TESIS. Determinacion de Concentracion de Amilasas

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ALFA Y BETA AMILASAS
COMERCIALES EN LA PRODUCCIN DE ETANOL A PARTIR ALMIDN DE

CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Bogot, D.C. Enero 11 del 2009

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al ttulo de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Bogot, D.C.
Enero 11 del 2009
NOTA DE ADVERTENCIA:
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario
al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia.

APROBADO
_________________________
_________________________
HELBERTH ESPITIA RIVERA
IVONNE GUTIERREZ ROJAS
Ingeniero Qumico
Bacteriloga M. Sc
Director
_______________________
ADRIANA MATIZ
Bacteriloga M. Sc
Jurado
Asesor
_______________________
ANDREA AGUIRRE
Bacteriloga M. Sc
Jurado

APROBADO
_______________________
INGRID SCHULER
_______________________
JANETH ARIAS
Biloga, Ph.D.
Bacteriloga, M. ScM. Ed
DECANA ACADEMICA
DIRECTORA DE CARRERA
Este trabajo lo dedico a Dios por darme la sabidura y fortaleza en cada paso de
este proceso formativo. A mis padres por su amor, esfuerzo y apoyo. Tambin
quiero agradecer a mis amigos que me acompaaron durante la carrera por toda su
colaboracin y amistad que fueron muy importantes para lograr esta meta.
Carolina.

AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo es el resultado del inters de la empresa Destilera Premier

LTDA., en especial del Ingeniero Helberth Espitia, director tcnico de la misma, por
su continua bsqueda de alternativas de mejoramiento del proceso a nivel de de
rendimientos, calidad y rentabilidad, as como tambin por proponer, financiar y
dirigir este trabajo.
Agradezco especialmente la colaboracin y asesora permanente e incondicional de
la Doctora Ivonne Gutirrez de la Pontificia Universidad Javeriana. Tambin al
Ingeniero Axel, director del laboratorio de Bromatologa de la Secretara de Salud
del Tolima de la ciudad de Ibagu, por su asesora y colaboracin en la realizacin
de los anlisis de este proyecto.
Por ltimo agradezco a mi madre por su inters compartido por este trabajo,
acompandome siempre con una voz de nimo y disposicin de ayuda para poder
lograr esta meta.
vii

TABLA DE CONTENIDO
Pg.
1.
INTRODUCCIN ....................................................................................................... 18
2.
MARCO TEORICO .................................................................................................... 19
2.1
LA CEBADA .............................................................................................................. 19
2.1.1
Taxonoma ................................................................................................................ 19
2.1.2
Caractersticas generales ........................................................................................ 19
2.2
CEBADA MALTEADA ............................................................................................... 20
2.3
ALMIDON DE CEBADA ............................................................................................ 21
2.3.1
Amilosa...................................................................................................................... 21
2.3.1.1 Amilopectina ............................................................................................................. 23

2.4
MTODOS HIDROLTICOS DEL ALMIDN ............................................................ 23
2.4.1
Mtodo qumico ........................................................................................................ 23
2.4.2
Mtodo enzimtico ................................................................................................... 24
2.4.2.1 -Amilasa .................................................................................................................. 27

2.4.2.2 -amilasa ..................................................................................................................... 28
2.4.2.3 Glucoamilasas .......................................................................................................... 29
2.4.2.4 Pululanasa ................................................................................................................ 29
2.5
PROCESO DE PRODUCCIN DE ALCOHOL ......................................................... 30
2.5.1
Sustrato: mosto ........................................................................................................ 30
2.5.2
Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae ....................................................... 31
2.5.2.1 Morfologa ................................................................................................................. 31

2.5.2.2 Reproduccin ........................................................................................................... 32
2.5.2.3 Requerimientos nutricionales ................................................................................. 32
2.5.2.3.1 Fuente de Carbono ................................................................................................ 32
2.5.2.3.2 Fuente de nitrgeno .............................................................................................. 32
2.5.2.3.3 Macro y Micronutrientes ....................................................................................... 33
2.5.2.3.4 Vitaminas ................................................................................................................ 33
2.5.2.4 Requerimientos ambientales ................................................................................. 34
2.5.2.4.1 Temperatura ........................................................................................................... 34
2.5.2.4.2 Oxigeno................................................................................................................... 34
2.5.2.4.3 pH ............................................................................................................................ 34
2.5.2.5 Metabolismo ............................................................................................................. 34
2.5.2.5.1 Azcares ................................................................................................................. 34
2.5.2.5.2 Nitrgeno ................................................................................................................ 35
viii

2.5.2.5.3 Fsforo.................................................................................................................... 35
2.5.3
FERMENTACIN ...................................................................................................... 36
2.6
PRODUCCIN DE ALCOHOL EN DESTILERA PREMIER LTDA. ........................ 37
3.
FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION .......................................... 39
4.
OBJETIVOS ............................................................................................................... 40
4.1
OBJETIVO GENERAL............................................................................................... 40
4.2
OBJETIVOS ESPECFICOS...................................................................................... 40
5.
MATERIALES Y MTODOS ..................................................................................... 41
5.1
DISEO DE LA INVESTIGACIN ............................................................................ 41
5.1.1
Poblacin de estudio ............................................................................................... 41
5.1.2
Materiales .................................................................................................................. 41
5.1.3
Enzimas y levadura .................................................................................................. 41
Multifect AA 21L y Multifect AA 23L son enzimas comerciales de Genencor

Internacional, Inc., las cuales son utilizadas en Destilera Premier LTDA. para
el desarrollo de investigaciones de mejoramiento del proceso hidroltico del
almidn de cebada. Multifect AA 21L es una -amilasa estable a altas
condiciones de calor y a un pH bajo, esta enzima no requiere calcio adicional
para operar bajo condiciones de licuefaccin industrial. Las condiciones
recomendadas de licuefaccin primaria son 105-110C por 5-7 minutos y
secundaria 95C por 90-120 minutos (molido hmedo) 85-93C por 90-120
minutos (molido seco) a un pH entre 5.5-5.8......................................................... 41
5.2
MTODOS ................................................................................................................. 42
5.2.1
Proceso hidroltico del almidn .............................................................................. 42
5.2.1.1 Control de comparacin .......................................................................................... 43

5.2.1.2 Control negativo ....................................................................................................... 44
5.2.2
Rendimiento del proceso de hidrlisis .................................................................. 44
5.2.3
Condiciones de fermentacin ................................................................................. 44
5.2.3.1 Pruebas preliminares ............................................................................................... 44

5.2.3.2 Preparacin de inculo............................................................................................ 45
5.2.3.3 Fermentacin ............................................................................................................ 45
5.3
DETERMINACIN DE BIOMASA ............................................................................. 46
5.4
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE AZCARES REDUCTORES Y

ALMIDN. .................................................................................................................. 46
5.4.1
Determinacin del ttulo de la solucin de Fehling. ............................................. 46
5.4.2
Valoracin de la muestra ......................................................................................... 47
5.4.2.1 Clculo de azcares reductores ............................................................................. 48
ix

5.5
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ETANOL .................................. 48
5.5.1
Destilacin ................................................................................................................ 48
5.5.1.1 Clculo de la gravedad especfica.......................................................................... 50

5.6
VARIABLES DE ESTUDIO........................................................................................ 50
5.7
RECOLECCIN DE LA INFORMACIN .................................................................. 51
5.8
ANLISIS DE INFORMACIN .................................................................................. 51
6.
RESULTADOS Y DISCUSIN .................................................................................. 52
6.1
CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS ............................................................... 52
6.2
PROCESO HIDROLTICO DEL ALMIDN DE CEBADA SIN MALTEAR .............. 53
6.3
ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIN ................................................................. 58
6.4
FERMENTACIN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE

CEBADA SIN MALTEAR .......................................................................................... 61
6.4.1
Consumo de sustrato .............................................................................................. 66
6.4.2
Produccin de etanol ............................................................................................... 69
6.5
COSTOS DE PRODUCCIN .................................................................................... 73
7.
CONCLUSIONES ...................................................................................................... 75
8.
RECOMENDACIONES .............................................................................................. 77
9.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................... 78
10.
ANEXOS .................................................................................................................... 88

INDICE DE TABLAS
Pg
Tabla 1.
Composicin del grano de cebada..20
Tabla 2.
Accin que ejerce sobre el almidn la fosforilasa, -glucosidasa,

-amilasa,
-amilasa
y
enzimas
desramificadoras.....25
Tabla 3.
Composicin tpica del mosto.30
Tabla 4.
Resumen del diseo experimental............42
Tabla 5.
Resultados de la concentracin de almidn realizados a la

cebada
mateada
y
sin
matear......52
Tabla 6.
Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso

hidroltico...56
Tabla 7.
Datos de la biomasa mxima alcanzada y el consumo de sustrato

bajos las diferentes concentracin de enzimas, (C+) control de
comparacin
y
(C-)
control
negativo..........68
xi

INDICE DE GRFICAS
Pg
Grfica 1.
Concentracin de azcares reductores en funcin de la dosis de

de enzimas, (C+) control de comparacin y (C-) control negativo
despus
de
la
hidrlisis
por
8h.54
Grfica 2.
Relacin azcares reductores producidos y rendimiento de

hidrlisis en funcin
de la concentracin de enzimas, (C+)
control
comparacin
de
(C-)control
negativo.57
Grfica 3.
Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante el

ensayo previo de experimentacin..59
Grfica 4.
Poblacin de Saccharomyces cerevisiae presente en el medio de

fermentacin
con
las
diferentes
concentraciones
de
enzimas...62
Grfica 5.
Relacin entre concentracin de clulas/mL mxima y el tiempo

de obtencin de la biomasa mxima de S. cerevisiae en funcin
de la concentracin de enzimas, (C+) control de comparacin y
(C-)
control
negativo...............65
Grfica 6.
Relacin entre la concentracin de azcares reductores inicial y

final de la fermentacin con S. cerevisiae en funcin de la
concentracin de enzimas, (C+) control de comparacin y (C-)
control
negativo...67
xii

Grfica 7.
Consumo total de sustrato bajos las diferentes concentracin de

enzimas,
(C+)
control
de
comparacin
(C-)
control
negativo..69
Grfica 8.
Produccin total de etanol bajos las diferentes concentracin de

enzimas,
(C+)
control
de
comparacin
(C-)
control
negativo...70
Grfica 9.
Consumo total de sustrato y produccin total de etanol bajos las

diferentes
concentracin
comparacin
de
enzimas,
(C-)
(C+)
control
de
control
negativo................71
Grfica 10.
Relacin entre la concentracin de etanol producido y

productividad producto-sustrato en funcin en funcin de la
concentracin de enzimas, (C+) control de comparacin y (C-)
control
negativo.72
xiii

INDICE DE FIGURAS
Pg
Figura 1. Representacin de las dos formas de almidn que se dan en la
cebada...22
Figura 2. Degradacin del almidn....26
Figura 3. Coloracin de Gram Saccharomyces cerevisiae.....31
Figura 4. Reproduccin del inculo..45
Figura 5. Reaccin de Fehling....47
Figura 6. Destilacin de las muestras...49
Figura 7. Determinacin del peso del destilado....50
xiv

INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. Soluciones de trabajo....88

ANEXO 2. Determinacin del porcentaje de almidn...89
ANEXO 3. Mtodo para recuento celular en cmara de Newbauer...90
ANEXO 4. Tablas complementarias del proceso hidroltico...92
ANEXO 5. Figuras complementarias del proceso hidroltico.....93
ANEXO 6. Tablas complementarias de fermentacin...95
ANEXO 7. Grficas complementarias de fermentacin101
ANEXO 8. Figuras complementarias del proceso fermentativo105
ANEXO 9. Anlisis estadstico106
ANEXO 10. Costos de produccin......109
ANEXO 11. Ficha tcnica Multifect AA 21L.........110
ANEXO 12. Ficha tcnica Multifect AA 23L112
ANEXO 13. Ficha tcnica Saccharomyces cerevisiae...114
xv

RESUMEN
Destilera Premier LTDA dentro de sus procesos productivos emplea cebada sin
maltear como sustrato para la produccin de etanol en conjunto con la cebada
malteada, con el fin de equilibrar los costos de produccin, por lo que en este
trabajo se prob la concentracin de y amilasas que se deben adicionar al grano
de cebada sin maltear como alternativa para disminuir el uso de la cebada maltada
en el proceso de obtencin de etanol. Para lo anterior se realizo ensayos a nivel de
laboratorio variando las concentraciones de y amilasas, Multifect AA 21L y
Multifect AA 23L, respectivamente, que se agregaron al medio para la etapa de
hidrlisis del almidn de cebada. La concentracin de enzimas ptima fue 20 ml/L,
lo cual permiti mejorar el rendimiento de hidrolisis con 89,44 % en comparacin
con las concentraciones que obtienen con la cebada malteada empleada en la
planta (41.85%) adems de producir mayor cantidad de alcohol.

ABSTRAC
Premier LTDA distillery within their manufacturing processes used unmalted barley
as a substrate for the production of ethanol in conjunction with malted barley, in
order to balance the costs of production, so that this work was tested in the
concentration of and amylases to be added to the grain of unmalted barley as an
alternative to reduce the use of barley malt in the process of obtaining ethanol. For
the foregoing tests was performed at the laboratory by varying concentrations of
and amylases, Multifect 21L and Multifect AA 23L AA, respectively, which were
added to the medium stage for the hydrolysis of starch from barley. The optimal
concentration of enzymes was 20 ml / L, which helped improve the performance of
hydrolysis with 89.44% compared with the concentrations obtained with malted
barley used in the plant (41.85%) in addition to producing larger quantities of alcohol.

1. INTRODUCCIN
Destilera Premier LTDA, es una empresa dedicada a la produccin, maduracin,
fabricacin, destilacin, decantacin y comercializacin de vinos, champaas,
aperitivos y licores en general.
Tradicionalmente en el proceso de elaboracin de whisky o de cerveza se requiere a
la cebada cmo materia prima esencial, utilizada para la obtencin de malta
mediante el proceso de malteado, que es la sustancia que da origen al extracto
fermentable. Hacia el final del proceso de malteado, las diversas enzimas lticas o
degradativas se hacen solubles y adems son transferidas al endospermo del grano
en donde causan la modificacin del almidn a un sustrato ms sencillo, debido a la
accin de alfa y beta amilasas.
Los mayores inconvenientes a los que se enfrenta la industria licorera Colombiana
es la falta de malterias que comercialicen malta o cebada malteada, lo que hace
necesario la importacin de la cebada ya transformada, generando de esta forma
trmites y costos para las empresas que requieren la cebada en estas condiciones.
Destilera Premier importa cebada malteada de Chile y adquiere cebada de
produccin nacional sin maltear de la regin cundiboyacense, con el fin de realizar
una mezcla de las cebadas para la generacin de productos de calidad a un menor
precio.
Como consecuencia de esto, surge la necesidad de buscar alternativas eficaces
para reducir el uso de la cebada malteada. Por tal motivo, la empresa pretende
utilizar cebada nacional como nica materia prima esencial del proceso, empleando
enzimas amilolticas comerciales Multifect AA 21L ( -amilasa) y Multifect AA 23L
( -amilasa), para sustituir el paso de sacarificacin y licuefaccin enzimtica del
almidn llevado a cabo por las enzimas de la cebada malteada, por el empleo de
enzimas comerciales de microorganismos amilolticos para la degradacin total o
parcial del almidn contenido en los granos de esta cebada, con el propsito de
disminuir tiempos de produccin y mejorar la rentabilidad del proceso. Para lograr
este objetivo se propone determinar la concentracin ptima de las enzimas con el
fin de obtener la mayor produccin de etanol, estableciendo de esta forma una
alternativa eficaz de produccin para la empresa.
18

2. MARCO TEORICO
La fermentacin alcohlica a partir de cereales ha sido investigada por varios aos,
considerando a la cebada, en trminos de produccin, el cereal ms importante en
el mundo, constituido por un 63-65% de almidn (Varman, 1997). Las empresas de
alimentos y bebidas muestran un inters cada da por este almidn, que es utilizado
en la fermentacin de las azcares, utilizando levaduras que contienen enzimas
catalizadoras que transforman los azcares en alcohol y dixido de carbono (Routh
et al, 1984). Sin embargo, las levaduras no tienen la capacidad de acceder a esta
fuente de carbono directamente, por lo que durante el malteado de la cebada, el
almidn de la cebada se degrada fundamentalmente a una mezcla de poliglucosa,
obteniendo el mosto de fermentacin (Varman, 1997). Actualmente en el mercado
se
encuentra
una
variedad
de
enzimas
comerciales
producidas
por
microorganismos y que son usadas en la industria de alimentos y bebidas. En la

industria de bebidas las enzimas de mayor importancia son las amilasas ya que se
ven implicadas desde el proceso de elaboracin del mosto. El uso de -amilasas, amilasas y glucoamilasas producidas por diferentes microorganismos ha beneficiado
la industrial por proveer una alternativa y un mtodo ms eficiente para la
produccin de dextrinas, maltosa y glucosa (Beltran y Maldonado, 2002).
2.1 LA CEBADA
2.1.1
Taxonoma
Botnicamente, la cebada pertenece a la familia de las Gramneas, plantas

herbceas con flores, que en los antiguos sistemas naturales de clasificacin se
situaron en la sub-clase Glumaceae Glumiflorae. Las cebadas se incluyen en el
gnero Hordeum, del que existen varias especies, siendo H. vurgare y H. distichon
las especies ms importantes en la industria cervecera (Hornsey, 2003).
2.1.2
Caractersticas generales
El uso predominante de la cebada para la elaboracin de malta se basa en una

serie de factores tales como ser tradicionalmente el cereal de eleccin; crece en una
variedad de ambientes, con una germinacin rpida y uniforme; el 60% del peso
19

seco total del grano es almidn; contiene protenas, generalmente en cantidades
necesarias para proporcionar los aminocidos necesarios para el crecimiento de la
levadura; y posee una dotacin enzimtica satisfactoria (Hough, 1990).
En el proceso de elaboracin de cerveza o de whisky se emplea como materia
prima esencial cebada que se caracteriza por tener carbohidratos fermentables,
protenas, minerales y una alta actividad enzimtica (Ver Tabla 1), sin embargo
estas caractersticas tambin favorecen el desarrollo de microorganismos capaces
de producir diferentes metabolitos y enzimas que pueden modificar las propiedades
finales del mosto y por consiguiente del desarrollo de elaboracin de alcoholes de
cebada (Beltrn, y Maldonado, 2002).
Tabla 1. Composicin del grano de cebada por 100 g de sustancia.

