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CAPTULO 8: EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

Un quimiostato andante
El sueo de la microbiologa industrial es convertir un substrato barato y abundante en un producto de gran valor.
Los microbilogos podran no estar de acuerdo en cuanto al producto ideal pero s en cuanto al substrato ideal.
Todos coinciden en que la celulosa el componente mayoritario de la pared de la clula vegetal es el
compuesto orgnico ms abundante en el mundo y probablemente el ms barato. Sin embargo, slo los
microorganismos pueden utilizar la celulosa como substrato y, por lo tanto, convertirla en algo til.
Al preguntarle a Robert Hungate, un microbilogo norteamericano de primera linea, si se descubriria alguna vez
una conversin microbiana de la celulosa de inters comercial, ste replic que ya exista - la vaca. La vaca y otros
rumiantes son fbricas andantes que utilizan los microorganismos para convertir la celulosa en carne y leche. Estos
rumiantes obtienen la celulosa (y pequeas cantidades de otros substratos) al ingerir hierba y otros forrajes que
mastican para desmenuzarlos en pequeas porciones que llegan al rumen, la gran cmara del estmago, constituido
por cuatro compartimientos. El rumen de la vaca es rico en bacterias y protozoos. Estos -y no la vaca- son los que
metabolizan la celulosa. La vaca no hace nada para obtener los nutrientes a partir de la celulosa. Sin embargo, los
obtiene en su mayor parte de los productos de la fermentacin microbiana producida en su rumen y de las clulas
microbianas que pasan de manera continua desde el rumen de la vaca al intestino, donde son digeridas y
absorbidas.
Hungate y sus colegas han demotrado que el rumen de la vaca funciona como un quimiostato, un aparato que se
utiliza para cultivar microorganismos. Los nutrientes llegan de forma continua al rumen, donde los
microorganismos crecen tambin sin parar, y parte de su contenido pasa continuamente al sistema digestivo. Esto
no significa que las vacas estn siempre comiendo. Por el contrario, los rumiantes aportan nutrientes al rumen de
manera regular, rumiando el forraje, es decir, masticando el forraje regurgitado. Cuando mastican, fluyen al rumen
fragmentos de forraje suspendidos en la saliva. La vaca no rumia siempre que no est comiendo, pero el aporte de
nutrientes al rumen es esencialmente continuo porque los fragmentos slidos de celulosa actan como reservorios
de nutrientes para los microorganismos.
Las vacas y otros rumiantes han alcanzado los objetivos que suean los microbilogos industriales - convertir la
celulosa en productos de valor. Adems, lo hacen eficaaanente, con mayor eficiencia que cualquier proceso
industrial conocido.

Comprender:
Cmo crecen los microorganismos: el tiempo de duplicacin y el crecimiento exponencial
Las fases de crecimiento de un cultivo microbiano
Los mtodos que se pueden utilizar para mantener los microorganismos creciendo continuamente
Qu tipos de nutrientes requieren los microorganismos para crecer
Las condiciones ambientales que permiten el crecimiento microbiano: la temperatura, la presin
hidrosttica, el pH y la fuerza osmtica

Cmo medir el crecimiento de una poblacin microbiana usando mtodos indirectos - midiendo la turbidez,
el peso seco, o la actividad metablica
Cmo medir el crecimiento de una poblacin microbiana mediante recuento directo, recuento en placa,
nmero ms probable y mediante filtracin
8.1 LAS POBLACIONES
Al estudiar el metabolismo y la gentica de los microorganismos, nos hemos centrado en un individuo - la forma
en que se mantiene y se reproduce una clula microbiana. En este captulo y en el siguiente, prestaremos atencin
a los grandes grupos - estudiando cmo las poblaciones de microorganismos aumentan mediante el crecimiento y
disminuyen o desaparecen como resultado de la muerte.
Estudiar las poblaciones requiere que observemos a los microorganismos desde una nueva perspectiva. Cuanto
estudiamos individuos, lo que hacemos es describir. Describimos las partes de la clula implicadas en un proceso
particular, cmo produce la clula las molculas que necesita para originar una nueva clula y cmo protege su
informacin gentica cuando sta pasa de una generacin a la siguiente. Sin embargo, cuando estudiamos
poblaciones, lo que hacemos es Contar. De las poblaciones queremos saber "cunto?","cunto ms?"o"cunto
menos?". El estudio de las poblaciones, ya sean microbianas o humanas, se realiza desde un punto de vista
matemtico.
A menos que digamos lo contrario, usaremos el trmino crecimiento microbiano para referirnos al crecimiento de
una poblacin, no al incremento en tamao de una clula individual. Las clulas microbianas individuales crecen,
pero la mayoria solo incrementan su tamao hasta alrededor del doble, antes de que se dividan en dos. La divisin
celular se traduce en crecimiento o incremento en el nmero de celulas de la poblacin (Figura 8.1).

8.2 CMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS

En un ambiente favorable, una clula microbiana dada aumenta su tamao; y cuando ste se duplica, la clula se
divide. La mayora de las bacterias se alargan y se dividen mediante fisin binaria, o biparticin, cerca del ecuador
celular, para formar dos clulas hijas aproximadamente iguales. Algunos microorganismos unicelulares, incluidas
algunas bacterias, se replican por gemacin, formando una yema que crece y se separa de la clula parental.
Aunque tratamos el crecimiento en trminos de una poblacin bacteriana que se divide mediante fisin binaria, los
mismos principios se pueden aplicar para los microorganismos que se reproducen mediante gemacin (Captulo 5).
El crecimiento de los microorganismos filamentosos (aquellos que forman largos tubos) y de los microorganismos
con ciclos de vida complejos siguen reglas ms complicadas.

