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INTRODUCCIN
Las microalgas corresponden a uno de los microorganismos ms primitivos que aparecieron en nuestro planeta y tienen un rol
fundamental en la evolucin de la vida desde hace ms de dos billones de aos. La produccin de oxgeno microalgal contribuy en gran
medida a la formacin de la atmsfera de nuestro planeta, permitiendo el predominio de las formas de vida aerbicas, primer paso para
el surgimiento de las plantas y el origen de los diversos grupos de eucariotas.
Estos microorganismos presentan un rol ecolgico fundamental, ya que son el primer eslabn que sustenta la cadena trfica
marina contribuyendo a los procesos de produccin de los ecosistemas acuticos (revisado en Purvina y Balode, 2004). En los ambientes
terrestres, por otra parte, participan en la formacin del suelo, renovacin de la fertilidad y los ciclos biogeoqumicas (Gollerbah y
Shtina, 1969)).
Las microalgas han formado parte del quehacer del hombre desde tiempos remotos. Las proliferaciones masivas planctnicas en
la superficie del mar fueron reconocidas por algunos pueblos antiguos y registradas en la historia. La narracin contada en la Biblia
sobre la primera plaga de Egipto es una convincente descripcin de un bloom de dinoflagelados y su efecto sobre los peces en el Nilo. Las
tribus indias en el Pacfico noroeste posean conciencia de una conexin entre la bioluminiscencia en el mar durante la estacin clida, y
el envenenamiento de los mtilidos, probablemente producido por un bloom de dinoflagelados, al igual que pueblos indgenas en frica y
Australia conocan su naturaleza venenosa (Codd y cols. y cols.. 2005). Es hacia fines del siglo XIX cuando se inician estudios ms
detallados del comportamiento de estos florecimientos planctnicos de microalgas, incluyendo observaciones a travs del microscopio.
El primer informe cientfico que da cuenta de la naturaleza txica de cianobacterias fue escrito por George Francis, quien describi en
1878 la muerte de animales en el Lago Alexandrina en el sur de Australia (Francis 1878).

Sin embargo, las microalgas tambin han sido utilizadas de forma beneficiosa por el ser humano. Existen numerosos registros
histricos sobre sus usos en la alimentacin humana. Por ejemplo, los Aztecas utilizaban microalgas del gnero Spirulina (nombre
cientfico Arthrospira; Tomaselli y cols.y cols.. 1996) como parte habitual de su alimentacin. Alrededor del ao 1300 DC, cronistas
espaoles describieron como nativos recogan masas verde-azules desde el Lago Texcoco (Mexico), utilizndola para preparar una torta
seca conocida como tecuitlatl (Farrar 1966; Henrikson 1997). De la misma forma, durante siglos la poblacin local en la Republica de
Chad ha cosechado y usado la Spirulina, conocida en el Idioma local como dihe, en la alimentacin diaria (Ciferri 1983). La tribu de los
Kanembu, en el lago Chad, la utiliza actualmente en la preparacin de alimentos y adems es vendida en los mercados locales y
mayoristas (Abdulqader y cols.. 2000). Otras microalgas verde-azules filamentosas que han sido ampliamente utilizadas como alimento
en Asia pertenecen al gnero Nostoc. La microalga Nostoc commune forma colonias al principio esfricas, que luego se aplanan en forma
de grandes y gelatinosas hojas, las que son consumidas crudas, secas, fritas y en sopas, y tambin son usadas como espesante (Facciola
1998). Tambin muy utilizada en la cocina china y vietnamita, la microalga Nostoc flageliforme es especialmente popular durante la
temporada de fiestas (Takenaka y cols. 1998). Esta microalga, conocida tambin como fa cai o faat choi, crece muy lentamente en
forma de una alfombra adherida al sustrato en las regiones desrticas del norte y noroeste de China (But y cols. 2002). N. punctiforme es
tradicionalmente utilizada en la dieta humana en China, Mongolia y Amrica del Sur (Soeder 1980), en particular Nostoc es consumida
tambien por la comunidad nativa del Norte de Chile.
Adems de la variedad filamentosa, las microalgas unicelulares son tambin parte de la dieta humana. Aphanotheca sacro
(originalmente identificada como Phylloderma sacro) es otra microalga comestible que se consume en Japn y se conoce como ''suizenjinori (Fujishiro y cols. 2004). Algunas algas filamentosas verde (Spirogyra y Oedogonium) se utilizan tambin como componente de la
dieta en Birmania, Tailandia, Vietnam, y la India (Richmond 1986).

An cuando las microalgas pueden encontrarse como parte de la dieta normal de distintos pueblos y culturas, la obtencin de
biomasa microalgal es artesanalmente desde la naturaleza. El desarrollo de la ciencia y las aplicaciones tecnolgicas en el ltimo siglo
permitieron aproximaciones a la produccin de microalgas en laboratorio y su posterior escalamiento a la produccin masiva de estos
organismos.
Los primeros pasos en el cultivo de las microalgas se dan con el uso de Chlorella como modelo para el estudio de la fotosntesis, lo
que le vali en Premio Nobel de Medicina en 1931 al bioqumico alemn Otto Heinrich Warnburg. Como resultado de la Segunda Guerra
Mundial, la gente pensaba que el hambre en el mundo era un problema en crecimiento, donde las microalgas se vislumbraban como una
alternativa atractiva para obtener alimento de alta calidad nutricional a bajo costo. Las investigaciones cientficas de la aplicacin de las
microalgas fueron publicadas en el reporte Algal culture from laboratory to pilot plant (Burlew, 1953). Tamiya, en 1956, concluy que
la produccin de 1 tonelada de Chlorella poda costar cerca de US 520 dolares, pero no competa con la barata produccin plantas como
la soya, ricas en protenas (Tamiya, 1956). Sin embargo, la produccin de Chlorella ha sido un xito comercial en Japn y Taiwn, debido
principalmente a que los productos de esta microalga han sido introducidos como alimenticios favorables para la salud en el lejano
oriente.
Con el desarrollo de la tecnologa, el cultivo de microalgas ha tenido un importante desarrollo y su estudio ha iniciado una nueva
fase a travs de la utilizacin de los cultivos masivos para distintos propsitos.
Adems de su valor nutricional inherente, las microalgas son fuente de gran variedad de productos bioactivos de importancia
comercial como los cidos grasos poliinsaturados (PUFA) (Meireles y cols 2003, Kachroo y cols 2006), agentes antivirales naturales
(Kokk y cols 2010), antifngicos (Katircioglu y cols 2006) y pigmentos (revisado en Dufosse y cols, 2005), entre otros. El conocimiento
de las variadas propiedades de las microalgas ha despertado gran inters por estos microorganismos y muchas investigaciones se han
orientado ha desarrollar sus aplicaciones biotecnolgicas. Chlorella sp. se ubica entre las microalgas de mayor importancia econmica y

nutricional, adems de ser una de las ms estudiadas por su fcil adaptacin en condiciones de laboratorio. Spirulina sp ha sido tambin
utilizada como fuente de protena para la alimentacin de ganado y humano (Becker y Venkataraman 1984). Una de las lneas de
investigacin actuales en microalgas es la bsqueda y seleccin de cepas microalgales para la produccin de cidos grasos esenciales,
como el omega 3 (Carvalho y cols, 2005; Meireles y cols 2003; Hammond y cols, 2002; Otle y Pires, 2001; Barclay y cols, 1998; Cohen y
cols, 1995) y vitaminas (Pinto y cols, 2002; Barbosa y cols, 2005).
En Chile, cinco empresas producen microalgas (principalmente Spirulina), todas ubicadas en la zona norte. El 2003 se exportaron
13 toneladas de alga que implicaron US$ 129.751. Sus cultivos son desarrollados exclusivamente en sistemas tipo raceway el cual genera
limitantes para elaboracin de productos de mayor valor agregado. El desarrollo de la fase elaboradora es an incipiente siendo
necesario para esta industria, la incorporacin de tecnologa tanto en fase de cultivo como en procesamiento.
Como se puede ver hay una variedad de usos y aplicaciones en las cuales se pueden utilizar las microalgas, las cuales van desde la
utilizacin directa como alimento a partir de microalgas secas hasta la produccin de compuestos qumicos altamente elaborados por la
industria biotecnolgica. Sin duda estos microorganismos autotrficos son una veta an inexplorada en gran medida y que requiere la
pronta motivacin e incorporacin de talentos de jvenes y nuevos cientficos que incursionen en investigaciones que tiendan a
masificar el uso de microalgas para diversos fines que son de beneficio para la sociedad en los campos de la industria alimentaria y
farmacutica. Es particularmente importante de desarrollar este tipo de investigaciones en nuestros paises en vias de desarrollo lo cual
permitir generar nuevos emprendimientos para una incipiente industria biotecnolgica en estas latitudes.
El presente manual presenta, en un lenguaje muy sencillo, una visin sobre que son las microalgas, dnde se encuentran y su
potencial aplicacin desde la industria de alimento animal hasta su uso como fuente energtica.

Capitulo I: Proceso de Cultivo

1M
1Unidad

Cristina Ayala R, 1Jazmin Bazaes D, 1Yery Luza P, 1Paola Marticorena D, 1Claudia Seplveda V, 1,2Carlos Riquelme S.

de Microbiologa Aplicada, 2Laboratorio de Ecologa Microbiana, Facultad De Recursos Del Mar & Centro de Bioinnovacin, Universidad de Antofagasta, Av.
Angamos 601, Antofagasta, Chile. Email: uma@uantof.cl

1. Introduccin
En los ltimos aos se ha producido gran inters por el potencial biotecnolgico de las microalgas, principalmente debido a la
identificacin de diversas sustancias producidas por estos organismos. La inmensa biodiversidad y consecuente variabilidad en la
composicin bioqumica obtenida de los cultivos de microalgas, aliada a un mejoramiento gentico y un establecimiento de tecnologa de
cultivo a gran escala, van permitiendo que determinadas especies sean utilizadas con fines comerciales. En este sentido, los cultivos de
microalgas han sido realizados visualizando la produccin de biomasa tanto para uso en la elaboracin de alimentos como para la
obtencin de compuestos naturales con alto valor en el mercado mundial (Bianchini y cols, 2006).
El proceso de cultivo se inicia a partir de colonias algales axnicas mantenidas sobre medio solid con las que se siembran
cultivos lquidos de bajos volmenes,los que son mantenidos como ceparios y la vez sirven como inculo para el cultivo intermedio
(normalmente de 1 litro) dando asi inicio a un proceso que finalizar con la cosecha del cultivo para obtener la biomasa microagal
concentrada. Estas primeras etapas se inician en cmaras cerradas con luz y temperatura controlada y se consiguen producciones fijas
de microalgas en un estado fisiolgico ptimo.

Segn Borowitzka y Borowitzka (1988), estos organismos pueden ser cultivados en diversos sistemas de produccin, con
volmenes que varan desde pocos litros a billones de litros, siendo sistemas muy poco sofisticados, lo que va a determinar la
estandarizacin del proceso de cultivo para cada microalga utilizada.
La actividad acucola ha tenido un importante desarrollo en la ltima dcada en nuestro pas y el mundo, lo que va acompaado
de continuas demandas de alimento para suplir los requerimientos nutricionales de los organismos en cultivo (Riquelme y cols. 2003). El
mas abundante uso para el cultivo de microalgas es la industria acucola (Yepez de Leal & Silva 1997), aunque el desarrollo de alimento
artificial como sustituyentes de algas ha avanzada para muchas especies en cultivo (Cahu e Infante 2001; Lazo y cols. 2000; Holt 1993),
una gran cantidad de especies prefieren el alimento vivo, especialmente durante la etapa larval (Coutteau 1996; Takeuchi y cols. 2002;
Shields, 2001; Hagiwara y cols. 2001). La expansin de la industria acucola requiere tecnologas para la produccin de alimento (Rusch
y Christensen 2003).
Sin duda, el uso ms extendido de las microalgas es como base de la cadena trfica en la acuicultura, ya que son necesarias para el
alimento de larvas de peces, crustceos y moluscos o como alimento de las presas vivas que se utilizan en los distintos estadios larvarios
(Domnguez y cols., 2006). Sin embargo, algunos autores consideran que la calidad de las microalgas es un criterio totalmente subjetivo y
depende de los organismos que se estn alimentando y de las tcnicas y condiciones del cutlivo de las especies de inters comercial.
(Voltolina y cols. 1998)
El proceso por el cual se llega a obtener biomasa microalgal altamente concentrada va a depender de la especie de microalga a
cultivar y del resultado de interaccin entre los factores biolgicos, fsicos y qumicos (Raven, 1988).
Los factores biolgicos estn relacionados a las tasas metablicas de la especie cultivada y va depender de la influencia de otros
organismos sobre el desenvolvimiento microalgal. En cuanto a los factores fisico-quimicos, los ms estudiados corresponden a la
iluminacin, temperatura, salinidad y disponibilidad de nutrientes (revisado en Bianchini y cols 2006). La productividad microagal va

estar limitada adems por el control de los distintos parmetros de cultivo como lo son: inculo, agitacin, fuentes de carbono, calidad
del agua, evaporacin del sistema y pH. La separacin de la microalgas del lquido de cultivo tambin ha sido un problema para el
desarrollo del cultivo a gran escala de las microalgas.
Por otro lado, el costo asociado al empleo de microalgas vivas en operaciones de acuicultura constituyen un problema cuando se
requiern de manera masiva, lo que ha llevado a numerosas investigaciones cuyo objetivo es preservar las microalgas para su posterior
empleo en la alimentacin de las diferentes especies acucolas. Por ejemplo, algunas especies de diatomeas pueden ser almacenadas
hasta tres aos a bajas temperaturas (5 C) y oscuridad, para despus ser transferidas a un medio fresco y comenzar su crecimiento
(Jaime-Ceballos y cols, 2006). El almacenamiento de microalgas para su posterior utilizacin presentan muchas ventajas cuando se
estn cultivando larvas de animales marinos, ya que reduce la dependencia de los cultivos frescos para alimentacin y disminuye los
riesgos de prdida total de larvas por algn motivo que impide el buen desarrollo del cultivo del fitoplancton (Buitrago, 1988).
Las mltiples aplicaciones de las microalgas promueven la necesidad de generar a travs de actividades informativas y cientficas,
estrategias de trabajo a corto o mediano plazo que permitan la conservacin del medio ambiente y la generacin de ingresos a partir de
la produccin industrial (Albarracn 2005). Sin embrago, el mercado de produccin de biomasa o pastas microalgales es incipiente ya
que una de las grandes dificultades es la produccin de biomasa significativa, dondeestandarizar el proceso de cultivo es el objetivo
principal para la obtencin biomasa microalgal en forma constante y controlada.

Microalgas dulceacucolas.
La distribucin de microalgas de agua dulce depende no solamente de la accin selectiva del medioambiente fisicoqumico sino
que tambin de la habilidad del organismo a colonizar determinado medioambiente (Watanabe M. 2005). Sin embargo, el aislamiento y
cultivo de estas microalgas en el laboratorio requiere de condiciones particulares, que permitan imitar favorablemente los
requerimientos de nutrientes de los individuos y, por otro lado, establecer los parmetros ecolgicos para cada tipo de cultivo. De
acuerdo al World Catalogue of Algae publicado por Komagata y cols (1989), existen cerca de 11.000 cepas de microalgas, clasificadas en
3.000 especies, las que son mantenidas en 40 colecciones de cultivos representando a 16 pases. El nmero de especies cultivables es
menor del 10% de aquellas especies descritas, por lo tanto nuevos intentos deben hacerse en determinar los medios de cultivos ms
adecuados para cada especie, y esto est a menudo basado en la qumica del hbitat o los requerimientos especficos de nutrientes por
las algas.
Microalgas marinas
Uno de los medios de cultivo ms utilizados y recomendados por su amplio espectro de uso en algas marinas es el medio f/2 y
variaciones (Guillard y Ryther 1962, Guillard 1975), diferentes versiones de medio Erdschreiber (e.g., Medio Plymouth Erdschreiber), y
ESNW (segn sus siglas en ingls: Enriched Seawater Natural Seawater o agua de mar natural enriquecida, en castellano) parecen
dominar las citas (Berges y cols.2001). La familia de los medios-K (Keller y cols. 1987) ha sido especficamente desarrollada para
especies marinas oligotrficas (ocenicas), y dos nuevos medios ocenicos, MNK y Pro99 (Moore y cols. 2007), ofrecen promisorias
mejoras. Medios ms especie-especficos que son frecuentemente usados incluyen la familia del medio L (Guillard y Hargraves 1993,

Guillard 1995), GPM y variaciones (Sweeney y cols.. 1989 modificado por Loeblich 1975 y Blackburn y cols.. 1989), y medio para
cianobacterias ocenicas, SN (Waterbury y cols.. 1986).
Es difcil proveer un set comprensivo de recomendaciones de cual medio de cultivo es mejor para ciertas especies. Un buen punto
de inicio es utilizar el mismo medio de cultivo en el cual la especie est siendo mantenida y de donde fue obtenido en las colecciones de
cultivos (ver sitios web de colecciones de cultivos). En trminos de vitaminas hay una importante consistencia entre los medios:
tiamina, biotina, y B12 son normalmente adicionadas en similares concentraciones, aunque podran no ser requeridas. Para algunos
medios especficos la esterilizacin por autoclave puede evitarse debido a la descomposicin de las vitaminas y, aunque existen especies
que requieren vitaminas, son viables de crecer con los productos degradados (Ver McLachlan 1973). Una estrategia prctica es agregar
las vitaminas filtrndolas luego de autoclavar el medio, de esa manera uno puede asegurarse que todo el medio est estril y las
microalgas contarn con los nutrientes que requieren.

2. Obtencin De Clulas Microalgales


El cultivo de microalgas consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan
multiplicarse de forma controlada. Los procesos o caminos establecidos para la obtencin de biomasa microalgal en cantidades
econmicamente factibles se denominan Mtodos de Cultivo. El mtodo de cultivo comienza con la preparacin del material necesario
para iniciar el aislamiento de la especie de inters, es por ello que se debe conocer cuales son los requerimientos previos de las
microalgas en general, mecanismos de esterilizacin de los materiales, esterilizacin de medios de cultivo, tcnicas de masificacin del
cultivo y finalmente cuales son las opciones de cultivo microalgal (cultivo continuo, semicontinuo y discontinuo.

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Recoleccin de la muestra
El mtodo de colecta es crucial para el xito, debido a que clulas daadas o muertas provocan el fracaso. Si la especie objetivo es
bien conocida y si ha sido colectada y estudiada previamente, entonces el investigador tiene experiencia substancial para guiar el
proceso de coleccin. El uso de redes de plancton o botellas Niskin Go-Flow (General Oceanics Inc.), depender del lugar de colecta de la
muestra, ya que otras variables pueden afectar la sobrevivencia de las especies objetivos. Muchas especies ocenicas son
particularmente sensibles a la colecta y a la concentracin celular. Muestras colectadas a mayor profundidad pueden ser sensibles a la
presin, luz o cambios de temperatura. El investigador debe invertir ms tiempo tratando de encontrar las especies objetivos en
muestras diludas, ya que en esas condiciones la clula es usualmente viable. Las muestras naturales a menudo contienen zooplancton
que se alimenta de algas yuna vez concentrados, estos animales pueden rpidamente comer las algas contenidas. Para ello es necesario
remover prefiltrando gentilmente la muestra, permitiendo el paso de las algas y no de los animales, cuidando de no daar o provocar
desecacin de las muestras. El tiempo es un factor importante cuando se aislan algas. Algunos organismos mueren despus de 1 hora o
unas pocas horas despus del muestreo, para lo cual el aislamiento debe hacerse rpidamente. La aplicacin de buenas tcnicas de
esterilizacin tambin es importante cuando se colectan muestras, ya que vasos, matraces, mangueras, redes, sistemas de filtracin
sucios y/u otros dispositivos de muestreo pueden contener cystos, que contaminen las muestras. Los microscopios de diseccin e
invertidos son los ms usados. Los microscopios de diseccin tienen buenos lentes e iluminacin permitiendo ajustar las muestras
celulares hasta hacerlas claramente visibles. Los microscopios invertidos tienen alejado el condensador para proveer fcil acceso cuando
se usa micropipetas y placas multipozo. Los cultivos enriquecidos en placas multipozo y unicultivos algales aislados son fcilmente
monitoreados con este tipo de microscopio, y las clulas pueden ser aisladas directamente desde los pozos.

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Metodologas de aislamiento de microalgas


El primer paso para un aislamiento exitoso es comprender e imitar las condiciones naturales en las que se encuentran las
microalgas en el medioambiente. En el caso de las algas marinas costeras, la temperatura y la salinidad son importantes, mientras que
para el fitoplancton ocenico la calidad del agua y la toxicidad de metales son componentes adicionales. El conocimiento taxonmico de
la especie objetivo tambin es importante. Las diatomeas requieren silicio, los euglenoides requieren amonio, y otros gneros requieren
selenium (e.g. Chrysochromulina). Especies mixotrficas, como ciertos dinoflagelados y crysofitos, requieren de una fuente bacteriana de
alimento.
El segundo paso lo constituye la eliminacin de contaminantes, especialmente de aquellos que puedan competir con la especie
objetivo. Las tcnicas de dilucin, aislamiento de clulas aisladas por micropipeteo, y siembra en estras sobre placas de agar son
ampliamente usados.
El paso final requiere lograr el crecimiento contnuo de los cultivos subsecuentes. No es raro que la especie objetivo crezca en las
etapas iniciales de aislamiento, pero luego muera despus de una o ms transferencias a medio de cultivo fresco. Esto a menudo indica
que el medio de cultivo carece de un elemento particular o compuesto orgnico, el cual no se manifiesta inmediatamente. Adems estos
mismos organismos podran acumular desechos que envenenan su medio causando la muerte, o provocan la aparicin de otros
organismos que metabolizan aquellos compuestos (e.g. Bacterias).
El aislamiento de clulas desde una colecta natural de algas microscpicas produce cultivos monoespecficos, sin embargo la
preparacin de cultivos axnicos requieren paciencia y perseverancia. Los medios enriquecidos son comnmente usados como un paso
preliminar en el aislamiento de clulas nicas, adicionando nutrientes a la muestra de agua natural, lo cual permite favorecer el
crecimiento de las algas contenidas en una muestra (Ver Medios de cultivo).

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a) Aislamiento de clulas mediante micropipetas


El mtodo ms comn es el aislamiento por micropipetas, realizada con una pipeta Pasteur o un capilar de vidrio. La pipeta Pasteur
puede ser calentada, extendida y quebrada. Con una practica mnima, esta tcnica se hace fcil y rpida, pero el principiante debe gastar
tiempo practicando antes de producir micropipetas adecuadas. La forma de hacer estas pipetas es calentando el extremo delgado
rotando suavemente en un mechero sujetado en el extremo con unas pinzas hasta llegar al punto de fundicin del vidrio, posteriormente
la pipeta es removida del fuego y se estira hasta producir un delgado tubo (Fig. 1.1).
Figura1.1. Preparacin de una micropipeta a partir de una pipeta
Pasteur. a) La pipeta es sujeta en el extremo mas caliente por unas
pinzas. La pipeta debe ser rotada a medida que se derrite el vidrio. b)
Una vez que el vidrio se vuelto suave es removida rapidamente del fuego
y estirada para producir un tubo fino. C) las pinzas deben ser
relocalizadas apropiadamente en la regin delgada del tubo. D) con las
pinzas se dobla cuidadosamente el tubo hasta que se quiebre, formando
la micropipeta. E) Este tipo de corte mostrando bordes irregulares no es
adecuado. F) una punta larga con un corte recto es adecuado para usar.
Note que el dimetro de la punta tan largo como el flagelo de una clula
flagelada, as se reduce la posibilidad de que varias clulas entren a la
micropipeta durante la aislacin.