Componentes
Porcentajes (%)
Protenas
10
Materia grasa
1.8
Hidratos de carbono
66.5
Celulosa
5.2
Materias minerales
2.6
Agua
14
Fuente: http://fenalce.net/pagina.php?p_a=50
Aunque son varios los granos de cereal que pueden ser satisfactoriamente
malteados, los de cebada son los que generalmente presentan menos problemas
tcnicos. Sus cscaras ayudan a proteger el grano del malteado, adems son tiles
como coadyuvantes de filtracin en etapas posteriores (Hoseney, 1991).
2.2 CEBADA MALTEADA
Se entiende exclusivamente por cebada malteada o malta al grano de cebada
sometido a germinacin parcial y posterior deshidratacin y/o tostado en
condiciones tecnolgicas adecuadas. El malteado es la germinacin controlada de
20

la semilla, seguida por su desecacin tambin controlada, durante ste se considera
a la semilla de cebada como un sistema complejo fisiolgico donde los principales
procesos son la sntesis de enzimas amilolticas y proteolticas y la degradacin de
las estructuras del endospermo. El objetivo del mateado es producir alta actividad
enzimtica y el sabor caracterstico, con una mnima prdida de peso seco. El grano
seleccionado para maltear debe estar sano, tener alto poder germinativo y estar
libre de pajas, granos rotos y hongos (Hoseney, 1991).
El cereal que se maltea con ms frecuencia es la cebada, aunque tambin se
emplean cantidades apreciables de trigo y centeno, y en algunas partes de frica se
maltea sorgo. En teora al menos, se podra utilizar cualquier cereal. No obstante, el
tipo y cantidad de las enzimas producidas, varan de uno a otro cereal (Hoseney,
1991).
2.3 ALMIDON DE CEBADA
El almidn es un polmero semicristalino de glucosa de gran abundancia en la
naturaleza, por lo que se considera una buena fuente de obtencin de este azcar
para una fermentacin econmica y rentable (Navarro y Sossa, 2003). La cantidad
de almidn contenido en el grano de cereal vara, pero generalmente oscila entre el
60 y 75% del peso del grano. El almidn presente en los granos es el ms
importante de los carbohidratos para fines industriales resultando preciso degradarlo
enzimticamente con una gelatinizacin previa por accin de calor o sometetiendolo
a un intenso trabajo mecnico. El almidn de cebada gelatiniza a 58-90C, pero
durante la germinacin la temperatura alcanzada es de slo 15C, por lo tanto las
enzimas que degradan el almidn, las amilasas, operan en el malteado sin
gelatinizacin previa (Hoseney, 1991). El almidn consta de dos fracciones: amilosa
(20 %(p/p)) que es soluble en agua y amilopectina (80%(p/p)) que es insoluble en
agua con un alto peso molecular (Ver Figura 1) (Navarro y Sossa, 2003).
2.3.1
Amilosa
Es un polmero de glucosa que contiene de 1.000 a 4.000 unidades de ste

monmero, tiene por tanto un peso molecular de 200.000-800.000 daltons, valor que
vara no slo segn la especie de planta, sino tambin dentro de la misma especie y
21

d
depende
de
el estado de maduracin
n (Hoseney, 1991). Cad
da unidad de
e glucosa esst
u
unida
a la prxima por un enlace
e glucosdico -1,4 (Ve
er Figura 1)). Este enla
ace
d
determina
que el grupo reductor de
e la glucosa,, situado en la posicin uno, pierda la
f
funcionalida
ad, una mo
olcula de amilosa
a
no tiene mss poder red
ductor que el
c
correspondie
ente a una
a sola mol
cula de glu
ucosa, porq
que slo tie
ene un grupo
r
reductor
funcional, situa
ado en un exxtremo (Houg
gh, 1990).
ntacin de las dos forrmas de alm

midn que se dan en la
Figura 1. Represen
milosa y (b) amilopectina
a
a ramificada
a. Cada crcu
ulo
cebada (a) cadena lineal de am
nta una unidad de gluco
osa y posible
es puntos de
e ataque para las amilassas
represen
y ; NR
RE indica un
n extremo no
o reductor.
Fuente: Hough, 199
90
G
Generalmen
nte, es un po
olmero linea
al aunque se cree que solamente
s
p
para
una parte
d la amilos
de
sa, siendo liigeramente ramificado el
e resto. Cuando se lixivia el almidn
p
para
separa
ar la amilosa
a calentando ligeramen
nte por encima de la te
emperatura de
g
gelificacin
del almid
n, la amilosa solubilizada es esencialmen
e
nte lineal. La
n
naturaleza
lineal
l
y de gran longitud, confiere
e a la amilo
osa algunass propiedades
nicas,
por ejemplo: su
u capacidad
d para forma
ar complejoss con yodoss, alcoholess o
cidos
org
nicos. Estoss complejoss se llaman clatratos o compuestoss de inclusin
h
helicoidal
(H
Hoseney, 19
991). A tem
mperatura am
mbiente, la cadena de molculas de
22

glucosa adopta una conformacin en espiral cuyas hlices permiten albergar en su
interior una molcula de yodo. Cuando se trata de la amilosa con yodo, disuelto en
una disolucin de yoduro potsico, el yodo se ubica en las hlices, formando un
complejo amilosa-yodo que tiene un color azul negruzco. Si el complejo se calienta
se desintegra transitoriamente la espiral de amilosa y el yodo deja de teirla
(Hoseney, 1991).
2.3.1.1 Amilopectina
Es un polisacrido cuyas cadenas principales son restos de glucosa unidos en
enlace -1,4, como en la amilosa, y que presentan espordicamente ramificaciones
-1,6, localizadas cada 15-25 unidades lineales de glucosa (Ver Figura 1). Su peso
molecular es muy alto ya que algunas fracciones llegan a alcanzar hasta 200
millones de daltons. La amilopectina constituye alrededor del 75% de los almidones
ms comunes (Bailey y Bailey, 1998). La consecuencia de los enlaces -1,6 es la
formacin de una molcula ramificada que al igual que la amilosa, tiene un slo
grupo funcional. (Hough, 1990).
2.4 MTODOS HIDROLTICOS DEL ALMIDN

El principal inconveniente para la produccin de etanol a partir de almidn, radica en
que la levadura no produce enzimas amilasas y no es capaz de fermentar el
almidn, por consiguiente es necesario realizar una sacarificacin previa. La
sacarificacin se puede realizar por dos mtodos: uno qumico y uno de conversin
enzimtica (Chica, 1996).
2.4.1
Mtodo qumico
El almidn puede ser hidrolizado por cidos como el cido clorhdrico, (hidrlisis
cida), llegando a una conversin parcial del almidn a D-glucosa. Este mtodo es
utilizado para preparar jarabes de glucosa a partir de suspensiones que contienen
20%(p/p) de almidn a pH 2 y a una temperatura de 140C (Glazer y Nikaido, 1998).
Tras el tratamiento, se neutraliza y se recupera el almidn no hidrolizado por
filtracin (Hoseney, 1991).
23

Durante la reaccin, el cido penetra libremente por las partes amorfas del grano de
almidn, e hidroliza los enlaces glucosdicos. El cido no puede penetrar por las
reas cristalinas, quizs a causa de la doble hlice, permaneciendo por ello intactas.
El efecto principal del cido es reducir el peso molecular de las molculas de
almidn, dejando intacta la estructura cristalina del grano (Hoseney, 1991).
Esta sacarificacin qumica presenta serios inconvenientes tales como: un bajo
rendimiento en la produccin de etanol, los residuos lquidos que quedan de la
hidrlisis no son utilizados como alimento para el ganado y por ltimo requiere un
mantenimiento costoso a causa del mayor deterioro de las instalaciones por
corrosin. Por lo anterior, los mtodos enzimticos se han convertido en una buena
alternativa (Chica, 1996).
2.4.2
Mtodo enzimtico
La hidrolisis enzimtica ha desplazado a la hidrlisis cida en los ltimos 30 aos,

debido a que se dispone de nuevas enzimas. Hoy en da la mayor parte de la
hidrlisis de almidn se realiza usando enzimas, ya que esta tcnica presenta
ventajas como: control de la formacin de productos no deseables y mayor
flexibilidad del producto (Chica, 1996).
Durante el malteado, el almidn de la cebada se degrada fundamentalmente a una
mezcla de molculas de poliglucosa, algo menos complejas que las originales. Para
los procesos respiratorios y biosintticos embrionarios, slo se libera una cantidad
limitada de azcares simples. La amilopectina es ms fcilmente degradada que la
amilosa. Las enzimas capaces de degradar el almidn no gelatinizado de la cebada
son las siguientes: fosforilasa, -glucosidasa, -amilasa, -amilasa y enzimas
desramificadoras (Ver Tabla 2). Durante la deshidratacin de la malta, las
actividades de estas enzimas se reducen de un modo drstico a excepcin de la amilasa y -amilasa (Hough, 1990).
Hay tres tipos de descomposicin enzimtica de los glucanos: fosforlisis, hidrlisis
y transglicosilacin. La fosforlisis por la -1,4-glucanfosforilasa slo ocurre
intracelularmente. La transglicosilacin es la formacin de ciclodextrinas con 6-8
unidades de glucosa a partir del almidn, por accin de Bacillus macerans y otros.
24

El ataque extracelular del almidn es debido a la accin hidroltica de las amilasas
(Ver Figura 2) (Schlegel, 1993).
Tabla 2. Accin que ejerce sobre el almidn de la fosforilasa, -glucosidasa, amilasa, -amilasa y enzimas desramificadoras.
Enzima
Microorganismos
productores
Accin
-glucosidasa
Necesita agua para la hidrlisis, ataca

enlaces -1,4 -1,6 con menos
frecuencia.
Exoenzima que acorta las cadenas de
almidn en una unidad, partir del
extremo no reductor y libera glucosa.
Aspergillus niger,
Rhizopus niveus,
Aspergillus oryzae

enlaces -1,4.
Bacillus megaterium,
Bacillus cereus,
Acorta las cadenas de almidn en dos
Streptomyces
sp.
unidades, partir del extremo no reductor,
-amilasa
las que libera como maltosa

enlaces -1,4.
-amilasa
Endoenzima que rompe las cadenas al

azar generando una mezcla de maltosa
y oligosacridos
Bacillus subtillis,
Bacillus
amyloliquefaciens,
Bacillus polymixa,
Bacillus
licheniformis
Clostridium
Necesita agua para la hidrlisis, ataca thermodyrosulfurico,
Enzimas
enlaces -1,4. Desramificacin de la
Leuconostoc,
desramificadoras
amilopeptina produciendo una mezcla
Enterobacter
(Pululanasa)
de dextrinas y unos pocos azcares.
aerogenes, Bacillus
polymixa
Fuente: Gonzlez, 2002.
Normalmente la hidrlisis enzimtica de los granos de almidn presenta bajos

rendimientos
de
conversin
azcares
fermentables,
pesar
que
las
macromolculas del almidn pueden ser hidrolizadas en estado granular, sin

embargo, los ensayos de hidrlisis de los grnulos naturales a menudo dan como
resultado un lento y deficiente producto de hidrlisis (Oates, 1997). Normalmente
25

estos ensayos de hidrlisis analizan los azcares reductores liberados tras un
proceso hidroltico empleando el mtodo de Fehling. Este mtodo se basa en las
propiedades reductoras de los azcares presentes en la muestra sobre una solucin
alcalina de cobre. Los azcares totales son la suma de los azcares reductores y no
reductores. Los azcares reductores son los monosacridos como glucosa, fructosa,
galactosa, etc. y disacridos como lactosa y maltosa, los cuales reaccionan con
oxidantes suaves, como los reactivos de Fehling, Tollens y Benedict (NTC 5146,
2008). El reactivo de Fehling tiene una coloracin azul y al reaccionar con los
azcares reductores, forma un precipitado rojizo de xido cuproso (Cu2O) y el cido
carboxlico del respectivo aldehdo (NTC 5146, 2008).
En general, la accin de y -amilasas en grnulos de almidn natural no es muy
eficaz, porque son muy resistentes a la digestin amiloltica y se necesita un largo
perodo de hidrlisis para poder degradar el almidn (Sarikaya et al., 2000). Con los
nuevos avances tecnolgicos en los ltimos aos, se han descubierto una nueva
generacin de enzimas como la -amilasa de Aspergillus kawachi y la glucoamilasa
de Aspergillus niger. Estas enzimas trabajan sinrgicamente para hidrolizar almidn
granular que directamente puede hidrolizar el almidn en un solo paso, a una
moderada temperatura muy por debajo de la temperatura de gelatinizacin (Shariffa
et al., 2008).
Figura 2. Degradacin del almidn.

Fuente: Schlegel, 1993.
26
Estas enzimas tienen la ventaja de exo-actividad como la glucoamilasa, que es

capaz de perforar fuerte y profundamente orificios, as como la endo-activitividad de
la -amilasa, que permite la ampliacin de los orificios (Shariffa et al., 2008). Esta
combinacin mejora la liberacin continua de glucosa fermentable a partir de los
granos de almidones. Franco et al., (1988) reportaron, que se puede obtener una
mayor degradacin hidrolizando el almidn con -amilasa junto con la glucoamilasa.
La modificacin se puede realizar con el fin de aumentar la eficiencia de hidrlisis
del almidn natural. Oates (1997) sugiri que se puede lograr una mejor hidrlisis de
almidn
nativo
mediante
el
aumento
de
la
temperatura
de
incubacin
aproximadamente a 60 C. Si el grado de conversin de almidn nativo se puede

incrementar an ms, sera muy til en el proceso industrial de fermentacin de
azcares y de bioetanol.
2.4.2.1 -Amilasa
Cataliza la hidrlisis al azar los enlaces -1,4 glucosdicos de la regin central de la
cadena de amilosa y amilopeptina, exceptuando las molculas cercanas a la
ramificacin, obteniendo como resultando maltosa y oligosacridos de varios
tamaos (Cruger y Cruger, 1993).
Esta enzima tiene un peso molecular de 50.000 Daltons, es estable a pH de 5.5-8.0
con una actividad ptima de 5.9. Las -amilasas son enzimas dependientes de
calcio, aunque el catin no est integrado en el centro activo de la enzima, se
encuentra fuertemente unido a la enzima y slo pueden ser removidos a pH bajos
por el uso de agentes quelantes. La completa remocin del calcio conlleva a una
prdida total de actividad (Pedroza, 1999).
Se cree que el Ca+2 estabiliza la
conformacin global de la enzima, encontrndose hasta 10 iones por molcula de

enzimas (GodFey y Reinchelt, 1993). La importancia radica en que mantiene la
molcula de la enzima en la configuracin ptima para generar una mxima
actividad y estabilidad. A menudo se nombra la amilasa como enzima licuante,
debida a su rpida accin para disminuir la viscosidad de las soluciones de almidn
(Pedroza, 1999).
27

La actividad de la enzima se determina cualitativamente mediante la disminucin de
la capacidad de la solucin de almidn para formar el color azul caractersticos con
el yodo o midiendo la disminucin de la viscosidad de la suspensin de almidn
(GodFey y Reinchelt, 1993).
Las principales aplicaciones de las enzimas extracelulares que degradan el almidn
consisten en la conversin del almidn de jarabes que contienen glucosa, maltosa y
oligosacridos, en la produccin de azcares fermentables en cervecera y en la
obtencin de bebidas alcohlicas y en la modificacin de la harina de panadera.
Entre las enzimas comercialmente utilizadas se destacan las alfa amilasa de
Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens y Aspergillus oryzae (Owen, 1989).
Entre los microorganismos que producen amilasa, se encuentran tanto bacterias
como hongos tales como Bacillus subtilis, B. cereus, B. amyloliquefaciens,
Pseudomonas, Proteus, y Serratia; algunos gneros de hongos como Aspergillus,
Penicillium, Cephalosporium, y Mucor (Crueger y Crueger, 1993)
Se han obtenido enzimas termoestables a partir de Bacillus subtilis y Bacillus
licheniformis, permitiendo llevar a cabo la sacarificacin a altas temperaturas,
acelerando el proceso y minimizando la contaminacin microbiana (Chica, 1996).
2.4.2.2 -amilasa
La -amilasa -1,4 glucan-maltohidrolasas es una exoenzima que ataca los
enlaces 1,4 glucosdicos en la parte externa de la cadena de almidn, la amilasa
separa unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores de esta por
hidrlisis alterna de enlaces glucosdicos (Pedroza, 1999). Las amilasas atacan la
amilosa solo desde un extremo a la vez, y, a causa de ello, son mucho menos
efectivas que las amilasas (Baker, 1994).
Debido a que est enzima esta imposibilitada para hidrolizar los puntos ramificados
-1,6 en la molcula de almidn, los productos finales de la accin sobre el sustrato
son maltosas y dextrinas, formndose pocas cantidades de maltotriosa y glucosa
(Mario, 1989).
28

Las -amilasas contienen un grupo sulfidrlo esencial para la actividad enzimtica,
que se lleva acabo de forma ptima en un rango de pH entre 4 y 5. La actividad de
la enzima se analiza mediante mtodos colorimtricos que miden la cantidad de
azcares reductores, liberados a partir del almidn. Estas enzimas estn presentes
en gran nmero de bacterias Gram positivas formadoras de esporas (Gonzlez,
2002).
Algunos
microorganismos
productores
son:
Bacillus
polymyxa,
B.
cereus,
Streptomyces sp. y Rhizopus japonicus. Aunque el rendimiento en las cepas

silvestres es generalmente bajo, se han descubierto mutantes que producen 200
veces ms enzimas que la cepa silvestre (Crueger y Crueger, 1993).
2.4.2.3 Glucoamilasas
Las glucoamilasas o -1,4-glucan-glucohidrolasas son enzimas carbohidrolasas no
especificas, de accin externa, rompen enlaces glucosdicos -1,3, -1,4 y -1,6,
generando glucosa a partir de los enlaces terminales no reductores de la cadena de
almidn, por tanto son enzimas sacarificantes. Sin embargo, la glucoamilasa es
incapaz de hidrolizar el almidn por completo a glucosa, ya que la ruptura requiere
la participacin de una enzima de accin interna. La glucoamilasa puede ser
separada en dos fracciones glucoamilasa I y glucoamilasa II. La glucoamilasa I
posee alta actividad desramificante la cual se acelera en presencia de -amilasas,
por otro lado la glucoamilasa II posee una baja actividad desramificante (Chica,
1996).
Las glucoamilasas frecuentemente denominadas amiloglucosidasas, son producidas
por hongos como Aspergillus niger, adems siempre contienen cierta actividad
transglucosidasa, la cual cataliza la reaccin reversa, que conduce a la
polimerizacin de la glucosa a maltosa (Byong, 2000).
2.4.2.4 Pululanasa
La pululanasa es una enzima desramificante que acta sobre los enlaces -1,6 de la
amilopeptina liberando como nico producto la maltosa (Byong, 2000). Son
29

utilizadas para mejorar la sacarificacin, elevando el rendimiento de la liberacin de
glucosa (Maarel et al., 2002).
2.5 PROCESO DE PRODUCCIN DE ALCOHOL
2.5.1
Sustrato: mosto
Es la solucin en agua potable de carbohidratos, protenas, sales minerales y

dems compuestos resultantes de la degradacin enzimtica de la malta (Ver Tabla
3), con o sin adjuntos, como arroz, sorgo, trigo, etc., realizada mediante procesos
tecnolgicos adecuados.
Tabla 3. Composicin tpica del mosto.