8.2.1 Tiempo de duplicacin y tasa de crecimiento


El tiempo de duplicacin (tambin conocido como el tiempo de generacin) es el perodo que requieren las
clulas de una poblacin microbiana para crecer, dividirse, y dar lugar a dos nuevas clulas por cada una de las que
existan anteriormente. El tiempo de duplicacin es, aproximadamente, el mismo para todas las clulas de una
determinada poblacin. No cambia hasta que se agotan los nutrientes o comienzan a acumularse los productos
metablicos txicos. Cuando las condiciones para el crecimiento se hacen menos favorables, el tiempo de
duplicacin aumenta antes de que el crecimiento se detenga.
El tiempo de duplicacin vara dependiendo de la especie microbiana y de las condiciones de crecimiento de la
poblacin. Por ejemplo, el tiempo de duplicacin de Escherichia coli es de alrededor de 18 minutos en un medio
de laboratorio rico. Pero en el tracto intestinal de los vertebrados, en el cual los nutrientes son menos abundantes,
el tiempo de duplicacin es de unas 12 horas. Algunas bacterias pueden crecer un poco ms rpidamente que E.
coli; pero incluso en las condiciones ms favorables, muchos microorganismos crecen mucho ms lentamente,
requiriendo horas o das para duplicar su numero.
El valor del tiempo de duplicacin nos indica la rapidez con que est creciendo una poblacin, pero la relacin es
inversa, Esto es, las poblaciones con un valor de tiempo de duplicacin bajo estn creciendo rpidamente, mientras
que las poblaciones con un valor ms elevado de tiempo de duplicacin estn creciendo ms lentamente. Por esta
razn, la misma informacion se expresa frecuentemente como tasa de crecimiento, o tiempo de duplicacin por
hora, que es elevada para las poblaciones de crecimiento rpido y baja para las de crecimiento lento. As, la tasa de
crecimiento de un cultivo de E. coli que tiene un tiempo de duplicacin de 18 minutos ser de 3,3 (60/18)
generaciones por hora.

8.2.2 El crecimiento exponencial

Durante un periodo de tiempo de duplicacin constante, una poblacin microbiana se encuentra en crecimiento
exponencial. Esto significa que durante cada tiempo de duplicacin, el nmero de clulas de la poblacin se
incrementa en un factor de dos, es decir, se duplica.
El concepto de crecimiento exponencial se ilustra mediante un paradigma matemtico acerca de los lirios
acuticos. Un lirio de agua produce una hoja nueva cada da, por cada hoja que tena
el da anterior. Comenzando con una unica hoja, el lirio cubre un estanque de media hectrea en unos 30 das.
Cunto tardar en cubrir un estanque de una hectrea? La respuesta correcta es 31 das, no 60, porque el tiempo de
duplicacin es de un da. En condiciones de crecimiento exponencial, los seres vivos se multiplican con una
asombrosa rapidez. Durante cada tiempo de duplicacin se producen tantas nuevas clulas como se haban
producido anteriormente de manera acumulada.

Figura 8.1 La mayora de las clulas microbianas se dividen por fisin binaria como se muestra en esta
micrografa electrnica de barrido de la bacteria Staphylococcus aureus. En la isin binaria, la clula replica su
DNA y proporciona una copia a cada clula hija.

Puesto que el crecimiento microbiano es exponencial, para la expresin grfica del crecimiento de una poblacin
microbiana se utiliza una escala exponencial (Figura 8.2). Aunque la misma informacin podra expresarse
utilizando una grfica aritmtica, o numerica sencilla, la grfica exponencial tiene ventajas significativas. El
numero de microorganismos de una poblacin que aumenta exponencialmente se incrementa lentamente al
principio y luego muy rpidamente. Por ejemplo, durante las tres primeras duplicaciones de una sola clula, slo
se producen siete nuevas celulas. Durante la sptima duplicacin, se originan 64 clulas y durante la duplicacin
vigsimo primera, ms de un milln. Si se expresa esta curva en una escala aritmtica, el incremento inicial apenas
se apreciar, mientras que las fases de crecimiento posteriores dispararan la grfica. Utilizando una escala
exponencial, la curva se convierte en una lnea recta, con una pendiente directamente relacionada con la tasa de
crecimiento de la poblacin. Esto es lgico si recordamos que por cada duplicacin la poblacin se duplica. En
otras palabras, el nmero total de clulas es igual a dos elevado a un exponente, y dicho exponente es el nmero de
generaciones que han transcurrido desde que la poblacin comenzo a aumentar. As, una poblacin que comienza
como una clula (20), se incrementa a dos clulas (21), luego a cuatro clulas (22), ocho clulas (23), 16 clulas (24),
y asi sucesivamente. La frmula general es N = 2n, donde N es el nmero de clulas en el cultivo despus de que
pasen n tiempos de duplicacin.
Por qu la grfica es una lnea recta y no una lnea en forma de escalera? Si una poblacin microbiana proviene
de una umea clula y tiene un tiempo de duplicacin constante, no se mantendra la poblacin constante durante
cada tiempo de duplicacin y luego se incrementara bruscamente - en forma de escalera? De hecho, este modelo,

denominado crecimiento sincrnico, no se produce en circunstancias ordinarias. Por el contrario, las clulas
individuales de la poblacin suelen dividirse antes o despus del tiempo de duplicacin de la poblacin, segn
un modelo de crecimiento asincrnico. Los tiempos de divisin efectivos se distribuyen alrededor del tiempo de
duplicacin, de manera que el incremento de la poblacin es uniforme y la grfica aumenta como una lnea recta.
Tiempo