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El objetivo del aislamiento por micropipeta es recoger una clula desde una muestra, depositandola sin daarla en medio de
cultivo estril. Un microscopio es necesario para observar y aislar las clulas. La muestra conteniendo la especie objetivo puede ser
dispuesta en un portaobjeto, portaobjeto escavado, placas multipozo o contenedores similares. Se deben preparar con anticipacin
goteros estriles y el medio de cultivo nuevo. Una manguera flexible es adherida a una boquilla en un extremo y la micropipeta o capilar
al otro. El operador coloca la boquilla en la boca cubriendo con la lengua un extremo y se acerca al organismo objetivo con el tubo fino,
succionando suavemente de manera de permitir que la accin capilar absroba a la clula al interior de la micropipeta. Despus de
capturar la clula, la micropipeta es removida y se dispone en el medio nuevo contenido en un tubo de ensayo, placas multipozo, etc.
Mediante el movimiento suave de la micropipeta la clula es descargada en el segundo medio de cultivo estril. A continuacin se
examina microscpicamente la muestra extrada (Fig 1.2). Este procedimiento es repetido solo hasta que una nica clula sea aislada de
las otras clulas. (Andersen & Kawachi, 2005)

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1
Gota

Figura 1.2. Aislamiento mediante Microfishing. Paso 1, muestra


problema disuelta en medio estril; Paso2, identificacin de la clula a
aislar; Paso 3, traspaso a las siguientes gotas para su dilucin; Paso 4,
traspaso de la clula a

un tubo de cultivo estril

Protocolo de Aislamiento por micropipeteo (Microfishing):

Sobre un portaobjetos limpio, deposite una gota de la muestra, si est demasiado densa diluir con una gota de medio de cultivo
(figura 1.2.1).

Sobre otro portaobjeto, deposite 4 gotas separadas de medio de cultivo para el lavado de la muestra.Con la ayuda del microscopio
enfoque la gota de la muestra e identifique la especie deseada (figura 1.2.2).

Tome un microcapilar, ubique su extremo en el campo visual sobre la gota, dirjalo sobre el blanco elegido y asprelo rpidamente
por capilaridad. Dirija suavemente el lquido retirado en la gota estril N 1. Verifique bajo aumento si la especie est presente
(figura 1.2.3). Con un nuevo capilar retomar la clula de la gota N 1 y transfirala a la gota N 2, para el segundo lavado, repita ste
procedimiento una dos veces ms hasta el ltimo lavado (gota N 4) (figura 1.2.3).

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Si la clula parece bien aislada y sigue viable, tomarla por ltima vez con un microcapilar nuevo y expulsarlo dentro de un tubo
inclinado con medio de cultivo adecuado (figura 1.2.4). Otra opcin es quebrar el extremo del micro capilar que contiene la clula
aislada y depositarlo en el tubo con medio de cultivo (figura 1.2.4).
b) Aislamiento con Uso de Agar
Una de las metodologas utilizadas es la siembra extendida de la muestra microalgal, es decir, inocular el lquido directamente al

agar y expandirlo con un asa de vidrio (Fig 1.3). Para lograr un aislamiento exitoso, la microalga debe ser capaz de crecer sobre este
medio. Algunos flagelados (e.g., Heterosigma, Pelagomonas y Peridinium) no crecen sobre agar, pero otras (e.g., Chlamidomonas, Pavlova,
Synura, Navicula y Tetraselmis) crecen muy bien en agar. La mayora de las diatomeas y chlorarachniophytes crecen muy bien sobre
agar, no tanto los dinoflagelados. El agar es tambin un buen medio para hongos y bacterias. Estos microorganismos crecen rpido,
contaminando las muestras. Si se observan hongos en las placas selladas con parafilm, es mejor descartar las placas sin abrirlas, ya que la
presencia de esporas podran producir mayores complicaciones Las bacterias usualmente producen colonias pequeas y bien limitadas.
Es posible obtener un cultivo unialgal si la placa ha sido estriada apropiadamente. (Fig 1.4). Un asa de siembra con una pequea
cantidad de muestra, se dispersa a travs del agar en diferentes formas o patrones. Normalmente, el inculo en el asa de siembra tiene
muchas clulas que no estn separadas, por lo que se aumenta la distancia de las estras desde el origen de manera de ir aislando las
clulas hasta obtener una sola clula (Fig.3) Luego, la placa de agar es incubada hasta que las colonias de clulas aparezcan. Los tiempos
de incubacin varan desde unos pocos das para muestras de suelo y agua dulce hasta varios meses para especies ocenicas. Cuando la
coloniaaparece sobre el agarpueden ser dispuestas en medio lquidos o slidos.

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Figura 1.3. Tcnica siembra extendida.

Protocolo Siembra Extendida

Limpie con alcohol la superficie de trabajo y sus manos (secuencia 1).

Deposite sobre la superficie de una placa petri una gota o 0.1 ml de la determinada dilucin (secuencias 2 y 3).

Esterilice el cayado o asa de vidrio mediante un flameado en el mechero (4).

Enfre el cayado oasa de vidrio flameado en la tapa de la placa petri, con movimientos suaves (5).

Extienda la gota con ayuda del cayado o asa de vidrio en todas direcciones hasta que se observe completamente seco (6).

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Figura 1. 4. Aislamiento por siembra estriada.

Protocolo Siembra Estriada:

Limpie con alcohol la superficie de trabajo y manos.

Esterilice el asa de siembra, flamendola con el mechero y luego enfre (Fig 1.4)

Tome una muestra y extienda sobre un rea pequea de la placa petri en forma de estras pequeas (secuencia 1 y 2).

Tenga cuidado de hacer estras muy juntas y con poca presin para no daar el agar nutritivo (3).

Despus de terminar la 1 estra, prosiga con la segunda hasta completar la placa petri (4)

Repita sucesivamente este proceso, flameando u enfriando el asa al comienzo de la toma de cada muestra.

Incube la placa en forma invertida (5).

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c) Tcnica de Dilucin
Esta tcnica es efectiva cuando los organismos son muy abundantes en las muestras pero muy ineficiente en individuos raros o en
baja concentracin. El objetivo del mtodo de dilucin es depositar solo una clula en un tubo de ensayo, matraz, o pozo de una placa
multipozo, estableciendo clulas nicas aisladas. Si la concentracin aproximada es conocida, entonces es fcil calcular la dilucin
necesaria, sobre la base de la probabilidad para un pequeo volumen (por ejemplo una gota, 50L, 1mL) que contendr a una sola clula
de la muestra. En la prctica, algunas contienen mas de una clula y otras no contienen clulas del todo. La tcnica de dilucin es quizs
la mas frecuente cuando se intenta cultivar especies algales aleatorias desde muestras de terreno, a menudo con el objeto de descubrir
nuevas especies. La tcnica puede ser variada en diferentes formas: Primero, la dilucin puede hacerse con medio de cultivo, agua
destilada, agua de mar, agua filtrada o alguna combinacin de estas. El medio de cultivo puede fortalecer a algunos organismos o no
permitir el crecimiento de otros presentes en menor concentracin. Segundo, estimar la concentracin en la cual se obtendr el cultivo a
nivel unialgal. Comnmente se inocula un gran nmero de tubos, asumiendo que algunas clulas morirn, algunas contendrn dos o ms
especies, y que algunos no recibirn clulas. Tercero, elementos como amonio o selenio pueden ser adicionados en algunos tubos de
aislamiento para seleccionar especies determinadas que requieran ciertos nutrientes. De manera similar, se pueden experimentar
diferentes temperaturas, rgimen de luz u otros parmetros. Los aislados axnicos no son obtenidos a menudo con la tcnica de dilucin
ya que las bacterias normalmente son ms abundantes que las microalgas presentes (Fig 1.5).

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Figura 1.5. Tcnica de dilucin. Una alcuota es removida desde la


muestra original y colocada en tubos de ensayo conteniendo medio
estril. Despus de mezclar una alcuota es removida desde el tubo y
dispensada en las placas multipozo conteniendo medio estril, y una
segunda alcuota es adicionada al siguiente tubo de ensayo con medio
estril. El ciclo se detiene cuando se hace probable que no haya clulas a
transferir.

Protocolo de Aislamiento por diluciones

Se toma 1 ml de la muestra microalgal y se suspende en 9 ml de agua de mar filtrada y autoclavada sta sera la primera
dilucin rotulada como -1, que quiere decir que la muestra microalgal problema esta diluida 10 veces.

A partir de esta dilucin (-1), se toma 1 ml de muestra y se agregua a 9 ml de agua de mar filtrada y autoclavada,
correspondiendo en esta ocasin a una dilucin -2.

Realice este procedimiento 4 veces, obteniendo una un factor de dilucin de 10000 o 10 -4.

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d) Separacin por gravedad: Centrifugacin.


La separacin por gravedad puede ser efectiva para particionar grandes y pequeos organismos y los dos principales mtodos
son la centrifugacin y el asentamiento. La centrifugacinse utiliza frecuentemente para concentrar organismos en cultivos unialgales. El
objetivo es separar las clulas grandes y pesadas de las algas y bacterias. Una centrifugacin a baja velocidad durante corto tiempo trae
grandes dinoflagelados y diatomeas a formar un holgado pellet y las clulas pequeas pueden ser decantadas. Las clulas objetivos
entonces pueden ser resuspendidas, y si es necesario se repite el proceso. Sin embrago, una excesiva centrifugacin puede daar las
clulas, especialmente aquellas con organelos eyctiles. Esta tcnica es efectiva para concentrar grandes clulas, pero es difcil obtener
cultivos unialgales, por lo tanto se emplea en combinacin con otras tcnicas descritas (Andersen & Kawachi, 2005).

2. Escalamiento De Cultivo
El cultivo microalgal comienza con la obtencin de la cepa aislada y posterior mantencin de un stock en pequeos recipientes,
mantenidos en condiciones axnicas para ser utilizados en el escalamiento de cultivo, el cual se refiere bsicamente a ir aumentando
gradualmente el volumen de cultivo, con el objeto de obtener la mayor cantidad celular para su posterior cosecha.
El escalamiento comienza con el denominado cultivo primario, ste se lleva a cabo en matraces erlenmeyer de 150 250 mL,
generalmente en volmenes de 60 y 100 mL de cultivo respectivamente; el medio de cultivo se esteriliza mediante calor hmedo y sin
aireacin. Al tiempo de obtener la mxima densidad celular (segn la especie y su curva de crecimiento), se procede al traspaso de un
volumen de cultivo fresco (inculo) a recipientes de mayor volumen. El siguiente nivel del escalamiento ser el Cultivo

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Semiintermedio, el cual se realiza en bolones de fondo plano de 1 - 2 litros y matraces erlenmeyer de 2 litros, los volmenes de cultivo
fluctan entre 500 1600 mL. En este caso se recomienda la utilizacin de aireacin leve en recipientes con volmenes superiores a
1000 mL y la esterilizacin del medio de cultivo al igual que el cultivo primario se realiza mediante calor hmedo (autoclave). En el
cultivo intermedio, los recipientes utilizados son botellones de polietileno de 20 litros de capacidad. Estos cultivos son realizados en
volmenes de 17 litros con una aireacin que permita la mezcla de nutrientes y la utilizacin adecuada de la luz. El ltimo nivel del
escalamiento es el cultivo masivo, el cual se puede realizar tanto en invernaderos con condiciones de luz y temperatura controladas,
como al aire libre, siendo en este caso la eleccin del lugar uno de los principales factores a considerar. Es necesario un clima apropiado,
buen suministro de agua, en calidad y cantidad, y adems fuente de energa disponible. En el caso de microalgas marinas, el agua puede
ser natural o artificial. Para el cultivo masivo se pueden utilizar estanques o piscinas (race-way), bolsas y reactores cilndricos. En
cualquiera sea el caso hay factores a considerar en el diseo sistema de cultivo:
1. Columna de agua: La profundidad del cultivo debe ser la ptima para permitir la penetracin de la luz a toda la columna de agua.
2. Revestimiento: Las superficies de estanque o reactores deben ser lisas, para favorecer la circulacin del lquido y evitar el
estancamiento de las clulas en ranuras o pliegues.
3. Evaporacin: Esto cambia las condiciones del medio de cultivo, las cuales pueden ser perjudiciales para el cultivo. Para
minimizar la evaporacin se recomienda la utilizacin de revestimientos trasparentes en las piscinas o estanques.
4. Agitacin: Al igual que en el cultivo semiintermedio e intermedio, la agitacin del cultivo permite un aprovechamiento
homogneo de los nutrientes y luz por parte de las clulas. En estanques la agitacin suele ser por paletas o hlices, en el caso de
los reactores es mediante la incorporacin de aire.

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Cualquiera sea el nivel en el que se est trabajando, el traspaso o escalamiento se realiza previa verificacin de las condiciones en
las que se encuentre el cultivo, siendo necesario conocer la densidad celular y as inocular el volumen adecuado al siguiente nivel.
Generalmente, las densidades de inculo van entre 1E +04 a 5E +04 cel/mL; las densidades finales y el tiempo de cultivo va a depender
de la especie, entre 7E +05 a 3E +06 cel/mL y un tiempo entre 6 a 8 das aproximadamente.

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OBTENCIN
CEPARIO
- Matraces erlenmeyer.
- Sin aireacin.
- 7-8 das de cultivo.
- traspaso a volmenes
iguales o superiores.

Cultivo primario 100 -150 mL


- Matraces erlenmeyer. Bolones fondo plano.
- Aireacin.
7-8 das de cultivo.
- traspaso a volmenes iguales o superiores.

Cultivo semiintermedio 500 1600


mL
- Estanques (race-way).
- Reactores.
- Agitacin mediante paletas o
hlices.
- 8-12 das de cultivo.
- listo para la cosecha

- Reactores, botellones y bolsas.


- Aireacin
- 7-8 das de cultivo
- Slo traspaso a volmenes superiores

Cultivo Masivo > 400 litros.


Cultivo intermedio 18 50 litros

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3. Tcnicas de Recuento
A continuacin se hace una descripcin breve de los mtodos que se utilizan para determinar el nmero de clulas presentes en
una muestra de microalgas.
a) Hematocitmetro o Cmara de Neubauer
Mediante una pipeta Pasteur o una micropipeta se toma una muestra de microalgas (10-20 l) y se desliza en la cmara de Neubauer que
previamente tiene adherido el cubreobjetos (Fig 1.6), se deja pasar 5~10 minutos para que la muestra se estabilice; se procede a contar
utilizando un contador de mano (Fig 1.7).

Figura 6.- Conteo celular en homatocmetro.

Figura 7.- Cuadrantes de la cmara de conteo.

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En algunos casos es necesario diluir la muestra cuando la densidad es alta y tambin fijarla cuando la microalga es mvil, siguiendo
los siguientes pasos:
1. Se toma un millitro de la muestra.
2. Se aade un mililitro de agua de mar filtrada ya preparada con formaldehdo al 4%.
3. Se deja reposar por tres minutos.
4. La muestra se homogeniza con una Pipeta Pasteur.
5. Se cuentan las clulas de cada una de las cmaras.
Una vez que se tiene el promedio de clulas de las cmaras, el clculo total de clulas por mililitro se lleva a cabo de la siguiente
manera:
N de Clulas = (F.D.) (P.H.) (1,000) (N.P.)

F.D.: factor de dilucin


m = Muestra problema (ml)
f = Agua de mar con formaldehdo
P.H.: Profundidad del Hematocmetro, est incluida en la parte inferior derecha de la cmara
N.P. = Nmero promedio de clulas por ml
Todo el clculo se multiplica por 1,000 para convertir a mililitros.

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b) Densidad ptica
Mediante el uso de un espectrofotmetro es posible determinar la concentracin celular de una muestra por densidad ptica. Para
esto, es necesario calibrar primero el equipo con el medio de cultivo utilizado, asignndole el valor de 0 absorbancia o densidad ptica.
Con diluciones decrecientes de la muestra se determina el nmero de clulas para cada una y se realiza una curva de calibracin. Para
esta curva, se determina la absorbancia de cada dilucin preparada, lo que se graficar posteriormente de manera que en el eje de las
absisas se indica la concentracin de la muestra (en nmero de clulas por ml) y, en el eje de las ordenadas, se indica la densidad ptica o
absorbancia. La longitud de onda escogida para trabajar depender de la especie de microalga que se est caracterizando. De esta
manera, es posible determinar la densidad tpica de diferentes muestras, ya sea a travs del grfico de la curva de calibracin o
utilizando la ecuacin de la recta determinada para esta curva. Este procedimiento es particular para cada especie.
c) Volumen Celular
Es posible determinar la cantidad de clulas o de biomasa de la muestra (peso/volumen , p/v o w/v en ingls) por centrifugacin,
donde se descarta el sobrenadante y el pellet puede ser pesado hmedo o seco (3-4 das en estufa a 40-40C).
d) Composicin Qumica
En algunos estudios se puede determinar la concentracin de clorofila A, B y otros pigmentos presentes en la muestra. Debe
considerarse que la composicin qumica del fitoplancton vara de acuerdo al tipo de cultivo usado, medio nutritivo y otros factores por
lo que es necesario realizar un anlisis proximal de la especie en estudio en relacin al tipo de cultivo desarrollado.

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4. Medios De Cultivo
Uno de los mtodos ms importantes para la identificacin de microalgas es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales, preparadas en laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es denominado medio de cultivo y
el crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Se han diseado muchos medios de cultivo diferentes, siendo varios de ellos
desarrollados y usados para el aislamiento y el cultivo de microalgas tanto de agua de mar como de agua dulce.
La forma de cultivo microalgal ms usual es aquella en la que una disolucin acuosa de volumen limitado es mezclada en forma
equilibrada, conteniendo los nutrientes orgnicos e inorgnicos en concentraciones necesarias: una base mineral, una fuente de carbono,
nitrgeno y azufre, adems de una atmsfera adecuada las cuales permiten un buen crecimiento de microalgas.En sta se inocula un
nmero relativamente pequeo de clulas y se expone a condiciones favorables de luz y temperatura. Podemos mencionar que el agua
de mar enriquecida es la base para la preparacin de muchos medios de cultivos de microalgas marinas, empezando con las frmulas
ms sencillas basadas en la de Miguel, hasta las mezclas actuales ms complejas.
Es importante considerar, cuando se examinan recetas para medios de cultivo, que diferentes microalgas pueden poseer
requerimientos nutricionales distintos. Por ello, para tener xito en el cultivo de una determinada microalga, es necesario conocer estos
y suministrarle nutrientes esenciales en la forma y proporciones adecuadas; entonces, si se es cuidadoso en la preparacin de stos es
bastante fcil cultivar microorganismos en el laboratorio.
Por otro lado, la modificacin del medio de cultivo ha sido un mtodo ampliamente utilizado para incrementar la produccin de
biomasa o variar su composicin. A partir de medios descritos en la literatura, la mayor parte de los estudios han utilizado la estrategia
de la modificacin cuantitativa en los nutrientes suministrados. As, se han obtenido variaciones importantes en la productividad y

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composicin bioqumica modificando la concentracin de nitrgeno, fsforo o la relacin entre ellos. El contenido y composicin de
cidos grasos, vitaminas y aminocidos libres tambin vara con las condiciones de nutrientes del medio.

Naturaleza qumica de los medios de cultivo.


En general, el medio de cultivo debe proporcionar los requerimientos mnimos de la especie a cultivar, pudiendo utilizarse
medios no definidos qumicamente (naturales y/o enriquecidos) o medios definidos (artificiales) , los que se emplean con mayor
frecuencia . En la literatura existen listas de medios definidos que han sido utilizados por diversos investigadores para cultivar variados
grupos de microalgas, se utilizan tambin para el estudio de requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles.
Dichos medios se preparan aadiendo al agua destilada, cantidades precisas de compuestos orgnicos o inorgnicos altamente
purificados, por ello se conoce la composicin qumica exacta. Estos medios pueden ser preparados en laboratorio o adquirirse
comercialmente y tienen la ventaja de soportar el crecimiento de un gran nmero de especies de microalgas; por otra parte, si estos
medios son muy ricos en compuestos orgnicos se corre el riesgo de contaminacin con bacterias ms fcilmente que los inorgnicos. Un
medio de cultivo no definido (enriquecido) es un medio preparado con agua de mar limpia y filtrada para eliminar el material
particulado o en suspensin, a la que se aaden algunos compuestos que los organismos necesitan en cantidades grandes en relacin a
su concentracin en el agua de mar. Estos medios son bastante sencillos: contienen fuentes de nitrgeno, fsforo, silicio y hierro; los ms
sofisticados contienen adems mezclas de metales traza y vitaminas y se utilizan para microalgas que tienen grandes exigencias
nutricionales. Los medios definidos naturales y/o enriquecidos pueden prepararse en estado lquido

y/o slido. Como agente

solidificante se usa agar al 1,5 o 3% (p/p). Las ventajas de trabajar con un medio slido son las siguientes: se inmovilizan las unidades
algales, se pueden separar las unidades algales de otros organismos que puedan interferir con su crecimiento y se proporcionan

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nutrientes y otras condiciones favorables para su multiplicacin. La desventaja es el problema de contaminacin con bacterias y hongos,
problemas que se minimizan si se trabaja en condiciones aspticas.
Microorganismo a cultivar.
Los diversos tipos de nutricin organotrfica en microorganismos fotosintticos estn relacionados con la utilizacin de energa
luminosa y CO2, adems de los compuestos orgnicos asimilados. El carbono puede aportarse a las microalgas en forma muy diversa
dependiendo del tipo de metabolismo que posean y es utilizado por los microorganismos para sintetizar los compuestos orgnicos
requeridos para las estructuras y funciones de la clula. Algunas microalgas son capaces de crecer en condiciones de fotoautotrofa,
esto significa que los organismos obtienen la energa necesaria para realizar sus funciones metablicas utilizando la luz y componentes
inorgnicos, de esta manera sintetizan los esqueletos carbonados de los metabolitos orgnicos; en condiciones de mixotrofa los
organismo utilizan una fuente de carbono orgnico y energa luminosa como fuente de electrones y en condiciones de heterotrofa los
organismos requieren de una fuente de carbono orgnico y pueden crecer en la oscuridad. Las fuentes de carbono orgnico ms
comnmente citadas son el etanol, el acetato y la glucosa.
Utilizacin u objetivo del cultivo.
Algunos cultivos estn dirigidos a la obtencin de biomasa microalgal enriquecida con sustancias de inters comercial. Entre
estas sustancias se destacan los pigmentos, tales como la clorofila a y los carotenoides, vitaminas, protenas, cidos grasos
poliinsaturados, y compuestos bioactivos. La biomasa microalgal tambin es una fuente alternativa con alto contenido proteico: los

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cultivos de microalgas se han empleado en la alimentacin de animales, humanos, en acuicultura para la cra de microcrustceos, para
tratamiento de aguas residuales y como fuente energtica, adems de contribuir a la eliminacin de desechos. La mayor parte de la
biomasa microalgal se comercializa como alimentos medicinales, en forma de tabletas y cpsulas; adems se estn incluyendo sus
extractos, como suplemento, en algunas pastas, vinos, refrescos, cereales y cosmticos.
En algunos casos se requieren cultivos unialgales o puros (aquellos cultivos que contienen una sola especie de alga), y este tipo de
cultivo se puede iniciar con un solo individuo o con varios, conteniendo adems bacterias. Los cultivos axnicos o puros absolutos son
aquellos exentos de bacterias.
Otros cultivos realizados en medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que, brindan resultados
constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento,
las principales frmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de EndSchereiber de 1934, y Medio f/2 Guillard que es utilizado para un gran nmero de especies unicelulares.
Estado del medio de cultivo.
Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios
lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en laboratorio. Los medios lquidos son una solucin acuosa que incluyen los nutrientes
que las microalgas precisan: una fuente de carbono y una fuente de nitrgeno. Adems el medio de cultivo debe aportar una fuente de
energa qumica, que puede proceder de un compuesto inorgnico u orgnico. Favorecen mucho el desarrollo y la multiplicacin de las
microalgas porque al difundirse stas por todo el medio encuentran con facilidad las sustancias que necesitan para nutrirse y son de
gran utilidad para la realizacin de mltiples pruebas, a diferencia de los medios slidos o semislidos los cuales llevan un agente

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solidificante: agar. El agar es un polisacrido acdico elaborado a partir de ciertas algas Rodofceas que gelifica por debajo de 45 C, ste
se utiliza a una concentracin en una proporcin por encima del 15% (15 g/L) para medio slido y 0.7 o 3 % (0.7-3 g/L) para medios
semislidos. La utilidad del agar en el medio de cultivo es al da de hoy irreemplazable, porque hasta ahora no se ha encontrado otro
agente solidificante con las ventajas que tiene el agar. En estado slido el agar se nos muestra con un aspecto blanco tendiendo a lo
amarillento. No es soluble en agua a 25 C, pero s lo es en agua a 100 C y en formamida y lo ligeramente en etanolamina. Asimismo, su
equilibrio elctrico se desplaza en solucin, ultimando sales como sulfato de magnesio, de sodio o de amonio, causa de la precipitacin
parcial de la agaropectina. En estos medios slidos o semislidos las microalgas crecen con mayor dificultad, pues los nutrientes se
agotan con rpidez en el punto donde se desarrollan; no obstante, nos permite el aislamiento, purificacin y visualizacin de su
crecimiento.
Requerimientos nutricionales.
As como las microalgas requieren de factores fsico-qumicos para su crecimiento tambin requieren de factores nutritivos. Entre
estos ltimos son relevantes los macronutrientes, que son utilizados para sintetizar compuestos orgnicos y los micronutrientes, usados
como catalizadores. En trminos generales los macronutrientes son el carbono, nitrgeno, fsforo, silicio, magnesio, potasio y calcio, que
se requieren en cantidades relativamente grandes, cada especie de microalga responde ante la disponibilidad y proporcin de estos
macronutrientes y en el caso especfico de las diatomeas la disponibilidad de slice, mientras que los llamados micronutrientes como el
fierro, manganeso, cobre, zinc, sodio, molibdeno, cloro y cobalto se necesitan en menores cantidades. El crecimiento microalgal se rige
por la ley de mnimo, es decir, el factor limitante del crecimiento es aquel que est presente en cantidades ms prximas al mnimo
crtico necesario.