Componente
Cantidad
(gl-1)
Fructosa
2,1
Glucosa
9,1
Sacarosa
2,3
Maltosa
52,4
Maltotriosa
12,8
Carbohidratos
fermentecibles
no
23,9
Nitrgeno total
0,8
Aminocidos
(nitrgeno)
totales
0,30
Aminocidos totales
1,65
Componentes fenlicos totales 0,25

Isocidos
0,035
Iones calcio
0,065
Fuente: Hough, 1990.
30

2.5.2
Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae
En la industria se utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae, al ser considerada

como la mayor productor de etanol a nivel mundial. Este hecho se evidencia en un
sin nmero de atributos que para tal fin presenta esta levadura, como por ejemplo
su capacidad de respiracin tanto aerobia como anaerbica, y la utilizacin de
sustratos como glucosa, fructuosa, galactosa, maltosa, entre otros (Tuite y Oliver,
1991). Saccharomyces cerevisiae es uno de los microorganismos ms atractivos
para trabajar, se ha comprobado a travs de la historia que no es patgeno, ya que
se ha utilizado en las industrias alimentarias y ha sido clasificado como un
organismos GRAS (Generally Recognized As Save) (Ostergaard et al., 2000). As
mismo, posee un gran potencial para la produccin de etanol fermentando la
glucosa, soportando altas concentraciones de la misma, logrando altos niveles de
produccin y rendimiento (Chandrakant y Bisaria, 2000).
2.5.2.1 Morfologa
Es un hongo unicelular levaduriforme que presenta clulas alargadas, globosas,
elipsoidales con gemaciones o blastoconidios multilaterales de 3-10 x 4,5-1 m que
al microscopio se ven refringentes (Ver imagen 3). Presenta ascos con hasta cuatro
ascosporas esfricas o elipsoides y de pared lisa en su interior. Las colonias en agar
Sabouraud son cremosas, blandas, de color crema o blanco, con apariencia
hmeda y brillante y con bordes irregulares (White, 1995).
Figura 3. Coloracin de Gram Saccharomyces cerevisiae

Fuente: www.ual.es/.../myco-ual/galeria04/figura8.htm.
31

2.5.2.2 Reproduccin
Su reproduccin puede ser asexual por gemacin. Cuando las condiciones son
adversas la mayor parte de las levaduras pueden reproducirse sexualmente
generando ascosporas (Mesas y Alegre, 1999). Durante la gemacin, la clula hija
inicia crecimiento formando una yema en la clula madre, posteriormente ocurre la
divisin nuclear, la sntesis de la pared y finalmente la separacin de las dos clulas
(White, 1995).
2.5.2.3 Requerimientos nutricionales

2.5.2.3.1
Fuente de Carbono
Esta levadura tiene la habilidad para fermentar la glucosa, fructosa, maltosa,

maltotriosa presentes en los medios regulares. La sacarosa es hidrolizada
primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplsmico extracelular.
Los azcares son transportados a travs de la membrana celular por transporte
activo o pasivo, mediado por permeasas producidas constitutivamente o indecibles.
La maltosa y la maltotriosa son hidrolizadas intracelularmente por la -glucosidasa
(Kretzschmar, 1990). Las dextrinas, que comprenden la maltotriosa y productos de
degradacin mayores, no son metabolizados. Algunas cantidades mnimas de
azcares pentsicos tampoco son fermentados (Hornsey, 2003).
2.5.2.3.2
Fuente de nitrgeno
Las levaduras no pueden asimilar el nitrgeno elemental ni los iones nitrato. Algunas
cepas pueden utilizar los iones de amonio, pero la mayor parte de nitrgeno
requerido para la sntesis de constituyentes celulares esenciales, procede de los
aminocidos y de los di- y tri-pptidos del mosto. Estos han sido originados
proporcionalmente por la propia malta. Como en el caso de la utilizacin de
carbohidratos
por
levaduras,
los
aminocidos
son
captados
utilizados
consecuentemente, de acuerdo con la presencia de enzimas adecuadas de

transferencia en la membrana. Un mosto de malta total, contiene 19 aminocidos
(Hornsey, 2003). La propia clula produce aminocidos por transaminacin y/o
32

sntesis a partir de un conjunto de diferentes cidos y cetcidos. En algunas cepas
de levadura, determinados aminocidos son
siempre sintetizados dentro de la
clulas, incluso aunque se encuentren presentes en cantidad abundante en el

mosto, como en el caso de la arginina, histidina y lisina (Hornsey, 2003).
2.5.2.3.3
Macro y Micronutrientes
El ms importante de los macronutrientes es el fosforo el cual est involucrado en la

sntesis de protenas y en los fosfolpidos que permiten la resistencia a altas
concentraciones de etanol; adems las levaduras sintetizan polifosfatos como
reservas de energa. El fsforo puede ser tomado en forma monobsica (H2PO4) y
puede ser aadido al medio como cido o como sal de amonio, sodio o potasio y se
debe encontrar de un 1 a 2% en el medio (Kretzschmar, 1990).
El sulfuro es
requerido en la levadura para la sntesis de metionina y cistena, dos aminocidos

que contienen azufre. Se necesita ms o menos de 0.3 a 0.5% del medio. Los
microelementos cobalto, boro, cadmio, yodo, molibdeno y nquel se requieren en
concentraciones de 0.1 a 100M (Kretzschmar, 1990).
2.5.2.3.4
Vitaminas
El mosto proporciona una rica fuente de vitaminas y aunque las levaduras difieren
mucho en sus necesidades de vitaminas para el crecimiento, normalmente existe un
aporte adecuado en variedad como de cantidad en la cuba de maceracin. El mosto
debe contener biotina, tiamina (B1), cido nicotnico, riboflavina, pantotenato clcico,
inositol, piridoxina, piridoxal y piridoxamina. Con la excepcin del inositol, que
interviene o participa en la sntesis de la membrana (fosfolpidos), es decir
desempea un papel estructural. Todas las vitaminas tienen funcin cataltica como
parte de alguna coenzima en el metabolismo (no-funcional). Los factores de
crecimiento que comnmente requiere la levadura son: biotina, cido pantotnico e
inositol importantes para la resistencia del microorganismo a altas concentraciones
de etanol (Jaccques et al., 1999).
33

2.5.2.4 Requerimientos ambientales
2.5.2.4.1
Temperatura
Las temperaturas ptimas de la fermentacin, respiracin y crecimiento celular de

las levaduras son claramente diferentes. La velocidad de fermentacin aumenta
generalmente con la temperatura entre los 15 y los 35C, as como tambin los
niveles de glicerol, acetona, bueteno-2-3-diol, acetaldehdo, piruvato y 2cetoglutarato (Ward, 1991).
2.5.2.4.2
Oxigeno
Los requerimientos de oxigeno para la reproduccin y para la fermentacin son

diferentes, mientras para la reproduccin se necesitan grandes cantidades de
oxigeno para la produccin de clulas hijas y para la sntesis de cidos grasos que
sern los responsables de la resistencia a grandes concentraciones de etanol; la
fermentacin se realiza en condiciones anaerobias pues la produccin de etanol
necesita de ausencia de oxigeno (Ward, 1991).
2.5.2.4.3
pH
Los valores comprendidos entre 3 y 6 son la mayora de las veces favorables al

crecimiento y actividad fermentativa; esta ltima es mayor cuanto mayor sea el pH
(Santander, 2006).
2.5.2.5 Metabolismo
2.5.2.5.1
Azcares
Las levaduras son consideradas microorganismos anaerobios facultativos, ellos son

capaces de crecer en presencia o ausencia de oxigeno, cuando el oxigeno es
suficiente y el sustrato est lo suficientemente diluido, ellas consumen los azcares
para el crecimiento de las clulas y para su reproduccin; en cambio cuando el
oxigeno es reducido y los niveles de glucosa exceden 0.1% p/v, ocurre el proceso
de fermentacin (Santander, 2006). S. cerevisie usa la va glicoltica o EmbdenMeyerof-Parnas para metabolizar las molculas de azcar y obtener la energa
necesaria para su supervivencia (Jaccques et al., 1999). Cuando la levadura
34

encuentra las condiciones necesarias para la produccin de etanol, el piruvato es
descarboxilado y convertido en Acetaldehdo, el cual tras la adicin de hidrgeno se
transforma en etanol (Stryer, 1995).
2.5.2.5.2
Nitrgeno
La levadura prefiere los compuestos nitrogenados fcilmente difusibles a travs de

la membrana celular, sobre todo los aminocidos, sus amidas, la urea y las bases
hexnicas (Santander, 2006). La degradacin no transcurre de un modo regular,
sino que guarda estrecha relacin con la acidez de la fermentacin. La curva de
acidez empieza de manera alcalina ya que se hace necesario agregar un exceso de
nitrgeno al medio en forma de sales amoniacales que reaccionan con las sales
alcalinas y amoniacales orgnicas presentes en el medio. Las sales de amonio
entran a la clula y all se disocian, liberando cido sulfrico, el cual fatalmente
lesiona la pared celular, aunque las otras sales ayudan a neutralizar la accin de
ste cido. De esta manera el medio pasa de ser alcalino a ser cido, paso que se
acelera cuando empieza la degradacin de los aminocidos orgnicos, ya durante la
fermentacin la levadura toma el nitrgeno de estos compuestos de manera que los
aminocidos van perdiendo su carcter anftero y convirtindose en cidos.
Nuevamente la acidez disminuye cuando los cidos orgnicos van siendo
metabolizados y la levadura ha logrado asimilar la mayor parte del azcar y del
nitrgeno. No obstante queda un resto de nitrgeno amnico no disociado
(Kretzchmar, 1990).
2.5.2.5.3
Fsforo
La levadura introduce este elemento a la clula en su forma inorgnica y adentro

obtiene cido fosfrico, cuyo metabolismo vara a lo largo del proceso de
fermentacin. Poco despus de iniciada la fermentacin comienza la esterificacin
del azcar con el cido fosfrico, el cual sale del interior de la clula de la levadura
para unirse con el azcar y hacerlo asimilable. Durante todo el proceso el cido
fosfrico permanece entrando y saliendo, presentando un ritmo alternativo adaptado
a la germinacin de la levadura y al crecimiento de las clulas hijas (Kretzchmar,
1990).
35

2.5.3
FERMENTACIN
Una fermentacin es una reaccin de oxidacin-reduccin interna equilibrada en la

que algunos tomos se reducen mientras otros se oxidan, y la energa se produce
por fosforilacin a nivel de sustrato. Una ruta bioqumica muy usada para la
fermentacin de la glucosa es la gluclisis, tambin denominada va de EmbdenMeyerhof (Madigan et al., 2003). La fermentacin anaerbica constituye el tipo ms
sencillo y primitivo de mecanismo biolgico que permite la obtencin de energa de
las molculas nutritivas, mediante reacciones de oxidacin y reduccin. En este
proceso, el etanol es una molcula relativamente reducida que se produce junto con
el CO2 que es una molcula relativamente oxidada (Reinier, 2005).
La fermentacin alcohlica es el proceso por el que los azcares contenidos en el
mosto se convierten en alcohol etlico. Para llevar a cabo este proceso es necesaria
la presencia de levaduras, la cuales extraen energa qumica de las molculas de
glucosa y de otros combustibles en ausencia de oxigeno molecular para producir
etanol. La fermentacin alcohlica transcurre por la misma ruta enzimtica de la
gluclisis, pero necesita dos etapas adicionales. En la primera parte, el tomo de
carbono del piruvato es atacado por el pirofosfato de tiamina y experimenta una
descarboxilacin; la coenzima queda en la forma de 2- hidroxietil, derivado que
puede considerarse una forma del acetaldehdo activado o ligado a la coenzima. En
la etapa final al acetaldehdo se reduce a etanol y el potencial de reduccin es
proporcionado por el NADH+, en una reaccin catalizada por la alcoholdeshidrogenasa. Las reacciones de la fermentacin alcohlica se consideran
completas cuando hay formacin de ATP a partir de fosfatos. En realidad, este
proceso no puede ocurrir sin la simultnea fosforilacin oxidativa del ADP (Reinier,
2005).
Durante la etapa de crecimiento de los cultivos, los mismos son sometidos a una
oxigenacin fuerte, mediante la aireacin del medio, lo que permite la utilizacin de
la glucosa por oxidacin completa. Este proceso genera una gran cantidad de
energa que en parte es fijada mediante el sistema ADP-ATP y posibilita el
desarrollo de reacciones de sntesis celular, que consumen gran cantidad de
energa. Una vez que el cultivo en el fermentador ha alcanzado el nmero de clulas
36

necesario para la degradacin ptima de la materia prima se elimina la aireacin y
las condiciones anaerbicas se establecen en el medio por el consumo de oxgeno
remanente y el desprendimiento de CO2. En las condiciones anaerobias, el aporte
de energa a las clulas es muy pequeo comparado con el de la respiracin y con
las necesidades energticas de la sntesis lo que implica que en estas condiciones
no se produzca el crecimiento celular. La experiencia indica, no obstante, que an
en condiciones anaerobias existe una mnima reproduccin celular a expensas y
acorde con el pequeo aporte energtico recibido por la clula. Este fenmeno es
conocido como "Efecto Pasteur" (Reinier, 2005).
2.6 PRODUCCIN DE ALCOHOL EN DESTILERA PREMIER LTDA.

La produccin se inicia con la molienda donde se trituran los granos de cebada de
tal forma que el contenido de almidones quede pulverizado, para el proceso de
inversin y conversin a azcar.
En el reactor se carga e hidrata la cebada molida con agua potable, en este paso se
utilizan mezclas de cebada nacional con cebada malteada o importada. El sistema
de agitacin y calentamiento con vapor del reactor permite llevar a cabo la hidrlisis
de los almidones, y posterior transformacin en azcares. Cundo todos los
almidones han sido transformados en azcares, se procede a separar el mosto de
cebada del resto de los afrechos de la misma, de tal forma que el mosto a fermentar
est libre de cascarilla, obtenindose as un mosto disponible para realizar el
proceso de fermentacin.
El mosto proveniente de la hidrlisis de la cebada es pasado a un esterilizador con
un volumen de 1.500 litros donde se mantiene por 40 minutos a temperatura de
esterilizacin, seguido de un enfriamiento hasta 28 C, garantizando de esta forma
la inocuidad del mismo durante la siembra de la levadura. La cepa empleada es
Saccharomyces cerevisiae, durante la pre-fermentacin las levaduras se reproducen
en el mosto, mantenindose las condiciones ptimas para la propagacin de la
misma, para esto macro y micronutrientes, como el fosfato de amonio, vitamina B1 y
tiamina, son adicionados paulatinamente.
37

Una vez se obtienen los grados Brix y la poblacin de levadura requerida, se pasa
alternadamente a la batera de cubas madres, dnde se realiza el pie de cuba y se
controla temperatura, poblacin y calidad de la fermentacin. Una vez iniciada la
fermentacin en la cuba madre se procede al cargue de esta al tanque de
fermentacin, alimentndose con un mosto de 15 a 18 Brix hasta llenar el tanque
para dar paso a la fermentacin por espacio de 8 a 10 das.
Se dice que la fermentacin llega a su fin cuando los azcares de la cebada son
consumidos y convertidos a alcohol, la temperatura disminuye y cesa la produccin
de gas carbnico y de esta forma la biomasa se deposita en el fondo del recipiente.
En esta etapa se realizan trasiegos para la separacin de los slidos en el lquido,
realizndose de tanque a tanque con bombas y mallas. Finalizada la fermentacin y
trasiegos se determina la calidad producida del producto durante el proceso
fermentativo realizando anlisis para determinar los parmetros fisicoqumicos.
Una vez el mosto ha fermentado se pasa al destilador de columna rellena, donde se
realiza la extraccin de cabezas y colas. La extraccin de cuerpos que es la fraccin
deseada se pasa a un rectificador empacado y se efectan nuevamente
extracciones de cabezas y colas.
El alcohol de cereales, son los cuerpos de la rectificacin los cuales presentan un
delicado aroma y excelente sabor. Este destilado es analizado para determinar sus
caractersticas fisicoqumicas, el producto analizado se dispone para la preparacin
de lotes de produccin normalmente de 10.000 litros donde se realizan mezclas de
los diferentes lotes existentes para su caracterizacin para su trasladado a los
procesos de aejamiento en barriles de roble.
38

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Actualmente se presenta un fuerte incremento en la demanda e implementacin del

proceso productivo de etanol a partir de diferentes materias primas y diversas
tecnologas, desarrollndose estudios que mejoran el proceso de produccin de
etanol (Romero et al., 2005). Por tal motivo el presente estudio pretende encontrar
una alternativa rentable para Destilera Premier LTDA en su produccin de etanol a
partir de almidn de cebada.
Destilera Premier LTDA dentro de su proceso de produccin de alcohol de cereales
no realiza el malteo de la cebada, importa la materia prima para la elaboracin de
sus diferentes productos, por lo tanto, el presente trabajo pretende emplear cebada
nacional no malteada como materia prima principal del proceso. Debido a que esta
contiene cantidades inferiores de enzimas amilolticas en relacin a la cebada
malteada, se busca establecer la concentracin ms eficiente de enzimas Multifect
AA 21L ( -amilasa) y Multifect AA 23L ( -amilasa), para la degradacin total o
parcial del almidn contenido en los granos de la cebada, con el fin de reducir
costos de produccin sin alterar la calidad final de los productos.
El empleo de enzimas tiene muchas ventajas: son de origen natural y por lo tanto no
son txicas, son muy especficas en su manera de actuar, por lo que no propician
reacciones secundarias indeseables, funcionan en condiciones moderadas de
temperatura y de pH y no requieren de condiciones de procesamiento drsticas que
puedan alterar la naturaleza del alimento, ni del equipo, actan a bajas
concentraciones y son fcilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de
transformacin deseado (Hough, 1990).
El obtener un producto estable sin alteraciones organolpticas utilizando una
materia prima nacional representara una disminucin de costos para la empresa,
as como tambin la eliminacin del almacenamiento de grandes volmenes de
cebada importada, al poder realizar los pedidos de cebada nacional en funcin de la
demanda de produccin planificada y no por la oferta de cebada malteada en el
exterior.
39

4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Establecer la concentracin de y amilasas comerciales en la obtencin de etanol
a partir de cebada sin maltear, como una alternativa de produccin, empleando
Saccharomyces cerevisiae.
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Establecer las concentraciones de las enzimas comerciales Multifect AA 21L y

Multifect AA 23L, mediante la determinacin de la concentracin de azcares
fermentables y etanol producido utilizando como sustrato cebada sin maltear.
Medir parmetros fsicoqumicos (pH, temperatura) durante el proceso

degradativo y
fermentativo del almidn de cebada que favorezcan la actividad
de las enzimas y crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.
Observar el comportamiento de Saccharomyces cerevisiae en las diferentes

concentraciones de enzimas probadas, teniendo en cuenta la formacin de
biomasa, consumo de sustrato y produccin de etanol en el medio de
fermentacin.
Comparar el desempeo durante el proceso hidroltico y fermentativo entre los

tratamientos con cebada sin maltear y las enzimas Multifect AA 21L y Multifect
AA 23L; y el tratamiento con cebada malteada desarrollado tradicionalmente por
la Destilera, con el fin de establecer la utilizacin de las enzimas comerciales
como una alternativa para disminuir el volumen de importacin de la cebada
malteada.
Determinar la dosis ptima de las enzimas Multifect AA 21L y Multifect AA 23L

para la etapa amiloltica del proceso de produccin de alcohol cuando se emplea
como sustrato cebada sin maltear, con el fin de establecer la rentabilidad del litro
de etanol obtenido a partir de cebada sin maltear en relacin al costo del litro de
etanol que se obtiene normalmente con la cebada malteada usada en planta, sin
arriesgar el aumento de costos.
40

5. MATERIALES Y MTODOS
5.1 DISEO DE LA INVESTIGACIN

En el presente trabajo se realiz un estudio experimental, con el fin de obtener la
concentracin ptima de alfa y beta amilasas comerciales en el proceso de hidrlisis
del almidn de cebada sin maltear, que permitan obtener etanol por procesos
fermentativos empleando Saccharomyces cerevisiae.
5.1.1
Poblacin de estudio
El presente trabajo se realiz en el laboratorio de control de calidad de la Destilera

Premier LTDA., ubicado en el centro industrial Chapeton (Va Nevado) de la ciudad
de Ibagu, sobre muestras de cebada mateada y sin maltear para uso productivo en
la industria del etanol, inoculadas con una concentracin conocida de enzimas
amilolticas. Adems se cont con el respaldo tcnico
del
laboratorio de
Bromatologa de la Secretara de Salud del Tolima de la ciudad de Ibagu.