Clulas/Mililitro

Notacin

Minutos

Horas

Nmero

Cientfica

Logaritmo

1000

103

3,0

20

0,33

2000

2X103

3,301

40

0,66

4000

4x103

3,602

60

1,00

8000

8x103

3,903

80

1,33

16000

1,6X104

4,204

100

1,66

32000

3,2x1O4

4,505

120

2,00

64000

6,4x104

4,806

140

2,33

128000

1,28x105

5,107

160

2,66

256000

2,56x105

5,408

180

3,00

512000

5,12x105

5,709

200

3,33

1024000

1,02x106

6,010

aa

(a)

Figura 8.2 Crecimiento exponencial de un cultivo bacteriano. (a) El nmero de clulas por mililitro en un cultivo
que crece exponencial mente se mide cada 20 minutos y se expresa como el nmero, de clulas o como el
logaritmo del nmero de clulas. (b) La expresin del logaritmo del nmero de clulas frente al tiempo es una
lnea recta. (c) La representacin del nmero de clulas frente al tiempo es una curva que tiene una pendiente muy
acusada. Puesto que el nmero de clulas se duplica cada 20 minutos, el tiempo de duplicacin es de 20 minutos y
la tasa de crecimiento es 3,0 (60/20) duplicaciones por hora. Un cultivo que crece con esta tasa se incrementa, en
200 minutos, desde 1000 hasta ms de 1 milln de clulas por mililitro.

8.2.3 Fases del crecimiento


Un cultivo microbiano pasa tpicamente por cuatro fases de crecimiento, distintas y secuenciales: la fase de
latencia o fase lag (lag, en ingls, significa "retraso"), la fase log (tambin llamada logartmica oexponencial), la
fase estacionaria y la fase de muerte (Figura 8.3). Cuando estudiamos el crecimiento exponencial, estamos
estudiando la fase log, de manera que retomaremos el tema en este punto. No obstante, el ciclo comienza
generalmente con la fase lag.
No todos los cultivos presentan todas las fases del crecimiento. Las fases lag y de muerte pueden existir o no. La
fase log tiene lugar casi siempre cuando las clulas estn en un ambiente favorable, pero no puede continuar
indefinidamente. De acuerdo con el ejemplo del lirio acutico, la masa de un cultivo microbiano que continuara
creciendo de forma exponencial superara rpidamente el peso del planeta. Pero siempre sucede algo; se agota un
nutriente esencial, se acumula un producto txico, o el pH se hace desfavorable. Por lo tanto, el cultivo deja de
crecer y entra en la fase estacionaria de crecimiento.
Aunque no se produce un aumento neto de la masa del cultivo durante la fase estacionaria, la composicin celular
cambia cuando el cultivo pasa a esta fase. Las clulas se hacen ms pequeas y comienzan a sintetizar
componentes que les ayudan a sobrevivir, sin crecer, durante largos perodos de tiempo. Por ejemplo,
cuando Escherichia coli entra en la fase estacionaria sintetiza alrededor de 30 protenas, que no se encuentran en
las clulas en la fase log, y modifica la composicin de algunos de los cidos grasos de sus membranas. Las cepas
mutantes que no pueden producir estas protenas de la fase estacionaria mueren rpidamente cuando dejan de
crecer. Algunas especies bacterianas han desarrollado sofisticados mecanismos, como la formacin de endosporas
para sobrevivir a la fase estacionaria (Captulo 4)

Figura 8.3 Fases de crecimiento de un cultivo bacteriano (esta grfica se basa en el cultivo descrito en la Figura
8.2). La fase de muerte es una fase de declive exponencial, como la fase exponencial y, por tanto, es una lnea
recta, aunque se produce a una tasa mucho ms lenta.

Despus de aproximadamente un da en fase estacionaria, comienza la fase de muerte, y las clulas del cultivo
comienzan a morir. Durante esta fase, las clulas de la mayora de las especies mueren exponencialmente, pero a
una velocidad lenta - mucho menor que la tasa de incremento de las clulas durante la fase log. Generalmente, la
muerte se produce porque las clulas han agotado sus reservas intracelulares de ATP y no pueden reparar los
componentes celulares. Las clulas que no crecen no pueden generar nuevo ATP y, por tanto, se produce la muerte
cuando no existe suficiente energa para continuar la reparacin celular o para reiniciar el crecimiento, cuando
existan nutrientes disponibles.
La fase lag es, asimismo, un perodo en el que no hay crecimiento. Generalmente, se produce cuando las clulas en
fase estacionaria o en fase de muerte se inoculan en un medio de cultivo fresco. Aunque en la fase lag no se
produce crecimiento neto, existe una actividad metablica considerable, ya que las clulas se preparan para crecer.
Esta preparacin es necesaria porque los daos metablicos sufridos durante las fases estacionaria o de muerte
deben ser reparados completamente, antes de que las clulas puedan comenzar a crecer de nuevo. Si las clulas
empleadas para inocular (sembrar) un nuevo cultivo estn en la fase log, no existe fase lag, siempre que el nuevo
medio de cultivo sea el mismo que el viejo y las dems condiciones permanezcan idnticas.
La duracin de la fase lag depende de cunto tiempo haya estado el cultivo previo en fase estacionaria o de muerte,
o puede depender de un cambio en el medio. Si las clulas han estado en la fase estacionara slo brevemente, la
posterior fase lag podr durar slo unos minutos. Pero si han permanecido en la fase estacionara durante meses, la
subsiguiente fase lag de las clulas sobrevivientes puede durar muchas horas. Si un cultivo exponencial se pasa de
un medio pobre a uno rico, no existe fase lag. Pero el paso de un medio rico a uno pobre implica una fase lag de
varias horas, en la mayora de los cultivos bacterianos.

Figura 8.4 El quimiostato se utiliza para mantener una poblacin microbiana en un estado de crecimiento
constante. Una bomba peristltica aade al cultivo el medio estril desde un reservorio a una tasa constante. El
cultivo -que contiene las clulas y consume el medio parcialmente- sale con la misma tasa. Un quimiostato real
tiene muchos controles electrnicos.