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Los macronutrientes agregados a los medios de cultivo pueden ser muy diferentes Normalmente deben encontrarse en
cualquier medio de cultivo nitrgeno, fsforo y silicio, sin embargo, el silicio es requerido slo en las diatomeas, silicoflagelados, y
algunas crisofceas. Tambin se considera el dixido de carbono en forma de carbonatos o bicarbonatos. Estos macronutrientes son
generalmente requeridos en una proporcin de 16N:16Si:1P; en ambientes marinos estas proporciones a menudo son similares, excepto
en algunos estuarios donde hay entradas de nitrgeno y fsforo.
Las microalgas presentan la capacidad de utilizar diferentes sustratos como fuente de nitrgeno. No obstante, en funcin del
estado de xido-reduccin del nitrgeno, ste ser asimilado por diferentes rutas metablicas que requerirn un diferente gasto del
poder reductor y energa generados durante la fotosntesis. As, la fuente de nitrgeno se ha descrito como un factor que puede afectar al
crecimiento y composicin bioqumica de una microalga en cultivo. Algunas investigaciones sealan que el reparto del carbono fijado
fotosintticamente entre las fracciones proteicas, glucdica y lipdica, difiere en funcin de la fuente de nitrgeno asimilada, en relacin a
esto, microalgas marinas pertenecientes a distintas clases taxonmicas pueden utilizar nitrato, nitrito, amonio incorporada como NH4Cl
o urea como nicas fuentes de nitrgeno, a su vez la utilizacin de diferentes fuentes de nitrgeno afecta a la capacidad de carga de los
distintos medios, de esta manera nitrato y fsforo son normalmente adicionadas como NaNO 3 y NaHPO4. En algunos medios, el fsforo
agregado como glicerofosfato de sodio y puede precipitar como una sal de calcio y elevar la temperatura del medio. El silicato es
adicionado como Na2SiO3 debido a que el cido del slice aumenta la precipitacin, es til omitirlo del medio si la especie no requiere el
silicato.
Los micronutrientes corresponden a los metales que intervienen en el enriquecimiento del agua de mar. Las concentraciones de
stos compuestos varan segn la formula del medio que se trate. Se recomienda utilizar sales hidratadas para facilitar su dilucin
cuando se prepara la solucin de metales traza. Estos metales son agregados en forma quelada, siendo el Na 2EDTA el principal quelante

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y con el se evitan precipitados durante la combinacin de las sales. El cobalto, cobre, magnesio, molibdeno, zinc, selenio y nquel se
pueden preparar por separado como soluciones stocks primarios y diluir, para luego formar parte de una solucin stock de trabajo.
Las tres vitaminas mayormente utilizadas en orden de importancia en el crecimiento de las microalgas son: vitamina B12
(cianocobalamina), vitamina B1 (tiamina) y vitamina B7 vitamina H (biotina) son requeridas generalmente en cultivos de microalgas
axnicas, ellas son usadas en muy bajas concentraciones y almacenadas a temperatura de congelamiento. Pueden ser adicionadas
aspticamente al medio esterilizado a travs de filtracin con membrana 0.2 m o autoclavada.
La vitamina B12 (cianocobalamina) ha sido reconocida como un componente necesario para el crecimiento de muchas
microalgas; aunque su rol metablico no es claro, evidencias de estudios recientes sugieren que es un cofactor principalmente para la
metionina sintetasa (Croft y cols. 2005). Esta vitamina es estable en forma de polvo y contiene un 12% de humedad. En la preparacin
de los medios pueden usarse ampollas que contienen 10 mg del compuesto, para lo cual se prepara una solucin stock primaria de
cianocabolamina disolviendo el contenido de una ampolla en agua destilada. Se ajusta el pH a 4.5 con HCl y se diluye a un volumen
determinado. Ella tambin puede ser filtrada con membrana millipore. Se debe almacenar la solucin a 20 C esta vitamina resiste los
recongelamientos y reautoclavados.
La vitamina H (biotina) es estable en forma de cristal y contiene un 4% de humedad la solucin stock primaria se prepara
pesando lo requerido. Su acidificacin la vuelve estable para el autoclavado.
Por otro lado, la cantidad de vitamina B1 (tiamina) requerida puede diluirse en la solucin de biotina y ajustar a pH 5.5 puede
autoclavarse en esta condicin y guardarse a -20C. Las 3 vitaminas pueden combinarse para formar una solucin stock de trabajo hasta
para mil diluciones. Cuando se prepara un medio se agregan las vitaminas en forma asptica por filtracin a travs de membranas de
0,22 um, aunque ellas son frecuentemente autoclavadas con el medio, por que su condicin cida permite su autoclavado.

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Requerimientos fsicos-qumicos.
Las microalgas requieren diferentes requerimientos fsico-qumicos, entre los que se destacan la luz, temperatura, salinidad, pH y
CO2.
a) Temperatura.
No slo afecta las reacciones celulares, sino tambin los requerimientos nutricionales y la composicin de la biomasa, as como la
solubilidad de los gases en el agua, la que tiene un rango ptimo: un incremento en ella estimula el crecimiento hasta el mximo y
despus disminuye. La temperatura puede cambiar segn el tipo, especie y variedad de microalga, se puede mantener un margen de 1825 C. Cada especie tiene un ptimo, normalmente alrededor de 20-22 C, por debajo de los 16 C se ralentiza mucho el crecimiento y
por encima de 30 C hay muerte de microalgas. Para tener un cultivo en buenas condiciones, se debe mantener en salas atemperadas,
sobre todo en volmenes pequeos (10-100 litros). Slo interesa mantener la temperatura por debajo de 18 C cuando se hace
referencia a cepas puras, para mantenerlas en las condiciones ms axnicas o estriles posibles.
b) pH
La respuesta de las microalgas al pH vara ampliamente, debido a que este factor determina la solubilidad del dixido de carbono
y de los minerales en los cultivos e influye directa o indirectamente en su metabolismo. El pH ptimo est entre 7 y 8, el agua de mar
tiene un pH de 8,2-8,3. Si se diluye el agua de mar, entre otras cosas puede haber una acidificacin ms o menos importante. Se deben
aadir sustancias para mantener este pH por encima de 7, aadiendo carbonatos o suministrar en el aire de burbujeo un aporte de CO2,

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que pasa a H2CO3. Cuando se agota el CO2 por consumo de las microalgas provoca una disminucin de pH. Para mantener estos valores,
se debe aadir CaCO3.

c) Aire
Dentro de estos factores hay que considerar en los cultivos masivos la aireacin, ya que es un factor muy importante para la
homogenizacin de los nutrientes y para evitar la sedimentacin de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en lugares donde el
agua no se mezcla, esto tambin depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento. Otro
factor importante es la penetracin de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz
incidente no es suficiente para la fotosntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetracin de la luz
es ms efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es
recomendable la inyeccin de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosinttico. El crecimiento y la divisin celular son afectados por
la intensidad de la luz y el fotoperodo (horas de iluminacin y oscuridad) en relacin tambin a la temperatura, por ejemplo en
Diatomeas a 20 C y 1.000 lux se obtiene un crecimiento favorable.
d) Luz
La luz afecta el crecimiento de las microalgas de forma que, a mayor intensidad de luz, responde con un incremento del nmero
de clulas pero se satura. Puede usarse cualquier tipo de luz (da o fluorescente). Hasta avolmenes de 400 litros se usan tubos de luz
fluorescentes. En volmenes superiores, se usan invernaderos. La respuesta a la luz continua es buena (24 h de luz). Depende del
volumen que haga falta, pudiendocombinarse las dos cosas. Normalmente, en la produccin intensiva se trabaja con menos de 200 litros.

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Con menos litros, los luxs son ms altos que a volmenes elevados. Los tubos fluorescentes son la forma ms barata y no se aconseja que
se incremente mucho la temperatura del medio.
Hay que tener en cuenta que, cuando las microalgas estn asociadas a bacterias en la naturaleza (no axnicas), se ejerce una
interaccin que puede ser beneficiosa para ambos, de manera que la microalga es capaz de asimilar productos de la actividad bacteriana
en el medio. As mismo, la flora microbiana asociada est implicada en la regulacin de parmetros fisiolgicos como pH, temperatura y
salinidad. En cambio, en condiciones axnicas, las microalgas no llegan a alcanzar un crecimiento ptimo, por carecer de la flora
microbiana asociada, la cual le aportar factores esenciales para estimular el crecimiento. Los cultivos axnicos de microalgas de inters
en biotecnologa pueden ser utilizados para fines farmacolgicos y de nutricin humana, mientras que los cultivos no axnicos en los
cuales se mantiene la flora bacteriana asociada, pueden ser seleccionados para acuicultura, nutricin animal o para biofertilizantes. Sin
embargo, la respuesta de las microalgas para cada condicin de cultivo es susceptible de ser modificada en funcin de diversos
parmetros de cultivos.
Es posible incluir el uso de antibiticos cuando se quieren eliminar del cultivo las algas verde-azules contaminantes. En este caso,
debe tenerse precaucin en la concentracin del antibitico a usar ya que concentraciones muy altas pueden inhibir el crecimiento de
algas eucariontes. Si el investigador est interesado en aislar algas verde-azules fijadoras de nitrgeno, deber eliminar la fuente de
nitrgeno del medio de cultivo; como este elemento es esencial para la mayor parte de las algas, slo se desarrollarn aqullas capaces
de fijar nitrgeno atmosfrico.

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Preparacin del medio de cultivo.

Los medios son generalmente preparados en soluciones stock previamente mezcladas, para simplificar su preparacin, luego,
alcuotas desde stos son medidas y agregadas a un volumen dado de agua destilada. Sin embargo, algunos medios son preparados
pesando o midiendo el componente que se requiere y agregando esto directamente a un volumen de lquido (agua de mar, agua dulce o
agua destilada segn sea el caso de la microalga que quiere cultivarse), ya que la combinacin directa de varias soluciones stock de
trabajo sin diluir en agua pueden causar una precipitacin. Las soluciones stock pueden ser preparadas y almacenadas a bajas
temperaturas por un largo perodo de tiempo, pero siempre hay que tener cuidado con el recipiente donde se almacena: deben usarse
recipientes con tapa de vidrio, ste debe tener un sellado firme para evitar la evaporacin ya que esta influye en la concentracin del
determinado stock. Siempre es aconsejable preparar las soluciones stock en el momento que se vaya a realizar un experimento, ya que
algunos procedimientos incorrectos pueden causar precipitaciones, por ejemplo, de nitratos y fosfatos.
Los componentes qumicos usados para preparar los medios deben ser de buena calidad, la que esta determinada por la pureza
de los compuestos. Uno de los puntos mas importantes a considerar en la preparacin de los medios de cultivo es la precisin requerida
en la pesada de los compuestos; para ello, se debe contar con una balanza analtica.
En general, los recipientes de cultivo utilizados son de vidrio, y dentro de stos, los de borosilicato son los preferidos. En
experimentos de nutricin, particularmente para individuos que contienen impregnaciones de slice, como es el caso de las diatomeas y
silicoflagelado, no es recomendable el uso de material de vidrio, ya que ste contiene silicios solubles. En estos casos, se recomienda
recubrir el recipiente por ejemplo con parafina, o usar recipientes de plsticos desechables (poliestireno), los cuales vienen esterilizados
de fbrica. En la actualidad, es posible conseguir accesorios para cultivo de policarbonato con tapa de polipropileno, que tienen la
ventaja de ser esterilizados por autoclave. Los recipientes de cultivo ms comnmente usados son de materiales no txicos como las

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placas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos
a gran escala los recipientes de plstico, madera y concreto son los ms recomendables, incluyendo los estanques rsticos en reas
rurales son los sistemas ms econmicos.
Como se seal anteriormente, el material ms utilizado para preparar los medios es el vidrio, que puede ser reutilizado as que,
el proceso de limpieza no debe producir dao a los recipientes. Cuando el material de vidrio est extremadamente sucio, se recomienda
lavar con una solucin de cido crmico o sulfocrmico y luego lavar con abundante agua corriente. Para terminar la limpieza y
neutralizar los recipientes de vidrio es recomendable utilizar un detergente especial, el que debe eliminarse con enjuagues sucesivos de
agua corriente y, finalmente, con agua destilada. Si los recipientes de vidrio son nuevos y no vienen estriles de fbrica, deben
sumergirse en una solucin diluida de cido clorhdrico para remover lcalis libres presentes. El instrumental de vidrio que no se limpie
con detergente, o que su limpieza sea difcil de efectuar debe sumergirse en solucin concentrada de cido clorhdrico saturado con
cido ntrico (conocida tambin como agua regia por su capacidad de disolver el oro).
Una vez limpios los recipientes se procede a la preparacin de los medios de cultivo, sta es una labor que ha de hacerse
cuidadosamente y por ello se eligen tcnicas y mtodos lo ms sencillos y rpidos posible, que evitan el riesgo de que cualquiera de sus
componentes se contamine con otras sustancias o sufra un tratamiento fsico que altere sus caractersticas: recoger el agua de zonas lo
ms limpia posible, libre de sedimentos finos, comprobar que la salinidad es la adecuada, almacenarla en recipientes que no sean txicos
para la especie que se va a cultivar, filtrarlas por filtros de poro de 0.45 m para eliminar las partculas en suspensin. La filtracin
puede hacerse con varios tipos de filtros, segn se empleen para filtrar grandes o pequeas volmenes de agua de mar y segn sea el
tamao de poro requerido. Para volmenes grandes, los ms usuales son los filtros cilndricos, de diferentes poros y materiales,
incluidos en una carcasa a travs de la cual circula el agua. Normalmente los filtros de poros grandes, entre 100 y 10 m, e incluso hasta
1 m son de algodn fibra sinttica entrelazada. Los filtros de poro pequeo, entre 0.45 m y 0.2 m son de fibra de vidrio o de

39

membranas steres de celulosa. Ninguno de ellos es lavable, por lo cual deben eliminarse una vez que se hayan saturado. Para pequeos
volmenes se usan filtros de membrana, que son pequeos discos de 2.5 a 4.7 cm. de dimetro, de steres de celulosa o de compuestos,
que se colocan en equipos de filtracin especiales a los que se acopla una bomba de vaco para acelerar la filtracin. Los poros ms
frecuentes en estos filtros son de 0.45 y 0.22 m.
Luego de ser agregado el medio de cultivo a los recipientes, stos deben sellarse, mediante un algodn hidrfobo envuelto en un
trozo de gasa, el que permite una buena aireacin y evita el ingreso de contaminantes. Es posible tambin usar tapones de goma. Ambos
tipos de tapones pueden ser reutilizados despus de un proceso de esterilizacin. En algunos casos, dependiendo del tipo de goma, stas
deberan ser hervidas en una solucin de fosfato trisdico y luego enjuagadas abundantemente con agua destilada. Tambin existen los
tubos de ensayos que tienen tapas metlicas o de plstico autoclavable para la mantencin cultivos unialgales por perodos prolongados
de tiempo, evitando la contaminacin y retardando la evaporacin. Tambin se pueden utilizar con este propsito lminas de papel de
aluminio, paraplast, parafilm, alusafoil y alusaplus. El xito de un cultivo en particular ser la mejor recomendacin para la eleccin del
material utilizado.

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Algunos Ejemplos De Medios De Cultivo (extrado de http://www.fao.org/docrep/field/003/ab473s/AB473S02.htm)


Medio CHU10 (O. Umebayashi, 1975)

MEDIO ENRIQUECIDO

Recomendado para aislamiento de microalgas de hbitats

Medio Miguel o Agua de Miguel (Allen-Nelson, 1910)

oligotrficos y eutrficos.
Solucin A
Ca (NO3)2.............................. 0.04%

KNO3....................................... 20.2 g

K2HPO4................................. 0.01%

H2O.......................................... 100 ml

Na2CO3.................................. 0.02%
MgSO4 * 7H2O...................... 0.025%

Solucin B

Na2SiO3.................................. 0.025%

Na2HPO4 * 12H2O.................. 4 g

Citrato de Fierro Amoniacal... 0.005%

CaCl2 * 6H2O ........................... 4 g

Para medio solidificado puede usarse:

HCl concentrado........................ 2 ml

Agar-Agar............................. 1.0%

FeCl3.......................................... 2 ml
H2O............................................ 80 ml
Agregar 2 ml de la solucin A y 1 ml de Solucin B a un litro de
agua de mar y calentar a 70C por 20 minutos.

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Medio Erd-Sahreiber enriquecido (Foyn, 1934)

Medio Erd-Schreiber
Agua de mar................................... 1 litro

NaNO3..........................................10 mg

Extracto de suelo............................ 50 ml

Na2HPO4 * 12H2O......................2 mg

NaNO3............................................ 0.2 g

Extracto de suelo..........................5 ml

Na2HPO4 * 12H2O.......................... 0.03 g

Agua de mar...............................100 ml

Yanase & Imai (1968) para cultivar Monochrysis lutheri, Platymonas sp., Nitzschia closterium, Chaetoceros calcitrans.
NaCl............................... 18 mg

Metal mix

Vitamina mix

KC.................................. 600 mg

Na2EDTA........ 100 mg

B12................. 10 ug

NaNO3............................ 500 mg

Fe..................... 1 mg

Biotina........... 50 ug

MgSO4 * H2O................. 5 g

Zn..................... 0.5 mg

B1................... 5 mg

Ca (as Cl-)...................... 100 mg

Mn.................... 4 mg

H2O................ 50 ml

K2HPO4.......................... 30 mg

Co..................... 0.01 mg

Metal Mix*..................... 30 ml

Cu..................... 0.004 mg

Fe (as Cl-)....................... 100 ug

B....................... 20 mg

Tris...................................1 g

H2O................... 100 ml

Vitamina B12 .................. 3 ug


Na2SiO3...........................1 ml
Vitamina mix *................1 L

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MEDIO DE CULTIVO (Agua Dulce) (Stein, 1979).

c. Vitaminas (Solucin C):

Se toma 1 ml de cada solucin (A, B y C) y se adicionan a 1 litro

Tiamina. HCl............................... 0.1 mg/l

de agua esterilizada

Biotina......................................... 0.5 g/l

Macronutrientes (Solucin A):

Cianocobalamina......................... 0.5 g/l

CaCl2 * 2H2O.............................. 36.76 g/l


MgSO4 * 7H2O........................... 36.97 g/l

Se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada.

NaHCO3...................................... 12.60 g/l


K2HPO4....................................... 8.71 g/l

d. Tris:

NaNO3......................................... 85.01 g/l


Na2SiO3 * 9H2O.......................... 28.42 g/l

Tris (Hidroximetil)-Aminometano.....50.g
H2O destialda.................................... 200 ml

Micronutrientes (Solucin B):


Na2EDTA....................................4.36 g/l

Una vez preparado el medio de cultivo, se debe hacer ajuste de

FeCl3 * 6H2O...............................3.15 g/l

pH a 7.2 con HCl cuidadsamente para no obtener el pH cido.

CuSO4 * 5 H2O........................... 0.01 g/l


ZnSO4 * 7H2O............................ 0.022 g/l
CoCl2 * 6H2O............................. 0.01 g/l
MnCl2 * 4H2O............................ 0.18 g/l
Na2MoO4 * 2H2O.............. ........ 0.006 g/l

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MEDIO MET 44 (Schone & Schone, 1982) Para microalgas

Medio Guillard F/2 (Stein 1979) Ajustar a pH 8.0 con 1 M

marinas de la Familia Bacillariophycea

NaOH o HCl. Esterilizar en autoclave

NaNO3........................................ 3.4 mg
Na2HPO4 *12H2O....................... 0.925 mg
Na2SiO3 * 9H2O........................... 0.803 mg
FeSO4 * 7H2O............................ 60.0 g
MnCl2 * 4H2O............................ 14.4 g
Vitamina B12............................... 0.5 g
Biotina......................................... 0.5 g
Tiamina-HCl............................... 0.5 g
Agua de mar.................................1 L
NOTA: La solucin stock de Fierro y Silicato debe de
acidificarse un poco con una gota de Acido Sulfrico
concentrado, y la solucin de EDTA debe acidificarse con Acido
Clorhdrico. El EDTA puede ser adicionado antes que el Fierro.

NaNO3................................... 0.075 g
NaH2PO4 * 2H2O.................. 0.00565 g
* Elementos trazas................ 1 ml
* Vitamina mix.................... 1 ml
Agua de mar......................... 1 l
Elementos trazas
Na2 EDTA................................ 4.16 g
FeCl3 * 6H2O........................... 3.15 g
CuSO4 * 5H2O......................... 0.01 g
ZnSO4 * 7H2O......................... 0.022 g
CoCl2 * 6H2O.......................... 0.01 g
MnCl2 * 4H2O.......................... 0.18 g
Na2MoO4 * 2H2O.................... 0.006 g
H2O destilada........................... 1 l

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Stock de Vitaminas
vitamina B12............................ 0.0005 g
vitamina B1............................... 0.1 g
biotina....................................... 0.0005 g
H2O destilada........................... 1 l
Medio Mnimo (Sueoka, 1960) para el cultivo de Chlorella.