5.1.2
Materiales
Los ensayos se realizaron empleando cebada no malteada de la regin

cundiboyacense y cebada malteada importada de Malteras Unidas, Chile.
5.1.3
Enzimas y levadura
Multifect AA 21L y Multifect AA 23L
son enzimas comerciales de Genencor
Internacional, Inc., las cuales son utilizadas en Destilera Premier LTDA. para el
desarrollo de investigaciones de mejoramiento del proceso hidroltico del almidn de
cebada. Multifect AA 21L es una -amilasa estable a altas condiciones de calor y a
un pH bajo, esta enzima no requiere calcio adicional para operar bajo condiciones
de licuefaccin industrial. Las condiciones recomendadas de licuefaccin primaria
son 105-110C por 5-7 minutos y secundaria 95C por 90-120 minutos (molido
hmedo) 85-93C por 90-120 minutos (molido seco) a un pH entre 5.5-5.8.
Multifect AA 23L es una -amilasa que exhibe excelente estabilidad a pH 5.5 o
mayor y a una temperatura de 60 C. Estas enzimas cumplen con las actuales
41

condiciones de calidad de la FAO / OMS y el Codex para alimentos y productos
Qumicos y son GRAS (Generally Recognized As Safe) en los Estados Unidos (Ver
Anexos 11 y 12).
La levadura utilizada para la fermentacin alcohlica fue Saccharomyces cerevisiae
Safwhisky M-1 de la casa comercial Fermentis en una presentacin de levadura
seca instantnea (Ver Anexo 13).
5.2 MTODOS
5.2.1
Proceso hidroltico del almidn
Teniendo en cuenta la diferencia en cuanto a la concentracin de enzimas entre la

cebada mateada y la cebada no malteada para el proceso de hidrlisis, el trabajo
experimental se desarroll estableciendo la influencia de las concentraciones de
enzimas en la liberacin de azcares reductores, formacin de biomasa y alcohol.
Durante esta etapa se realiz un control de comparacin con las materias primas
estandarizadas por la empresa para la produccin de alcohol de cereales y un
control negativo utilizando cebada sin maltear y sin presencia de enzimas
amilolticas (Ver Tabla 4).
Tabla 4. Resumen del diseo experimental
Concentracin de
Sustrato
Ensayo
1
2
3
4
5
Control De
Comparacin
Control Negativo
Concentracin de
Enzimas
Cebada
Malteada
Cebada
Sin
Maltear
-amilasa
-amilasa
250g/L
250g/L
250g/L
250g/L
250g/L
5 mL/L
10 mL/L
15 mL/L
20 mL/L
25 mL/L
5 mL/L
10 mL/L
15 mL/L
20 mL/L
25 mL/L
250g/L
250g/L
Fuente: Autor.
42

Todos los ensayos de hidrlisis se llevaron a cabo en un erlenmeyer de 2 litros en
shaker termostatado, bajo las mismas condiciones de experimentacin (Cceres et
al., 2008) (Ver Tabla 4). Para esto se tomaron 250 g, (25 % (p/p)) de cebada sin
maltear y se mezclaron con 500 mL de agua destilada tibia durante 15 minutos,
seguidamente se adicion un volumen de 500 mL de buffer de acetato de sodio
0.05M (pH 5.5) (Frigard et al., 2002). La hidrlisis del almidn se realiz en dos
etapas. En la primera o licuefaccin, se aadi la -amilasa termoestable durante 2
horas a 95C y pH 5.5. Para la sacarificacin se adicion la - amilasa a 57C y pH
5.5 durante 6 horas (Linde et al., 2008). La hidrlisis de la mezcla se detuvo por
adicin de HCl 2M hasta pH 1.5-1.6. Finalmente se ajust el pH a 5-6 (Shariffa et
al., 2008) y las muestras se almacenaron
a -20C para la determinacin de
azcares reductores al final del proceso (Ebrahimi et al., 2007). Este procedimiento
se realiz por duplicado.
Las concentraciones de enzimas Multifect AA 21L y Multifect AA 23L evaluadas
fueron 5, 10, 15, 20 y 25 mL/L, establecidas de acuerdo a ensayos previos
realizados en la destilera bajo las mismas condiciones, en los cuales el manejo de
una concentracin inferior a 2 ml/L no representara un mejoramiento en el proceso
hidroltico del almidn de cebada no malteada, Sin embargo, este rango de
concentraciones tambin se establecieron por propuesta por parte del personal de
calidad en base a la experiencia que estos poseen e inters de experimentar bajo
este rango de concentraciones. A su vez se tuvieron en cuenta los resultados
obtenidos por Chen et al. (2007) y Kolusheva y Marinova (2007), los cuales
reportaron rendimientos de hidrlisis satisfactorios.
5.2.1.1 Control de comparacin
Se tomaron 250 g, 25 % (p/p) de cebada malteada mezclndolos en un 1 L de
agua destilada a 45C durante 55 minutos, seguidamente se realiz la escala de
temperatura establecida por la experiencia de la empresa de la siguiente forma:
52C por 30 min, 62C por 1 hora y 72C por 30 min, con el fin de asegurar que los
almidones de la cebada se transformen en azcares, posteriormente se separ el
mosto de cebada del resto de los afrechos de la misma, de tal forma que el mosto a
fermentar est libre de cascarilla, obtenindose as un mosto o hidrolizado para
43

realizar el proceso de fermentacin. Las muestras fueron almacenadas a -20C
para la determinacin de azcares reductores (Ebrahimi et al., 2007). Finalmente el
mosto obtenido se ferment bajo las mismas condiciones de experimentacin con
las enzimas comerciales.
5.2.1.2 Control negativo
Este control se desarroll bajo las mismas condiciones amilolticas y fermentativas
del control de comparacin utilizando cebada sin maltear y sin adicin de enzimas
durante el proceso hidroltico.
5.2.2
Rendimiento del proceso de hidrlisis
El rendimiento de la hidrlisis enzimtica fue calculada de acuerdo a la formula

reportada por Chen et al. (2007):
Azcares reductores x 0,9x 100
Rendimiento de Hidrlisis (%) =
Polisacrido en el sustrato
5.2.3
Condiciones de fermentacin
5.2.3.1 Pruebas preliminares

Se
realiz
una
fermentacin
previa
bajo
las
mismas
condiciones
de
experimentacin de los tratamientos de hidrlisis con enzimas, empleando como

sustrato mosto producto de la hidrlisis de cebada malteada, el cual se prepar bajo
las mismas condiciones del control de comparacin, con el fin de determinar el
tiempo de duracin de la fase aerbica empleando tapn de algodn para los
erlenmeyes; y durante la fase anaerbica empleando tapn de caucho con filtro de
salida de gases, para asegurar el crecimiento y fermentacin de Saccharomyces
cerevisiae Safwhisky M-1. La determinacin de las fases se realiz cuantificando la
concentracin de biomasa en clulas/mL con cmara de Neubauer durante la
fermentacin, con el fin de establecer la duracin de la fase exponencial o aerbica
y de esta forma observar el momento en el cual el crecimiento de la levadura se
44

vuelve estacionario dando lugar a la produccin de alcohol en un ambiente
anaerobio.
5.2.3.2 Preparacin de inculo
Se sembr 1 g de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1 en 1 litro de mosto
producto de la hidrlisis del almidn de la cebada malteada preparado bajo las
mismas condiciones del control de comparacin, no estril, sin complementos
nutricionales o ajuste de pH, en erlenmeyer, incubando con agitacin a 30C, 100
rpm por 24 h (Siqueira et al, 2008).
Figura 4. Reproduccin del inculo.

Fuente: Autor.
5.2.3.3 Fermentacin
Las fermentaciones se llevaron a cabo en erlenmeyers de vidrio de 2L con un
volumen de trabajo de 1L (incluido el inculo). Se inocul un 10 % de inculo a una
concentracin de 1, 06 x106 UFC/mL de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1
en el producto de las hidrlisis con las diferentes concentraciones de enzimas y
controles (Ebrahimi et al., 2007). Se adicion sulfato de amonio como fuente de
nitrgeno en una concentracin de 1,5 g/L y se incub en aerobiosis a 35 2C con
agitacin de 100 rpm, durante el tiempo determinado en el ensayo previo de
fermentacin (numeral 5.2.3.1) (Cceres et al., 2008). Pasado este tiempo se
45

cambi el tapn de algodn por un tapn de caucho con filtro de salida de CO2, para
dar inicio a la fase de fermentacin en condiciones anaerbicas. Se tomaron
muestras cada 12 horas para determinar biomasa (Cceres et al., 2008). La
concentracin de azcares reductores y etanol se determinaron al final del proceso
de fermentacin. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
5.3 DETERMINACIN DE BIOMASA
La concentracin de biomasa en clulas/mL se cuantific con cmara de Neubauer
(Alfenore et al., 2002) (Ver Anexo 3).
5.4 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE AZCARES REDUCTORES
Y ALMIDN.
5.4.1
Determinacin del ttulo de la solucin de Fehling.
Se valor la solucin de Fehling con la solucin de glucosa al 0.5% (p/v) a partir de la

cual se calcul el contenido de azcares reductores (NTC 5146, 2008).
Se vertieron 5 mL de solucin de Fehling A y 5 mL de solucin de Fehling B (Ver
Anexo 1) en un erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de agua destilada, agregando
perlas de ebullicin, para regular la ebullicin, llevndose posteriormente a ebullicin
sobre la estufa con malla de asbesto durante 1.5-2 minutos. Mientras se va agitando
el vaso se aade la disolucin de glucosa al 0.5 % (p/v) desde una bureta hasta que
solo quede una coloracin azul suave, aadiendo 5 gotas de azul de metileno al 1 %
y se continua la valoracin (Ver Figura 5). El punto final corresponde al cambio de
coloracin de azul de metileno a rojo ladrillo. Entre el comienzo de la ebullicin y la
terminacin de la valoracin no deben transcurrir ms de 3 minutos, adems se
debe mantener la ebullicin durante la valoracin (NTC 5146, 2008).
La determinacin se debe repetir hasta que los resultados no difieran en 0.2 mL.
El ttulo se calcul mediante la siguiente ecuacin (NTC 5146, 2008):
T=
(Pg)x(Vg)
100mL delasolucin
46

T = Ttulo: gramos de glucosa empleados para titular la solucin de Fehling.
Pg = Peso de glucosa empleado para preparar la solucin patrn, en gramos.
Vg = volumen del patrn para titular la solucin de Fehling, en mL.
Figura 5. Reaccin de Fehling.

Fuente: Autor.
5.4.2
Valoracin de la muestra
En un erlenmeyer limpio se agreg 5 mL de solucin A, 5 mL de solucin B de

Fehling, 150 mL de agua destillada y unas perlas de vidrio. Procedindose como se
47

indico el numeral 5.4.1, pero empleando como titulante el filtrado recogido de las
muestras con las diferentes concentraciones de enzimas y controles (NTC 5146,
2008).
5.4.2.1 Clculo de azcares reductores
El volumen de muestra y los gramos de solucin de glucosa gastados para titular la
solucin de Fehling, son equivalentes (NTC 5146, 2008).
Azcares reductores expresados en gramos de glucosa/ L de producto (NTC 5146,
2008):
Gramosglucosa/L=
1000mL xTtulo
VgastadoxValcuota
5.5 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ETANOL

Para la determinacin de la concentracin de etanol
se utiliz el mtodo por
destilacin y estimacin del contenido alcohlico por determinacin de la gravedad

especfica. En este mtodo el producto se someti a destilacin en condiciones
especificadas, determinndose la densidad del destilado y con este valor y
utilizando tablas correspondientes se calcul el grado alcoholimtrico (NTC 5113,
2008).
5.5.1
Destilacin
Utilizando un matraz aforado de 250 mL, se llen casi hasta la marca con la muestra
y colocndose en un bao a temperatura constante a 20C por una hora.
Mantenindolo en el bao, se complet el volumen con la cantidad necesaria de
muestra, a 20C. Teniendo instalado el destilador, se verti en el matraz con la
ayuda de un embudo la muestra contenida en el baln aforado; lavndose el
recipiente que contiene la muestra y el embudo, con tres porciones de 15 mL de
agua destilada, las cuales se aaden al matraz de destilacin, retirando el embudo y
agregando una pequea cantidad de regulador de ebullicin, tapando y dando
comienzo a la destilacin, recogiendo el destilado en el mismo matraz en que se
48

midi la muestra. El matraz en el que se recoge la muestra debe tener previamente
10 mL a 20 mL de agua, en los que se sumerge la punta de un tubo que prolonga el
refrigerante (NTC 5113, 2008).
Figura 6. Destilacin de las muestras.

Fuente: Autor.
El calentamiento se regul de tal forma que la destilacin ocurra sin sobresaltos de
manera lenta pero continua. Se contino la destilacin hasta que el destilado llegue,
aproximadamente, hasta los hombros del matraz. Se suspendi la destilacin, se
retir el tubo colocando en la parte interior del refrigerante y lavando con agua, por
dentro y por fuera, sobre el mismo matraz pero sin llegar al cuello de ste. Se coloc
el matraz en el bao de temperatura contante a 20C por una hora y, sin retirarlo del
bao, se complet a volumen con agua a 20C. Una vez terminada la destilacin y
completado a volumen el destilado, se procedi a determinar su gravedad especfica
por el mtodo del picnmetro, para lo cual se pes un picnmetro vaco, limpio y
seco (NTC 5113, 2008).
49

Se llen con agua a 20C y se pes para obtener el peso del agua contenida. Se
desocup el picnmetro, se lav varias veces con pequeas cantidades del
destilado, llenandolo con el destilado a 20C y volvindolo a pesar para obtener el
peso del destilado (NTC 5113, 2008).
Figura 7. Determinacin del peso del destilado.

Fuente: Autor.
5.5.1.1 Clculo de la gravedad especfica
La gravead especfica se calculo por la siguiente frmula (NTC 5113, 2008):
Peso del destilado
Gravedad especfica =
Peso del agua
Con los resultados obtenidos se calcularon los grados alcoholimtricos, por medio
de las tablas correspondientes (NTC 5113, 2008).
5.6 VARIABLES DE ESTUDIO
Las variables independientes de estudio son la concentracin de y amilasas.
50
Las variables dependientes son la concentracin de azcares reductores,

formacin de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, y produccin de etanol.
5.7 RECOLECCIN DE LA INFORMACIN

Se realiz una revisin bibliogrfica en el compendio de norma tcnicas y guas de
implementacin de normas del sector bebidas alcohlicas del ICONTEC, libros,
artculos cientficos, revistas especializadas en el tema y normas relacionadas con la
elaboracin y calidad microbiolgica de las bebidas alcohlicas, especficamente
para aquellas producidas a partir de cebada. As mismo, la preparacin de reactivos,
medios de cultivo y el desarrollo de los mtodos se realizaran segn Procedimientos
Operativos Estndar.
Todos los resultados obtenidos sern llevados en una bitcora, anotando la fecha
de montaje experimental, evolucin, observaciones, fecha de anlisis y los
resultados obtenidos.
5.8 ANLISIS DE INFORMACIN
Para el anlisis estadstico de los datos obtenidos, se realiz un anlisis de varianza
y se aplic la prueba de Tukey para determinar si entre los niveles de cada factor
hay diferencias significativas. Las variables de respuesta fueron biomasa,
concentracin de azcares reductores y produccin de etanol.
La hiptesis nula ser que hay igualdad de medias entre los niveles para cada
factor, as:
Para el factor amilasa:
Ho: 5 = 10 = 15 = 20 = 25
Ha: Al menos dos son diferentes
Para el factor amilasa:
Ho: 5 = 10 = 15 = 20 = 25
Ha: Al menos dos son diferentes.
51

6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS
Para poder iniciar el estudio, fue necesario determinar la concentracin de almidn
presente en cada una de las cebadas empleadas, en donde se encontr que la
cebada malteada posee un 80% de almidn y la cebada sin maltear un 60%, como
se puede observar en la Tabla 5.
Tabla 5. Resultados de la concentracin de almidn realizados a la cebada mateada
y sin matear.
Tipo
% Almidn
Representacin
Cebada
malteada
80
Cebada sin
maltear
60
Estos valores concuerdan con los mencionados en el marco terico (Ver Tabla 1).
Descartndose
que cualquier irregularidad en los ensayos sea ocasionada por
limitacin de la concentracin de almidn. En el trabajo realizado por Chen et al.
52

(2007), se describe que la concentracin de sustrato resulta ser un factor crtico en
el momento de la liberacin de azcares reductores, sustentando de manera
confirmativa lo descrito anteriormente, es decir, a mayor concentracin de sustrato
la cantidad de azcares reductores disponibles para la levadura se incrementan.
Considerando de esta forma a estas cebadas como sustratos manejables para la
levadura, y su fermentacin (Santander, 2006), debido a que la concentracin de
azcares fermentables producidos en el proceso de hidrlisis de almidn de cebada
determinarn ms adelante las condiciones de fermentacin para la produccin de
etanol.
6.2 PROCESO HIDROLTICO DEL ALMIDN DE CEBADA SIN MALTEAR
Para establecer la concentracin ptima de y amilasas comerciales en la
obtencin de etanol a partir de cebada sin maltear empleando Saccharomyces
cerevisiae, se tuvieron en cuenta los siguientes factores: concentracin de azcares
reductores, pH, temperatura, formacin de biomasa y produccin de etanol.
En orden a lo citado anteriormente, se experiment con una concentracin de
cebada de 250 g/L, estipulada como la dosis equivalente en una base de clculo de
un litro, a la concentracin empleada a escala industrial determinada en base a la
experiencia prctica y terica de la destilera, asegurando de esta forma el consumo
total de los azcares por parte de la levadura. Esta concentracin se confirma con lo
reportado por Kolusheva y Marinova (2007), quienes obtuvieron la mejor condicin
de hidrlisis de almidn con una concentracin de sustrato de 250 g/L, ya que
evidenciaron una inhibicin generada por los azcares reductores obtenidos durante
la hidrlisis del sustrato en concentraciones superiores al 250 g/L. Para probar esta
hiptesis, investigaron la influencia de la concentracin de la glucosa aadida al
sustrato sobre el tipo de reaccin enzimtica, concluyendo que la adicin de glucosa
en el inicio del proceso de hidrlisis, reduce significativamente la velocidad de
reaccin del proceso, y
el porcentaje de esta reduccin es proporcional a la
cantidad de glucosa aadida.