8.2.4 Cultivo continuo de los microorganismos


En el laboratorio, la mayora de los microorganismos se cultivan en sistemas cerrados, lo que significa que no se
suministran nutrientes ni se eliminan los productos txicos. Consecuentemente, los cultivos pasan, generalmente,
por las cuatro etapas de crecimiento. Cuando se inocula un cultivo en fase estacionaria en un medio fresco que
contiene las concentraciones adecuadas de todos los nutrientes esenciales, ste pasa secuencialmente por una fase
lag, una fase log, una fase estacionaria y una fase de muerte. Sin embargo, los microorganismos no crecen de esta
manera en la naturaleza. En la mayora de las condiciones naturales, los nutrientes entran de manera continua y a
bajas concentraciones en el ambiente de una clula, y las poblaciones crecen continuamente a una tasa baja, pero
uniforme. La tasa de crecimiento est determinada por la concentracin del nutriente limitante, o nutriente ms
escaso. En la naturaleza raramente la tasa de crecimiento viene fijada por la acumulacin de los productos
metablicos, porque generalmente otros microorganismos pueden usarlos a medida que se van formando.
Es posible conseguir un cultivo continuo en el laboratorio en condiciones que imitan las de la naturaleza manteniendo la concentracin de un nutriente esencial lo suficientemente baja como para que limite la tasa de
crecimiento. Dicho crecimiento limitado por la concentracin se consigue generalmente con un aparato de cultivo

continuo denominado quimiostato (Figura 8.4). Un quimiostato consta de una bomba peristltica, un reservorio,
un recipiente de cultivo, y un sistema de desage. La bomba aade una cantidad controlada de medio fresco desde
el reservorio, de manera continua, al cultivo. Al mismo tiempo, una cantidad idntica de cultivo sale
continuamente a travs del sistema de desague. En estas condiciones, el nmero de clulas en el vaso de cultivo no
cambia. El cultivo crece lo suficientemente rpido como para reemplazar las clulas que se pierden a travs del
sistema de desage.
La concentracin del nutriente limitante en el cultivo fija la tasa de crecimiento del mismo. El cultivo crece a la
misma velocidad con que se suministra el nutriente limitante, que es, asimismo, la misma con que se consume
parcialmente el medio de cultivo y salen las clulas mediante el sistema de desage. En el vaso de crecimiento del
quimiostato, las clulas permanecen indefinidamente en fase exponencial de crecimiento.
El cultivo continuo tiene aplicaciones industriales importantes (Captulo 29). Es una forma eficaz de producir
clulas microbianas o sus productos (tales como antibiticos y vitaminas), porque constantemente se obtiene un
cultivo denso que sale por el desage del vaso de crecimiento.

8.2.5 Crecimiento de una colonia


Cuando una poblacin de clulas microbianas se desarrolla a partir de una nica clula en una superficie slida por ejemplo, en un medio solidificado con agar en una placa de Petr - forma una masa slida de clulas
denominada colonia. Los distintos microorganismos forman colonias con diferentes formas y texturas. Algunas
colonias tienen un aspecto tan caracterstico que los microbilogos pueden identificar ciertos microorganismos
observando las colonias que forman.
Las clulas de una colonia estn en diferentes fases de crecimiento, dependiendo de su localizacin (a diferencia
de las clulas de un cultivo liquido, que se encuentran todas en la misma fase de crecimiento). Las clulas en el
centro de la colonia han dejado de crecer y se encuentran en la fase estacionaria o en la fase de muerte. Estas no
tienen ya acceso a los nutrientes. Por el contrario, las clulas del borde de la colonia estn en contacto con los
nutrientes y continan creciendo activamente en fase log. Ninguna clula de una colonia visible est en fase lag,
porque una vez que las clulas del centro de una colonia han dejado de crecer, no pueden hacerlo de nuevo hasta
que se transfieren a un medio fresco.
Asimismo, la localizacin de una clula en una colonia determina el acceso a los nutrientes de otra forma. Por
ejemplo en una colonia que crece en contacto con el aire, las clulas de la superficie son aerobias. Las clulas
incluidas en el centro de la colonia son totalmente anaerobias, porque las clulas de la superficie de una colonia
que crece en aerobiosis captan todo el oxigeno del aire que difunde a travs de la colonia.

8.3 QU NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA CRECER?


Cada especie microbiana requiere para crecer unas condiciones particulares. Estos requerimientos son muy
variados, porque los ambientes en los que las diferentes especies se han adaptado varian enormemente.

8.3.1 Nutricin
Todos los seres vivos utilizan compuestos qumicos presentes en el medio ambiente para construir las molculas
necesarias para fabricar nuevas clulas. Estos compuestos qumicos se denominan nutrientes.Sabemos que la
nutricin afecta al crecimiento de todos los organismos. Un ser humano, un animal o una planta bien alimentados
crecen mas rpidamente que otros mal alimentados. Para los microorganismos, particularmente las bacterias, el
efecto de la nutricin en la tasa de crecimiento es enorme. Por ejemplo, Eschenchia coli puede llegar a crecer 10
veces ms rpidamente en un ambiente rico en nutrientes, tal como el extracto de carne que en un ambiente
nutritivo pobre, como por ejemplo uno compuesto por succinato y sales. El medio con succinato y sales cubre
todas las necesidades esenciales de E. coli, pero el crecimiento en dicho medio requiere que la clula realice ms
procesos biosintticos. El resultado es un crecimiento ms lento.
Una tasa de crecimiento ms elevada significa que un cultivo alcanza sus mximos nmero y masa totales de
manera ms rpida que en un ambiente pobre en nutrientes. Sin embargo, un cultivo puede alcanzar la misma
densidad, al cabo de un tiempo suficiente, siempre que est presente la misma cantidad total de nutrientes.
El rendimiento, o mxima masa total, de un cultivo es directamente proporcional a la cantidad de nutrientes,
Los nutrientes que necesitan los microorganismos para crecer incluyen una fuente de carbono, de oxgeno, de
nitrgeno, de fsforo, de azufre, de elementos traza y de factores de crecimiento orgnicos. Las clulas utilizan
estos nutrientes para generar fuerza conductora o metabolitos precursores (Captulo 5). Tambin se requiere
hidrgeno para el crecimiento, pero nunca es un factor limitante en cualquier medio que permita el crecimiento.