Solucin Trazas: Diluir 1 ml en 1 L de agua destilada

Solucin 1: Diluir 25 mL en 1 L de agua destilada

EDTA ................................. 50.00

NH4Cl..................................16.00

ZnSO4 * 7H2O................... 22.00

CaCl2 2H2O........................2.04

H3BO3................................. 11.40

MgSO4.............................................4.00

MnCl2 * 4H2O..................... 5.06


FeSO4 * 7H2O..................... 4.99

Solucin 2: Diluir 25 mL en 1 L de agua destilada

CoCl2 * 6H2O...................... 1.61

K2HPO4.............................. 37.42

CuSO4 * 5H2O.................... 1.57

KH2PO4.............................. 14.52

(NH4)6Mo7O24..................... 1.10

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Medio de cultivo Zarrouk (1966) para el cultivo de Spirulina


Concentracin g/L

Solucin A5 + Co *

NaHCO3 ..................... 13.61

H3BO3....................... 2.86 g/l

Na2CO3........................ 1.03

MnCl2 * 4H2O ........... 1.81 g/l

K2HPO4........................ 0.50

ZnSO4 * 7H2O.......... 0.22 g/l

NaNO3......................... 2.50

NaMoO4 * 2H2O........ 0.39 g/l

KSO4............................ 1.00

CuSO4 * 5H2O............ 0.079 g/l

NaCl.............................. 0.20

Co(NO3) 2 * 6H2O...... 0.049 g/l

MgSO4 7H2O ................ 0.04


CaCl2 2H2O................... 0.01
FeSO4 7H2O................... 0.05

Solution B6 *

Sol A5 +CO * ................1 ml

VOSO4 * 5H2O...............49.6 g/l

Sol B6 * .........................1 ml

K2Cr2(SO4)4 * 2H2O..... 96 g/l


NiSO4 * 7H2O................ 47.8 g/l
Na2WO4 * 2H2O............ 17.9 g/l
TiOSO4.......................... 33.3 g/l
Co(NO3)2* 6H2O........... 44.9 g/l

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5. Esterilizacin De Materiales Para Un Cultivo


Tanto el agua como los recipientes a utilizar para el cultivo microalgal requieren de tratamientos previos para la remocin de
agentes contaminantes al cultivo, agentes que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento del normal del
microorganismo deseado. Los sistemas clsicos para la esterilizacin se dividen en: Mecanismos de calor (calor seco y calor hmedo),
filtracin, esterilizacin electromagntica (radiacin UV) y desinfeccin qumica (hipoclorito de sodio, alcohol 70%). El sistema clsico
para esterilizar los medios de cultivo en pequeos volmenes (hasta 5 litros) es la autoclave. En el caso de cultivos superiores a los 20
litros la filtracin mecnica, radiacin UV y desinfeccin mediante hipoclorito de sodio son los tratamientos utilizados para el
tratamiento del agua.
El principal objetivo de esterilizar el agua de cultivo es la eliminacin de materia orgnica, partculas, plantn, zooplancton y
bacterias.
Esterilizacin por Calor
a)

Calor seco
Es utilizado para la esterilizacin del material de trabajo (material de vidrio y metal), este procedimiento se debe realizar previo a

la preparacin del cultivo y consiste en la exposicin del material a temperaturas que varan entre 120 180C, segn el tiempo de
exposicin. Generalmente el tiempo de mas utilizado es a 160C por un periodo de 2 hrs.

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b)

Calor Hmedo (Autoclave)


El autoclavado es el mecanismo mas efectivo y comnmente utilizados a nivel de laboratorio para la esterilizacin de medios

lquidos, medio agar y

equipamiento de vidrio y metal. La esterilizacin utiliza vapor de agua a presin y consiste en la

desnaturalizacin celular y coagular de protenas utilizando una temperatura de 121 C con un tiempo de exposicin de 15 minutos (Fig.
1.8)

Figura 1. 8. Equipamiento para la esterilizacin mediante calor hmedo


(A: autoclave), y calor seco (B: estufa).

48

c)

Esterilizacin por Filtracin


Tanto para cultivos internos y externos, la filtracin mecnica se realiza mediante la utilizacin de membranas filtrantes (0,2

0,45 m), o cartuchos dispuestos en serie con un radiante de filtracin de entre 10-0,5 m. (Fig 1.9), para la eliminacin mecnica de
slidos, microalgas y bacterias. Las membranas filtrantes son de tamao determinado, el que depender del uso al que se va a someter la
muestra.
d)

Esterilizacin por Radiacin UV


En los cultivos en los cuales los volmenes de cultivo son superiores a los 20 litros es necesario utilizar otros mecanismos de

esterilizacin. La radiacin UV es letalmente efectiva a 260 nm, debido principalmente a que provoca la formacin de enlaces covalentes
entre la tiaminas adyacentes en el ADN. Estos enlaces causan errores en la replicacin del ADN dando como resultado mutantes
potencialmente letales. Sin embargo se recomienda para la filtracin de agua la utilizacin de filtros mecnicos complementarios a la
radiacin UV.
e)

Desinfeccin por Hipoclorito de Sodio


La desinfeccin mediante la cloracin es usada en acuicultura para cultivos especialmente masivos, que requieren elevados

volmenes de agua. Si bien el proceso de desinfeccin puede no matar los quistes presentes en el agua de mar, es un mecanismo
efectivo en la eliminacin de una serie de microorganismos no deseados, como los protozoos.

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La figura muestra el proceso de esterilizacin de agua de mar para ser utilizada en cultivo internos y externos. El agua pasa por
una serie de poros filtrantes (10 - 0,5 um), para finalmente ser expuesto a luz UV y posteriormente ser utilizada en el cultivo.

10

0,5 (m)

filtro uv

CULTIVOS

Internos (< 30 L)
Externos (> 30 L)

RESERVORIO
AGUA MAR
Cartuchos filtrantes

SISTEMA TRATAMIENTO
DE AGUA

Figura 1.9. Proceso de esterilizacin de agua de mar, para ser utilizada en cultivo internos y externos. El agua pasa por una serie de poros filtrantes (10 0,5 um), para finalmente ser expuesto a luz UV.

50

6. Problemas Asociados al Manejo.


Los cultivos microalgales generalmente se ven afectados por contaminantes microscpicos como bacterias, hongos y protozoos,
los cuales pueden invadir el cultivo. stos contaminantes pueden ser transportados por aire (suministros de aire o del medio ambiente),
materiales mal esterilizados, inculos contaminados o simplemente por problemas de manejo durante la inoculacin. Es por ello que
durante la inoculacin de un medio de cultivo nuevo, primero se debe evaluar el inculo y realizar el traspaso en un ambiente limpio,
idealmente bajo campana de flujo laminar, evitando as las corrientes de aire. En los cultivos interiores en los cuales se utilizan pequeos
recipientes, stos deben estar aislados mediante tapones de algodn o de gomas estriles y selladas con papel aluminio u otro. En el caso
de los cultivos externos estos suelen contaminarse debido a que la forma de desinfeccin del agua se realiza mediante la aplicacin de
qumicos, los cuales son eficaces en la eliminacin de protozoos y bacterias, sin embrago, no eliminan los quistes y esporas en reposo los
cuales proliferan al momento de encontrarse con un medio fresco creciendo a lo largo del cultivo. Un buen sistema de filtracin del agua
de mar acompaado de filtros uv, minimiza notablemente la contaminacin. La esterilizacin mediante autoclave sigue siendo la tcnica
preferida, sin embargo, sta no puede ser til en sistemas productivos.
Los cultivos microalgales que han sido contaminados con otra clase de microalga, presentan un crecimiento ms lento y suelen no
alcanzar las densidades habituales. Si bien estos cultivos no pueden ser utilizados como inculos se pueden utilizar para la alimentacin
de larvas, siempre que las algas contaminantes sean del tamao adecuado para utilizarlos como alimento, ya que diatomeas y
dinoflagelados de alrededor de 25 um son demasiados grandes para los bivalvos.

51

En la practica es muy difcil obtener un cultivo libre de bacterias, aunque un grado de contaminacin bacteriana con frecuencia es
aceptable, debido principalmente a que la asociacin bacteria-microalga desempea un papel positivo en el crecimiento microalgal y en
la nutricin larval. La clave est en seguir al pie de la letra las indicaciones durante el manejo de los cultivos: contar con el material
estril e inculos libres de contaminantes asegura el xito del cultivo.
La contaminacin por hongos y levaduras ocurre generalmente en los cultivos de lagunas o abiertos y en cultivos realizados con
nutrientes de origen orgnico. No presenta mayor problema al comportamiento algal ni para el consumidor.
El zooplanton contaminante aparece generalmente en cultivos de algas verdes, teniendo apenas efecto sobre crecimiento algal,
peo s tiene causa una deficiencia en alcanzar las densidades habituales; en estos casos es recomendable desechar en cultivo
contaminado. Las especies mas comnmente encontrados como contaminantes son Lycrymanis sp.,Colpidium sp., y Vorticella sp.
Es necesario el examen microscpico del cultivo antes de realizar suescalamiento,para evitar la contaminacin de las etapas
siguientes (cultivos secundarios, intermedios y masivos). Cuando se observa contaminacin es necesario probar con diluciones del
inculo con medio de cultivo fresco, favoreciendo la tasa de duplicacin de la microalga por sobre la de el contaminante.
Mecanismos de eliminacin
Cuando el cultivo se ve afectado por la contaminacin bacteriana el mejor remedio es utilizar las tcnicas tradicionales de
aislamiento (micropipeteo, siembra estriada o extendida, filtracin y centrifugacin), acompaado de un tratamiento de antibitico. Los
mejores resultados se obtenen cuando el cultivo se encuentra en una fase de crecimiento exponencial. En este caso, una mezcla de
antibiticos por un periodo de 48 hrs es suficiente para reducir las bacterias viables.

52

Filtracin del cultivo


Es utilizado generalmente para la mantencin de cepas y cultivos primarios, eliminando procariontes no deseados y levaduras.
En el caso de levaduras de tamaos similares a las de las microalgas se recomienda enriquecer el medio (con extracto de malta, por
ejmplo), que no sea perjudicial para el crecimiento microalgal. El enriquecimiento provoca la germinacin de las levaduras en filamentos
que s quedarn atrapados por las membranas filtrantes.
Centrifugacin Diferencial
Generalmente se utiliza como estrategia complementaria a la eliminacin de procariontes. La centrifugacin provoca la
sedimentacin de las microalgas y los contaminantes permaecen en el sobrenadante, el que ser remplazado por medio de cultivo
fresco. El lavado del cultivo se recomiendo por lo menos tres veces.
Tratamiento con Antibiticos
La ausencia de crecimiento bacteriano no se puede asegurar del todo, en la prctica, el concepto de cultivo axnico significa que
son cultivos sin procariontes no deseados demostrables. Sin embargo, existen casos en los cuales el cultivo microalgal puede morir en
ausencia de bacterias debido a la relacin simbionte entre ellas. El uso de antibiticos reduce notablemente las bacterias viables de tal
manera que al realizar la dilucin o tomar una pequea cantidad de inculo la densidad bacteriana es mnima o inexistente. Diferentes
especies de microalgas toleran diferentes concentraciones de antibiticos, por lo que deben usarse diferentes concentraciones en el

53

tratamiento. La dosis y el perodo de exposicin es la clave del xito de la tcnica. La mezcla de antibiticos generalmente utilizada para
el tratamiento es: penicilina, estreptomicina y gentamicina en proporciones de 100/25/25 mg diluidas en 10 ml de agua destilada estril
filtrada a 0,2 um, conservadas a -20C hasta su uso.
La purificacin parte inoculando 1 ml de cultivo a 50 ml de medio fresco, posteriormente se agrega la mezcla de antibiticos en
una serie de concentraciones (en un rango entre 50-500 mg/L) y expuesta por un periodo de 24-48 hrs, complementando ste
tratamiento se recomienda realizar a las 24 y 48 hrs la transferencia de una nica clula a tubos de ensayo con medio de cultivo estril y
libre de antibiticos por triplicado. Finalmente, teniendo las clulas aisladas por micropipeteo se deben incubar los tubos en condiciones
favorables por un periodo de 14 a 21 das (Fig. 1.10)

Micropipeteo
24 hrs.

48 hrs.

Figura 1.10. Secuencia de tratamiento con antibiticos. Se agrega a un


matraz erlenmeyer 50 ml de medio fresco ms 1 ml
de inculo
contaminado, cada matraz contiene la dosis de mezcla de antibiticos
entre 50-500 mg/l.- Posterior a 24 y 48 hrs. se transfiere mediante
pipeteo una nica clula a un tubo de ensayo con medio fresco libre de
antibiticos en triplicado.

Capitulo II: Cianobacterias del Desierto de Atacama: Potencialidades y Cultivo de Cepas Nativas
del Gnero Nostoc
Hctor Olivares y Benito Gmez-Silva
Grupo de Bioqumica, Depto. Biomdico, Facultad Ciencias de la Salud, Universidad de Antofagasta, Av. Angamos 601, Antofagasta, Chile. E-mail:
holivares@uantof.cl; bgomez@uantof.cl

1. Introduccin
Las cianobacterias (algas verde-azuladas) son microorganismos fotoautotrficos oxignicos, unicelulares o filamentos, que
colonizan una gran variedad de hbitats, incluyendo desiertos fros y calientes (Gmez-Silva y cols., 2008). Como clulas libres o como
ficobiontes en asociacin simbitica en lquenes, este diverso grupo de microorganismos Gram-negativo son productores primarios
claves en la colonizacin de nuevos hbitats y en la sobrevivencia de miembros heterotrficos de comunidades microbianas (Dodds,
1995; Warren-Rhodes y cols.. 2006; Dvila y cols.. 2008). Algunas especies poseen la capacidad de diferenciar una o ms clulas
vegetativas en heterocistos, clulas especializadas en la fijacin fotosinttica de nitrgeno atmosfrico, jugando un importante rol
ecolgico en la formacin de suelos y en la entrada de nitrgeno a ecosistemas terrestres y acuticos naturales.

2. El Gnero Nostoc
Las cianobacterias del ubicuo gnero Nostoc, Seccin IV, Familia Nostocaceae, Orden Nostocales (Rippka, 1979, 1988) son
microorganismos filamentosos fijadores de nitrgeno, con heterocistos localizados cada 8-10 clulas vegetativas a lo largo del tricoma
(Fig. 2.1). Las clulas se dividen por fisin binaria en un plano y se reproducen por medio de hormogonios (pequeas tricomas mviles)
y aquinetos (estructura tipo espora) en cadena, prximos a los heterocistos. Las especies de Nostoc son miembros esenciales en
comunidades de ambientes extremos y pueden localizar lugares favorables para la formacin de colonias mediante respuestas
quimiotcticas y fototcticas (Dodds, 1995). Estos organismos crecen en forma natural formando macrocolonias que han sido
histricamente usadas como alimento y medicina en frica, Asia, Europa y Norte y Sudamrica (Aldave-Pajres, 1989; Becker, 1998;
Richmond, 2003). Los bofedales y estuarios son hbitats con inundaciones estacionales particularmente adecuados para Nostoc. En
ambientes acuticos, Nostoc se asocia principalmente al bentos y puede generar masas planctnica flotantes. Colonias macroscpicas de
Nostoc se encuentran abundantemente en humedales por sobre los 3.000 msnm a lo largo de la Precordillera de los Andes en el norte de
Chile (Fig. 2.2).
Las especies de ambientes terrestres poseen la capacidad de soportar ciclos repetidos de congelamiento-descongelamiento,
permanecer en estado de desecacin por meses y recuperar completamente la actividad metablica despus de horas o das de
rehidratacin (Potts, 1994; Helm, 2000; Satoh, 2002). Representantes del gnero que proliferan en hbitats terrestres y acuticos poco
profundos sintetizan compuesto protectores contra la daina radiacin ultravioleta (RUV) (Bhm, 1995; Ehling-Schulz, 1997; Araoz,
1998; Sinha y cols.., 2001; Sinha y Hder, 2008). Adicionalmente, las cianobacterias del gnero Nostoc son relativamente resistente a la
predacin a consecuencia de la presencia de una cubierta celular masiva, la biosntesis de toxinas y la formacin de macro colonias, entre
otros factores (Sivonen, 1990). Las clulas de Nostoc commune secretan un exopolisacrido (EPS) cuyo contenido es modulado por los

niveles de radiacin UV-B (280-315 nm) (Ehling-Schulz and Scherer, 1997). Las macromolculas de EPS forma una matriz protectora
que participa en la disminucin de la prdida de agua, aumentando la estabilidad de membranas y as permitiendo la sobrevivencia del
organismo en condiciones extremas de dficit de agua. En el estado de desecacin, el material de la envoltura celular de las colonias
forma una estructura vidriosa, quebradiza y altamente higroscpica que, una vez que la colonia es rehidratada, se transforma en un gel
semirgido y maleable (Potts, 1994). As, las diversas estrategias adaptativas permiten explicar la abundancia y la presencia dominante
de representantes del gnero Nostoc en los humedales de la Precordillera altiplnica del Norte de Chile.

Figura 2.1. Fotografas de una suspensin de filamentos de la cianobacteria Nostoc sp. var. Machuca cultivada en ausencia de nitrgeno combinado. Las
flechas indican la posicin de los heterocistos bajo el microscopio de luz (A) y microscopio fluorescente (B).

Figura 2.2. Macrocolonias de cianobacterias del gnero Nostoc existentes en humedales precordilleranos del norte de Chile. A-B: Machuca, Regin de
Antofagasta. C: Parinacota, Parque Nacional Lauca, Regin de Arica y Parinacota. D: Salar de Huasco, Regin de Tarapac.

3. Aplicaciones de la Biomasa de Nostoc


Un bajo nmero compuestos qumicos sintetizados por microalgas tienen un xito comercial slido en la actualidad. Sin contar
con las microalgas y cianobacterias que an no han sido identificadas y/o cultivadas, existe un nmero significativamente superior de
especies que esperan ser evaluadas en trminos del tipo de metabolitos primarios y secundarios de inters econmico que ellas
sintetizan y la capacidad de produccin masiva de biomasa y/o compuestos. Las cianobacterias fijadoras de nitrgeno bajo condiciones
aerbicas son particularmente atractivas para la fotoproduccin de biomasa y compuestos qumicos al sintetizar todos sus componentes
celulares en base a energa solar, sales minerales y agua dulce, salobre y/o salada, sin necesidad de una fuente de nitrgeno combinado.
Su naturaleza filamentosa representa otra ventaja evidente en la cosecha de la biomasa.
La utilizacin biotecnolgica de representantes del gnero Nostoc es una rea en desarrollo sin aplicaciones concretas a la fecha,
an cuando existen ejemplos del uso de algunas especies como fertilizantes naturales en cultivos agrcolas de impacto social, sin
mayores desarrollos tecnolgicos y otras tienen un uso alimenticio que se remonta a tiempos prehispnicos en el cono sur de
Sudamrica y otros lugares del nuestro planeta (Aldave-Pajares, 1969; Rother, 1989).
Produccin de Pigmentos Naturales
a) Ficobiliprotenas
El aparato fotosinttico de las cianobacterias se caracteriza por la presencia de clorofila a como pigmento fotosinttico principal y
carotenoides ms ficobiliprotenas (FBPs) como pigmentos accesorios. Las FBPs se organizan en la forma de complejos multiproticos,
los ficobilisomas, que actan como antenas captadoras de energa lumnica en la superficie de las membranas tilacoidales. Las FBPs son

protenas altamente fluorescentes que poseen grupos cromforos (pirroles de cadena abierta) que se unen covalentemente a las
apoproteinas. Tres tipos de FBPs se encuentran en los ficobilisomas de cianobacterias: C-aloficocianina (AC), C-ficocianina (FC) y Cficoeritrina (FE), con longitudes de onda de absorcin mxima de 650 nm, 620 nm y 562 nm, respectivamente (Fig. 2.3).
Todas las cianobacterias poseen AC y FC constitutivamente; sin embargo, algunas especies poseen FE en sus ficobilisomas. En ellas, los
contenidos relativos de FC y FE pueden ser modulados por la calidad espectral de la luz incidente a travs de un proceso denominado
Adaptacin Cromtica (AC). De acuerdo a la capacidad para responder a cambios en la calidad de la luz incidente, las cianobacterias con
AC pueden clasificarse en tres grupos: Grupo I, cianobacterias que no alteran la composicin de sus FBPs, Grupo II, cianobacterias que
slo pueden modificar los niveles de FE y Grupo III, cianobacterias que pueden modular diferencialmente la sntesis tanto de FC y FE en
un fenmeno denominado adaptacin cromtica complementaria (Tandeau de Marsac, 1977).
Las tres FBPs de cianobacterias son altamente fluorescentes, de modo que las protenas purificadas han encontrado diversas
aplicaciones biotecnolgicas como colorantes naturales alternativos a los pigmentos sintticos en la industria de alimentos, cosmtica y
farmacutica. FE ha sido evaluada como marcador fluorescente en tcnicas de inmunoensayos, microscopa, diagnsticos e
investigaciones biomdicas, con ventajas frente a trazadores fluorescentes tradicionales (Glazer, 1981).
Una cianobacteria filamentosa del gnero Nostoc ha sido aislada del bofedal de Caquena, Regin de Tarapac y Parinacota. En cultivo, la
estirpe nativa del altiplano chileno muestra altos niveles de FE y adaptacin cromtica complementaria, siendo un excelente candidato
para la produccin masiva de biomasa y FE (Acosta y Gonzlez, 1995; Pineda Tello, 1997).

Figura 2.3. Espectro de absorcin de una suspensin de filamentos de la


cianobacteria

Nostoc

sp.

var.

Machuca

(lnea

suave)

del

correspondiente extracto acuoso luego de la ruptura celular (lnea


gruesa). Las flechas indican los mximos de absorcin de clorofila a
(415-440 y 680 nm), carotenoides (500 nm) y C-ficocianina (620 nm).

b) Pigmentos Fotoprotectores de RUV


La biosntesis los pigmentos tipo micosporina-similar-a-aminocidos (MAAs) y escitonemina, es un eficiente mecanismo de
defensa de algunas especies de Nostoc al estrs por RUV. MAAs son un grupo de compuestos hidrosolubles que pueden constituir hasta
el 19% de la biomasa seca de colonias de Nostoc; sin embargo, las molculas de MAAs son liberadas extracelularmente durante los
eventos de rehidratacin y representan prdidas cclicas y drenaje de recursos celulares (Potts, 1994). Sus mximos de absorcin en el
rango 309-362 nm cubren las radiaciones incidentes en las regiones UV-A (315-400 nm) and UV-B (280-315 nm), disipando la energa
absorbida en la forma de calor. MAAs son los metabolitos filtradores excretados por especies de Nostoc commune resistentes a la

desecacin y se acumulan en la envoltura extracelular unidos a oligosacridos. En especies cianobacteriales halotolerantes, MAAs actan
adems como osmoreguladores pero su distribucin intracelular no est an bien establecida (Sinha and Hder, 2008).
Alternativamente, escitonemina es un dmero liposoluble, de coloracin amarillo-pardo, comn y nico de cianobacterias de
ambientes terrestres (Potts, 2000). Las molculas de escitonemina poseen un mximo de absorcin in vivo a 370 nm y se localizan en las
envolturas extracelulares de un gran nmero de especies de cianobacterias. A diferencia de MAAs, las escitoneminas son altamente
estables una vez que se han sintetizado, manteniendo su rol protector frente a RUV sin que las clulas tengan la necesidad de invertir
energa metablica adicional durante perodos de prolongada inactividad metablica (por ejemplo, perodos de desecacin), cuando
otros procesos de proteccin y reparacin no son efectivos (Sinha and Hder, 2008). Las propiedades antiinflamatorias y el rol protector
contra la radiacin UVA y UVB de escitonemina conforman una combinacin que consolida la idea de promover investigaciones relativas
al desarrollo de la produccin industrial farmacutica de estos compuestos con aplicacin en la preparacin de cremas protectoras para
uso humano (Sinha and Hder, 2008).
Recientemente, hemos confirmado la abundante presencia de escitonemina en colonias secas de Llaita. El espectro de absorcin
del extracto acetnico de Llaita seca se muestra en la Fig. 2.4 con un mximo de absorcin a 384 nm, caracterstico del pigmento in vitro.
Esto confirma que las macro colonias de Nostoc en los humedales a lo largo de la precordillera del Norte de Chile sintetizan masivamente
pigmentos protectores a la luz UV, como una de las estrategias clave de adaptacin a las condiciones medioambientales extremas.
Consecuentemente, se requieren estudios para evaluar la posibilidad de que estos microorganismos sean considerados una alternativa
de inters comercial en la produccin de este tipo de pigmentos.