Como es conocido, la tasa mxima de reaccin enzimtica es proporcional a la
concentracin de enzimas (Kolusheva y Marinova, 2007), por lo tanto, se determin
53

la concentracin de alfa y beta amilasas comerciales necesaria para degradar el
almidn presente en la cebada no malteada, de tal forma que
Saccharomyces
cerevisiae utilice los productos de la hidrlisis como fuente de energa. Se examin

esta influencia en un rango de concentraciones entre 5-25 mL enzimas por litro de
suspensin. En la Grfica 1 se observa la relacin obtenida entre la concentracin
de azcares reductores y las dosis de enzimas adicionadas para el proceso
hidroltico, evidenciando cmo la concentracin de azcares reductores aumenta a
medida que se incrementa la dosis de enzima, hasta la concentracin de de 20
mL/L, como respuesta a la hidrlisis de almidn, demostrndose que el medio y las
condiciones utilizadas para el proceso hidroltico, llevado a cabo por
la accin
cataltica de las enzimas Multifect AA 21L y Multifect AA 23L fueron los

adecuados. Sin embargo, Kolusheva y Marinova (2007) reportan, que la mayora de
las veces la hidrlisis enzimtica se lleva a cabo con -amilasas y con menos
frecuencia son empleadas las -amilasas, demostrndose con los resultados
obtenidos que estas dos enzimas pueden llegar realizar una labor sinrgica para
hidrolizar el almidn de la cebada sin maltear. Adems, de acuerdo con lo reportado
Eglinton (1998), las beta-amilasas son enzimas claves en la degradacin del
almidn de la cebada germinada (Hordeum vulgare L.), la cual es sintetizada
durante el desarrollo de la cebada grano, en contraste con otras importantes
enzimas hidrolticas que son sintetizados durante la germinacin.
Grfica 1. Concentracin de azcares reductores en funcin de la dosis de de

enzimas, (C+) control de comparacin y (C-) control negativo despus de la
hidrlisis por 8h.
54

En la Grfica 1 se observa, que el valor obtenido de azcares reductores en el
control negativo, fue inferior en relacin a los valores obtenidos en todos los
ensayos con enzimas, demostrando que efectivamente se logr hidrolizar el almidn
de la cebada sin maltear reflejndose en el aumento de la concentracin de
azcares reductores, desaparicin del caracterstico color azul con yodo (Ver Figura
Anexo 5.2), y en la turbidez y color del medio (Ver Figura Anexo 5.1) (Norris y
Richmond, 1981).Por lo que se podra considerar el uso estas como una ayuda para
mejorar el rendimiento hidroltico del almidn de la cebada sin maltear, utilizada en
el proceso de produccin de la destilera.
Teniendo en cuenta, que generalmente la accin de y amilasas sobre el almidn
natural de los granos no es muy efectiva por que estos presentan una resistencia a
la digestin amiloltica (Sarikaya et al., 2000), los valores obtenidos de las
concentraciones de azcares reductores, demuestran lo reportado por Lauro (2001),
donde la accin hidroltica de las amilasas sobre el almidn de granos de cebada se
lleva a cabo porque estas enzimas erosionan la superficie del grano o digieren
canales en puntos seleccionados en la superficie hacia el centro del grano,
permitiendo la difusin de la enzima hacia el sustrato, la adsorcin de la enzima
sobre el sustrato y el evento catalizador.
En la Grfica 1, se evidencia una cada en los valores de la concentracin de
azcares reductores entre la concentracin con 20 mL/L y 25 mL/L, la causa de este
hecho segn lo reportado por Kolusheva y Marinova (2007), se debe a que entre
mayor sea la concentracin de enzimas y menor sea el sustrato disponible, la tasa
de reaccin disminuye, porque hay menos lugares de reaccin activos disponibles
para hidrolizar el almidn, generando una limitante por exceso de enzimas.
Comparando los resultados anteriores, se determin que la concentracin ptima
de enzimas para produccin del mosto hidrolizado de fermentacin es 20 mL/L, ya
que la utilizacin de concentraciones mayores no se traduce en un aumento de la
tasa de reaccin enzimtica (Tabla Anexo 4.1).
Kolusheva y Marinova (2007), reportan en su trabajo que los parmetros bsicos
que afectan al proceso de hidrlisis son la temperatura, el tiempo de hidrlisis, el pH
55

del medio, la concentracin del sustrato y la concentracin de la enzima, los cuales
varan dependiendo de la enzima. Teniendo en cuenta lo anterior, todos los ensayos
se desarrollaron bajo las mismas condiciones de pH (5.5), temperatura (95oC para
- amilasa y 57oC para -amilasa), y tiempo de hidrlisis (8 horas). Los resultados
obtenidos del proceso hidroltico, concuerdan con los obtenidos en el estudio de la
influencia de la temperatura sobre la tasa de hidrlisis por Kolusheva y Marinova
(2007), quienes determinaron que la tasa de la reaccin enzimtica es casi idntica
a 90C y 100C, eligiendo 90C como la temperatura ptima. De igual forma, Hill et
al. (1997) reportaron que la mayor tasa de hidrlisis obtenida con una -amilasa fue
pH 5.5. En cuanto al tiempo de hidrlisis, Kolusheva y Marinova (2007) en sus
resultados sobre la influencia del tiempo de hidrlisis en la concentracin de
azcares reductores, obtuvieron la mxima concentracin de azcares reductores y,
por ende, el nivel mximo de hidrlisis despus de 4 horas y 15 minutos. Sin
embargo, reportan que el comportamiento hidroltico de otra amilasa termoestable,
sintetizada por B. licheniformis MB-80 tuvo una duracin superior a 7 horas, lo que
concuerda con el tiempo empleado para la hidrlisis del almidn de cebada, y
confirmndose con los valores de las concentraciones de azcares reductores de la
Grafica 1.
Tabla 6. Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso hidroltico.
Dosis de Enzimas
Rendimiento de
(mL/L)
hidrlisis (%)
66.9964
10
67.3686
15
73.1762
20
89.4376
25
65.3359
Control de
41.8491
comparacin
Control Negativo
3.8570
56

Otro parmetro evaluado fue el rendimiento de hidrlisis, estos datos estn
presentados en la Tabla 6, exhibiendo que la prueba con el mejor rendimiento de
hidrolisis fue con la dosis con 20 mL/L (89,44%), seguida de la dosis con 15 mL de
enzimas (73.17%), demostrndose que la presencia de enzimas es fundamental
para la obtencin de un mejor rendimiento hidroltico, ya que en todos los
tratamientos con enzimas y en el control de comparacin se obtuvo un rendimiento
satisfactorio en relacin al control negativo, en el cual la concentracin de amilasas
es insuficiente para la degradacin completa del almidn presente en la cebada,
razn por la cual el valor del rendimiento de hidrlisis es bajo.
Al igual que en la liberacin de azcares reductores, la tendencia seguida por el
rendimiento de la hidrlisis enzimtica es similar, tal como se aprecia en la Grfica
2, coincidiendo con lo reportado por Chen et al. (2007), quienes reportaron este
parmetro para la determinacin del efecto de la concentracin de sustrato y de
enzimas en el proceso de hidrlisis enzimtica, donde la concentracin de azcares
reductores tena una tendencia de variacin similar al rendimiento de hidrlisis,
aumentando ambas a medida que la concentracin de enzimas era mayor.
Grfica 2. Relacin azcares reductores producidos y rendimiento de hidrlisis en

funcin de la concentracin de enzimas, (C+) control de comparacin y (C-) control
negativo.
57

Los anlisis estadsticos fueron realizados por medio del programa computarizado
SPSS vs 10, en donde se cumpli la hiptesis alterna (ver numeral 5.8),
presentando diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.1 y
9.2), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la
concentracin de azcares reductores (p<0,005) y del rendimiento de la hidrlisis
enzimtica (p<0,005), obteniendo la mayor concentracin de estos en el tratamiento
con 20 mL/L de enzimas.
6.3 ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIN
La conversin de glucosa a etanol es llevada a cabo por muchas levaduras, pero
muy pocas bacterias. En los procesos industriales generalmente es utilizada
levadura del gnero Saccharomyces, ya que posee un rendimiento terico de 51.1%
(p/p) (Glazer y Nikaido, 1998), adems de ser un microorganismo no patgeno
anaerobio facultativo (Navarro y Sossa, 2003). Por esta razn y por ser esta la
levadura empleada en Destilera Premier LTDA. en su proceso productivo, se
seleccion Saccharomyces cerevisiae cepa Safwhisky M-1 para la fermentacin de
los mostos generados en el proceso de hidrlisis (Ver Anexo 12).
Para predecir el desarrollo de la fermentacin fue necesario conocer la curva de
crecimiento de la levadura (UFC/mL), determinado los intervalos de tiempo para la
fase aerobia y anaerbica, debido a que las levaduras en aerobiosis oxidan los
azcares simples como la glucosa hasta gas carbnico y agua por la va de Embden
Meyerhoff Parnas y despus el ciclo de Krebs, para producir ATP, NADH+H+ y
formar radicales carbonados intermediarios en la biosntesis celular. Mientras que
en anaerobiosis se produce etanol y CO2 (Madigan et al., 2003). Razn por la cual,,
se realiz una fermentacin previa, empleando un hidrolizado de cebada obtenido
bajo las mismas condiciones de experimentacin del control comparacin tal como
se observa en la Grfica 3, evidenciando que a partir de la hora 6 empieza una fase
logartmica hasta la hora 36 de fermentacin. Navarro y Sossa (2003), reportan que
la glucosa (azcar reductor) que es la fuente principal de carbono en el medio
disminuye con el paso del tiempo, reflejndose en el aumento de la biomasa. A la
hora 48 de fermentacin se presenta la mayor cantidad de UFC/mL con un recuento
58

de 2,88x 109 UFC/mL, como se aprecia en la Tabla Anexo 6.1. Sin embargo el
recuento entre la hora 36 y 48 no present un aumento significativo, como se puede
ver en la Grfica 3, determinando que la fase aerbica de fermentacin de los
tratamientos con enzimas y controles seria durante las primeras 36 horas de
crecimiento de S. cerevisiae Safwhisky M-1, teniendo en cuenta que muchas
fermentaciones anaerbicas requieren una fase inicial de crecimiento aerbico como
es el caso de la produccin de dextranos, alcoholes y 2,3 etilenglicol, y slo
despus, en la fase de produccin se generan condiciones reductoras (Rhodes y
Fletcher 1969).
Grfica 3. Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante el ensayo

previo de experimentacin.
En la grfica 3, se observa una fase estacionaria corta, con una duracin de 24
horas, es decir entre la hora 36 y a la 60. A partir de la hora 60 empieza la fase de
muerte de la levadura, donde disminuye la viabilidad celular hasta finalizar con un
recuento de 8,0 x 108 UFC/mL, como se aprecia en la Tabla Anexo 6.1. Estudios
han demostrado el papel que tienen los esteroles en la fermentacin de cerveza y
whisky, estando conectados con la necesidad de oxgeno en el proceso de
fermentacin. En el estudio realizado por Aries et al. (1977), observaron que el
oxgeno durante la fermentacin es necesario para la ciclizacin del escualeno a
59

lanosterol. En ausencia de oxgeno, el escualeno se acumula y el contenido de
esteroles disminuye, reduciendo el crecimiento de la levadura, mientras que en
presencia de oxgeno conduce a una mayor sntesis de ergosterol, concurrente con
el aumento en el crecimiento de la levadura. En otro estudio, realizado por
Hayashida y Ohta (1980), se demostr el papel del ergosterol sobre la tolerancia del
etanol, complementando las clulas con ergosterol solo y ergosterol con cido oleico
durante 48 h, evalundose la indurabilidad de las clulas y la accin fermentativa
en presencia de alcohol (20%). Se observ que el oleato de ergosterol ligeramente
promueve el crecimiento, mientras que en alcohol la indurabilidad de las clulas fue
notablemente mayor. Aunque el cido oleico y el ergosterol en combinacin mejoran
el crecimiento y el alcohol indurabiliza, ninguno de estos puede aumentar la
actividad fermentativa de las clulas. Por lo tanto, se sugiri que los esteroles son
cruciales para la promocin de la indurabilidad de clulas en presencia de alcohol
mediante el suministro de rigidez a la membrana. Una disminucin en el contenido
de ergosterol de la membrana de la clula tambin ha sido directamente relacionada
con disminucin de la viabilidad celular en presencia de etanol (Larue et al. 1980;
Lees et al., 1980).
Por ltimo, de acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo previo de
fermentacin, se determin que para los tratamientos con enzimas y controles, se
suspendera la entrada de aire a partir de las 36 horas, empleando un tapn de
caucho y filtro de salida de gases hasta terminar la fermentacin, considerando que
partir de este punto inicia la fase estacionaria en donde la ausencia de oxigeno
favorece la fermentacin de azcares hasta etanol, terminado la fermentacin a las
84 horas. A pesar que esta fermentacin se d durante un tiempo prologado, el
objetivo de dejar hasta la hora 84 fue recuperar el mayor volumen de etanol que las
levaduras pudieran producir, adems de poder observa el comportamiento de las
levaduras durante este tiempo, a su vez se estableci este periodo de fermentacin
en base a la experiencia de experimentacin obtenida por parte del personal en la
destilera.
60

6.4 FERMENTACIN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE
CEBADA SIN MALTEAR
Las levaduras son comnmente los microorganismos ms utilizados para la
fermentacin alcohlica. El cultivo anaerbico de Saccharomyces cerevisiae, genera
adems de etanol, dixido de carbono, glicerol y biomasa como los ms importantes
subproductos (Brandberg et al., 2007). Siqueira et al. (2008), reportan en su trabajo
que para la produccin de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, realizaron la
propagacin del inculo bajo condiciones de agitacin de 100 rpm y 30C durante
24 horas. Condiciones que se adoptaron para la produccin del inculo de
Saccharomyces cerevisiae cepa Safwhisky M-1, con el fin de asegurar una gran
produccin de biomasa, obteniendo un recuento de 1,06 x 106 UFC/mL. Para
evaluar el comportamiento de la levadura se evaluaron durante la fermentacin
diferentes parmetros tales como la produccin de biomasa (UFC/mL), y la
concentracin de azcares reductores y etanol al final de la fermentacin.
En orden a lo mencionado anteriormente, de cada repeticin de un tratamiento, se
sac una curva de crecimiento promedio que permiti observar el comportamiento
de S. cerevisiae Safwhisky M-1 a lo largo de la fermentacin en el hidrolizado de
cebada, producto de las diferentes concentraciones de amilasas comerciales
estudiadas. En la Grfica 4, se observan las curvas de crecimiento obtenidas,
evidenciando que las clulas no necesitaron de una fase de adaptacin, desde la
hora cero empezaron un crecimiento exponencial que termin en la hora 48, a partir
de la cual la poblacin empez a disminuir, en este caso no se evidenci la fase de
muerte.
Reducir la fase de adaptacin a cero horas, implica alcanzar en menos tiempo la
concentracin de clulas necesaria para iniciar el proceso de fermentacin, lo cual
es muy bueno para optimizar la reproduccin llevada a cabo en planta (Santander,
2006). Adems, la razn por la cual, a partir de la hora 48 la formacin de biomasa
muestra un comportamiento estacionario, donde los valores de los recuento tienden
a disminuir, como se aprecia en las Tablas Anexo 6, es debido a que la glucosa
presente en el medio entra a un proceso glicoltico, seguido por uno fermentativo,
61
Grfica 4. Poblacin de Saccharomyces cerevisiae presente en el medio de

fermentacin con las diferentes concentraciones de enzimas.
donde solo se genera un ATP en la primera etapa (glicolisis), lo que representa un
rendimiento ms bajo que el obtenido por va aerobia (Glazer & Nikaido 1998),
adems del agotamiento de este azcar en el medio.
La Grfica 4, muestra el comportamiento obtenido de la poblacin durante el
proceso de fermentacin de 84 horas en los mostos resultantes de la hidrlisis con
las amilasas. Al comparar los datos obtenidos, no se observa que una diferencia
significativa entre los recuentos de los diferentes ensayos, sin embargo las curvas
con mejor desempeo fueron aquellas donde el medio fue tratado con las
concentraciones ms altas de enzimas (Ver Tablas Anexo 6 y Grficas Anexo 7). La
poblacin de todos los ensayos tienden a aumentar con el transcurso del tiempo
durante las primeras horas de fermentacin aproximadamente hasta la hora 48, con
excepcin del ensayo con 5mL/L (Hora 54); momento en el cual se obtiene la
biomasa mxima para todos los tratamientos, a partir de este punto se evidencia un
descenso de la poblacin, debido al agotamiento del sustrato, en este caso glucosa,
ya que los valores obtenidos de la concentracin de azcares reductores al final de
la fermentacin son inferiores a los obtenidos al inicio de la fermentacin (Ver Tabla
Anexo 6.9). Adems, S. cerevisiae tiene la capacidad de alcanzar tasas de glicolisis
62