Carbono El carbono es la base estructural de los compuestos bioqumicos. Los microorganismos autotrofos
obtienen su carbono a partir del dixido de carbono (C02) de la atmsfera, mientras que los microorganismos
heterotrofos obtienen el carbono a partir de los compuestos orgnicos del ambiente (Captulo 5).
Los microorganismos heterotrofos utilizan como fuente de carbono muchas molculas orgnicas diferentes. De
hecho, probablemente cualquier compuesto orgnico que se encuentra en la naturaleza es utilizado como fuente de
carbono por alguna especie bacteriana. Una de las fuentes ms comnmente utilizada por los microorganismos es
la glucosa, una hexosa que juega un papel central en el metabolismo. Consecuentemente, la glucosa es un
ingrediente comn de los medios de cultivo microbiolgicos. No obstante, frecuentemente se aaden a los medios
como fuente de carbono otros azcares, as como polisacridos, cidos orgnicos, alcoholes y aminocidos.
Para los quimioheterotrofos, las molculas orgnicas que contienen carbono, como la glucosa, proporcionan tanto
una fuente de energa para generar ATP, como los tomos de carbono necesarios para fabricar los compuestos
bioqumicos (Captulo 5). Las fuentes de carbono que son metabolizadas rpidamente permiten un crecimiento
relativamente rpido, mientras que las fuentes de carbono que son metabolizadas ms lentamente permiten slo un
crecimiento lento. Por ejemplo, en un medio de cultivo al que se aade glucosa como fuente de carbono en lugar
del aminocido lisna, Escherichia coli crece el doble de rpido que en un cultivo idntico excepto la adicin
mencionada.
Oxgeno Todos los microorganismos requieren oxgeno elemental para fabricar sus componentes bioqumicos,
pero no todos los microorganismos requieren oxgeno atmosfrico. La mayora de los microorganismos
heterotrofos obtienen el oxgeno a partir de la misma molcula que les sirve como fuente de carbono. La frmula
qumica de los hidratos de carbono (una fuente de carbono comn para los hetertrofos) es CH2O, que significa
que cada molcula de hidratos de carbono proporciona a la clula un tomo de oxgeno por cada tomo de
carbono. Los autotrofos, que generan energa a partir de la luz, obtienen la mayor parte de su oxgeno a partir del
CO2 fijado durante la fotosntesis. La mayora de los microorganismos aerobios tienen enzimas denominadas
oxigenasas que pueden aadir directamente oxgeno atmosfrico a las molculas orgnicas, pero sta es una fuente
minoritaria de oxgeno. Algunas enzimas permiten a los microorganismos utilizar el oxigeno presente en el agua
mediante reacciones hidrolticas.

Redescubridores de microbios

Los supervivientes
Cmo pueden sobrevivir las bacterias no formadoras de endosporas cuando dejan de crecer? Unas pocas horas
despus de que Escherichia coli (y otras bacterias no formadoras de endosporas) entra en la fase estacionaria de
crecimiento, comienza la fase de muerte. Aunque el declive de la fase exponencial puede ser muy lento, puede
ocurrir la muerte de todas las clulas del cultivo. Segn esto, sera slo una cuestion de tiempo la eliminacin de
todas las especies bacterianas? De hecho, esto no ocurre porque no todas las clulas mueren durante la fase de
muerte. Incluso despus de un ao de almacenamiento, un cultivo de E. coli en fase estacionara contiene ms de
un milln de clulas vivas por mililitro. Las clulas del cultivo mueren exponencialmente en cuatro o cinco das,
pero las clulas que permanecen sobreviven durante largos perodos de tiempo. Roberto Kolter, un microbilogo
de la Universidad de Harvard, encontr que las bacterias no formadoras de endosporas han desarrollado sus
propios mecanismos para sobrevivir perodos prolongados de escasez de nutrientes. La mayora de las clulas
mueren, pero unas pocas estn programadas para sobrevivir, lo cual es suficiente para preservar la especie.

Adems de utilizar el oxgeno como nutriente, los microorganismos que son capaces de una respiracin acrbica
usan el oxgeno para generar energa. Pero, para algunos organismos el oxigeno atmosfrico es txico. Algunas
enzimas son destruidas rapda e irreversiblemente por la exposicin al oxgeno atmosfrico. Un ejemplo extremo
es la ntrogenasa, enzima que permite a las bacterias fijadoras de nitrgeno utilizar el nitrgeno atmosfrico.
Como resultado, los microorganismos han desarrollado varios mecanismos para proteger incluso las enzimas
altamente sensibles al oxigeno y, por tanto, sobrevivir en presencia del oxgeno. Algunas cianobacterias fijadoras
de nitrgeno - que son acrbicas y producen oxgeno gaseoso mediante fotosntesis - protegen la nitrogenasa,
segregndola en clulas especializadas, denominadas heterocistes. Los heterocistes no producen oxgeno y son
impermeables al mismo. La bacteria fijadora de nitrogeno Azotobacter realiza una respiracin aerobica a una tasa
lo suficientemente evada como para mantener anaerbico el centro de la clula, donde est localizada la
ntrogenasa.
Adems del oxgeno, los organismos deben hacer frente a los compuestos txicos que contienen oxigeno y que se
producen durante el metabolismo acrbico. Entre estos agentes txicos se encuentran el perxido de hidrgeno
(H2O2) y los radicales libres, que son incluso ms txicos: superxido (O2) y el radical hidroxilo (OH), que se
forma a partir del superxido. Un radical libre es un compuesto con un electrn sin aparear que lo hace
extraordinariamente reactivo. Si se acumula superxido, los compuestos bioqumicos se oxidan rpidamente y las
clulas mueren.