Figura 2.4. Espectro de absorcin de una muestra de colonias secas de


Llaita extrada con acetona al 100%. Las flechas indican los mximos de
absorcin de escitonemina (384 nm) y clorofila a (430 y 663 nm).

c) Produccin de EPS
La biosntesis de EPS en microalgas y cianobacterias es influenciada por factores externos tales como temperatura, concentracin
de nitrgeno, irradiancia y turbulencia de los cultivos (De Philipis y cols.., 1991; Moreno y cols.., 1998). El EPS bacteriano est
constituido por diversos polmeros de alta viscosidad que forma capas en la envoltura externa de las clulas. Dada su naturaleza
higroscpica, los EPS disminuyen la prdida

de agua en clulas sometidas a estrs hdrico y, en conjunto con polisacridos

intracelulares, estabilizan macromolculas y membranas, aumentando la probabilidad de sobrevivencia en condiciones extremas de


desecacin (Potts, 1994).

Los exopolisacridos han sido tradicionalmente usados como emulsionantes, estabilizantes y espesantes en la industria
alimenticia, textil, cosmtica, farmacutica y en la produccin de pinturas y papel. Las fuentes de EPS son las plantas y macroalgas, por lo
que EPS de origen microbiano son una alternativa comercial de gran inters dada las propiedades fsicas de estos y las ventajas relativas
de manejo y manipulacin de las condiciones que inciden en el aumento en las tasas de crecimiento y/o produccin de EPS (Bertocchi y
cols.., 1990; Sutherland, 1990, 1996). El efecto de EPS de origen cianobacterial en la remocin de metales pesados de lquidos
contaminados ha sido recientemente evaluada (Paperi y cols.., 2006); sin embargo, el uso de cianobacterias y EPS en procesos de
acondicionamiento fsico de suelos, particularmente la recuperacin de suelos de ambientes ridos, no ha sido suficientemente
estudiado (Barclay, 1985).
d) Biomasa de Nostoc como Fuente Alimenticia
Las cianobacterias son un recurso biolgico que ha sido usado como suplemento alimenticio desde tiempos precolombinos por
los asentamientos humanos a lo largo de los Andes de Ecuador, Per, Bolivia, Argentina y Chile. Esta costumbre ancestral permanece
activa al interior de Arica (Putre, Visviri y otros). Las colonias secas de cianobacterias de los bofedales altiplnicos chilenos y bolivianos,
conocidas bajo los nombres vernaculares de Llaita, Llacta o Cuschuro, son cosechadas y secadas al sol (Fig. 2.5). Las colonias secas de
Llaita se comercializan en los mercados de las ciudades de Arica e Iquique y se usan ocasionalmente como aditivo alimenticio en la
preparacin de platos locales. Esta costumbre es prcticamente desconocida en la Regin de Antofagasta, con excepcin de unos pocos
poblados altiplnicos (Mendizbal, 1994; Gmez-Silva y cols., 1995).
Las colonias de Llaita son acumulaciones masivas de filamentos de una cianobacteria del gnero Nostoc. Las composiciones
bioqumicas (protenas aminocidos esenciales, cidos grasos poliinsaturados) de la biomasa seca y la de cultivos del microorganismo

aislado (Nostoc sp. var. Llaita), confirman que este recurso posee calidad nutricional adecuada para ser considerada un suplemento
alimenticio humano y/o animal (Tablas 1-3) (Vargas y cols.., 1988). Lpez y Yutronic (2005) han formulado y evaluado un producto
alimenticio en base a una mezcla de harinas de Llaita y espinaca; esto representa un primer paso en la bsqueda de alternativas vlidas
para la recuperacin y utilizacin de un recurso natural nativo del norte chileno.
An cuando el uso de este recurso alimenticio ancestral se ha perdido en la Regin de Antofagasta y es ocasionalmente usado por
las poblaciones de Arica e Iquique, colonias de cianobacterias del gnero Nostoc crecen en bofedales y vegas a lo largo de la precordillera
del norte de Chile (Parque Nacional Lauca, Salar de Huasco, Turi, Ro Grande, Machuca; Fig. 2.5). Los anlisis comparativos de las
secuencias del gen 16S rRNA de los genomas de las cianobacterias que forman las colonias de Llaita y las colonias del bofedal de
Machuca han permitido concluir que ambas pertenecen a la misma especies del gnero Nostoc (Linsambart, Pastenes y Rojas, 2005).
El anlisis proximal de las colonias de Machuca indica un alto contenido de protenas, carbohidratos y lpidos (Tabla 4). Lo
anterior reafirma nuestra nocin sobre el uso comercial de las cianobacterias de Nostoc sp. var. Machuca y otras estirpes que beneficie a
los asentamientos precordilleranos en el norte de Chile dada su relacin geogrfica e histrica con estos recursos genticos.

Figura 2.5. Fotografa de una macrocolonia seca de Llaita (A; escala: 1


cm) y microfotografa al microscopio electrnico de barrido de Llaita
(B) mostrando abundantes filamentos embebidos en una matriz de
exopolisacridos (escala: 10 m).

4. Cultivo de Especies del Gnero Nostoc del Norte de Chile


Condiciones de Cultivo
Para cultivo lquidos o slidos (agar al 1,5% p/v) se utiliza el medio descrito por Arnon y cols. (1974) sin fuentes de nitrgeno
combinado (Tabla 5). El cultivo en medio lquido se realiza en frascos de vidrio de 800 ml y 5 cm de paso de luz o en cilindros de vidrio
de 200 ml y 4 cm de dimetro por 15 cm de alto, terminado en forma de cono en su parte inferior para facilitar la agitacin por la

aireacin. Los cultivos son iluminados lateralmente con tubos fluorescentes o focos con filamentos de Hg, de acuerdo a la intensidad de
luz deseada. Los cultivos son burbujeados continuamente con aire enriquecido en 1% v/v CO2.
a) Cultivos Semicontinuos.
El manejo de los cultivos en rgimen semicontinuo se realiza mediante diluciones diarias cada 24 h para mantener la densidad
celular deseada. La prdida de agua por evaporacin se repone con H 2O desionizada estril. Luego de cada ciclo de retiro de un volumen
de cultivo, ste se repone con medio fresco de acuerdo a la siguiente ecuacin:

VR =

Donde

DCmed - DCdes
* Vol .cultivo ( L) ;
DCmed

VR: volumen en litros (L)


DCmed: densidad celular medida;
DCdes: densidad celular deseada.

El volumen de cultivo colectado permite medir biomasa (peso seco) y pigmentos.

La productividad se evala de acuerdo a las siguientes frmulas:


Biomasa (g m-2d-1)

PS ( g / l ) *VR
;
AC * T

Biomasa (mg L cultivo-1d-1) =

PS (mg / l ) *VR
;
VC * T

PS = peso seco (g l-1 o mg l-1);


VR = volumen a ser reemplazado (L);
AC = rea expuesta a la luz (m2);
VC = volumen de cultivo (L);
T = tiempo de incubacin entre cada dilucin (das).
Para calcular la velocidad especfica de crecimiento en los cultivos mantenidos en modo semicontinuo se utiliza la siguiente
frmula:
(d-1)

LN ( DC2) LN ( DC1)
;
T

LN(DC2) = logaritmo natural de la densidad celular medida antes de la dilucin (final)


LN(DC1) = logaritmo natural de la densidad celular en el tiempo cero (inicial), que se mide una vez que se realiza la dilucin
T = intervalo de tiempo entre cada dilucin expresada en das

b) Cultivos Masivos
El cultivo masivo de la variedad Nostoc sp. Llaita ha sido evaluado en un fotobioreactor tubular cerrado de 90 m de largo total y
2,2 m2 de superficie fotosintticamente activa. Por otra parte, la variedad Nostoc sp. Caquena fue cultivada en fotoquimiostato con
control de pH, oxgeno y dixido de carbono disueltos, temperatura, entre otros. Usando condiciones de crecimiento continuo a la
intemperie, la productividad mxima en el fotobioreactor fue de 10 g (biomasa seca var. Llaita) m -2 d-1. Por otra parte y usando la
biomasa de la variedad Caquena para la produccin del pigmento C-ficoeritrina, la fotoproduccin semicontinua en quimiostato fue de
0,6 g FE m-2 d-1 (Olivares y cols.., manuscrito en preparacin).
En base a la informacin que disponemos, se puede indicar que actualmente no existen actividades industriales relacionadas con
la produccin masiva de cianobacterias del gnero Nostoc. Sin embargo, tanto la biomasa como alguno de sus metabolitos representan
alternativas potenciales de aplicacin comercial (pigmentos, polisacridos y biomasa rica en protenas, cidos grasos insaturados y
aminocidos esenciales).
Algunas de las caractersticas propias de este gnero de microorganismos (crecimiento en filamentos, fijacin de nitrgeno
atmosfrico y otras) son ventajas comparativas para su cultivo masivo.
Las experiencias obtenidas en el cultivo y productividad en fotobioreactores y quimiostatos fortalecen la nocin sobre la
factibilidad tcnica de cultivar masivamente una o ms de las variedades de Nostoc para la obtencin de biomasa con fines alimenticios o
para la extraccin de metabolitos de valor comercial.
La ntima relacin geogrfica e histrica de las poblaciones precordilleranas con este recurso natural renovable del norte de Chile
debera reflejarse en que futuras actividades productivas que usen este recurso gentico beneficien el desarrollo socioeconmico de
estos asentamientos.

Tabla 2.1. Composicin bioqumica de colonias de Llaita y Nostoc sp. (var. Llaita). La cianobacteria fue cultivada fototrficamente en
medio mineral Arnon sin nitrato, con o sin suplemento de NaCl, y colectada al inicio de la fase estacionaria del crecimiento. Los
resultados corresponden al promedio con la desviacin estndar. El nmero de determinaciones se muestran entre parntesis. AG:
cidos grasos; CG: cromatografa de gases; ENN: extracto no nitrogenado; nd: no determinado.

Componente

Mtodo

Concentracin (% del peso seco)


Colonias

de Nostoc sp. (var. Llaita)

Llaita

Sin NaCl

NaCl 3%

Kjeldahl

30.46 0.20 (6)

46.05 0.20 (3)

40.04 0.50 (3)

Folin-

35.60 0.06 (3)

47.70

Lpidos

Soxhlet
Lowry

2.40 0.03 (6)

AG Totales

CG

1.16 (3)

12,14
(10) 0.10 (2)
nd

5.25
(10) 0.30 (3)
Nd

Carbohidrato

ENN

60.79 (6)

36.22 (6)

46.76 (6)

Antrona

41.80 0.10 (3)

20.20

Cenizas

Calcinacin

6.35 0.01 (6)

5.58
(10) 0.02 (3)

Protenas

3.00 35.80

1.70

1.50 21.00 0.20 (3)


7.95 0.10 (3)

Tabla 2.2. Contenido y composicin de cidos grasos de colonias naturales de Llaita.


cido graso

% del peso % del total de


seco

cidos grasos

cido caproico (10:0)

0.077

6.5

cido mirstico (14:0)

0.017

1.4

cido palmtico (16:0)

0.370

31.1

cido

margrico 0.009

0.8

cido
(17:0)esterico (18:0)

0.122

10.2

cido behnico (22:0)

0.008

0.7

cido

palmitoleico 0.155

13.0

cido
(16:1)oleico (18:1)

0.066

5.5

cido linolico (18:2)

0.082

6.9

cido linolnico (18:3)

0.285

23.9

Tabla 2.3. Composicin aminoacdica de Nostoc sp. (var. Llaita) creciendo bajo condiciones de laboratorio en medio libre de nitrgeno
combinado.
Aminocido

% del total de
aminocidos

Leucina
Treonina
Valina
Isoleucina
Lisina
Triptfano
Histidina
Arginina
Fenilalanin
Metionina
a
Glutamato
Aspartato
Alanina
Tirosina
Glicina
Serina
Cistena

9.3
7.2
5.6
5.0
4.9
1.2
1.0
8.2
4.7
2.8
15.1
10.9
7.9
5.5
5.3
5.0
0.5

Tabla 2.4. Composicin bioqumica de Nostoc sp. (var. Machuca) cultivado a nivel de laboratorio. Los valores corresponden a la media de
cuatro determinaciones independientes la desviacin estndar. Los cultivos en rgimen estanco, se realizaron a 30 C, pH 8,5 con una
irradiancia de 180 E m-2 s-1.

Componente

% Peso seco

Protenas

53,76 4,9

Lpidos totales

19,52 2,09

Carbohidratos

31,07 6,69

Ficobiliprotenas:
C-Ficocianina

19,07 1,65

C-Ficoeritrina

0,59 0,07

C-Aloficocianina

7,88 1,14

Captulo III: Microalgas ricas en PUFAs


1Fernando
1Unidad

Silva-Aciares, 2Claudia D. Infante, 1,2Carlos Riquelme S.

de Microbiologa Aplicada, 2Laboratorio de Ecologa Microbiana, Facultad de Recursos del Mar & Centro de Bioinnovacin, Universidad de
Antofagasta. Avenida Angamos 601, Antofagasta. Email: fsaciares@gmail.com, cinfante@uantof.cl.

1. INTRODUCCION
Actualmente, la aplicacin en la industria alimenticia de biotecnologa de microalgas ha retomado un gran inters. Sin embargo, la
colecta y el cultivo para utilizacin en la alimentacin humana son realizados hace siglos (Richmond, 1988). Son varias las especies
cultivadas comercialmente en algunos pases y la biomasa producida es usada como fuente de productos para la industria de alimentos.
Segn Pulz y Gross (2004), los productos naturales obtenidos de microalgas pueden ser usados en la preparacin de masas, panes,
yogures y bebidas, presentando un rpido desarrollo en pases como Francia, Estados Unidos, China y Tailandia. Las principales
microalgas cultivadas comercialmente son especies de los gneros Chlorella Beyerinck, (Chlorophyceae) y Arthrospira Stizenberger
(Cyanophyceae) para la adicin en alimentos naturales (health food), Dunaliella salina Teodoresco, (Chlorophyceae) para la obtencin
de betacaroteno, Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae) para la obtencin de astaxantina y Muriellopsis para la obtencin del
pigmento lutena. (Del Campo y cols.., 2001; Becker, 2004).
Las microalgas, adems de poseer importantes atributos biolgicos y de no presentar muchas exigencias en cuanto a condiciones de
cultivo, son relativamente fciles de procesar con la tecnologa existente y producen una vasta gama de productos naturales entre los cuales

10

estn los cidos grasos poliinsaturados (polyunsaturated fatty acids o PUFAs, segn sus siglas en ingls) y pigmentos fotosintticos,
destacando los carotenoides.
Los organismos marinos superiores as como los mamferos tienen una limitada capacidad para sintetizar cidos grasos
poliinsaturados (PUFAs) esenciales como el cido eicosapentaenoico (eicosapentaenoic acid, EPA) y el cido docosahexaenoico
(docosahexaenoic acid, DHA), por lo cual estos deben ser incorporados en la dieta para un desarrollo normal sobre todo del sistema
nervioso y ocular. El crecimiento experimentado por la acuicultura a nivel mundial ha aumentado los requerimientos de PUFAs, los
cuales son obtenidos principalmente a partir del aceite de pescado. Sin embargo, en los ltimos aos debido a la sobreexplotacin de los
recursos marinos ha decrecido la capacidad de captura y adems se ha acentuado el cuestionamiento al aceite de pescado debido a
posibles contaminantes como dioxina (Oberg y cols. 2002; Jacobs y cols. 2002). Tonon y cols. (2002) plantean la necesidad imperiosa de
desarrollar nuevos sistemas de produccin de PUFAs a bajo costo con tecnologa ambientalmente amigable alternativos al uso de
harinas de pescado. Esto ltimo se basa principalmente en proyecciones que sealan que la utilizacin de harinas de pescado por parte
de la industria acucola desde el 2000 al 2010 aumentara desde un 54% a un 97%. Esto significara que prcticamente la demanda total
de harinas sera utilizada por la industria de la acuicultura (Zaldivar, 2004).

11

Figura 3.1: A: Acido docosahexaenoico (DHA). B: Acido Eicosapentaenoico

Las microalgas, y especficamente las diatomeas, comprenden un amplio grupo de microorganismos fotosintticos y
heterotrficos que incluye al fitoplancton, fuente primaria en la cadena alimenticia del ocano y son una de las principales fuentes de
cidos grasos polinsaturados (Lpez Alonzo y cols., 2000; Molina Grima, 2003). Existen varios antecedentes del desarrollo de cultivos de

12

microalgas tales como Phaeodactylum tricornutum una diatomea que produce 33.5 mg x lt-1 x da-1 de EPA (Molina-Grima, 2003) y
Crypthecodinium cohnii que puede llegar a producir 53 mg x lt-1 x h-1 de DHA (de Swaaf y cols. 2003).

Figura 3.2: Crypthecodinium cohnii y Phaeodactylum tricornutum

De las aproximadamente 30.000 especies descritas de microalgas, slo un nmero limitado ha sido estudiado y analizado para la
produccin de lpidos. El producto obtenido no posee el olor y sabor caractersticos del aceite de pescado. Los aceites producidos por las
microalgas contienen una alta proporcin de DHA y EPA, y son ms estables a la degradacin oxidativa que aquellos obtenidos de otras
fuentes (Barclay y col.., 1998). La produccin comercial de algas posee algunos obstculos entre los que se encuentra la necesidad de
procesar grandes volmenes de agua, razn por la cual los costos de cosecha pueden representar hasta el 33% del costo total de

13

produccin (Barclay y cols., 1994). Adems, la produccin de biomasa en estanques y piscinas depende de la estacin del ao. En cultivos
de Porphyridium cruentum, desarrollados para la produccin de EPA, la productividad en biomasa present valores de 12 y 24 g (m3
da)-1 en los meses de invierno y verano, respectivamente (Cohen y cols., 1988).
En cultivos de microalgas fototrpicas realizados en fermentadores para la produccin de cidos grasos, se obtienen bajos
rendimientos principalmente debido a que la produccin de biomasa es limitada por el suministro de luz y oxgeno (Barbosa,2003).
Martek Biosciences (EE.UU.) ha desarrollado la tecnologa para la produccin de PUFAs a partir de cepas de la diatomea Nitzschia,
productora de EPA, y del dinoflagelado marino heterotrfico estricto Cryptheconidium cohnii, productor de DHA. La concentracin
celular obtenida en el cultivo de cepas de Nitzschia alba en fermentadores es de 45 - 48 g L-1, en procesos realizados durante 64 horas.
El contenido de aceite en la biomasa puede ser superior al 50% del peso seco. Se han descrito densidades superiores a 40 g L-1, en
tiempos de fermentacin de 60-90 horas, para el cultivo del dinoflagelado. El contenido de aceite en la biomasa se encuentra entre 15 a
30%, del cual el 20 - 35% es DHA (Barclay, 1994).
Estudios realizados con Cryptheconidium cohnii muestran que el contenido de lpidos puede ser superior al 20% del peso seco de
la biomasa, y la fraccin de DHA se encuentra entre 30 y 50% (de Swaaf y cols., 1999). Al usar glucosa como fuente de carbono para el
crecimiento, los principales cidos grasos producidos por C. cohnii son C16:0 y C22:6 con una productividad de 19 mg (L h)-1 (Jiang y
cols., 1999). Otras fuentes de carbono como cido actico y etanol se han usado en operaciones de fermentacin.
Se han obtenido productividades de 45 y 53 mg (L h)-1 al usar cido actico y etanol, respectivamente (de Swaaf y cols., 2003;
Ratledge y cols., 2001). Las nuevas estrategias de cultivo consideran el uso de aireacin forzada, ya que se ha comprobado que el proceso
de biosntesis de PUFAs requiere oxgeno (Jiang y cols., 1999). La relacin carbono:nitrgeno (C:N) es uno de los parmetros importantes
en la produccin de PUFAs por microalgas. En cultivos en los cuales se ha suprimido la fuente de nitrgeno, se ha obtenido un
incremento de hasta tres veces en el contenido de cidos grasos, en conjunto con aumentos en peso y tamao celular (Roessler, 1990).

14

Este fenmeno se atribuye a la acumulacin de sustancias de reserva en condiciones de crecimiento limitado, caracterstica de los
microorganismos oleaginosos.