y de produccin de etanol en condiciones ptimas en poco tiempo, pero esta tasa se
mantiene slo por un breve perodo durante la fermentacin y disminuye
progresivamente a medida
que el etanol se acumula en el medio (Casey y
Ingledew, 1977; Ingram y Buttke, 1984; Moulin et al., 1984). Estudios anteriores han
identificado una necesidad esencial de lpidos (Beavan et al., 1982; Casey et al.,
1984; Thomas et al., 1978) u oxgeno molecular para la biosntesis de los lpidos
(Andreason y Stier, 1954; Buttke et al., 1980; Buttke y Pyle, 1982) en muchos
medios de fermentacin para el mantenimiento de una actividad fermentativa alta. El
suministro de estas necesidades nutricionales reduce, pero no elimina la
disminucin de la actividad fermentativa durante la fermentacin. Se conoce que el
etanol altera la permeabilidad de membrana y la funcin de la membrana en una
variedad de sistemas biolgicos (Casey y Ingledew, 1986; Ingram y Buttke, 1984).
En levaduras, el etanol provoca un aumento en el flujo de iones de hidrgeno a
travs de la membrana plasmtica de las clulas suspendidas en agua (Cartwright,
et al., 1986). Este aumento de flujo de iones de hidrgeno se ha propuesto como el
responsable de la induccin del etanol, disminuyendo las tasas de transporte
observadas en condiciones similares (Beavan, 1982; Leao y Van Uden, 1982; Leao
y Van Uden,1984; Leao y Van Uden,1984). Demostrndose que la acumulacin de
etanol no puede ser el nico factor responsable para la disminucin de la actividad
fermentativa, ya que la sustitucin del medio de fermentacin que contiene etanol
por uno nuevo que carece de este, no restablece inmediatamente la actividad
fermentativa (Dombek y Ingram, 1986.). Millar et al. (1982) demostr que las
concentraciones de etanol por debajo del 12% (v/v) no desnaturaliza las enzimas o
causa una inhibicin de la actividad apreciable in vitro. Dado a que el etanol no se
acumula dentro de levadura, pero si se difunde rpido en toda la membrana celular
(Dombek y Ingram, 1985; Guijarro y Lagunas, 1984), inhibiendo directamente las
enzimas glicolticas intracelulares, sin embargo, reportan que es poco probable que
durante la fermentacin se produzca una concentracin del 12% (v/v) de etanol o
menos.
En la grfica 4 tambin se observa, que las curvas de crecimiento de todos ensayos
con enzimas estn muy cercanas a la curva de control de comparacin, en especial
los tratamientos con concentraciones de enzimas mayores, lo que demuestra que
63

los hidrolizados de cebada fueron medios con concentraciones de azcares
adecuadas para el desarrollo de Saccharomyces, logrando tener un comportamiento
muy cercano al establecido tradicionalmente por la destilera (control de
comparacin). Sin embargo, teniendo en cuenta el valor obtenido de azcares
reductores en el control de comparacin (Ver Grfica 1), se puede decir que en este
medio los azcares liberados al medio son fcilmente asimilados por las levaduras,
favoreciendo una mayor formacin de biomasa en relacin a las curvas de
crecimiento obtenidas en los tratamientos con enzimas en los cuales todos
presentaron valores de azcares reductores superiores a este control, no obstante,
este valor no indica que toda esta concentracin sea aprovechable para las
levaduras, ya que de acuerdo con lo reportado por Hornesey (2003), estas enzimas
pueden producir altos niveles de monosacridos pero relativamente poco azcar
fermentecible.
En la Grfica 5 se evidencia, que las barras que representan el valor de la biomasa
mxima alcanzada en los diferentes ensayos, tienden a alcanzar la misma altura, lo
anterior no expresa que todos los ensayos tengan el mismo valor de biomasa
mxima, por ejemplo el tratamiento con una concentracin de enzimas de 25 mL/L
presento la poblacin mximas ms alta a la hora 48 (2,35 x 109 UFC/mL), seguido
por el control positivo (2,33x 109 UFC/mL), y las concentraciones de 20 mL/L,10
mL/L y 15 mL/L(2,15x109 UFC/mL, 1,98x109 UFC/mL, 1,83x109 UFC/mL,
respectivamente),
mientras que los valores ms bajos fueron obtenidos en la
concentracin de 5 mL/L (8,0x108 UFC/mL) a la hora 54 y en el control negativo

(7,75x108 UFC/mL). Aunque el ensayo llevado a cabo con 25 mL/L de y amilasas alcanz el valor de biomasa mxima mayor y sabiendo que este es un
factor importante, no se escogi a esta dosis por la baja concentracin de azcares
reductores liberados en la hidrlisis del almidn de cebada, al descartarla le sigue
la concentracin con 20 mL/L, en la cual se obtuvo la mayor concentracin de
azcares reductores, y el valor de biomasa mxima para esta no est tan alejado al
de la concentracin con 25 mL/L, alcanzando la biomasa mxima, tambin a las 48
horas de fermentacin.
64
Grfica 5. Relacin entre concentracin de clulas/mL mxima y el tiempo de

obtencin de la biomasa mxima de S. cerevisiae en funcin de la concentracin de
enzimas, (C+) control de comparacin y (C-) control negativo.
En la Grfica 5 se observa, que al incrementar la dosis de enzimas se favorece la
produccin de biomasa a pesar que la diferencia entre ensayos no es
representativa. Tambin se evidencia que el tiempo en el que alcanza S. cerevisiae
su biomasa mxima, se ve influenciado por la concentracin de enzimas, como por
ejemplo, en el medio con 5 mL/L de enzimas S. cerevisiae alcanz su biomasa
mxima a la hora 54 de fermentacin, en comparacin al tiempo en el cual S.
cerevisiae alcanz su biomasa mxima en todos los dems tratamientos, el cual fue
a las horas 48 horas de fermentacin.
Al analizar estadsticamente los resultados obtenidos de biomasa, se comprueba
que existe diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.3 y
9.4), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la
formacin de biomasa (p<0,005). Adems se demostr, que la concentracin de
enzimas no influye en el tiempo en el cual la levadura alcanza su biomasa mxima ,
ya que no se presentaron diferencias significativas, razn por la cual, S. cerevisiae
65

present una tasa de crecimiento diferente en cada tratamiento con una
determinada concentracin de enzimas, debido a que en cada ensayo se obtuvo
una
concentracin
diferente
de
azcares
disponibles
para
la
levadura,
consumindolos como fuente de carbono y energa, independiente del tiempo de

fermentacin.
6.4.1
Consumo de sustrato
La glucosa (azcar reductor) es la fuente principal de carbono en los hidrolizados de

cebada, disminuyendo con el tiempo de fermentacin, como se observa en la
Grfica 6, evidenciando que las concentraciones de azcares reductores obtenidas
en el proceso de hidrlisis caen drsticamente hasta una concentracin determinada
para cada ensayo, especialmente en los tratamientos con las concentraciones de
enzimas ms altas. Este descenso o consumo de sustrato, es causado por que los
azcares disponibles en el medio son utilizados por la levadura como fuente de
carbono. Se observa tambin, que el consumo de sustrato es proporcional a la
concentracin de azcares reductores inciales de la fermentacin, entre mayor sea
la fuente de carbono disponible, mayor ser el consumo de sustrato por parte de la
levadura. Demostrando que la variacin observada a nivel de poblacin de S.
cerevisiae en los diferentes tratamientos con enzimas, se debe a la concentracin
de azcares disponibles, valor que est directamente determinado por la
concentracin de enzimas presente en el medio.
El consumo de sustrato observado, demuestra que los azcares reductores
presentes en el hidrolizado son fcilmente metabolizados por la levadura, ya que,
Saccharomyces cerevisiae posee una baja batera enzimtica, donde solo puede
fermentar hexosas como: D-glucosa, D-fructosa y D-manosa, aunque no todas las
utiliza a la misma velocidad (Tuite y Oliver, 1991), indicando tambin que el azcar
que posiblemente pueden estar presente en el hidrolizado es principalmente la
glucosa, a dems de ser el monmero constituyente del almidn.
66
Grfica 6. Relacin entre la concentracin de azcares reductores inicial y final de

la fermentacin con S. cerevisiae en funcin de la concentracin de enzimas, (C+)
control de comparacin y (C-) control negativo.
En la Tabla 7, se observa que la variacin entre los valores de la biomasa mxima
obtenidos, no es tan grande como la del consumo de sustrato, en relacin a la
concentracin de enzimas, por lo que se puede decir que la presencia de las
enzimas influye en el aprovechamiento del sustrato para producir biomasa
(Santander, 2006). Sin embargo, al comparar el tratamiento con 15 mL/L de
enzimas, y el de 25 mL/L, el consumo de sustrato obtenido para estos es muy
parecido (42,312 g/L, 41,084 g/L, respectivamente), pero la biomasa producida con
ese mismo consumo es ms alta cuando la concentracin de enzimas es mayor.
Segn estos resultados, adicionar una dosis de enzimas mayor al medio, hace ms
eficiente el consumo de sustrato, la clula aprovecha los azcares para producir
ms
biomasa
que
para
otras
funciones
fisiolgicas
(Santander,
2006),
demostrndose con los resultados obtenidos de formacin de biomasa (Ver Grfica

4), donde Saccharomyces cerevisiae incrementa su tasa de crecimiento a medida
que aumenta la concentracin de enzimas, ya que en los tratamientos con dosis de
enzimas mayores, se obtuvieron las concentraciones de azcares reductores y
consumos de sustrato ms altos, confirmando que la levadura toma los azcares
67

reductores presentes en el medio como fuente de carbono y energa (Navarro y
Sossa, 2003).
Tabla 7. Datos de la biomasa mxima alcanzada y el consumo de sustrato bajos las
diferentes concentracin de enzimas, (C+) control de comparacin y (C-) control
negativo.
Concentracin
de enzimas
mL/L
Log
Biomasa
mx
(UFC/mL)
Sustrato
Consumido
(g/L)
8,902
36,159
10
9,295
38,274
15
9,261
42,312
20
9,332
53,400
25
9,371
41,084
C+
9,366
34,208
C-
8,889
0,159
Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae

alcanza un valor de biomasa mxima de 8,889 Log UFC/mL, mostrando una mnima
diferencia de 0,013 Log UFC/mL con el tratamiento de 5 mL/L de enzimas, teniendo
en cuenta que en este control no hay un elemento enzimtico que realizara la
hidrlisis del almidn, se considera que este comportamiento se da, por la presencia
de fuentes de carbono diferentes a los azcares liberados del almidn y de fcil
asimilacin para la levadura, porque los valores obtenidos de azcares reductores y
del consumo de estos para este control fueron muy bajos, razn por la cual, la
concentracin de azcares obtenida no tiene una correlacin con el valor de
biomasa obtenido .
Como se observa en la Grfica 7, el aumento de la dosis de enzimas influye en el
consumo de sustrato, mostrando un comportamiento de variacin similar. Se
evidencia que la concentracin de enzimas con mayor consumo de sustrato es la
recomendada en este estudio, 20 mL/L (53,4 g/L), sin embargo, en los tratamientos
68
70
Sustrato Consumido (g/L)
60
50
40
30
20
10
0
5
10
15
20
25
C+
C-
Dosis de Enzimas (ml/L)
Grfica 7. Consumo total de sustrato bajo las diferentes concentraciones de

enzimas, (C+) control de comparacin y (C-) control negativo.
con las diferentes concentraciones de enzimas se observan consumos no tan
lejanos a los obtenidos en esta concentracin, pero si superiores al control de
comparacin (Ver tabla ANEXO 6.9), demostrndose, que el empleo de este tipo
enzimas favorece a la liberacin de azcares reductores en la hidrlisis del almidn
de la cebada sin maltear, los cuales sern asimilados por la levadura para su
mantenimiento celular. Al analizar estadsticamente los resultados obtenidos de
consumo de sustrato, se comprueba que existe diferencias significativas entre los
tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.5), confirmando que las dosis de enzimas influyen
significativamente en la formacin de biomasa, obteniendo el mayor consumo en el
tratamiento con 20 mL/L de enzimas (p<0,005).
6.4.2
Produccin de etanol
En la Grfica 8 se observa, la concentracin de etanol obtenido en la fermentacin

con S. cerevisiae Safwhisky M-1 en funcin de la concentracin de enzimas
utilizadas en el proceso hidroltico. Se evidencia, que la tendencia que tiene la
concentracin etanol es aumentar, a medida que se incrementa la dosis de enzima
69

(Ver tabla Anexo 6.11). El tratamiento con mayor produccin de etanol fue con 20
mL/L de enzimas, comprobando que el aumento de la dosis de enzimas, favorece la
obtencin de etanol. Sin embargo, los valores de etanol obtenidos en
la
concentracin de 15 mL/L, en relacin a los de la concentracin de 20 mL/l

presentan una variacin de solo 0,58% de etanol, por lo que el rendimiento de esta
concentracin es muy cercano al mejor (20mL/L).
Grfica 8. Produccin total de etanol bajos las diferentes concentracin de enzimas,

(C+) control de comparacin y (C-) control negativo.
En la grfica 9, se observa que la produccin de etanol en la concentracin de

25/mL fue la menor en relacin a los dems ensayos y al control de comparacin,
indicando que en este caso, la levadura utiliz gran parte del sustrato para formar
biomasa y el remanente lo utiliza para la formacin de producto, porque la biomasa
producida en este ensayo no tuvo mayor diferencia a la de los dems resultados
obtenidos, pero la influencia de esta concentracin si se refleja en el sustrato
consumido y porcentaje de alcohol producido. De la misma forma, se observa que
para los dems tratamientos y control de comparacin, la produccin de etanol
requiere un consumo mayor de sustrato, observando una proporcin directa entre
estos dos parmetros.
70
Grfica 9. Consumo total de sustrato y produccin total de etanol bajos las

diferentes concentracin de enzimas, (C+) control de comparacin y (C-) control
negativo.
Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae
alcanza un valor de etanol de 0,46 %, considerando que este valor, a pesar de ser
muy bajo, es obtenido posiblemente por la fermentacin de azcares liberados por
hidrlisis enzimtica por accin de alfa y beta amilasas de la cebada, las cuales se
encuentran en concentraciones tan bajas que para un proceso productivo no son
representativas en relacin a la concentracin presente en la cebada malteada, sin
embargo, como se observa en la grafica 8, la concentracin de enzimas presentes
en esta cebada tuvo la capacidad de liberar azcares del almidn para producir este
valor de etanol, pero la naturaleza de estos azcares son diferentes a la glucosa, ya
que el valor de azcares reductores obtenido y el consumo de sustrato, reflejan un
comportamiento muy bajo, por lo que la levadura pudo realizar la fermentacin a
partir de una fuente de carbono diferente a los azcares cuantificados por el mtodo
de Fehling.
Con el anlisis estadstico se comprob que existe diferencias significativas entre
los cinco tratamientos (p<0,005), (Ver Tabla Anexo 9.6), demostrando que los
tratamientos con una concentracin de enzimas entre 15 y 20 mL/L, producen
71

mayor concentracin de etanol, que en los tratamientos donde se utilizan dosis
menores o mayores a estas.
Etanol (%)
2
1
10
15
20
25
C+
C-
Y p/s (g de etanol/g azcares reductores)
Dosis de enzima (ml/litro)
Grfica 10. Relacin entre la concentracin de etanol producido y productividad

producto-sustrato en funcin en funcin de la concentracin de enzimas, (C+)
control de comparacin y (C-) control negativo.
En la Grfica 10 (Ver Tabla Anexo 9.7) se observa la productividad del proceso, en

la cual, la relacin de gramo de etanol producido por gramo de azcar consumido no
presenta una diferencia considerable entre ensayos, sin embargo la influencia de las
dosis de enzimas si afecta este valor, ya que la produccin de etanol depende de la
cantidad de azcar consumido y por ende la concentracin de azcares producidos
en la hidrlisis por accin de una determinada concentracin de enzimas. Estos
resultados concuerdan con lo referenciado por Siqueira et al. (2008) obteniendo
resultados donde el porcentaje de etanol generado, por gramo de sustrato
consumido en cada ensayo no presenta diferencias considerables. Por lo tanto se
concluye que la productividad con mejor comportamiento es para las dosis con 15 y
20 mL/L de enzimas, confirmando los dems resultados presentados donde el
desempeo de estas enzimas fue el ptimo para este estudio. Por otro lado, al
observar la Grfica 9 y 10, se evidencia que la mayor concentracin de etanol
obtenida fue con una concentracin de enzimas de 20 mL/L, confirmando a esta
72

como la mejor concentracin de alfa y beta amilasas, para la obtencin de una alta
concentracin de azcares reductores fcilmente asimilables por Saccharomyces
cerevisiae.
Finalmente, se sometieron a una prueba sensorial los diferentes destilados
obtenidos en los diferentes tratamientos con las concentraciones de enzimas, con el
fin de determinar una posible alteracin en la calidad organolptica del alcohol
obtenido en estos ensayos, determinado que en ninguno de los ensayos se
present una alteracin de sabor y olor, resultado que favorece y respalda la
propuesta de este ensayo, como lo es la utilizacin de enzimas comerciales como
alternativa en el proceso de produccin en Destilera Premier, teniendo en cuenta
tambin experiencias similares en la destilera que presentaron un producto picante
y con deficiente aceptacin por el panel de evaluacin sensorial.
6.5 COSTOS DE PRODUCCIN
Chen et al. (2007), reportaron como el costo de las enzimas contribuye
significativamente al costo total del proceso de conversin de biomasa, donde la
dosis de enzimas debe ser minimizado tanto como sea posible. Teniendo en cuenta
esto, las concentraciones empleadas en este estudio se establecieron basndose
en las recomendaciones del proveedor, y en un ensayo previo con una dosis de 1
mL/L, dando este ltimo un resultado desfavorable a nivel de hidrlisis y generando
un medio muy viscoso para la fermentacin. La reduccin de los costos de
produccin son la esencia de la adopcin de medidas contundentes en la mejora del
proceso manufacturero de la industria de destilera (Kosowski, 2006), por lo tanto,
se calcul el costo de un litro de etanol producido en la destilera para un lote de
10.000 litros, el cual es de 4.428 pesos/litro como resultado de la destilacin de un
volumen de 1.000 litros de etanol (Ver Anexo 10). Adems, se determin el costo
del mismo litro de alcohol, pero empleando una contraccin de 20 mL/L de enzimas
para un lote de produccin de 10.000 litros, dando como resultado que el litro de
alcohol tendra una equivalencia de 15.936 pesos/litro de etanol, en base a los
resultados obtenidos del presente estudio. Adems, la propuesta de este estudio de
emplear nicamente cebada nacional como materia prima para el proceso hidroltico
73

y fermentativo, presenta ventajas como ser 2.500 pesos/kilo ms econmica que la
cebada malteada, asimismo su disposicin no requiere un proceso de importacin.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, se considera que el empleo de
las enzimas en una concentracin de 20 mL/L como nica herramienta hidroltica
sustituyente de la cebada importada, no se favorece a nivel de rentabilidad en el
proceso productivo de las destilera. Sin embargo, la utilizacin de estas enzimas
como ayudante en el proceso de hidrlisis, especialmente para la degradacin del
almidn de cebada sin maltear, favorecera el rendimiento de este proceso y tiempo
de produccin, adems de ser una posible solucin a los problemas que en
ocasiones se presenta en el proceso productivo en la destilera, a nivel de tiempos
muy largos en la hidrlisis del almidn, incremento de la viscosidad, generando
apelmazamiento del medio y retraso en la produccin, teniendo en cuenta que estas
enzimas contribuyeron en la disminucin de la viscosidad del medio, de acuerdo con
los resultados obtenidos en el proceso hidroltico (Ver Anexo 5)
Por otro lado, en este estudio se demostr que las enzimas empleadas para el
proceso amiloltico, realmente degradaron el almidn de la cebada sin maltear, por
lo que se podra considerar para futuros estudios el empleo de concentraciones de
sustrato mayores, empleando las mismas concentraciones de enzimas de este
estudio durante periodos de tiempo ms largos y a su vez, concentraciones de
enzimas menores tales como las reportadas por Kolusheva y Marinova (2007), las
cuales fueron 6, 8, 10, 12 y 14 unidades de enzimas por mL, obteniendo un 30,2 %
de rendimiento de hidrlisis, teniendo en cuenta que entre mayor sea el uso de la
cebada nacional o sin maltear en el proceso productivo, mayor ser el ahorro para la
destilera.
74