Los seres vivos que sobreviven en presencia del aire han desarrollado sistemas para eliminar los radicales libres.
Todos los aerobios producen la enzima superxido dismutasa, que destruye el superxido convirtindolo en
oxgeno y perxido de hidrgeno

El perxido de hidrgeno, que es el producto de sta y de otras reacciones catalizadas por enzimas, es en si mismo
un oxidante txico. Se convierte en agua y oxgeno mediante la enzima catalasa.

El perxido de hidrgeno tambin es eliminado por las peroxidasas, enzimas que lo utilizan para oxidar ciertos
compuestos orgnicos. Los organismos que pueden tolerar la exposicin al oxigeno contienen superxido
dismutasa, y casi todos tambin contienen catalasa. Los organismos que pueden tolerar la exposicin al oxgeno
contienen superxido dismutasa, y casi todos tambin contienen catalsa. Los organismos que carecen de ambos
enzimas mueren rpidamente en un ambiente con oxgeno.
La relacin entre el oxgeno y el crecimiento varia enormemente de una especie microbiana a otra. Los aerobios
obligados pueden crecer tan solo en presencia de oxgeno porque para generar energa requieren oxgeno como
aceptor terminal de electrones. Los microaerfilos toleran menos oxgeno (o requieren eoncentraciones mayores
de CO2). stos pueden crecer slo a concentraciones reducidas de oxigeno (del 2 al 10 por ciento de oxgeno, en
comparacin con el 21 por ciento de oxgeno presente en el aire). Los anaerobios facultativos pueden crecer tanto
en presencia como en ausencia de oxgeno, porque cuando ste est disponible, lo utilizan como aceptor terminal
de electrones, pero cuando el oxigeno est ausente, utilizan otras rutas bioqumicas para generar energa.
Los anaerobios aerotolerantespueden generar energa sin oxgeno pero no mueren al ser expuestos al aire.
Los anaerobios obligados mueren en presencia del oxgeno, porque carecen de los enzimas necesarios para
eliminar el superxido(Tabla 8.1).
Nitrgeno El nitrgeno consttuye alrededor del 14 por ciento del peso seco de la mayora de los
microorganismos. Es un constituyente de las protenas y de los cidos nucleicos as como de algunos metabolitos
esenciales, de manera que todos los seres vivos requieren una fuente de este elemento. La forma de nitrgeno que
utilizan los microorganismos depende de su capacidad metablica y del ambiente en que se encuentran.
Probablemente, todos los microorganismos pueden usar amonaco (NH 3) como fuente de nitrgeno, porque esta
forma es la que se incorpora en la biosntesis. La mayora de los microorganismos pueden obtener amonaco a
partir de una variedad de compuestos orgnicos, incluidos los aminocidos, y algunos pueden utilizar formas
inorgnicas, entre las que se incluye el ion nitrato (NO3). Algunos pueden lijar el nitrgeno atrnosfrico gaseoso
(N2); estos organismos lijadores de nitrgeno prosperan en los ambientes en los que el nitrgeno es el nutriente
limitante.
Tabla 8.1. Relacin de las bacterias con el oxgeno

Aerobios estrictos

Requieren oxgeno

Catalas
Superxido
a
dismutasa
Presente Presente

Anaerobios
facultativos
Microaerfilos
Anaerobios
aerotolerantes
Anaerobios estrictos

Pueden crecer con o sin oxgeno

Presente Presente

Clase Microbiana

Respuesta al oxgeno

Crecen mejor con baja tensin de oxgeno


Presente Presente
Crecen sin oxgeno, pero no mueren en presencia Ausente Presente
del mismo
Mueren en presencia de oxgeno
Ausente Ausente

Ejemplo
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia coli
Campylobacter jejuni
Streptococcus
pneumoniae
Methanococcus
vannielii

Fsforo El fsforo se encuentra en las celulas exclusivamente en la forma de ion fosfato (Pol 3-4) o de compuestos
orgnicos que contienen fosfato. Constituye alrededor del 3 por ciento del peso seco de los microorganismos. Es
un constituyente de los cidos nucleicos, de los fosfolpidos y de ciertos metabolitos esenciales. El fsforo entra en
la clula en forma de ion fosfato, porque la mayora de los compuestos orgnicos que contienen fosfato no pueden
pasar a travs de la membrana plasmtica. Cuando los microorganismos utilizan como fuente de fsforo un
compuesto orgnico que contiene fosfato, generalmente liberan el grupo fosfato fuera de la clula o en el
periplasma, mediante enzimas que son producidas por la propia clula. Posteriormente, el ion fosfato penetra en la
clula. El fosfato es el nutriente limitante en muchos lagos y arroyos, de manera que cuando se vierte fosfato de
los detergentes en estos sistemas acuticos, se produce eutroficacin, o aumento en el desarrollo de algas y de
otros microorganismos.