2. Las microalgas en la nutricin humana y animal


En los ltimos aos ha merecido especial atencin en nutricin humana y, por lo tanto en salud, las grasas, los aceites y los
antioxidantes. Son numerosos los estudios que demuestran la estrecha relacin entre diversas enfermedades y el desequilibrio o la
carencia en la dieta de determinadas grasas, especialmente los cidos grasos poli-insaturados de cadena larga. La carencia o
desequilibrio diettico en estos compuestos provoca daos importantes en el desarrollo neurolgico y de la retina, enfermedades
cardiovasculares, artritis y otros problemas inflamatorios, adems de cncer. Los cidos grasos poli-insaturados (polyunsaturated fatty
acids, PUFAs) ms importantes en nutricin son los cidos -linoleico y acido -linoleico, y sus derivados, los cidos araquidnico (AA),
eicosapentaenoico (EPA) y docohexadecanoico (DHA) (Spolaore y cols., 2006). Los dos primeros son considerados esenciales, porque
adems de ser precursores de AA, EPA y DHA, son sintetizados exclusivamente por los vegetales, por lo que, las clulas animales,
incapaces de producirlos, los incorporan a travs de la dieta. Los desequilibrios en la composicin de cidos grasos en la dieta es algo
frecuente y peligroso en los pases ricos, debido al aumento en el consumo de carne y grasas animales y a la reduccin de vegetales de
hoja verde y pescado, ricos en cidos grasos poli-insaturados (Jiang y cols., 1999; Molina-Grima y cols., 2003; Wen y Chen 2003). En los
pases empobrecidos el problema es sencillamente la escasez de alimentos (cerca de 800 millones de personas en el mundo padecen
desnutricin segn Naciones Unidas). Las demandas alimenticias de la creciente poblacin mundial son muy altas, y esto plantea serios
problemas. Es necesario, por lo tanto, buscar fuentes alternativas de alimentos. La fuente comn de EPA es el aceite de pescado, donde la

15

composicin y contenido vara segn la especie de pez, estacin, localizacin geogrfica de los sitios de pesca, etc. En el ao 2000, la
produccin mundial anual de aceite de pescado fue de 1 milln de toneladas, con 100.000-250.000 toneladas de EPA y DHA (Lebeau,
2003), las que seran suficientes slo para 55-100 millones de personas, con un suplemento de 5 g por da. La demanda de EPA el ao
2000 slo en Japn fue de 125 toneladas, aproximadamente, alcanzando un precio de U$650 por kilo de etil ster de EPA (95% puro)
Desafortunadamente, la mayor parte del aceite de pescado producido es hidrogenado e incorporado a la margarina, de manera que los
cidos -3 son degradados. Adems, el aceite de pescado flucta en precio y calidad y actualmente se ha agregado como preocupacin la
posible contaminacin de los aceites con pesticidas y metales pesados. Esto hace necesario buscar fuentes alternativas de c

-3

de mejor calidad y ms estables


En este sentido, la produccin de cidos grasos poli-insaturados a partir de microalgas presenta grandes ventajas frente a otras
fuentes: permite alcanzar niveles de produccin elevados en condiciones altamente controladas y con un bajo riesgo de contaminacin;
es una actividad de una baja demanda de energa que no requiere suelo frtil ni agua de calidad, no compite, por tanto, con otras
actividades agrarias. En la actualidad ciertas microalgas son la base de una floreciente industria biotecnolgica. Crypthecodinium cohnii,
un dinoflagelado marino heterotrfico, es uno de los principales productores del cido omega-3 DHA (uno de los PUFAs ms importantes
y demandados). A partir de cepas seleccionadas de esta microalga, la empresa norteamericana Martek Biosciences Corporation ha
conseguido un aceite rico en DHA de gran calidad con el que suplementa leches maternizadas. Una de las dificultades asociadas a la
produccin de cidos grasos poli-insaturados de cadena larga a partir del cultivo de microalgas es la localizacin e identificacin de las
especies adecuadas. Se conocen ms de 40.000 especies de microalgas, de las cuales slo se han explorado los usos potenciales de apenas
unas decenas, no ms de 10 son explotadas comercialmente a gran escala. Los trabajos de seleccin de nuevas especies son lentos,
complejos y costosos, especialmente para la localizacin de nuevas especies ricas en cidos grasos. Adems de la consolidada produccin
para la obtencin de biomasa, diversas microalgas han sido cultivadas por su capacidad de sintetizar compuestos considerados

16

nutracuticos, como los ya mencionados PUFAs y pigmentos carotenoides (astaxantina, betacaroteno, lutena, cantaxantina etc.), que
presentan propiedades teraputicas (Tripathi y cols., 1999). Actualmente, son comercializadas como alimento natural o suplemento
alimenticio y son encontradas en formulaciones en forma de polvo, pastillas, cpsulas o extractos. Son tambin incorporadas en masas,
dulces, bebidas etc., tanto como suplemento nutricional y como colorantes naturales (Becker, 2004; Pulz y Gross, 2004; Spolaore y cols.,
2006).
La aplicacin ms comn es en Acuicultura, para la alimentacin directa o indirecta de algunas especies de peces, moluscos,
crustceos y de diversos organismos forneos de inters econmico. Son empleadas especies como Chaetoceros spp., Thalassiosira spp.,
Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema costatum, Isochrysis spp., Rhodomonas spp., Monochrysis spp., Tetraselmis spp., Arthrospira spp.,
Spirulina spp., Chlorella spp., Dunaliella spp. y Scenedesmus spp. y otras diversas especies (Silva y cols., 2003; Muller-Feuga, 2004).
Para el uso en la elaboracin de alimentos, as como para la extraccin de alguna sustancia de inters, es necesario separar la
biomasa del medio de cultivo por lo que, el proceso de separacin envuelve una o ms etapas slido-lquido, como floculacin,
centrifugacin y filtracin, por ejemplo. A continuacin, la biomasa es deshidratada y para esto pueden ser empleadas diversas tcnicas,
como secado al sol, spray-drying o liofilizacin. Para la extraccin de los compuestos, las clulas microalgales son rotas, empleando
diversos mtodos como homogeneizacin, ultra-sonido, choque osmtico, disolventes, enzimas etc. Las sustancias de inters son
entonces recuperadas y, en la mayora de los casos, sufren algn proceso de purificacin, como ultrafiltracin, cromatografa o
fraccionamiento (Molina-Grima, 2004).

17

3. Importancia de los cidos grasos poliinsaturados


Debido a los cambios en la dieta humana en los ltimos aos, y a la acentuada aparicin de una serie de enfermedades
relacionadas al bajo consumo de estos compuestos, as como su reconocida significancia teraputica, especialmente a aquellos de la
familia Omega-3 (Simopoulos, 2002) se ha comenzado la bsqueda de nuevas fuentes alternativas de PUFAs. Segn Ratledge (2001), la
produccin de aceite a partir de organismos unicelulares (single cell oilSCO) es un concepto relativamente nuevo, siendo las microalgas
una prometedora opcin. El contenido de lpidos de la biomasa microalgal puede variar entre 1 a un 40% del peso seco y, en ciertas
condiciones de cultivo, puede alcanzar hasta un 85% (Becker, 2004).
Los lpidos algales estn tpicamente compuestos por glicerol, azcares o bases esterificadas y cidos grasos con cadenas
carbonadas teniendo entre 12 y 22 carbonos, pudiendo ser saturadas, mono o poliinsaturadas. Los cidos grasos corresponden a la
mayor fraccin de los lpidos y, en algunas especies, los PUFA representan entre 25 y un 60% de los lipdos totales (Becker, 2004). Los
lipdos de algunas especies (casi siempre marinas) contienen cantidades relativamente altas de cidos grasos poliinsaturados de cadena
larga, principalmente EPA (20:5 n-3) y DHA (22:6 n-3) (Robles Medina y cols., 1998). Jiang y cols. (1999) confirmaron la importancia de
los PUFAs que esta dada por diversos estudios clnicos y epidemiolgicos. Los PUFAs participan en la prevencin y tratamiento de una
serie de enfermedades cardiovasculares, de la ateroclorosis y de la arritmia, de la reduccin de la presin arterial, de la reduccin de los
niveles de colesterol y triglicerdios en el plasma, de la artritis reumatoide, del cncer y son aparentemente esenciales en la nutricin
infantil y en el desarrollo cerebral (Gill y Valivety, 1997; Simopoulos, 2002).
En el caso de alimentacin humana, los cidos grasos como docosahexanoico (DHA) o eicosapentanoico (EPA) y sus derivados son
efectivos en la prevencin y el tratamiento de ciertas patologas, incluyendo enfermedades coronarias, agregacin plaquetaria, niveles
anmalos de colesterol, y algunos tipos de cncer, siendo adems altamente prometedores para el tratamiento de ciertas formas de

18

enfermedad mental (Thierry 2002). Estos cidos grasos son esenciales ya que no pueden ser sintetizados por el organismo y cumplen un
rol fundamental estructural, y tambin en los componentes de la membrana de fosfolpidos, son propulsores de la sntesis de la
prostaglandina, control de inflamacin, en la presin de sangre, dolor y fiebre (Ward & Singh 2005). Nutricionalmente los cidos grasos
poliinsaturados juegan un rol importante en la prevencin y tratamientos de enfermedades humanas severas,
El uso ms extendido de las microalgas sin embargo es como base de la cadena trfica en la acuicultura, ya que son necesarias
para el alimento de larvas de peces, crustceos y moluscos en sus primeros estadios, directamente o bien como alimento de las presas
vivas que se utilizan en los distintos estadios larvarios (Domnguez y cols. 2006).
Los peces marinos son una conocida fuente de estos compuestos nutricionalmente muy importantes. Sin embargo, existen
considerables evidencias indicando que los cidos grasos poliinsaturados encontrados en los aceites de peces provienen de la ingestin
de organismos que constituyen el zooplancton, los cuales tienen las microalgas como su principal alimento. De esta manera, a travs de
la cadena trfica, los PUFA sintetizados y acumulados por las microalgas son direccionados hasta los peces (Robles Medina y cols., 1998).
Sin embargo, los cidos grasos extrados de estas fuentes tienen varias desventajas como olor desagradable, contaminacin con metales
pesados, baja estabilidad, presencia de colesterol, produccin variable y un complejo perfil de cidos grasos, pudiendo presentar ms de
50 tipos diferentes (Robles Medina y cols., 1998). En contraste, los cidos grasos de las microalgas no presentan las desventajas citadas.
Adems, en los cultivos, las condiciones ambientales pueden ser controladas y las especies seleccionadas segn los cidos grasos
requeridos. Adems por presentar una composicin ms simple, el proceso de purificacin de los PUFA es relativamente ms sencillo
(Zittelli y cols., 1999; Wen y Chen, 2003). Entre las especies conocidas de microalgas que presentan cantidades significativas de PUFAs
Omega-3 y Omega-6, estn representantes de Haptophyceae (Isochrysis spp. y Pavlova lutheri), Bacillariophyceae (Phaeodactylum
tricornutum, Thalassiosira spp. y Odontella aurita), Dinophyceae (Crypthecodinium cohnii), Rhodophyceae (Porphyridium cruentum) y, en

19

menor cantidad, de las Chlorophyceaes. En consecuencia los cidos grasos poliinsaturados de origen microalgal tienen un mercado muy
prometedor en la biotecnologa, en especial en la industria de alimentos funcionales (Pulz y Gross, 2004).

4. Seleccin de microalgas ricas en cidos grasos poliinsaturados


Las condiciones de luminosidad caractersticas del Desierto de Atacama, permiten obtener cultivos masivos a bajo costo, con
microalgas de coleccin (Phaeodactylum tricornutum) o nativas aisladas desde diferentes hbitat acuticos. Una de las dificultades
asociadas a la produccin de cidos grasos poli-insaturados de cadena larga a partir del cultivo de microalgas es la localizacin e
identificacin de las especies adecuadas. Se conocen ms de 40.000 especies de microalgas, de las cuales slo se han explorado los usos
potenciales de apenas unas decenas, no ms de 10 son explotadas comercialmente a gran escala. Los trabajos de screening de nuevas
especies son lentos, complejos y costosos, especialmente para la localizacin de nuevas especies ricas en cidos grasos. En cambio, la
tcnica de Rojo Nilo nos permite seleccionar preliminarmente cepas de microalgas con alto contenido de cidos grasos, lo que se
confirma con los perfiles obtenidos para las microalgas estudiadas. Los altos contenidos de PUFAS en las microalgas nativas plantean la
necesidad de profundizar su estudio nutricional, para incorporarlas en dietas que puedan utilizarse en la industria acucola. Esto nos
permite avanzar con celeridad en la bsqueda de un producto nutricionalmente completo para la industria acucola principalmente, sin
descartar su posible uso para la industria nutracetica.
Cooksey y cols., (1987) optimiz el uso de la tincin con Rojo Nilo para microalgas, donde la tincin permanece estable entre 7 a
15 minutos en clulas vivas teidas, variando la cintica entre las diferentes especies posiblemente debido a diferencias en la
permeabilidad de la pared celular a la tincin, y a cmo son almacenados los lpidos en las clulas (gotas grandes o pequeas). A pesar

20

de las diferencias en la tincin de las cepas, este mtodo permite compararlas sin necesidad de extraer los lpidos para cuantificar su
contenido. An cuando el Rojo Nilo no permite discriminar entre la estructura de los compuestos, es un mtodo simple, rpido y sensible
para medir lpidos totales en las microalgas, lo que permite seleccionar preliminarmente cepas nativas con alto contenido de cidos
grasos (Fig. 3.3).

Figura 3.3: Fotografa de microscopia de epifluorescencia para Rojo Nilo (-1) y campo claro (-2) de microalgas nativas de 6 das. En (A): se observa
fluorescencia de color amarillo oro, indicando presencia de cuerpos lipdicos, mientras que en (B) no se observa fluorescencia amarilla para el Rojo Nilo.

21

Capitulo IV: Biodiesel desde microalgas


1Mariella
1Centro
2Unidad

Rivas A, 2Claudia Seplveda,

2,3Carlos

Riquelme S.

de Investigacin Cientfico-Tecnolgica para la minera, CICITEM.

de Microbiologa Aplicada, 3Laboratorio de Ecologa Microbiana, Facultad de Recursos del Mar & centro de bioinnovacin, Universidad de
Antofagasta. Avenida Angamos 601, Antofagasta. Email: mrivas@uantof.cl

El uso continuado del petrleo en los prximos aos como hasta ahora ha sido es tcnicamente imposible e insostenible debido al
agotamiento de las fuentes y a la contribucin de este tipo de combustible a la acumulacin de dixido de carbono al medioambiente.
Para la sustentabilidad ambiental y econmica se hace necesario el desarrollo de combustibles renovables y neutrales en aportes de
emisin de gases. El biodiesel producido a partir de cultivos agrcolas como maz, soya, raps son una alternativa potencial. Sin embargo,
en forma realista se necesitan grandes cantidades de hectreas y terreno dedicado slo a la produccin de combustible, desmereciendo
la produccin de cosechas con destino alimentario. Una alternativa que ha ido tomando fuerza los ltimos aos, es el uso de microalgas
ricas en cidos grasos de cadena larga como fuente de combustibles capaces de sostener la demanda global. Las microalgas usan la luz
del sol para producir aceites con beneficios medioambientales por el uso de CO2 para crecer y sin la emisin de gases txicos por lo que,
el biodiesel microalgal en el futuro ser una alternativa econmicamente competitiva con el petrleo diesel.

22

1. Introduccin
Las microalgas son pequeas fbricas celulares dirigidas por la luz del sol que convierten el dixido de carbono a un potencial
combustible, alimentos, semillas y sustancias bioactivas de alto valor agregado (Metting y Pyne, 1986; Borowitzka, 1999; Banerjee y cols.,
2002). Adems, estos microorganismos fotosintticos tienen aplicaciones en biorremediacin (Kalin y cols.., 2005; Muoz y Guieysse,
2006).
Las microalgas pueden dar origen a varios tipos diferentes de biocombustibles renovables. Estos incluyen metano producido por
digestin anaerbica de la biomasa algal (Spolaore y cols.., 2006), biodiesel derivado desde el aceite (Sawayama y cols.., 1995; Banerjee y
cols.., 2002) y biohidrgeno producido fotobiolgicamente (Melis, 2002). La idea de usar microalgas como fuente de combustible no es
nueva (Chisti, 1980; Sawayama y cols.., 1995) pero solo ahora se ha tomado en serio debido al gran aumento en el precio del petrleo y
ms importante, el fenmeno del calentamiento global asociado a la quema de combustibles fsiles (Gravrilescu y Chisti, 2005).
Los cidos grasos metil esteres provenientes desde aceites vegetales y grasas animales son conocidos como biodiesel. El biodiesel
es biodegradable, renovable y no-txico. Adems, no contribuye con dixido de carbono o sulfuros a la atmsfera y emite menos
contaminantes gaseosos que el diesel normal (Lang y cols., 2001; Antolin y cols., 2002; Vicente y cols., 2004).
Sin embargo, a pesar del impacto favorable que la comercializacin del biodiesel puede otorgar, el aspecto econmico de su
produccin previene el desarrollo y uso a gran escala, principalmente debido al alto costo del aceite vegetal (Lang y cols., 2001; Antolin y
cols., 2002). Los costos del biodiesel usualmente sobrepasan los 0.5US$/l, comparado a los 0.35US$/l para el diesel normal (Zhang y
cols., 2003). Investigar maneras de reducir los costos de produccin de biodiesel es de mucho inters entonces, especialmente mtodos
para concentrar o minimizar la materia prima.

23

Las microalgas son una excelente alternativa para la produccin de combustible tomando ventaja de su alta eficiencia
fotosinttica, alta produccin de biomasa y rpido crecimiento en comparacin a otras cosechas energticas (Milne y cols., 1990;
Minowa y cols., 1995). El crecimiento heterotrfico de algunas microalgas es usado para la produccin eficiente de biomasa y algunos
metabolitos tales como lpidos (Shi y cols., 2002; Wen y cols., 2002), los que pueden reducir el costo de la produccin de biomasa
microalgal y la produccin de aceite microalgal.
El biodiesel es producido hoy en da desde plantas y aceites animales pero no desde microalgas, pero actualmente existen varios
proyectos para hacer comercial el biodiesel microalgal, como por ejemplo, GreenFuel Technologies Corporation en Estados Unidos y el
de BioKing en Holanda-Canad. La tecnologa para producir biodiesel se ha conocido desde hace ms de 50 aos. En Estados Unidos el
biodiesel es producido principalmente desde la soya, aceite de canola, grasa animal, aceite de palma, aceite de desechos de cocineras y
aceite de jatrofa. Una superficie de una hectrea, puede producir el equivalente a 136.900 litros de aceite con microalgas cuya biomasa
contenga un 70% de aceite. En cambio una hectrea de suelo frtil para cultivo de soya producira slo 446 litros (tabla 1).
Si bien existen aspectos tecnolgicos a desarrollar para abaratar costos, las microalgas ofrecen muchas posibilidades como por
ejemplo, luego de extraer el aceite, el resto de la biomasa rica en protenas e hidratos de carbono, podra utilizarse como compost,
fertilizante o en productos alimenticios. Por fermentacin podra obtenerse bioetanol a partir de los hidratos de carbono. La ingeniera
gentica permitira modificar el genoma de las microalgas de modo de aumentar su velocidad de crecimiento, incrementar la cantidad de
aceite producido o incorporar genes para obtener algn principio farmacutico de alto valor comercial que contribuya a disminuir los
costos del proceso.

24

Tabla 4.1: Comparacin de algunas fuentes de biodiesel.


Cultivo

Aceite producido (L/h) Terreno


(M/h)

Maz

172

1540

Soya

446

594

Canola

1190

223

Jatropha

1892

140

Aceite de palma

5950

45

microalga a

136900

microalga b

58700

4.5

a: 70% aceite en biomasa (por peso); b: 30% aceite en biomasa (por peso). (Chisti, 2005)

necesario

25

2.-Produccin de biodiesel
El aceite usado para hacer biodiesel consiste de triglicridos en el cual tres molculas de cidos grasos son esterificados con una
molcula de glicerol. Estos triglicridos reaccionan con metanol en una reaccin conocida como transesterificacin o alcoholisis. La
transesterificacin produce metil esteres de aceites grasos, que son el biodiesel y glicerol como subproducto.
La produccin de biodiesel debera usar este mismo proceso. La produccin de metil esteres o biodiesel desde microalgas ya se
ha demostrado (Belarbi y cols., 2000). La biomasa puede ser convertida bioqumicamente a las formas usadas de varias maneras. Las
reacciones de conversin de energa de la biomasa pueden ser clasificadas dentro de conversin bioqumica y conversin termoqumica.
La conversin termoqumica, como la gasificacin, pirolisis y licuefaccin, es la descomposicin termal de los componentes orgnicos de
la biomasa para producir combustible. La conversin bioqumica puede ser adems subdividida en fermentacin, digestin anaerbica,
celdas de combustible bioelectroqumicas, y otros procesos para producir combustible usando el metabolismo de los organismos. Las
rutas biolgicas para la conversin de la biomasa son generalmente mas eficientes en trminos de reciclaje de nutrientes y materia
orgnica.
La transesterificacin catalizada por acido es la forma ms usada y se realiza en frascos, calentndose hasta llegar a la
temperatura de reaccin en un shaker o un bao de temperatura constante. Una mezcla de reaccin estndar consiste de aceite, metanol
y acido sulfrico concentrado. La mezcla de reaccin fue calentada por un periodo especfico, enfriada y lista para separarse en dos
capas. La capa superior de aceite (biodiesel) se separa y se lava con ter de petrleo y luego con agua caliente (50C) hasta que el lavado
sea neutral. El biodiesel es obtenido evaporando la solucin de eter. Se estima el biodiesel producido (%peso) en relacin al peso del
aceite microalgal.

26

3.-Obtencin de biodiesel desde microalgas


Dependiendo de la especie, las microalgas producen muchos tipos diferentes de lpidos, hidrocarbonos y otros aceites complejos
(Banerjee y cols., 2002; Metzger y Largeau, 2005; Guschina y Harwood, 2006). No todos los aceites algales son buenos para hacer
biodiesel, pero los disponibles son bastante frecuentes. Usando microalgas para producir biodiesel no se compromete la produccin de
alimento y otros productos derivados desde cosechas.
Potencialmente, en vez de las microalgas, se podra usar aceite producido desde microorganismos heterotrficos (Ratledge y
Wynn, 2002) creciendo con fuentes naturales de carbono orgnico tales como azcar; sin embargo, la produccin heterotrfica no es tan
eficiente como al usar microalgas fotosintticas. Esto debido a las fuentes de carbono orgnico renovable requeridas para el crecimiento
de hetertrofos.

27

Tabla 4.2: Contenido de aceite de algunas microalgas.


Microalga

Contenido de aceite (% peso seco)

Botryococcus braunii

25-75

Chlorella sp.

28-32

Crypthecodinium cohnii

20

Cylindroteca sp.

16-37

Dunaliella primolecta

23

Isochrysis sp.

25-33

Monallanthus salina

>20

Nannochloris sp.

20-35

Nannochloropsis sp.

31-68

Neochloris oleoabundans

35-54

Nitzchia sp.

45-47

Phaedactylum tricornutum 20-30

Tomada de Chisti, 2005

Schizochytrium sp.

50-77

Tetraselmis suecica

15-23

28

Algunas microalgas como Botryococcus braunii, Nannochloropsis sp. y Schizochytrium sp., en determinadas condiciones producen
mas de un 65% de aceite. Su cultivo puede realizarse en estanques o fotobioreactores en zonas geogrficas con escasos recursos
naturales. Dunaliella tertiolecta acumula glicerol el que puede ser transformado en biodiesel. Esta microalga puede adaptarse a un rango
extremadamente amplio de salinidades (Ginzburg, 1987). La composicin qumica nica de D. tertiolecta otorga beneficios para su
cultivo a gran escala y la tolerancia al stress por sal facilita la mantencin de cultivos unialgales outdoor (Tsukahara y Sawayama, 2005).
Adems de B. braunii y D. tertiolecta, varias algas tienen caractersticas particulares de crecimiento, especialmente con alta tasa
de multiplicacin y alto contenido de protenas. Entre ellas, Chlorella vulgaris es la especie mas comn para cultivo de biomasa, y la
informacin bsica de su fisiologa en condiciones de cultivo es bien conocida. No obstante, su uso para la produccin comercial de
alimento posee un gran potencial para la obtencin de combustible.

4.- Produccin de biomasa microalgal


La produccin de biomasa microalgal es generalmente ms costosa que los cultivos agrarios. El crecimiento fotosinttico requiere
luz, dixido de carbono, agua y sales inorgnicas. La temperatura debe permanecer constante generalmente entre 20 a 30C. Para
minimizar los costos, la produccin de biodiesel debiera descansar en la produccin de la luz del sol disponible gratuitamente, a pesar de
las variaciones diarias y estacionales en los niveles de luz.
El medio de crecimiento debe ser provisto de elementos inorgnicos que constituyen la clula algal. Los elementos esenciales
incluyen nitrgeno, fsforo, hierro y en algunos casos silicona. Los requerimientos nutricionales mnimos pueden ser estimados usando
la formula molecular aproximada de la biomasa microalgal que es CO0.48H1.83N0.11P0.01 (Grobbelaar, 2004). Los nutrientes tales como el
fsforo debe ser suplementados en exceso ya que el fosfato agregado forma complejos con los iones metlicos, adems no todo el P

29

agregado es biodisponible (Chisti, 2007). Lo ms comn es el uso de agua de mar suplementada con fertilizantes comerciales a base de
nitrato y fosfato y unos pocos micronutrientes para el crecimiento de microalgas marinas (Molina Grima y cols.., 1999).
La biomasa microalgal contiene aproximadamente el 50% de carbono por peso seco (Sanchez Miron y cols.., 2003). Todo este
carbono es tpicamente derivado desde el dixido de carbono. La produccin de 100 T de biomasa microalgal fija alrededor de 183 T de
dixido de carbono. El dixido de carbono debe ser agregado continuamente durante las horas de luz solar. La adicin controlada en
respuesta a seales desde sensores de pH minimiza la perdida de dixido de carbono y las variaciones de pH. La produccin de biodiesel
podra en el futuro asociarse al uso del dixido de carbono producido en industrias que queman combustible fsil (Sawayama y cols..,
1995). Este dixido de carbono puede estar disponible a bajo costo o en forma gratuita. Idealmente, el biodiesel microalgal podra ser
carbono neutral, como toda la energa necesaria para la produccin y procesamiento de las algas.
La produccin a gran escala de la biomasa microalgal generalmente usa cultivos continuos outdoor utilizando luz natural. En este
mtodo de operacin, el medio de cultivo fresco es agregado a una razn constante y la misma cantidad de cultivo microalgal es retirado
constantemente (Molina Grima y cols., 1999). La alimentacin cesa durante la noche, pero la agitacin del cultivo contina para prevenir
el asentamiento de la biomasa (Molina Grima y cols., 1999). Tanto como el 25% de la biomasa producida durante el da, puede ser
perdida durante la noche debido a la respiracin. La extensin de esta prdida depende del nivel de luz bajo la cual crece la biomasa, la
temperatura de cultivo y la temperatura en la noche.
El nico mtodo prctico para la produccin a gran escala de microalgas son los raceway (Terry and Raymond, 1985; Molina
Grima, 1999) y los fotobioreactores tubulares (Molina Grima y cols.., 1999; Tredici, 1999; Sanchez Miron y cols.., 1999).