7. CONCLUSIONES
Con la concentracin de enzimas propuesta (20 mL de enzimas/L suspensin) se
logr mejorar el rendimiento de hidrlisis en un 89,44 % en relacin al que se
obtiene normalmente en la planta 41.85 %, considerando a esta como la dosis
ptima para la etapa hidroltica del proceso de produccin de alcohol cuando se
emplea como sustrato cebada sin maltear.
Las condiciones de experimentacin en el proceso hidroltico favorecieron la
degradacin del almidn de cebada, logrando un medio con una temperatura y pH
favorable para la actividad de las enzimas, reflejndose en los valores de azcares
reductores obtenidos en todos los tratamientos.
Todos los resultados obtenidos en el estudio, muestran que se puede producir
etanol a partir de almidn de cebada sin maltear empleando las enzimas Multifect
AA 21L y Multifect AA 23L, considerando el uso de y -amilasas comerciales
como una alternativa viable para la degradacin del almidn de cebada sin maltear,
especialmente cuando se presentan problemas de hidrolisis del almidn de cebada
(apelmazamiento) en el proceso de produccin, pero la produccin del hidrolizado
requiriere ms estudios de optimizacin para la obtencin de una mayor gran
cantidad de azcares reductores que sean asimilados rpidamente por la levadura y
as obtener mayores niveles de produccin de etanol.
En etapa fermentativa, aumentar la concentracin de enzimas de 15 a 20 mL/L
ayuda a incrementar la obtencin de producto, sin embargo con la dosis de 25 mL/L
se presenta el hecho de tener ms concentracin de clulas en el medio,
generndose ms necesidades nutricionales para el mantenimiento de la levadura y
menos disponibilidad de sustrato para la produccin de alcohol.
El empleo concentraciones de enzimas comerciales en el medio de cultivo de
reproduccin mejora la eficiencia de consumo de sustrato, elimina la fase de
adaptacin del microorganismo y asegura la rpida obtencin
75
de la biomasa

mxima a las 48 horas de fermentacin dependiendo de la cantidad de enzimas
presentes en el medio.
El porcentaje de etanol obtenido al final de la fermentacin fue de 4,98 % v/v por
destilacin utilizando a Saccharomyces cerevisiae en hidrolizado de cebada sin
maltear con una concentracin de enzimas de 20 mL/L, mostrando una
productividad de producto en sustrato de 0,0951 g de etanol/ g de azcares
reductores.
Las pruebas realizadas mostraron que la ausencia de enzimas en la cebada no
malteada, puede ser reemplazada por amilasas comerciales donde el aumento en la
concentracin de estas se ve reflejado en la obtencin de concentraciones mayores
de producto, siempre y cuando esta concentracin libere los azcares reductores
necesarios para que la levadura pueda generar un buen nivel de etanol
La realizacin de este tipo de trabajos permite entender el proceso de produccin de
alcohol y por lo tanto saber cmo influyen factores tales como la temperatura y el
tiempo de hidrlisis, concentracin de azcares reductores, tiempo de fermentacin,
concentracin de inculo y por su puesto la concentracin de enzimas,
obtenindose as herramientas para solucionar los problemas que se puedan
presentar y bases para la optimizacin del proceso.
76

8. RECOMENDACIONES
Es necesario realizar al menos un ensayo de la concentracin de enzimas

propuestas a nivel piloto en la planta, con el fin de confirmar la correspondencia de
los resultados obtenidos en el laboratorio, debido a que los resultados que se
obtienen en el proceso industrial son el punto definitivo para considerar a estas
enzimas como una alternativa rentable para la empresa, ya que en el laboratorio se
trato de simular al mximo el proceso de la destilera, las condiciones ambientales,
separacin de afrecho, control de temperatura no se llevaron a cabo de forma igual,
por lo que los resultados pueden generar variaciones.
Realizar el proceso de hidroltico bajo tiempos de hidrlisis ms prolongados, con el

fin de poder obtener rendimientos interesantes empleando concentraciones
de
enzimas inferiores a la sugerida en este estudio.

Debido a que en este estudio no se determin la concentracin de
azcares
reductores al durante el proceso de hidrlisis, al iniciar la fermentacin y en la

fermentacin, as como tambin la realizacin de un seguimiento de la produccin
de etanol durante toda la fermentacin, sera muy valioso continuar con la
investigacin teniendo en cuenta estos aspectos, puesto que estos factores en la
industria de produccin de alcohol son puntos de suma importancia que podran
reportar resultados ms significativos.
Es necesario realizar una cromatografa para conocer el tipo y cantidad de
componentes del hidrolizado, para identificar la naturaleza de las fuente
nutricionales que puede utilizar Saccharomyces cerevisiae en la fermentacin del
hidrolizados de cebada.
Establecer un procedimiento para la determinacin de la actividad enzimtica de las
enzimas, con el fin de determinar la tasa de reaccin de estas a diferentes
concentraciones y en presencia del almidn de cebada no malteada.
77

9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Alfenore, S., Molina-Jouve, C., Guillouet, S. E., Uribelarrea, J. L., Goma, G.,
Benbadis, L. 2002. Improving ethanol production and viability of Saccharomyces
cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Appl. Microbiol.
Biotechnol 60 (12), 6772.
Andreason, A. A., y Stier, T. J. 1954. Anaerobic nutrition of Saccharomyces
cerevisiae. II. Unsaturated fatty acid requirement for growth in defined medium. J.
Cell. Comp. Physiol. 43:271-281.
Aries, V.,
Kirsop, B.H., Taylor, G.T. 1977. Yeast lipids. Proceedings of 16th
Congress,
Amsterdam.
European
Brewery
Convention,
Zoeterwonde,
The
Netherlands, Rotterdam, pp 255-266.

Bailey, P.S., y
Bailey, C.A. 1998. Qumica orgnica: conceptos y aplicaciones.
Quinta edicin. Editorial Prentice Hall. Mxico. 470 p.

Baker, C. 1994. Curso conservacin de papel en archivos, conservacin de los
objetos de papel. Centro Nacional de Conservacin y Restauracin, Santiago de
Chile.
Beavan, M. J., Charpentier, C., Rose. A. H. 1982. Production and tolerance of
ethanol in relation to phospholipid fattyacyl composition in Saccharomyces
cerevisiae NCYC 431. J. Gen. Microbiol. 128:1447-1455.
Beltran, P. Z., y Maldonado, P K. 2002. Caracterizacin microbiolgica de cebada
malteada y arroz y determinacin de actividad enzimtica amiloltica microbiana en l
proceso de elaboracin de mosto cervecero. . Requisito parcial para optar por el
ttulo de Microbilogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de
ciencias. Departamento de Microbiologa. Bogot, Colombia.
Bosse, K., y Das, D. 1996. Thermostable alpha-amylase production using Bacillus
licheniformis NRRL B14368. Indian J. Exp. Biol.,34, 1279-1282.
78

Brandberg, T., Gustafsson, A., Franzn, C.J., 2007. The impact of severe nitrogen
limitation and microaerobic conditions on extended continuous cultivations of
Saccharomyces cerevisiae with cell recirculation. Enzyme Microb. Technol. 40: 585
593.
Buttke, T. M., Jones, S. D., Bloch, K. 1980. Effect of sterol side chains on growth and
membrane fatty acid composition of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol.
144:124-130.
Buttke, T. M., y Pyle, A. L. 1982. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on
neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 152:747-756.
Byong, L. 2000. Fundamentos de biotecnologa de los alimentos. Zaragoza, Espaa.
Cceres, F. M., Lappe, P., Larqu, S. A., Magdub, M. A., Barahona, P. L. 2008.
Ethanol production from henequen (Agave fourcroydes Lem.) juice and molasses by
a mixture of two yeasts. Bioresource Technology 63: 1-4.
Cao, N. J., Krishnan, M. S., Du, J. X., Gong, C. S., Ho, N. W. Y., Chen, Z. D., Tsao
G. T. 1996. Ethanol production from corn cob pretreated by the ammonia steeping
process using genetically engineered yeast. Biotechnology letters, 18 (9): 10131018.
Cartwright, C. P., Juroszek, J.R., Beavan, M. J., Ruby, F. M. De Morais, S. M., Rose.
A. H. 1986. Ethanol dissipates the proton-motive force across the plasma membrane
of Saccharomyces cerevisiae. J. Gen. Microbiol. 132:369-377.
Casey, G. P., Magnus, C. A., Ingledew, W. M. 1984.High-gravity brewing: effects of
nutrition on yeast composition, fermentative ability, and alcohol production. Appi.
Environ.Microbiol. 48:639-646.
Casey, G. P., y Ingledew, W. M. 1986. Ethanol tolerance in yeasts. Crit. Rev.
Microbiol. 13:219-290.
Chandrakant, P., Bisaria, V. 2000. Simultaneous bioconversion of glucosa and
xylose to etanol by Saccharomyces cerevisiae in the presence of xylose isomerase.
Applied Microbiology and Biotechnology 53: 301- 309.
79

Chen, M., Xia, L., Xue, P. 2007.
production
from
cellulosic
Enzymatic hydrolysis of corncob and ethanol
hydrolysate.
International
Biodeterioration
&
Biodegradation 59: 8589.

Chica, N. 1996. Sacarificacin del almidn de papa. Trabajo final presentado como
requisito para optar por el ttulo de Especialista en Ciencia y Tecnologa de
alimentos. Universidad Nacional de Colombia. Manizales, Colombia.
Crueger, W., y Crueger, A. 1993. Biotecnologa: manual de microbiologa industrial.
Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 213-231 p.
Dobreva, E., Ivanova V., Emanuilova, E.1994. Effect of temperature on some
characteristics of the thermostable alphaamylase from Bacillus licheniformis. World
J. Microbiol. Biotech. 10, 547-550.
Dombek, K. M., y Ingram, L. 0. 1985. Determination of intracellular concentration of
ethanol in Saccharomyes cerevisiae during fermentation. Appl. Environ. Microbiol.
51:197- 200.
Dombek, K. M., y Ingram. L. 0. 1986. Nutrient limitation as a basis for the apparent
toxicity of low levels of ethanol during fermentation. J. Ind. Microbiol. 1:219-225.
Ebrahimi, F., Khanahmadib, M., Roodpeymaa, S., Taherzadeh. M. J. 2007. Ethanol
production from bread residues. Biomass and Bioenergy 7:1-5.
Eglinton, J. K., Langridgeand, P., Evans, D. E. 1998. Thermostability Variation in
Alleles of Barley Beta-Amylase. Journal of Cereal Science 28: 301-309.
Franco, C. M. L., Preto, S. J. R., Ciacco, C. F., Tavares, D. Q. 1988. Studies on the
susceptibility of granular cassava and corn starches to enzymatic attack.
Starch/Starke 40: 2932.
Frigard, T., Andersson, R.,
Arman, P. 2002. Gradual enzymatic modification of
barley and potato amylopectin. Carbohydrate Polymers, 47: 169-179.

Glazer, A., y
Nikaido, H. 1998. Microbial technology: Fundamentals of Applied
Microbiology. WH Freman. New York. 359-390 p.
80

Godfey, T., Reinchelt, J. 1983. The applications of enzymes in industry. The Nature
Press. USA.
Gonzlez, I. 2002. Inmovilizacin de bacterias proteolticas y amilolticas
provenientes de agua residual y compost de caf para el postratamiento de aguas
residuales del beneficio hmedo del caf. Requisito parcial para optar el ttulo de
Microbilogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias.
Bogot Colombia.
Grzegorz, K., Bogusaw, C., Magorzata, W. Characteristics of alcoholic fermentation
with the application of Saccharomyces cerevisiae yeasts: As-4 strain and I-7-43
fusant with amylolytic properties. Journal of Food Engineering 76: 500505.
Guijarro, J. M., y Lagunas, R. 1984. Saccharomyces cerevisiae does not accumulate
ethanol against a concentration gradient.J. Bacteriol. 160:874-878.
Hayashida, S., y Ohta, K. 1980. Effects of phosphatidylcholine or ergosteryl oleate
on physiological properties of Saccharomyces sake. Agric Biol Chem 44:2561-2567.
Helbert, W., Schulein, M., Henrissat. B. 1996. Electron microscopic investigation of
the diffusion of Bacillus licheniformis alphaamylase into corn starch granules. Intl. J.
Biol. Macro., 19:165-169.
Hill G.A., Macdonald, D.G., Lang X. 1997. -Amylase inhibition and inactivation in
barley malt during cold starch hydrolysis. Biotechnology Letters, 19 (11). 11391141.
Hornsey, I.S. 2003. Elaboracin de cerveza: microbiologa, bioqumica y tecnologa.
Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa.
Hoseney, R. C. 1991. Principios de ciencia y tecnologa de los cereales. Editorial
Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. 23-106 p.
Hough, J.S. 1990. Biotecnologa de la cerveza y de la malta. Editorial Acribia, S.A.
Zaragoza, Espaa. 9-154 p.
Ingram, L. O., y Buttke, T. M. 1984. Effects of ethanol on micro-organisms. Adv.
Microb. Physiol. 25:253-300.
81

Jaccques, K., Lyons, T.P., Kelsall, D.R. 1999. The Alcohol Textbook. Tercera
edicin. Nottingham Universty Press. Alltech Inc. Nottingham. 346 p.
Kosowski, G., Czuprynski, B., Wolska. M. 2006. Characteristics of alcoholic
fermentation with the application of Saccharomyces cerevisiae yeasts: As-4 strain
and I-7-43 fusant with amylolytic properties. Journal of Food Engineering 76:500
505.
Kolusheva, T., y Marinova, A. 2007. A study of the optimal conditions for starch
hydrolysis through thermostable amylase. Journal of the University of Chemical
Technology and Metallurgy, 42 (1): 93-96.
Konsula, Z., y Liakopoulou-Kyriakides, M. 2004. Hydrolysis of starches by the action
of an -amylase from Bacillus subtilis. Process Biochemistry 39, 17451749.
Kretzchmar, H. 1990. Levaduras y Alcoholes y otros productos de la fermentacin.
Editorial Reverte, S.A. Barcelona, Espaa. 582 p.
Ku Ismail, K.S., Ahmad, A.A., Inba, T., Kasim, K.F., Daud, M.Z.M. 2008. Thermoenzymatic hydrolysis of Cassava starch by -amylase and amyloglucosidase.
Malasyan Techinical Universities Conference on Engineerring and Technology.
Larue, F., Lafon-Lafourcade, S., Ribereau-Gayon, P. 1980. Relationship between the
sterol content of yeast cells and their fermentation activity in grape must. Appl
Environ Microbiol 39:808- 811.
Lauro, M. 2001. 2001. - Amylosis of barley starch. Espoo. Technical Research
Centre of Finland, VTT Publications 433. 45 p.
Leao, C., y Van Uden, N. 1982. Effects of ethanol and other alkanols on the glucose
transport system of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Bioeng. 24:2601-2604.
Leao, C., y Van Uden, N. 1984. Effects of ethanol and other alkanols on the general
amino acid permease of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Bioeng. 26:403405.
82

Leao, C., y Van Uden, N. 1984. Effects of ethanol and other alkanols on passive
proton influx in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta 774:4348.
Lees, N.D., Lotion, S.L., Woods, R.A., Bard, M. 1980. The effect of varied energy
source and detergent on the growth of steroi mutants of Saccharomyces cerevisiae.
J Gen Microbiol 118:209-214.
Linde, M., Galbe, M.,
Zacchi, G. 2008. Bioethanol production from non-starch
carbohydrate residues in process streams from a dry-mill ethanol plant. Bioresource

Technology 99: 65056511.
Maarel, M., Veen, B., Uitdehaag, J., Leemhuis, H., Dijkhuizen, L. 2002. Properties
and applications of starch-converting enzymes of amylase family. Journal of
Biotechnology 94: 137-155 p.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. 2003. Biologa de los microorganismos.
Dcima edicin. Editorial Prentice Hall. Espaa. 121-122p.
Mario, R. 1989. Seleccin de cepas de Aspergillus niger para la produccin de
amilosa. Trabajo de grado para optar el ttulo de Qumico Farmacutico. Universidad
Nacional de Colombia. Bogot, Colombia.
Mesas, J. M., y
Alegre, M. T. 1999. El papel de los microorganismos en la
elaboracin del vino. Cienc. Tecnol. Aliment 2 (4): 174-183p.

Millar, D. G., Griffiths-Smith, K., Algar, E., Scopes, R. K. 1982. Activity and stability
of glycolytic enzymes in the presence of ethanol. Biotechnol. Lett. 9:601-606.
Miller, L.G., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugars. Anal. Chem. 31 (3): 42264228.
Ming, C., Liming, X., Peijian, X. 2007. Enzymatic hydrolysis of corncob and ethanol
production
from
cellulosic
hydrolysate.
Biodegradation 59: 8589.
83
International
Biodeterioration
&

Moulin, G., Boze, H. Galzy. P. 1984. Inhibition of alcoholic fermentation. Biotechnol.
Bioeng. 25:365-382.
Navarro, M. A., y Sossa, D. P. 2003. Obtencin de etanol, a partir de almidn de
papa proveniente del sector agrcola. Requisito parcial para optar por el ttulo de
Microbilogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias.
Departamento de Microbiologa. Bogot, Colombia.
Norris, J., y Richomond, M. 1981. Essays in Applied Microbiology. Editorial: John
Wiley & Sons Ltd. Captulo 5.
NTC 5113. 2008. Compendio Normas tcnicas y guas de implementacin de
normas del sector bebidas alcohlicas. Instituto Nacional De Nomas Tcnicas y
Certificacin-ICONTEC. Bogot, Colombia.
NTC 5146. 2008. Compendio Normas tcnicas y guas de implementacin de
normas del sector bebidas alcohlicas. Instituto Nacional De Nomas Tcnicas y
Certificacin-ICONTEC. Bogot, Colombia.
Oates, C. G. 1997. Towards an understanding of starch granule structure and
hydrolysis. Trends in Food Science and Technology 8: 375382.
Ostergaard, S., Olsson, L., Nielsen, J. 2000. Metabolic Engineer of Saccharomyces
cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64 (1): 34-50p.
Owen, P. 1989. Biotecnologa de la fermentacin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza,
Espaa.
Panchal, C.J., y Stewart, G.G. 1981. Regulatory factors in alcohol fermentations. In:
Stewart GG, Russell I (eds) Current developments in yeast research. Pergamon
Press, Canada Ltd., 9-15 p.
Pedroza, A. 1999. Produccin de amilasa termoestable a partir de Thermus sp.
Tesis de maestra. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
Microbiologa Industrial. Bogot, Colombia. 18-19p.
84

Rhodes, A., y Fletcher, D. 1969. Principios de microbiologa industrial. Editorial :
Acribia S.A. Zaragoza Espaa.
Romero, A., Aguilar, S., Ruiz, A.A. 2005. Diseo del proceso de produccin de
alcohol carburante a partir de la planta de banano. Grupo de bioprocesos. Lnea de
investigacin en alcohol, GIBIOH. Universidad nacional de Colombia, facultad de
minas, Escuela de procesos y energa. Medelln, Colombia.
Routh, J.I., Eyman,
D.P., Burton, D.J. 1984. Compendio esencial de qumica
general orgnica y bioqumica. Segunda edicin. Editorial Revert. 427-467p.