Tabla 8.2. Elementos traza en las clulas microbianas


Elemento
Forma inica principal

Funcin

Potasio
Magnesio
Calcio
Hierro
Manganeso
Molibdeno
Cobalto
Cobre
Zinc

K+
Mg2+
Ca2+
Fe2+/Fe3+
Mn2+
Mo2+
Co2+
Cu2+
Zn2+

Mantiene la presin de turgencia; cofactor de ciertas enzimas


Cofactor de muchas enzimas
Cofactor de ciertas enzimas
En citocromosa y en ciertas enzimas
Cofactor de algunas enzimas
Presente en el coenzima de varias enzimas
Presente en la vitamina B12 y coenzimas relacionadas
Presente en varias enzimas
Presente en varias enzimas

Azufre El azufre es un constituyente minoritario pero esencial de la clula, constituyendo alrededor del 1 por
ciento del peso seco de la mayora de las clulas. Es un componente de dos aminocidos, de algunas especies de
RNA de transferencia y de ciertos metabolitos esenciales. Aunque el azufre entra en la biosntesis como sulfuro
(S2-), la fuente de azufre ms corriente, tanto en los medios de laboratorio como en la naturaleza, es el ion sulfato
(SO42-). El sulfato es abundante en el ocano, pero relativamente escaso en algunos lagos y suelos. La fuente
principal de azufre en muchos suelos son los compuestos que contienen sulfato orgnico, que los microorganismos
del suelo captan y convierten en sulfuro.

Elementos traza Adems de los elementos mayoritarios que necesitan para fabricar los compuestos bioqumicos,
los microorganismos requieren cantidades pequeas, aunque esenciales, de ciertos compuestos qumicos
inorgnicos, los elementos traza. Entre estos se incluyen el potasio y ciertos iones metlicos como son el cobre, el
cobalto, el hierro y el zinc. Los elementos traza cubren una variedad de funciones esenciales en la clula (Tabla
8.2). Algunos elementos traza son Cofactores, iones inorganicos que deben estar presentes para que una enzima
sea activa. Otros elementos traza forman parte de las coenzimas, molculas orgnicas que deben estar presentes
para que una enzima sea activa.
Aunque puede ocurrir, la disponibilidad de los elementos traza raramente limita el crecimiento microbiano, porque
se requieren en cantidades muy pequeas. Por ejemplo, aunque el hierro es abundante en la naturaleza, se
encuentra predominantemente en la forma de hidrxido de hierro (frrico), altamente insoluble, no disponible para
los microorganismos a menos que stos liberen compuestos que solubilizan el hierro,
denominados siderforos. Los tejidos vivos son una fuente particularmente pobre de hierro disponible. Por tanto,
la mayoria de las bacterias patgenas producen siderforos.

Factores de crecimiento orgnicos Muchos microorganismos pueden sintetizar todos los bloques bsicos
(aminocidos, nucletidos, monosacridos o disacridos) necesarios para fabricar las macromolculas a partir de
las fuentes nicas de los elementos que se acaban de estudiar. Pero si un microorganismo no puede sintetizar un
bloque bsico particular, ste debe ser suministrado a partir del ambiente. Estos bloques bsicos preformados se
denominan factores de crecimiento orgnicos. Pueden ser cualquiera de los diversos bloques bsicos estudiados
en el Captulo 5: aminocidos, purinas, pirimidinas, cidos grasos, etc. Las vitaminas, que son nutrientes que se
requieren en muy pequeas cantidades, fundamentalmente como precursores de los cofactores de las enzimas, son
factores de crecimiento orgnicos para algunos microorganismos.
La diversidad nutricional implica los diferentes requerimientos de factores de crecimiento orgnicos de los
microorganismos. Existe una gama considerable. Por ejemplo, Escherichia coli no necesita factores de crecimiento
orgnicos. Por el contrario, a Leuconostoc mesenteroides, una bacteria del cido lctico que agra la leche, deben
suministrrsele los 20 aminocidos esenciales, varias purinas y pirimdnas y 10 vitaminas (Tabla 8.3).
Si se encuentran en el medio ambiente los bloques bsicos preformados, la mayora de los microorganismos los
utilizan para aumentar su crecimiento. Los mecanismos de regulacin permiten a los microorganismos explotar
un ambiente de crecimiento rico, en el cual abundan los bloques bsicos preformados. De esta manera, el
microorganismo utiliza su capacidad metablica para sintetizar slo aquellos bloques bsicos que no se encuentran
disponibles en el medio ambiente. As, utilizan la capacidad metablica que ahorran para crecer ms rpidamente.
Para ello, producen ms ribosomas. Por ejemplo, cuando la bacteria Salmonella tiphimurium crece rpidamente en
un ambiente rico, tiene ms de 10 veces ms ribosomas por clula que cuando crece lentamente en un medio
pobre, porque debe sintetizar las protenas ms rpidamente para crecer a mayor velocidad. Esta relacin entre un
medio rico, la tasa de crecimiento y el nmero de ribosomas por clula se muestra en la Tabla 8.4. En un medio
pobre, compuesto por ejemplo, por sales y lisina (una fuente de carbono que utiliza S. Typhimuriom muy
lentamente), el tiempo de duplicacin es largo y las clulas del medio contienen slo el pequeo numero de
ribosomas que necesitan para crecer lentamente. En medios ms ricos, que contienen fuentes de carbono que
pueden ser utilizadas ms rpidamente (como la glucosa), o que son enriquecidos con bloques bsicos tales como

aminocidos y materiales que se encuentran en el extracto de came, el tiempo de duplicacion disminuye y el


nmero de ribosomas que contiene la clula aumenta, para acomodarse al crecimiento ms rpido del cultivo.

8.3.2 El ambiente no nutritivo


Adems de la nutricin, existen otros factores que influyen en el crecimiento de las poblaciones microbianas.
Entre ellos se encuentran los factores fsicos - temperatura y presin hidrosttica - y los factores qumicos - pH y
presin osmtica.