30

Tabla 2.3: Comparacin de las propiedades de combustibles.


Propiedades

Biodiesel

desde Combustible

ASTM

biodiesel

aceite microalgal

Diesela

estndar

Densidad (kg/l)

0.864

0.838

0.86-0.9

Viscosidad (mm2/s, cSt a 40C)

5.2

1.9-4.1

3.5-5.0

Punto de Flash (C)

115

75

min 100

Punto de solidificacin (C)

-12

-50 a 10

Punto de Cold filter plugging (C)

-11

-3.0 (mx -6.7)

mx

verano

0;

mx invierno <15
Valor cido (mg KOH/g)

0.374

mx 0.5

mx 0.5

Valor calorfico (MJ/kg)

41

40-45

Razn H/C

1.81

1.81

Tomada de Miao y Wu, 2006

31

Captulo V: Biopelculas Microalgales y su uso en la Acuicultura.


1Mario
1Unidad

Lody C, 2Claudia D. Infante.

de Recirculacin y Crecimiento Larval, 2Laboratorio de Ecologa Microbiana, Facultad de Recursos del Mar & Centro de Bioinnovacin,
Universidad de Antofagasta

1. Introduccin
Las biopelculas microbianas comenzaron a tomar importancia como un componente clave en el desarrollo de comunidades
biolgicas en los diferentes ecosistemas acuticos, a inicios de los aos setenta. Actualmente existen muchos laboratorios en el mundo
dedicados al estudio de las biopelculas microbianas los cuales investigan aspectos tan variados como uso de estas en bioremediacin,
medicina e ingeniera ambiental (Costerton y cols.., 1995). En el mbito marino, particularmente en la acuicultura existen antecedentes
bsicos que las biopelculas microbianas pueden estimular y/o inhibir el asentamiento larval de invertebrados marinos (Hormstrom &
Kjelleberg 1993). En el ecosistema marino un componente importante de las biopelculas microbianas son las microalgas, ya que estas
proveen de productos extracelulares (EPS) que permiten el establecimiento de comunidades microbianas multi-especificas. Uno de los
problemas para producir biopelculas mixtas (bacterias-microalgas) es la carencia de sistemas apropiados para su produccin masiva

32

2. Formacin de Biopelculas.
Las biopelculas se definen como poblaciones bacterianas adheridas por una matriz entre ellas y/o entre sustratos o interfaces.
Esta definicin incluye agregados microbianos, flculos y poblaciones adherentes dentro de los espacios de poros o medios porosos.
(Costerton y cols, 1995)La biopelcula bacteriana se forma como resultado de clulas plantnicas que encontraron una superficie
adecuada para su asentamiento. Las clulas utilizan polmeros extracelulares pegajosos para adherirse reversiblemente, compuestos
principalmente de fibrillas de polisacridos de glucosa y fructosa (Abarza and Jakubowski, 1995). Las colonias bacterianas cambiarn
su fenotipo desde comportamiento planctnico a un estado metablico adaptado a la biopelcula, incluyendo una mayor produccin de
sustancias polimricas extracelulares (EPS, segn sus siglas en ingls para extracelular polymeric substances,EPS) (Marshall,
2006).Estos cambios dan como resultado una comunidad microbiana multi-especifica altamente estructurada, atrapada en una matriz
polimrica producida por ella misma (Costerton y cols,. 1995, Watnick & Kolter, 2000).
Las biopelculas bacterianas son comunidades organizadas, que forman una arquitectura intrincada con microcolonias de varias
especies distintas, con canales de agua dentro de la matriz para permitir el transporte de nutrientes o metabolitos a travs de un flujo
convectivo (Costerton, 1995). Estas comunidades presentan una estructura anloga a los tejidos eucariontes, donde las clulas logran
una eficiencia fisiolgica y un alto nivel de proteccin de los estmulos nocivos externos.
Las biopelculas son ubicuas en los ambientes acuticos (Costerton y cols., 1995), particularmente en el mar, donde todas las
superficies son susceptibles de ser colonizadas una vez sumergidas (Krug, 2006). De manera general, las clulas constituyen alrededor
del 2-5% de la biomasa; el resto de la biopelcula est compuesta por la matriz de EPS (exopolisacridos, protenas, cidos nucleicos,
glicoprotenas, fosfolpidos y otros surfactantes) que tambin incluye traza de iones y sustancias hmicas del entorno (Allison, 2003).

33

Durante el proceso de adhesion, las clulas bacterianas alteran sus fenotipos en respuesta a la proximidad de una superficie. La
adsorcin espontnea de macromolculas y molculas hidrofbicas pequeas alteran la naturaleza qumica del sustrato,
acondicionndolo bioqumicamente a la adherencia primaria de bacterias. En esta primera etapa, bacterias ssiles se encuentran en una
juxtaposicin estable con otras clulas de la misma especie o de otras, formando microcolonias mixtas o nicas. Estas juxtaposiciones y
la produccin de una matriz de exopolisacridos dentro de la biopelcula en desarrollo, condicionan el microentorno de cada bacteria de
la biopelcula. Diferentes biopelculas responden a condiciones microambientales especficas, con diferentes patrones de crecimiento y el
desarrollo gradual de una biopelcula madura estructuralmente distinta (Wahl, 1989) (Fig. 5.1) La generacin de gradientes qumicos,
concentracin de oxgeno disuelto y variacin de pH, favorecen la coexistencia con otras especies bacterianas con distintos estados
metablicos (Costerton J. W & Stewart P. S., 2001) y en ocasiones coexistiendo con otros grupos de microorganismos como las
microalgas. Finalmente, se produce un desprendimiento de la biopelcula, desde el centro de sta hacia fuera (Mai-Prochnow y cols.,
2004) donde algunas clulas vuelven a su estado libre y escapan para formar nuevos biopelculas.

34

Figura 5.1. Formacin de biopelcula bacteriana

3. Factores que contribuyen a la formacin de una Biopelcula.


La superficie suele tener considerable importancia como hbitat para la formacin de biopelculas debido a que adsorben
nutrientes. El comportamiento de colonizacin de algunas bacterias y microalgas vara dependiendo de la hidrofobicidad del sustrato.
Las clulas, en superficies hidrofbicas (no polares) forman biopelculas estrechamente compactadas consistiendo de clulas nicas y
pareadas, en contraste, superficies hidroflicas son escasamente colonizadas (Donlan RM & Costerton WJ, 2002).

35

La temperatura e irradiacin son factores importantes a considerar en el medioambiente (Mac Intyre & Cullen JJ. 1995). En aguas
poco profundas ambas variables cambian en relacin a la estacionalidad y mareas, afectando en la actividad bntica bacterial. Estudios
en zonas del intermareal o submareal han demostrado que la temperatura puede ejercer un control sobre la fotosntesis y una
aclimatacin y/o cambio de la comunidad microfitobentonica (Barranguet y cols., 1998).
Los nutrientes son necesarios para la formacin de biopelculas considerando a los ms esenciales como C; N; P, pero los factores
ms importantes que afecta el crecimiento bacterial en el ecosistema acutico es la produccin primaria (Bird & Kalff 1984). Debido a
que los productos extracelulares del fitoplancton estimulan la proliferacin de bacterias (Riquelme & Ishida, 1988). Demostrado a travs
de estudios la relacin existente entre la productividad primaria y diversos parmetros del bacterioplancton, relacionando
positivamente la abundancia de bacterias y fitoplancton (Avendao y cols., 2003; Juhl & Murrell 2005).

36

C
A

Figura 5.2. Formacin de Biopelculas: A) La adsorcin de macromolculas y molculas hidrofbicas acondicionan bioqumicamente el sustrato y
favorecen la adhesin de bacterias ssiles que han formado microcolonias. B) Seales qumicas del sustrato y de las microcolonias bacterianas son
sensadas por microalgas, especialmente diatomeas, las que secretan sustancias polimricas extracelulares (EPS) que les permiten adherirse al sustrato o
alas colonias bacterianas. Esta adhesin es de tipo reversible y se transformar en irreversible, si las condiciones fisicoqumicas y las seales sensadas son
favorables. C) establecida la biopelcula mixta bacteria-microalga, se envan seales de asentamiento para colonizadores secundarios (larvas de
invertebrados, esporas de macroalgas e invertebrados)

37

Figura 5.3. Factores mediambietales que contribuyen a la formacin de


una biopelcula.

Las biopelculas se encuentran en una gran variedad de superficies, incluyendo tejidos vivos, aparatos mdicos, tuberas de
sistemas de agua potable y en sistemas acuticos marinos (Fig 5.4). Son ejemplos comunes de biopelculas la placa dental, la capa
resbaladiza de las rocas de un arroyo, y hasta el limo que inevitablemente se materializa en el fondo de un jarrn de flores al segundo o
tercer da.

38

En algunos lugares pueden llegar a producir efectos indeseables como: entorpecimiento del flujo de agua en las tuberas o de
petrleo en los oleoductos, aceleracin en la corrosin de tuberas; degradacin de objetos sumergidos como plataformas petroleras,
barcos e instalaciones acucolas situadas en la costa.

4. Caractersticas De Las Biopelculas


Son heterogneas: pueden estar formadas por bacterias, hongos, microalgas. Se ha visto que cuando los microorganismos son
variados dentro de una biopelcula presentan diferentes microambientes de pH, presin parcial de oxgeno, concentracin de iones,
carbono y nitrgeno (Costerton y cols.. 1994; Vroom y cols.. 1999).
La hidrodinmica juega un importante rol en el desarrollo de la biopelcula pues estas agregaciones se forman en una interfase
lquido-slido donde la velocidad del flujo que las atraviesa influye en el desprendimiento fsico de los microorganismos, con sistemas de
canales que les permiten el transporte de nutrientes y desechos (Juhl & Murrell 2005).
La resistencia de las biopelculas a diferentes agentes antimicrobianos. Las hace invencibles y contenidas en el exopolmero
forman una estructura impermeable en donde slo los microorganismos ms superficiales se ven afectados (Betancourth M, 2004).

5. Importancia de las Biopelculas en la Industria Acucola


Diversas investigaciones muestran que las larvas de moluscos se asientan en respuesta a un tipo especfico de biopelcula
formado sobre un sustrato (Wainman y cols., 1996). La presencia de complejas comunidades multi-especficas sobre sustratos es un

39

fenmeno natural y la formacin de microambientes sobre superficies limpias es algo inevitable (Cooksey & Wigglesworth-Cooksey,
1995). Los primeros colonizadores y constituyentes principales que conforman las biopelculas en el medio natural son las bacterias y
microalgas (principalmente diatomeas). Estas comunidades multi-especficas podran generar el asentamiento y metamorfosis de larvas
de invertebrados a travs de la estimulacin o inhibicin de seales qumicas (Holmstrom & Kjelleberg 1993, Kavouras & Maki 2000) e
influir en el desarrollo larval por la produccin de molculas solubles, afectando el comportamiento de asentamiento

y/o la

metamorfosis larval (Maki J.S 1990). Ms an, la utilizacin de biopelculas multi-especficas y, fundamentalmente la interaccin
bacteria-microalga, puede tener un rol benfico en procesos digestivos, disminuyendo el crecimiento de algunos agentes nocivos o bien
interactuando para mantener la dinmica de la poblacin bacteriana en los sistemas de cultivo (Nakamura y cols., 1999, Riquelme y cols.,
2001).
En el cultivo del Abaln, por ejemplo, las biopelculas permiten que el asentamiento sea selectivo y especfico frente al substrato
(Hahn, 1989). En Haliotis discus hannai se ha observado respuestas de asentamiento diferentes de acuerdo a las especies de diatomeas
presentes en la biopelcula (Kawamura & Kikuchi 1992). En cambio en Haliotis laevigata, la densidad y madurez de la biopelcula son
factores relevantes desde el punto de vista del asentamiento larval, ms que el tipo de diatomeas presente en la biopelcula (Daume y
cols.. 1999). En Concbolepas concholepas estudios de quimiotaxis realizados con larvas pre-metamorfoseadas expuestas a distintas
biopelculas (bacterianas, multiespecficas microalgales y multiespecficas de bacteria-microalga) y en distintos substratos revelaron
una preferencia significativa por biopelculas multiespecficas de bacteria-microalga (Rodrguez y cols.., 1995). En el caso de Argopecten
purpuratus, el uso de biopelculas de diatomeas utilizando como sustrato mallas de Netlon favorece el asentamiento de post-larvas en el
laboratorio y en el medio natural, alcanzando asentamientos mayores que colectores sin biologizar o con la biologizacin tradicional
utilizada en los cultivos de ostin (Avendao y cols.., 2003). Estas experiencias plantean la potencialidad de utilizar las biopelculas
para mejorar la produccin de otras especies cultivables tales como el erizo rojo (Loxechinus albus).

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6.- Interaccin Bacteria-Microalgas en el medio ambiente acutico


La relacin entre el fitoplancton (incluyendo a las diatomeas) y el medio ambiente acutico juega un rol crucial en importantes
procesos tales como flujo de carbono y regeneracin de nutrientes (Azam, 1998). Variados estudios han demostrado fenmenos de
estimulacin e inhibicin de crecimiento en microalgas y/o bacterias (Kogure y cols., 1979). Incrementando las bacterias el crecimiento
microalgal (Berland y cols.., 1970) mediante la produccin de algunas vitaminas y factores de crecimiento (Haines & Guillard, 1974). Por
otro lado, las substancias orgnicas derivadas del fitoplancton en ecosistemas naturales son utilizadas por las bacterias como substrato
de crecimiento (Ohara y cols.., 1993). Transformando los compuestos ms complejos en formas ms fciles de utilizar por otros
organismos heterotrficos, dando una continuidad al flujo del carbono en el ambiente acutico (Malone & Durklow. 1990). Estudios ms
recientes empleando modernas tcnicas moleculares demostraron que el desarrollo de un bloom de diatomeas depende de la dinmica
de la comunidad bacteriana y las partculas asociadas a estas (Riemann y cols..2000). No obstante, algunos componentes de las
comunidades bacterianas actan tambin como antagonistas de algas (Safferman & Morris1962, Blasco 1965, Shilo 1970) e incluso en
aguas costeras son capaces de lisar clulas microalgales, denominndose bacterias asesinas (Baker & Herson 1978, Ishio y cols..
1989,Sakata 1990, Imai y cols.. 1993, 1995, Yoshinaga.y cols.. 1997). Por lo tanto, las interacciones que se producen entre bacteriafitoplancton son recprocas y estn determinadas principalmente por la utilizacin y produccin de carbono orgnico disuelto, por
clulas algales y su efecto en el crecimiento bacteriano (Fogg 1983, Jones & Cannon 1986). Adems, se ha evidenciado que en
ecosistemas acuticos las interacciones bacteria-fitoplancton son especficas (especie-especie), provocando un efecto positivo
(simbiosis) o negativo (antagonismo), dependiendo de las condiciones del ecosistema. Figura 8. Uso de las biopelculas en la acuicultura

41

En los cultivos comerciales de invertebrados marinos, generalmente

se provee de sustratos artificiales con biopelculas

microbianas inespecficas para el asentamiento larval, especialmente en el cultivo del Ostin del Norte, uno de los moluscos de mayor
inters comercial en Chile. Los cultivadores utilizan como substrato mallas de polietileno denominados netln, los cuales son
sumergidos durante varios das en agua de mar circulante, para permitir la formacin de biopelculas sobre su superficie. La
composicin microbiolgica de estas biopelculas es completamente desconocida, ya que no se tiene certeza de los microorganismos que
colonizan el netln, variando dichos componentes y su dominancia de acuerdos a los factores estacionales existentes.
La aplicacin e implementacin de biopelculas especficas (bacteria-microalga) deriva del consenso de diversos estudios que
sustentan que

biopelculas microbianas especficas pueden influenciar favorablemente el asentamiento larval (Davies y cols. 1998,

Holmstrom & Kjelleberg 1999, Avendao y cols.., 2003). Ms an estudios tanto en Argopecten purpuratus 5.7(Avendao y cols.., 2003)
como en otros moluscos Concholepas concholepas (Rodrguez y cols.., 1995), Crassostrea gigas (Weiner y cols.., 1989), C. virginica (Young
and Mitchell 1973; Weiner y cols.., 1985) han demostrado que utilizando sustratos artificiales con biopelculas bacterianas, microalgales
en experiencias in situ y/o bacteria-microalga 5.8las que contribuyen a atraer las larvas al sustrato y de estas forma mejorar el
asentamiento larval de invertebrados marinos.

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Figura 5.6. Asentamiento de semillas de A. purpuratus en colectores


biologizados con microalgas.Ct s/b (Control), Natural, Nv (Navicula
veneta), Fp (Niztschia sp) Las lneas verticales corresponden a la
desviacin estndar.

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Figura 5.7. Retorno de semillas de Argopecten purpuratus desde experiencias de fijacin con Amphora sp (NV).

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Capitulo VI: Sistemas de Cultivo Fotobioreactores


Claudia Seplveda V,Yery Luza P.
Unidad de Microbiologa Aplicada, Facultad de Recursos del Mar & Centro de Bioinnovacin, Universidad de Antofagasta

1. Introduccion
En la dcada de 1950 se postul por primera vez que el empleo de luz solar y agua marina para obtener cultivos masivos de
microalgas ricas en protena de alta calidad, podra ser una buena alternativa para obtener alimento para el ser humano (Becker,
1994).Sin embargo, el cultivo a gran escala de microalgas y el uso prctico de esta biomasa como un recurso de bioproductos fue
considerado seriamente por primera vez durante la Segunda Guerra Mundial (Harder & Von Witsch, 1942; Abalde, 1995; Becker, 1994).
An cuando existe una gran diversidad de microorganismos fotosintticos con elevado potencial para la industria acucola,
cosmtica, farmacutica, agrcola y acucola, tan slo un pequeo porcentaje de estos ha visto potencializado su aprovechamiento,
debido principalmente a la carencia de sistemas de cultivos que permitan explotarlos adecuadamente.
Las microalgas son cultivadas a nivel de laboratorio e industrial, y las caractersticas esenciales que debe poseer un sistema de
produccin debe incluir la disponibilidad de luz solar o artificial y un medio de cultivo que proporcionen los nutrientes apropiados para
el crecimiento de las microalgas.
La diversidad de los sistemas empleados para producir la biomasa microalgal tambin es muy amplia, aunque podran incluirse
en dos grandes grupos: sistemas abiertos de gran extensin y baja complejidad tcnica, para el cultivo, en condiciones muy especficas,

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de muy pocas especies (Spirulina sp, Dunaliella sp.), y sistemas cerrados, con condiciones de crecimiento muy controladas pero de mayor
complejidad tecnolgica (Gudin, 2002).
La mayora de los sistemas de produccin industrial de biomasa de microalgas construidos antes de los aos 90 fueron
esencialmente sistemas abiertos tipo carrusel, los que permiten alcanzar densidades celulares de hasta 0,7 g/L en base seca (ContrerasFlores, 2003)
La creciente demanda de biomasa microlagalha incentivado en los cientficos y tcnicos a iniciar programas para cultivarlas,
especialmente aquellas que se utilizan para el consumo humano. En algunos pases como Japn y China, el cultivo de las microalgas
representa una industria que se encuentra en expansin y en distintas partes del mundo se est trabajando intensamente para lograr
cultivarlas tanto con fines alimenticios como industriales.
En funcin de las distintas aplicaciones consideradas en captulos anteriores, actualmente se reconoce la importancia comercial
de distintas especies de microalgas; sin embargo, el desarrollo industrial en biotecnologa microalgal es escaso, debido
fundamentalmente a los elevados costos de produccin; para que la tecnologa microalgal alcance su potencial final estos debern ser
reducidos significativamente, incrementando los rendimientos para aumentar la rentabilidad (Richmond, 2004) o disminuyendo los
costos de construccin y mantencion. Para llevar a cabo la produccin masiva de microalgas es imprescindible seleccionar
adecuadamente el diseo de reactor que se va a utilizar. Para ello se deben tener en cuenta una serie de parmetros en funcin del
microorganismo que se va a emplear, como condiciones ptimas de crecimiento y resistencia a variaciones ambientales, as como
parmetros econmicos, tales como valor del producto obtenido, capital inmovilizado necesario, costos de operacin estimados, etc. De
esta forma, el diseo de reactores que permitan alcanzar altas productividades a unos costes moderados es una de las lneas de trabajo
ms importantes en el campo de la biotecnologa, y sin cuyo avance ser imposible una expansin mundial de esta industria.

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Los productos derivados de microalgas son tambin una importante fuente de compuestos para la industria alimenticia y
farmacutica. En la primera son utilizados como colorantes, antioxidantes y aditivos y en la segunda como vitaminas, provitaminas,
inmunotrazadores y antioxidantes.
Aunque es difcil precisar el mercado mundial de los productos nutracuticos, entre los que se encuentran las microalgas y productos
derivados, se estima que ste asciende a ms de 2 billones de dlares, con un crecimiento promedio anual del 7% (Freedonia Group
Inc.2000), debido a los beneficios que cientficamente se estn comprobando respecto de su consumo.

2. Sistemas De Cultivos Abiertos


En el diseo de estanques y piscinas se deben considerar los costos de inversin con respecto a las ganancias esperadas, por lo
que estos sistemas de cultivo deben tener en cuenta distintos factores como por ejemplo: la profundidad, la calidad del material de
revestimiento y la agitacin del cultivo. Es sabido que la profundidad de los estanques ha sido una limitante en la expansin de este
sistema de cultivo, ya que este factor es limitante al momento de la penetracin de luz al sistema. La agitacin es uno de los puntos ms
importantes, esta debe ser capaz de mezclar los nutrientes suministrados y facilitar la exposicin celular de las microalgas a la luz solar
para la realizacin de la fotosntesis, logrando el mximo potencial de crecimiento celular. El material utilizado en la construccin de
estos sistemas es de un costo elevado, es por ello que actualmente son poco utilizados.
Los distintos tipos de estanques y piscinas (Fig 6.1) han sido evaluados en forma extendida por distintos autores Becker 1994;
Abalde 1995, considerando los distintos aspectos relevantes para el xito de un cultivo masivo de microalgas. Finalmente en la
actualidad aun son utilizadas las piscinas tipo raceways, su utilizacin es limitada debido a problemas de contaminacin, suciedad y

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evaporacin, perjudicando la obtencin de biomasa final. El funcionamiento de estos sistemas de cultivos raceways es muy simple ya
que consta de una estructura de soporte, adems de un sistema de paletas rotatorias encargadas de recircular y agitar el medio en forma
homognea y continua, estas paletas son impulsadas por una bomba. En el mundo se ha trabajado con distintos materiales para su
construccin, ya sea de concreto, membranas de PVC, geomembranas, policarbonatos, etc.

Figura 6.1: Sistemas de cultivos en piscinas circulares, utilizadas en


Brasil.

