva cuando se observa un cambio
a color morado al agregar el reactivo de
oxalato de dimetil p-fenilendiamina.
Tambin se realiz la prueba de
catalasa para identificar la enzima,
observndose un burbujeo al ser
positiva

Para identificar a Saccharomyces

cerevisiae se realizaron dos pruebas
bioqumicas, la tolerancia al etanol, la
cual se lee positiva cuando se observa
crecimiento del microorganismo en el
medio sembrado ,y la prueba
bioqumica para la fermentacin de

Se realiz prueba de movilidad, en la

que se debe presentar turbidez en la
puncin realizada sobre el medio.
Igualmente se debe observar la
superoxidacin del etanol positiva
cuando el medio vira a amarillo y
posteriormente vuelve a color verde.

RESULTADOS
En la tabla 3 se muestra la identificacin macroscpica y microscpica realizada para
las colonias que coinciden con las caractersticas del microorganismo de inters.
Macroscopa y microscopa.
Tabla 3. Reporte de resultados de identificacin macroscpica y microscpica.
Identificacin Macroscpica
Muestra

Colonia

YGC
GYC
CARR

1
2
3

Color

Bordes

Tamao

Textura

Forma

Blanco
Amarillo
Beige

Entero
Circular
ondulado

Pequeo
Pequeo
grande

Cremosa
Cremosa
spera

Circular
Circular
Irregular

Identificacin Microscpica
Tipo de
Forma
Gram
microorganismo
ovaladas
+
levaduras
ovaladas
+
Cocobacilos
Circulares
+
cocos

Pruebas bioqumicas.
A continuacin se presentan los resultados de las pruebas bioqumicas con el fin de
identificar si el microorganismo coincide con el de inters, Saccharomyces Cerevisiae
(ver tabla4) y Acetobacter (ver tabla 5).
Tabla 4. Resultados tolerancia de etanol y fermentacin de carbohidratos.
Colo

Tolerancia al etanol

Fermentacin de carbohidratos

7
nia
1

2%

4%

6%

8%

positivo

positivo

positivo

positivo

Glucos
a
positivo

Sacaro
sa
positivo

Xilosa

Ribosa

Negativo

Negativ
o

Lactos
a
Negativ
o

Maltosa
Positivo

Tabla 5. Resultados prueba de movilidad y Superoxidacin del etanol.

Colonia

Movilidad

Negativo

Macroscopa y microscopia
Saccharomyces cerevisiae

Superoxidacin
del etanol
Positivo

Catalasa

Oxidasa

Negativo

Negativo

de

Imagen 2. Macroscopa Crecimiento de

colonia 1 en Agar YGC.

Lectura de las pruebas bioqumicas.

Imagen 4. Resultados de fermentacin
de carbohidratos.

Tabla 2. Identificacin Macroscpica

Saccharomyces cerevisiae.
Identificacin Macroscpica
Color
Blanco
Bordes
Entero
Tamao
2mm
Textura
Cremosa
Forma
Circular

Imagen 5. Prueba de movilidad y

Superoxidacin del etanol.

Imagen 3. Morfologa microscpica

Saccharomyces cerevisiae

ANLISIS DE RESULTADOS
Para el aislamiento que se pretenda
lograr de Saccharomyces Cerevisiae y
Acetobacter
aceti
se
utilizaron
muestras de chicha y vinagre casero
respectivamente, de las cuales los
resultados
obtenidos
para
caracterizacin
microscpica
y
macroscpica no fueron satisfactorios
ya que no coinciden con el de inters.
En los resultados obtenidos para
bacterias
acticas,
se
obtuvo
resultados como prueba negativa para
la presencia de la enzima catalasa,
presente en la mayora de las bacterias
aerobias. Se esperaba que el resultado
fuera positivo, debido a que en el
proyecto de formacin se necesita
trabajar
con
el
microorganismo
Acetobacter. Tambin se realiz la
prueba de oxidasa, la cual dio negativa
para la presencia de citrocromo C
oxidasa, en este caso es lo ideal segn
Hernndez y Barbero, 2008, quienes
indican adems que la prueba para
catalasa debe ser positiva para
bacterias acticas.
Tambin se obtuvo prueba negativa
para la movilidad, es decir que el
microorganismo obtenido no presenta
movilidad alguna.

Los resultados no son satisfactorios

debido a que segn Hernndez y
Barbero, 2008 se indica que las
bacterias acticas son encontradas
fcilmente en las uvas, en lugar de
donde se realiz el aislamiento.
Para las levaduras se realiz una
prueba
al
microorganismo
de
tolerancias al etanol comprendidas
entre el 2%,4%,6% y 8%, en donde se
puede observar a travs de los
resultados que su capacidad de
supervivencia y reproduccin es alta,
ste es un buen resultado debido a que
segn Garzn y Hernndez ,2009 ste
tipo
de
microorganismos
tolera
concentraciones de etanol elevadas.
Posteriormente,
para
la
prueba
bioqumica
de
fermentacin
de
carbohidratos se puede observas que
no se obtuvo resultados satisfactorio
para Saccharomyces Cerevisiae, ya
que los resultados obtenido (ver tabla
4) no cumplen con los resultados
encontrados segn Buitrago, 2015.
Se
esperaba
lograr
aislar
el
microorganismo
Saccharomyces
cerevisiae en la chicha, ya que de
acuerdo Lpez, Ramrez y Mambuscay,
es una especie de levadura que se
puede encontrar en este tipo de
mostos.

Los resultados no son satisfactorios

porque lo que se obtuvo del aislamiento
segn las pruebas mencionadas
anteriormente no es una levadura, por
lo que es necesario trabajar con una
cepa control para poder inocular los
mostos, ya que es el microorganismo
que se esperar obtener para poder
iniciar con la fermentacin.
CONCLUSIONES
Se aislaron bacterias a partir de vinagre
de pia casero y levaduras a partir de
chicha comercial para realizar los
procesos de fermentacin alcohlica y
actica
Se observ que en las diferentes
concentraciones
de
etanol
el
microorganismo presenta crecimiento,
es decir, que tolera el medio al que ha
sido expuesto y por lo cual tiene la
capacidad de reproducirse, pero esto no
nos garantiza que sea Saccharomyces
cerevisae, ya que en la prueba
bioqumica de fermentacin de azcares
arrojo negativo en la confirmacin de
dicho microorganismo.
Se evidencio a travs de las pruebas
bioqumicas como superoxidacin de
etanol,
que dio
positivo para el
microorganismo de inters, pero en la
prueba de movilidad, prueba de oxidasa
y catalasa arrojando como resultado
negativo
para
confirmacin
de
Acetobacter aceti y obteniendo otro tipo
de microorganismo.

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