Santander, M. C. 2006. Optimizacin de las concentraciones de urea y fosfato de
amonio en la produccin de alcohol a partir de miel Final y miel virgen de caa de
azcar empleando Saccharomyces cerevisiae. . Requisito parcial para optar por el
ttulo de Microbilogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de
ciencias. Departamento de Microbiologa. Bogot, Colombia.
Sarikaya, E., Higasa, T., Adachi, M., & Mikami, B. (2000). Comparison of
degradation abilities of - and -amylases on raw starch granules. Process
Biochemistry, 35: 711715.
Schlegel H.G. 1993. General microbiology. Sptima edicin. Cambridge University
Press. 234-244, 446-464p.
Shariffa Y.N., Karim, A.A., Fazilah, A., Zaidul, I.S.M. 2008. Enzymatic hydrolysis of
granular native and mildly heat-treated tapioca and sweet potato starches at subgelatinization temperature. Food Hydrocolloids 09:1-7.
Siqueira, P. F., Karp, S. G., Carvalho, J. C., Sturm, W., Rodrguez, L. J., Tholozan,
J. L., Singhania, R. R., Pandey, A., Soccol, C. R. 2008. Production of bio-ethanol
from soybean molasses by Saccharomyces cerevisiae at laboratory, pilot and
industrial scales. Bioresource Technology 99: 81568163.
Stryer, L. 1995. Bioqumica. Cuarta edicin. Editorial Reverte S.A. 451 p.
Thomas, D. S., Hossak, J. A., Rose, A. H. 1978. Plasma membrane composition and
ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol. 117:239-245.
85

Torres, C. 1999. Aislamiento, identificacin y caracterizacin fenotpica de
Zymomonas mobilis sp autctonas: Produccin de etanol con clulas inmovilizadas
en cultivo discontinuo. Requisito parcial para optar por el ttulo de Magister de
Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias.
Departamento de Microbiologa. Bogot, Colombia.
Tuite, M., Oliver, S. 1991. Saccharomyces cerevisiae. Editorial Plenum Press. New
York. 100-120p.
Varman, A. H.1997. Bebidas: tecnologa, qumica y microbiologa. Editorial Acribia
S.A. Zaragoza, Espaa.
Ward, O.P. 1991. Biotecnologa de la Fermentacin: Principios, Procesos y
Productos. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. 274 p.
White, J. 1995. Yeast Technology. Wiley & Sons. USA. 431 p.
86

BIBLIOGRAFIA COMO RECURSOS ELECTRNICOS
Fenalce. [en lnea] <http://fenalce.net/pagina.php?p_a=50> [12 agosto de 2008]

Reinier, A. N, 2005. [en lnea]. Alcohol Orgnico: Otra alternativa de diversificacin.
www.monografias.com/trabajos20/
alcoholorgnico/
alcohol-organico.htmL>
[01
agosto de 2008]
[en lnea] <www.ual.es/.../myco-ual/galeria04/figura8.htm> [15 septiembre de 2008]
87

10. ANEXOS
ANEXO 1. SOLUCIONES DE TRABAJO (NTC 5146, 2008)
1.1 Solucin de glucosa al 0.5% (p/v)
Pesar 0.5 g de glucosa anhidra r.a.
Disolver en agua destilada hasta completar un volumen de 100 mL.
1.2 Solucin A de Fehling
Disolver 34.639 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 .5H2O) en 500 mL

de agua destilada.
Dejar en reposo hasta que clarifique.
Filtrar empleando vacio, a travs de asbesto o de un filtro Gooch.
1.3 Solucin B de Fehling
Disolver 173 g de la sal de Rochelle (tartrato de sodio y potasio) y 50 g de

hidrxido de sodio (NaOH) en 500 mL de agua destilada.
Dejar en reposo hasta que clarifique (alrededor de 48 horas).
Filtrar empleando vacio, a travs de asbesto o de un filtro.
1.4 Solucin indicadora de azul de metileno al 1%
Pesar 1g de azul de metileno.
88

ANEXO 2. DETERMINACIN DEL PORCENTAJE DE ALMIDN (NTC 5146,
2008)
Pesar 10g de la muestra.
Adicionar 50 mL de HCl.
Poner en reflujo durante 5 horas.
Enfriar y neutralizar a pH 7 con NaOH 40%.
Pasar a baln aforado de 500 mL y completar volumen con agua destilada.
Filtrar si es necesario.
Titular la solucin de almidn con Fehling de acuerdo al numeral 5.4.1.
Clculo:
500xT
%Almidn=
VxM
T: ttulo de Fehling.
V: volumen gastado.
M: peso muestra.
89

ANEXO 3. METODO PARA RECUENTO CELULAR EN CMARA DE
NEWBAUER (Santander, 2006).
Tomar 1mL de la muestra a evaluar y depositarla en un baln aforado de 100

mL.
Agregar agua destilada al baln hasta el enrase, agitar y transferir el contenido a

un erlenmeyer de 125 mL.
Alegra al erlenmeyer 2 gotas de azul de metileno al 1% y homogenizar.
Limpiar cuidadosamente la cmara de newbauer y el cubreobjetos.
Colocar el cubreobjetos sobre la cmara de recuento.
Agitar el erlenmeyer con la muestrea.
Con un capilar se toma la muestra del erlenmeyer.
Llevar cuidadosamente la punta del capilar, junto a la unin del cubreobjetos y la

cmara de contaje.
Dejar fluir el lquido por capilaridad hasta llenar de muestra el rea de conteo.
Evitar la formacin de burbujas entre el cubre objetos y la cmara, o derramar

muestra fuera de la cmara y que esto es causa de errores del conteo real de
clulas de la muestra.
Si esto ocurre se debe lavar la cmara y reiniciar de nuevo el montaje.
Una vez montada la muestra en la cmara, llevar la cmara al microscopio y

enfocar en el rea de recuento con el objetivo de 10X.
Una vez enfocada el rea de recuento (Cuadro del centro), centrarla y pasarla al
objetivo de 40x.
El rea utilizada para el recuento corresponde a 1mm2, el recuento se puede

hacer de 2 formas:
Contando el nmero de clulas presentes en los 25 cuadros= 1/9 de la

cmara 1 mm2.
Contando 1/5 del rea de 1 mm2 o sea los cuatro cuadros de los
extremos y el cuadro del centro y el nmero obtenido se multiplica por 5.
Contar el nmero de clulas de la forma ya mencionada con ayuda de un

contador manual.
90
En nmero obtenido corresponde al nmero de clulas que hay en un rea de 1

mm2.
Clculos:
Concentracin celular (# de Clulas x 106/mL)= X * EC*D*F
X: # de clulas en 1 mm3
C: Espesor de la cmara = 10
D: Dilucin de la muestra = 100
F: Factor de conversin de mm3 a cm3 = 1000
91

ANEXO 4. TABLAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO HIDROLTICO
Tabla4.1 Concentracin de azcares reductores del proceso de hidrlisis.
Concentracin de
enzimas (mL/L)
AR (g glucosa/L)
Rendimiento de
hidrlisis (%)
42,6528
63,9792
10
44,8590
67,2884
15
48,1819
72,2728
20
59,1323
88,6984
25
43,3637
65,0455
Control de
comparacin
37,1689
41,8150
Control Negativo
2,5710
3,8565
92

ANEXO 5. FIGURAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO HIDROLTICO
Figura 5.1. (a) Aspecto fsico de los ensayos antes de la hidrlisis; (b) despus
de la hidrlisis.
93

Figura 5.2. Reaccin de hidrlisis de almidn con yodo.
94

ANEXO 6. TABLAS COMPLEMENTARIAS DE FERMENTACIN
Tabla 6.1 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae durante el ensayo
preliminar.
Tiempo
(horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)
Log Recuento celular

promedio (UFC/mL)
1,08E+06
6,033
1,18E+07
7,072
12
1,22E+08
8,086
24
1,30E+09
9,114
36
2,83E+09
9,451
48
2,88E+09
9,458
60
2,28E+09
9,357
72
1,73E+09
9,237
84
8,00E+08
8,902
Tabla 6.2 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 5 mL/L de

Multifect AA 21L y Multifect AA 23L.
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)

promedio (UFC/mL)
1,08E+07
7,033
12
3,45E+07
7,536
24
6,25E+07
7,796
36
5,75E+08
8,756
48
7,50E+08
8,871
60
7,10E+08
8,851
72
5,50E+08
8,739
84
4,15E+08
8,480
95

Tabla 6.3 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 10 mL/L
de Multifect AA 21L y Multifect AA 23L.
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)

promedio (UFC/mL)
1,08E+07
7,033
12
4,28E+07
7,630
24
6,05E+07
7,782
36
9,00E+08
8,954
48
1,98E+09
9,295
60
7,25E+08
8,860
72
5,50E+08
8,739
84
8,25E+08
8,916

Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)

promedio (UFC/mL)
1,08E+07
7,033
12
3,45E+07
7,536
24
6,25E+07
7,796
36
5,75E+08
8,756
48
7,50E+08
8,871
60
7,10E+08
8,851
72
5,50E+08
8,739
84
4,15E+08
8,480
96

Tiempo (Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)

promedio (UFC/mL)
1,08E+07
7,033
12
6,25E+07
7,536
24
7,63E+07
7,796
36
1,33E+09
8,756
48
2,15E+09
8,871
60
9,00E+08
8,851
72
9,50E+08
8,739
84
1,05E+09
8,480

Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)

promedio (UFC/mL)
1,08E+07
7,033
12
8,40E+07
7,924
24
9,30E+07
7,968
36
1,68E+09
9,224
48
2,35E+09
9,371
60
9,00E+08
8,954
72
1,03E+09
9,007
84
9,25E+08
8,962
97

Tabla 6.7 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada
malteada (control de comparacin).
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (clulas/mL)

promedio (clulas/mL)
1,08E+07
7,033
12
1,19E+08
8,074
24
1,29E+08
8,109
36
2,28E+09
9,357
48
2,33E+09
9,366
60
1,98E+09
9,296
72
1,43E+09
9,154
84
1,63E+09
9,211
Tabla 6.8 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada no

malteada (control negativo).
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)

promedio (UFC/mL)
1,08E+07
7,033
12
2,55E+07
7,405
24
2,88E+07
7,455
36
5,00E+08
8,699
48
7,75E+08
8,889
60
1,50E+08
8,151
72
1,50E+08
8,151
84
1,00E+08
8,000
98

Tabla 6.9 Datos concentracin de azcares reductores y consumo de sustrato
Concentracin de
enzimas (mL/L)
Azcares
Reductores
Iniciales (g/L)
Azcares
Reductores
Finales (g/L)
Consumo de
Sustrato
(g/L)
42,664
6,5052
36,159
10
44,912
6,6380
38,274
15
48,784
6,4723
42,312
20
59,625
6,2246
53,400
25
43,557
2,4734
41,084
Control de
comparacin
37,199
2,9914
34,208
Control Negativo
2,571
2,4124
0,159
Tabla 6.10 Datos biomasa mxima y tiempo de biomasa mxima
Concentracin de
enzimas (mL/L) Biomasa mx
promedio
(UFC/mL)
Log Biomasa
mx promedio
(UFC/mL)
Tiempo
Biomasa Max
promedio
7,30E+08
8,9020
54
10
1,98E+09
9,2953
48
15
1,83E+09
9,2609
48
20
2,15E+09
9,3320
48
25
2,35E+09
9,3707
48
Control de
comparacin
2,33E+09
9,3664
48
Control Negativo
7,75E+08
8,8891
48
99

Tabla 6.11 Datos concentracin de etanol y productividad producto/sustrato
Concentracin de
enzimas (mL/L)
% OH
Yp/s
3,015
0,083
10
3,435
0,090
15
4,44
0,107
20
5,02
0,095
25
2,98
0,073
Control de
comparacin
3,76
0,110
Control Negativo
0,43
3,217
100

ANEXO 7. GRFICAS COMPLEMENTARIAS DE FERMENTACIN
Grfica 7.1 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 5 mL/L de

10
Log UFC/ml
0
0
12
24
36
48
60
72
84
Tiempo (horas)

10
Log UFC/ml
0
0
12
24
36
48
Tiempo (horas)
101
60
72
84

9,5
9,0
Log UFC/ml
8,5
8,0
7,5
7,0
6,5
6,0
5,5
0
12
24
36
48
60
72
84
Tiempo (horas)

10
Log UFC/ml
0
0
12
24
36
48
Tiempo (horas)
102
60
72
84

10
Log UFC/ml
0
0
12
24
36
48
60
72
84
Tiempo (horas)
Grfica 7.6 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada

malteada (control de comparacin).
10
Log UFC/ml
5
0
12
24
36
48
Tiempo (horas)
103
60
72
84

Grfica 7.7 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada no
malteada (control negativo).
10
Log UFC/ml
0
0
12
24
36
48
Tiempo (horas)
104
60
72
84

ANEXO 8. FIGURAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO FERMENTATIVO
Figura 8.1. Sistema de incubacin del crecimiento y fermentacin de
Saccharomyces cerevisiae.
105

ANEXO 9. ANLISIS ESTADSTICO
Tabla 9.1. Resultados del anlisis de varianza (ANOVA)
Tabla 9.2 Resultados del analisis estadistico para la concentracin de

azcares reductores.
106

Tabla 9.3 Resultados del analisis estadistico para Biomasa
Tabla 9.4 Resultados del analisis estadistico para el tiempo de biomasa

mxima
Tabla 9.5 esultados del analisis estadistico del Consumo de sustrato
107

Tabla 9.6 Resultados del analisis estadistico para la concentracin de etanol
Tabla 9.7 Resultados del analisis estadistico de la productividad YP/S
108

ANEXO 10. COSTOS DE PRODUCCIN
Tabla 10.1. Clculos de los costos de etanol sin enzimas comerciales.

Materia
Prima
Carge
Valor
para
Presentacin
Total
10.000L
(Kilo)
(Pesos)
(Kilos)
Costo
Costo
Etanol
Litro
lote para
Producido
OH
10.000L
(Litros)
(Pesos)
(Pesos)
Cebada
Nacional
1.000
600
600.000
Cabada
Importada
3.500
600
2.100.000
Azcar
50
72.000
1.200
1.728.000
1.000
4.428
Tabla 10.2. Clculos de los costos de etanol con enzimas comerciales.

Valor 20
Valor
mL de
Presentacin
Total
Enzima
enzimas
(Litros)
(Pesos)
(Pesos)
Costo de
OH
Costo
enzimas
OH
producido
litro de
para un producido
para
alcohol
lote de
(%)
10.000L
(Pesos)
10.000
(litros)
Multifect
AA 21L
8.000.000
Multifect
AA 23L
40.000
800
5,02
40.000
800
8.000.000
109
502
15.936

ANEXO 11. FICHA TCNICA Multifect AA 21L
110
111

ANEXO 12. FICHA TCNICA Multifect AA 23L
112
113

ANEXO 13. FICHA TCNICA Saccharomyces cerevisiae
114

TESIS. Determinacion de Concentracion de Amilasas

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DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ALFA Y BETA AMILASAS

COMERCIALES EN LA PRODUCCIN DE ETANOL A PARTIR ALMIDN DE

LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ALFA Y BETA AMILASAS

LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ALFA Y BETA AMILASAS

LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA

HELBERTH ESPITIA RIVERA

IVONNE GUTIERREZ ROJAS

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ALFA Y BETA AMILASAS

LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA

El presente trabajo es el resultado del inters de la empresa Destilera Premier

MARCO TEORICO .................................................................................................... 19

Caractersticas generales ........................................................................................ 19

CEBADA MALTEADA ............................................................................................... 20

ALMIDON DE CEBADA ............................................................................................ 21

2.3.1.1 Amilopectina ............................................................................................................. 23

MTODOS HIDROLTICOS DEL ALMIDN ............................................................ 23

Mtodo qumico ........................................................................................................ 23

Mtodo enzimtico ................................................................................................... 24

2.4.2.1 -Amilasa .................................................................................................................. 27

PROCESO DE PRODUCCIN DE ALCOHOL ......................................................... 30

Sustrato: mosto ........................................................................................................ 30

Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae ....................................................... 31

2.5.2.1 Morfologa ................................................................................................................. 31

PRODUCCIN DE ALCOHOL EN DESTILERA PREMIER LTDA. ........................ 37

FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION .......................................... 39

MATERIALES Y MTODOS ..................................................................................... 41

DISEO DE LA INVESTIGACIN ............................................................................ 41

Poblacin de estudio ............................................................................................... 41

Enzimas y levadura .................................................................................................. 41

Multifect AA 21L y Multifect AA 23L son enzimas comerciales de Genencor

Proceso hidroltico del almidn .............................................................................. 42

5.2.1.1 Control de comparacin .......................................................................................... 43

Rendimiento del proceso de hidrlisis .................................................................. 44

Condiciones de fermentacin ................................................................................. 44

5.2.3.1 Pruebas preliminares ............................................................................................... 44

DETERMINACIN DE BIOMASA ............................................................................. 46

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE AZCARES REDUCTORES Y

Determinacin del ttulo de la solucin de Fehling. ............................................. 46

Valoracin de la muestra ......................................................................................... 47

5.4.2.1 Clculo de azcares reductores ............................................................................. 48

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ETANOL .................................. 48

5.5.1.1 Clculo de la gravedad especfica.......................................................................... 50

RECOLECCIN DE LA INFORMACIN .................................................................. 51

ANLISIS DE INFORMACIN .................................................................................. 51

RESULTADOS Y DISCUSIN .................................................................................. 52

CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS ............................................................... 52

PROCESO HIDROLTICO DEL ALMIDN DE CEBADA SIN MALTEAR .............. 53

ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIN ................................................................. 58

FERMENTACIN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE

Consumo de sustrato .............................................................................................. 66

Produccin de etanol ............................................................................................... 69

COSTOS DE PRODUCCIN .................................................................................... 73

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................... 78

Composicin del grano de cebada..20

Accin que ejerce sobre el almidn la fosforilasa, -glucosidasa,

Composicin tpica del mosto.30

Resumen del diseo experimental............42

Resultados de la concentracin de almidn realizados a la

Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso

Datos de la biomasa mxima alcanzada y el consumo de sustrato