Este tipo de sistema se encuentra restringido solo para algunos tipos de microalgas como lo son la Spirulina, la cual posee
caractersticas muy adecuadas para un cultivo a gran escala, obteniendo biomasa rica en protena, crece a pH muy elevados y
condiciones muy extremas de cultivo obteniendo un alto nivel industrial (Molina, 2003). Para las especies Dunaliella salina y
Haematococcus pluvialis, el proceso de cultivo en raceways ha sido desarrollado en distintos lugares del mundo, debido a que por las

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caractersticas de estas microalgas el estar en condiciones extremas de luminosidad y salinidad favorecen sus procesos metablicos,
obteniendo asi beta-caroteno de alta calidad.
Algunos de los pases que han desarrollado sistemas de cultivos tipo raceways son: China, Singapur, Taiwn, Israel, Sudfrica,
India, Tailandia, Per y Chile.
Los principales productores de Spirulina a nivel mundial se localizan en Estados Unidos, Japn, Israel y Australia, abasteciendo a
sus propios mercados y a otros como Comunidad Europea y Canad. Por otra parte, China e India constituyen importantes productores
al sumarse la biomasa de cultivos de pequea a mediana escala, que realizan agrupaciones comunitarias para consumo interno,
principalmente.
En Chile existen cinco empresas dedicadas a la produccin de microalgas (principalmente Spirulina), todas ubicadas en la zona
norte del pas, la que presenta condiciones ambientales muy favorables para los cultivos de Spirulina y otras microalgas: abundante luz
solar durante todo el ao, temperatura ambiental promedioentre 5C y 33C-, abundantes napas subterrneas de agua dulce de
excelente calidad, agua de mar que se puede desalinizar -dependiendo de la microalga- y grandes depsitos naturales de salitre, base del
medio de crecimiento de cualquier microalga (Fig 6.2 y 6.3). El ao 2003 se exportaron 13 toneladas de microalgas que corresponden a
US$129.751, un alza de 68% respecto al 2002. Las empresas nacionales involucradas en el cultivo de estas microalgas desarrollan sus
cultivos exclusivamente en sistemas tipo raceways, el cual genera limitantes para la elaboracin de productos de mayor valor agregado.
El desarrollo de la fase elaboradora es an incipiente, siendo necesario para esta industria la incorporacin de tecnologa tanto en fase
de cultivo como en procesamiento (Proyecto fondef UNAP).

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Figura 6.2. Estanque raceways ubicado en el Norte de Chile, en la


localidad de Pica al interior, corresponde a la empresa ASTAX Chile.
2007

(Gentileza

Proyecto

Explora

CONICYT,

Universidad

de

Antofagasta)

Figura 6.3. Proyecto Haematococcus pluviales, ubicado al Norte de Chile,


2007 (Gentileza fotografa Ernesto Retamales).

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3. Sistemas De Cultivos Cerrados


El perfeccionamiento de la tecnologa de cultivo de los sistemas raceways hace tiempo lleg a su limite, quedando restringido slo
para cierto tipo de microalgas, dificultando el desarrollo biotecnolgico del cultivo microalgal. La baja densidad celular obtenida en estos
sistemas para algunas especies de microalgas, origina varios inconvenientes, incluyendo baja productividad, fcil contaminacin, costosa
recuperacin del producto desde medios diludos y dificultad para el control de la temperatura.
Las tcnicas de sistemas de cultivos cerrados de produccin de microorganismos fotoautotroficos son denominados
fotobiorreactores (PBR). Estos sistemas pueden ser evaluados en sus varios conceptos de configuracin respecto su potencial productivo
y factibilidad econmica (Pulz 2001). Los primeros fotobiorreactores fueron propuestos por Pirt y cols., 1983 y Gudin y Thepenier,
1986). El cultivo intensivo de microalgas ha sido posible en gran medida gracias al diseo de fotobiorreactores (Contreras y cols. 2003).
En la ultima dcada los fotobiorreactores tubulares y de placas planas han recibido, entre otros, mucha atencin, ya que permiten
establecer cultivos de alta densidad celular: 3 o ms veces que los sistemas de cultivos tipo raceways; adems, no restringe el tipo de
microalga a cultivar. Estos sistemas de cultivos presentan las siguientes ventajas:
1. Facilidad para cosechar la biomasa.
2. Mantenimiento del cultivo sin contaminacin.
3. Mejor control de las condiciones de cultivo.
4. Menor inversin de capital en el fotobioreactor.

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Los fotobioreactores para monocultivos de microalgas a gran escala han sido convencionalmente diseados como dispositivos
con grandes proporciones superficie/volumen. Varios tipos de fotobioreactores tubulares son ejemplo de este enfoque (Lee, 1992;
Borowitzka, 1996). Los fotobiorreactores cerrados pueden ser localizados en interior o exterior, pero la ubicacin en exteriores es mas
comn debido a que puede hacer libre uso de la luz solar (Acien y cols., 2003). Los fotobioreactores cerrados se han utilizado para
minimizar la introduccin de contaminantes e incrementar el control del sistema (Rusch, 2003). Muchos de estos sistemas cerrados
consisten en fotobiorreactores tubulares diseados con tubos de diferentes dimetros y longitud as como de materiales transparentes
(Tredici, 1999).

4. Recomendaciones Para El Diseo De Fotobioreactores


Segn lo discutido en trabajo realizado por Contreras-Flores 2003 titulado Avances en el diseo conceptual de fotobiorreactores
para el cultivo de microalgas
1. la trayectoria de la luz debe ser pequea (2,5 cm).
2. Mantener una alta densidad celular (>8-15g/L).
3. Un mezclado vigoroso para asegurar ciclos de luz/oscuridad de alta frecuencia.
4. Usar tramos cortos de tuberas (20 30 m) para evitar inhibicin del crecimiento por acumulacin de CO2.
5. Evitar acumulacin de sustancias inhibitorias
6. Mantener temperaturas y pH ptimos.

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Diseos de Fotobioreactores
En el mundo se han realizado un sin numero de investigacin con respecto a la optimizacin del proceso de cultivo de microalgas,
basados en la produccin de biomasa microalgal a travs de fotobioreactores cerrados, variando en su forma, funcionamiento y material
de construccin. En distintos trabajos y revisiones bibliograficas se encuentra variada informacin de acuerdo a su productividad de
biomasa, principal objetivo de estos sistemas para poder llegar a producir microalgas a nivel industrial de manera econmicamente
viable.

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Tabla 6.1: Sistemtica de equipamientos de cultivo para sistemas abiertos y cerrados

Tipo bsico

Variables tcnicas

1. Sistemas abiertos
Contenedor

Material plsticos o vidrios

Aguas naturales

Desarrollo de turbulencia (bombeo y


agitacin)

Estanques Raceways

Direccin de flujo (horizontal o vertical)

superficie inclinada

Superficie para el volumen

2. Sistemas cerrados
Fundas plsticas

Mayor remocin de O2 y menor entrada


de CO2

Estanques fermentadores

Tipo y duracin de iluminacin

Fotobioreactor tubular

Control de temperatura

Esterilizacin

Fuente: O. Pulls, 2001. Photo bioreactors: Production systems for phototropic Microorganisms.

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En la Universidad de Almera, Espaa, han trabajado con distintos tipos de fotobioreactores, los cuales han sido diseados en base
a la influencia de las condiciones ambientales, fluido-dinmicas del crecimiento y productividad de cada especie. Estos estudios son
realizados primeramente a nivel de laboratorio y en condiciones internas, para ello trabajan con fermentadores de 2 a 5 Litros (Fig. 6.4
A), en los cuales controlan todas las variables de operacin. Posteriormente los resultados son verificados y generalizados en
fotobioreactores a nivel de planta piloto. Los sistemas de cultivos utilizados por el grupo de investigacin constan de sistemas cerrados
de fotobioreactores tubulares y columnas verticales (Fig 6.4 B y C), los cuales permiten un mejor control en la operaciones y disminucin
de contaminantes para la produccin de un cultivo monoalgal.

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Figura 6.4: Fermentador utilizado a nivel de laboratorio (A), Fotobioreactor columnas verticales (B) y fotobioreactores tubulares (C).

Los fotobiorreactores tubulares horizontales utilizados consisten en un desgasificador vertical conectado a un lazo horizontal
sumergido en un bao termostatizado, a travs de dos tubos provistos de diferentes vlvulas para toma de muestras e inyeccin de CO2.
Se dispone adems de dos depsitos de 0,50 m3 de capacidad, as como bombas dosificadoras para trabajo en continuo y una bomba de
caudal superior para adiciones rpidas de medio. Cada fotobiorreactor est provisto de una sonda de temperatura, as como electrodos
de pH y oxgeno disuelto. Posee adems, una entrada de aire estril en uno de los conductos verticales, para producir la circulacin del
cultivo, y una doble entrada de gases para inyeccin de CO2, estando todo el sistema controlado mediante una unidad de control. El

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sistema se encuentra orientado al sur para maximizar la captacin de energa solar durante el da. En el desgasificador se encuentran los
electrodos y sonda de temperatura, as como un reservorio para trabajo continuo, y conducciones de entrada de medio en continuo,
entrada rpida de medio y salida de gases. Todas estas conexiones estn aisladas del exterior para evitar posibles contaminaciones. El
tanque de cosechado, por el que salen al exterior las corrientes gaseosas de cada reactor, se encuentra provisto de filtros de
esterilizacin Millipore de 0,2 m de dimetro de poro.
La circulacin del cultivo se induce mediante burbujeo de aire en uno de los conductos verticales (conducto de ascenso). La
mezcla entre el cultivo y el aire burbujeado produce una disminucin de la densidad del fluido en dicho conducto, que por diferencia
produce la circulacin del cultivo. Por tanto, para modificar la velocidad de circulacin se pueden modificar dos factores: la altura del
desgasificador y el caudal de aire aportado al conducto ascendente. Durante la experimentacin, ninguna de las dos variables se ha
modificado por lo que la velocidad de circulacin se ha mantenido constante e igual en ambos reactores, con un valor de 0,35 ms-1.
Los reactores tipo columna de burbujeo con recirculacin consisten esencialmente en un tanque de lquido dividido en dos zonas
interconectadas, de las cuales slo una es burbujeada con un gas. La diferencia de gas retenido entre la zona gasificada y no gasificada
origina una diferencia de densidad del fluido que produce la circulacin en el reactor.
La parte de reactor en la que se inyecta el gas y se produce la impulsin del fluido se denomina conducto ascendente, mientras
que la parte por la que desciende dicho fluido se denomina bajante, o conducto descendente
En teora, las columnas de burbujeo con recirculacin se pueden emplear para cualquier sistema gas-lquido. De esta forma, se ha
establecido la tcnica y el desarrollo econmico para utilizar este tipo de unidades en numerosos procesos, siendo cada vez ms
frecuentes en fermentaciones aerbicas, tratamiento de aguas residuales y otras operaciones similares. La simplicidad de su diseo y
construccin, la mejor definicin de los flujos (Merchuk, 1986) y los comparativamente bajos consumos de potencia para las velocidades
de transporte alcanzadas, hacen de ellos unos reactores muy atractivos desde el punto de vista industrial (Chisti, 1989). As, la

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produccin continua de cerveza, vinagre, cido ctrico y biomasa de levaduras, bacterias y hongos, se lleva a cabo en columnas de
burbujeo con recirculacin a diferentes capacidades de trabajo. En Rusia y Europa del Este se han empleado estos reactores para la
obtencin de protenas mediante cultivo de levaduras (Blakerbrough y col., 1967) y en Inglaterra la compaa ICI ha trabajado con un
fermentador tipo columna de burbujeo de 1500 m3 para el proceso PRUTEEN (Westlake, 1986).
Se estima que la utilizacin de estos reactores reduce en un 50% los consumos de potencia, lo cual repercute en una reduccin de
un 50% en los costos de la biomasa producida. La diferencia de productividad observada respecto a los reactores race-ways se atribuye
al hecho de que en los ltimos los coeficientes de transferencia de materia son mucho menores, adems de que la agitacin mecnica
puede producir daos en las clulas debido a las fuerzas de corte que introducen.
En cuanto a la clasificacin de estos reactores, se ha investigado una amplia variedad de ellos, los cuales a menudo se confunden
en bibliografa. Bsicamente se pueden distinguir dos tipos;
(a) la columna de burbujeo con recirculacin interna, que bsicamente podra consistir en una columna de burbujeo en la que
se coloca una entrada inferior de aire y unos paneles para separar las dos zonas de circulacin, y
(b) la columna de burbujeo con recirculacin externa, donde las zonas de ascenso y descenso estn separadas y se conectan
horizontalmente por el extremo superior e inferior. Estos tipos bsicos se pueden subdividir ms atendiendo a los diseos particulares
de cada uno.
El ltimo aspecto en el que se est trabajando en el grupo es en la relacin entre la frecuencia de exposicin de las clulas a la luz
y su productividad. Para ello se ha trabajado con una tcnica muy usual en el campo de los catalizadores y la circulacin de fluidos por
sistemas complejos, como es el CARPT (Computer Assisted Radiactive Particle Tracking). La tcnica consiste en insertar una partcula
radioactiva en el sistema y registrar, mediante detectores adecuados situados en diversas posiciones, como es la trayectoria de estas

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partculas. La informacin obtenida se analiza y de ella se obtiene el campo de velocidades, de trayectorias, e incluso los tiempos de
residencia en cada zona del reactor.
Existen diversos trabajos publicados por el grupo del Departamento de Qumica de la Universidad de Almera en revistas
cientficos muy importantes en el mundo. Durante el ao 1999 se realizo un trabajo titulado Photobioreactors: light regime, mass
transfer, and scaleup, publicado en la revista Journal of Biotechnology, en donde se emplea un modelo matemtico de transferencia de
masa, para evaluar distintos diseos de fotobioreactores tubulares out door, en donde la productividad de cultivo esta siempre
controlada por la disponibilidad de luz, sobre todo cuando la escala de produccin aumenta. Finalmente despus de analizar distintos
tipos de fotobioreactores cerrados propuestos, el fotobioreactor tubular es el que presenta mayores ventajas de escalamiento aun asi
considerando que su funcionamiento es mucho ms complejo que los sistemas de cultivos abiertos. Problemas de irradiancia,
suplemento de dixido de carbono son ms bien problemas fciles de resolver. Las dificultades ms bien se presentan al momento de
escalar los volmenes y dimetros de las tuberas, incrementando asi la zona de luz y oscuridad a la cual se encuentra expuesta la
microalga. El presente trabajo recomienda no utilizar dimetros superiores a 0,1 m y longitud de tubos no superiores a 80 m con una
velocidad de flujo de 0.3 0.5 m s -1.
En otro ensayo realizado en el ao 1999 titulado Use of concentric-tube airlift photobioreactors for microalgal outdoor
mass cultures publicado en la revista Enzyme and Microbial Technology por el mismo grupo de trabajo se analizaron dos sistemas de
cultivos: un fotobioreactor airlift vertical outdoor (ALP) y un segundo sistema denominado fotobioreactor tubular horizontal de tuberas
(HLTP) ubicados en el mismo lugar, usado para cultivar Phaeodactylum tricornutm UTEX 640. La productividad de biomasa mxima fue
similar en ambos, a pesar de la alta viabilidad de luz en HLTP. La eficiencia fotosinttica fue mayor en ALP. Este comportamiento fue
atribuido a la fotoinhibicin en HLTP y al efecto negativo de un inapropiado ciclo de luz y oscuridad.

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5. Caractersticas Fsico Qumicas Del Funcionamiento De Un Fotobiorreactor


a)

Luz

La luz es el parmetro ms importante en el diseo y construccin de un fotobioreactor. A pesar de su importancia, la luz puede ser una
entrada muy complicada de medir en lo que se refiere a la determinacin de la eficiencia del fotobioreactor (Janssen y cols.. 2002). Puede
ser suplementada continuamente o a travs de ciclos de luz y oscuridad. Como las concentraciones celulares varan, los requerimientos
de luz tambin cambian. El crecimiento algal esta limitado cuando la luz es escasa y cuando es abundante. La tasa de fotosntesis celular
(capacidad de captacin de fotones) depende de la energa luminosa que reciben las clulas. La curva dosis respuesta que describe esta
relacin representa una respuesta tpica del crecimiento respecto a la disponibilidad de sustrato (Richmond, 2000). A bajos niveles de
intensidad luminosa la rapidez de la fotosntesis aumenta con la intensidad de luz, pero a niveles de energa incidentes superiores a un
cierto valor (constante especfica Ek) inducen slo pequeos cambios en F. La constante especfica Ek, caracterstica para cada
organismo, indica el nivel de energa luminosa al que comienza a saturarse el fotosistema de un organismo. La energa incidente puede
llegar a niveles que causan inhibicin de los fotosistemas celulares, lo cual puede deteriorar el cultivo y causar incluso un dao
irreversible a las clulas microalgales.

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Figura 6.5. Sala de cultivos provista de iluminacin natural, Unidad de


Microbiologia Aplicada, Facultad de Recursos del Mar, Universidad de
Antofagasta.

b)

Circulacin
La circulacin es importante para asegurar varias condiciones claves en los cultivos de microalgas, entre ellas mantener un

adecuado intercambio gaseoso, ptimos niveles de iluminacin de las algas, la temperatura y mantener cierto control del pH al interior
del cultivo. Los fotobiorreactores pueden ser bombeados con aire, pero la baja concentracin de CO2 en el aire (0,033%) a menudo limita
el crecimiento fototrpico. Con un flujo de aire de 1Lmin-1, asumiendo que todo el dixido de carbono es usado y la biomasa es 50% de
carbn, hay suficiente para soportar 3.54x10-4 gramos de biomasa min-1; esto es una muy baja productividad. El principio de airlift en
el cual la circulacin se logra creando diferencias en la densidad del agua en diferentes regiones del fotobiorreactor. Este principio es

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comn en fermentadores y ha sido implementado a los fotobiorreactores en la Unidad de Microbiologa Aplicada de la Universidad de
Antofagasta (figura 2). Estos fotobiorreactores usan una columna de burbujeo de PVC de 1 metro de largo con circulacin interna de
agua, la incorporacin de gases a se ejecuta a travs de una manguera hasta la mitad del fotobioreactor producindose la diferencia de
densidad la cual origina la circulacin ascendente del medio de cultivo (Fig. 6.6). esta agitacin es uno de los ms importantes factores en
el cultivo de microalgas masivas y en la obtencin de altos rendimientos de biomasa. La agitacin implica una combinacin de varios
efectos, por ejemplo, la dispersin uniforme del alga asegura la frecuente exposicin a la luz, evade el asentamiento del alga en el fondo
del cultivo, permite una adecuada distribucin de los nutrientes, mejor utilizacin del dixido de carbono y previene la estratificacin
termal. Si la velocidad de mezcla es muy lenta, las clulas muertas y otras formas de desechos orgnicos se acumularan en el fondo,
especialmente donde la turbulencia es mala. Este hecho incrementa las zonas de condiciones anaerbicas, disminuyendo la calidad de la
biomasa. En sistemas abiertos como piscinas (raceways) el flujo turbulento es esencial para la produccin de microalgas, previniendo el
asentamiento de clulas, se evade la estratificacin termal y oxignica del cultivo.

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Figura 6.6. Fotobiorreactor Air-Lift para microalgas bentnicas


diseado en la Unidad de Microbiologa Aplicada, Universidad de
Antofagasta. La inyeccin de aire suministrada a travs de una columna
vertical la cual permite la diferencia de densidades logrando una
circulacin ascendente de flujo de agua del fondo del tubo.

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c)

Suministro de CO2
Cmo suplementar CO2 al cultivo algal tiene una consideracin de ingeniera clave. Cuando se habla de transferencia de CO2 desde

el aire al cultivo hay que tener en cuenta: el rgimen de mezcla, la concentracin de CO2 en el cultivo (del cual dependen el pH y la
alcalinidad) y el efecto causado por la reaccin del CO2 disuelto con OH- para producir bicarbonato.
Entre las tcnicas ms sobresalientes de distribucin de CO2 en el cultivo y eficientes en la distribucin en trminos de utilizacin por el
alga son:
a) Transferencia activa de gas a travs de dispersin de pequeas burbujas en el medio o rociando el liquido a travs de la fase
gaseosa; y
b) Transferencia pasiva por creacin de grandes reas de contacto entre el CO2 atmosfrico y la superficie del medio de cultivo.
El O2 atmosfrico requiere de atencin tambin en el cultivo, ya que en un experimento con diferencias de O 2 en el medio de cultivo
demuestran que la eficiencia fotosintetica es incrementada al 14% sin presencia de O2, pero se reduce cerca del 35% cuando el medio es
saturado con el 100% de O2.

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Figura 6.7. Flujmetro utilizado para suministrar dosis hasta 200


ml/min (PTFE)

c)

Temperatura
La temperatura influencia la respiracin y la fotorespiracin ms fuertemente que la misma fotosntesis. Cuando la luz o el CO2 es

limitante para la fotosntesis, la influencia de la temperatura es insignificante. Con un incremento en la temperatura, la respiracin se
eleva significativamente, pero el flujo en ciclo de Calvin incrementa slo marginalmente. As, la eficiencia neta de fotosntesis declina a
altas temperaturas. Este efecto puede empeorar en cultivos suspendidos por las diferencias en la baja solubilidad de CO 2 y O2 al elevar la
temperatura.

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Figura 6.8. Monitoreo de temperatura ambiental en sala de reactores.

d)

Valor de pH, Salinidad y nutrientes


La desviacin de ptimos pH, condiciones osmticas y salinidad causaran reacciones fisiologicas a las microalgas y problemas de

productividad asociados. Estas condiciones son fcilmente controlables en un fotobiorreactor manteniendo promedios ptimos en cada
cultivo. La fuente de carbono parece ser la fuente ms importante para algunos mixotrfico (uso de una fuente de carbono orgnico y
energa luminosa como fuente de electrones) o incluso microalgas heterotrficas (fuente de carbono orgnico en la oscuridad) sometidas
a sistemas de produccin de biomasa.las fuentes de carbno orgnico ms comnmente citadas son el etanol, el acetato y la glucosa. Un

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suficiente suministro de nutrientes para las microalgas es una precondicin para una ptima fotosntesis. El pH del medio de cultivo es
un factor importante en el cultivo algal y esta determinado por la solubilidad del dixido de carbono y minerales en el medio. El valor de
pH influencia directa e indirectamente el metabolismo del alga, exhibiendo una clara dependencia del pH en el medio de crecimiento,
diferentes especies de algas varan segn la respuesta al pH. Cyanidum por ejemplo, tiene un ptimo crecimiento a pH 2, mientras que
Spirulina crece bien a pH 9 y 11.
Figura 6.9. Sensor de pH, DO y Temperatura de tipo inalmbrico
usado en la Unidad de Microbiologa Aplicada.

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e)

Estrategias operacionales
Con adecuados monitoreos de parmetros de cultivo bsicos de luz, CO2, O2, pH, y temperatura, es posible optimizar estos

parmetros hasta alcanzar el deseado producto final desde los fotobiorreactores. El producto final los fija el alga, el cual gua las
condiciones generales de crecimiento. El rendimiento y la productividad son trminos que requieren cuidadosa definicin. El
Rendimiento es la produccin de masa por unidad de volumen, y se expresa en trminos de gramos Litro -1. La productividad es el
rendimiento por unidad de tiempo y se expresa en terminos de gramos Litro -1 hora-1 o gramos Litro-1 dia-1. Las condiciones que
producen mximo rendimiento son raramente las mismas condiciones que producen la mxima productividad. Optimizar los parmetros
metdicamente y controlar sus interacciones con el medio de cultivo para cada condicin de cultivo algal es clave para alcanzar maximo
rendimiento y/o productividad. Un punto importante radica en esto, ya que permite identificar aquellos parmetros que no son
importantes para los mximos bscados, y as eliminar la necesidad redundante de experimentacin.