Temperatura Cada especie microbiana crece en un rango de temperatura, desde la temperatura mnima de
crecimiento, o temperatura ms baja que permite el crecimiento, hasta la temperatura mxima de crecimiento, o
temperatura ms elevada que permite el crecimiento. La mayora de las bacterias crecen en un intervalo de
temperatura de aproximadamente 40 grados Celsius. La mayora de los microorganismos eucariotas tienen un
intervalo ms estrecho. La temperatura ptima de una especie es aquella a la cual crece el microorganismo ms
rpidamente. Generalmente, la temperatura ptima es tan slo unos grados inferior a la temperatura mxima de
crecimiento. La tasa de crecimiento aumenta desde la temperatura mnima a la temperatura ptima, ya que las
reacciones qumicas, incluidas las reacciones catalizadas por las enzimas, se realizan mas rapidamente cuando
aumenta la temperatura (Figura 8.5). Sin embargo, por encima de la temperatura ptima, la tasa de crecimiento
disminuye rpidamente, porque algunos componentes celulares, especialmente las protenas, se inactivan ms
rpidamente de lo que pueden ser reemplazados.
Los microorganismos crecen a temperaturas extremas, temperaturas en las que la mayora de los demas seres vivos
no pueden crecer. En general, los microorganismos procariotas toleran temperaturas ms extremas que los
eucariotas. Ningn eucariota puede crecer en el punto de ebullicin del agua, aunque algunos hongos pueden
crecer a temperaturas inferiores al punto de congelacin - tan bajas como las que pueden tolerar algunas especies
bacterianas - y algunas algas crecen cerca del punto de congelacin del agua. EI crecimiento de algunas algas
rojas, denominadas algas de la nieve, origina enormes manchas rojas en las zonas montaosas nevadas, en las
cuales persiste la nieve durante largos perodos de tiempo y la luz es muy intensa.
Segn el intervalo de temperatura en el cual pueden crecer los microorganismos se dividen en tres categoras
diferentes. Los termfilos (amantes del calor) crecen a altas temperaturas. Los mesfilos (amantes de una
temperatura moderada) crecen a temperaturas intermedias, y los psicrfilos (amantes del fro) crecen a bajas
temperaturas. Aunque los psicrfilos son capaces de crecer a bajas temperaturas, estos microorganismos, al igual
que los otros, crecen ms rpidamente cerca de la temperatura mxima de crecimiento.
Las bacterias termfilas crecen a temperaturas superiores a 50 0C - una temperatura a la cual el agua causa dolor,
si se sumerge la mano en ella. El termfilo extremo Pyrodictium occultum puede crecer a 110 0C, diez grados
Celsius por encima del punto de ebullicin del agua pura al nivel del mar. P. occultum se encuentra en fuentes
termales.

Tabla 8.3. Comparacin de los ingredientes de los medios que se requieren para permitir el crecimiento de una bacteria
del cido lctico, Escherichia coli y una cianobacteria
Bacteria del cido lctico
Cianobacteria
Fuente del nutriente (Leuconostoc mesenteroides)
Carbono
Glucosa
Acetato sdico
Fuente nitrogenada
NH4Cl
Sales inorgnicas
KH2PO4
K2HPO4
MgSO47H2O
FeSO4
MnSO4
NaCl

50 g
40 g
6g
1,2 g
1,2 g
0,4 g
20mg
40mg
20mg

Factores de crecimiento Alanina


(aminocidos)
Arginina HCl
Asparragina
Aspartato
Cistina
Fenilalanina
Glicina
Glutamato
Histidina HCl
Isoleucina

400 mg
484 mg Ninguno
800 mg
200 mg
100 mg
200 mg
200 mg
600 mg
124 mg
500 mg

Escherichia coli
Glucosa
2g
NH4Cl
Na2HPO4
KH2PO4
NaCl
Na2SO4
MgCl26H2O
CaCl2
FeCI6H2O

(Gleobacter Violaceus)
Ninguno

2g
Ninguno
6g
K2HPO4H2O
3g
MgSO7H2O
3g
CaCl2H2O
11 g Citrato frrico amnico
0,4 mg Na2CO3
11 mg Solucin de metales trazab
0,8 mg
Ninguno

40 mg
75 mg
36 mg
6 mg
20 mg
1 ml

Leucina
Lisina
Metionina
Prolina
Serina
Tirosina
Treonina
Triptfano
valina
Factores de crecimiento AdeninaS04
(bases)
Guanina HCl
Uracilo
Xantina
Factores de crecimiento TiaminaHCI
(vitaminas)
PiridoxinaHCI
PiridoxaminaHCI
PiridoxalHCI
Pantotenato
Riboflarina
Nicotinato
p-Aminobenzoato
Biotina
Folato

500 mg
500 mg
500 mg
200 mg
100 mg
200 mg
400 mg
80 mg
50 mg
20 mg Ninguno
20 mg
20 mg
20 mg
1 mg
Ninguno
2 mg
0,6 mg
0,6 mg
1,0 mg
1,0 mg
2,0 mg
0,2 mg
2,0 g
20 g

Ninguno

Ninguno

Tabla 8.4. Tasa de crecimiento de la bacteria Salmonella typhimurium en diferentes medios.


Tiempo de duplicacin
Nmero de ribosomas por clula
Medio
Composicin
(minutos)
Mnimo con lisina
El aminocido lisina + sales
97
7000
Mnimo con glucosa Glucosa + sales

20 aminocidos

Cerebro-corazn

50

17000

32

42000

21

83000

20 aminocidos + sales

Extracto de cerebro y corazn de vaca

El selenio: Banquete o veneno?


El selenio es un elemento que se parece mucho al azufre. Cuando el selenio se encuentra a elevadas
concentraciones, algunas enzimas que catalizan normalmente las reacciones de compuestos azufrados lo usan en
su lugar. El resultado puede ser desastroso. El selenio se incorpora en las macromolculas del organismo, las
cuales no funcionan normalmente. El organismo podra morir, o podra convertirse en una nueva criatura. Muchos
de estos organismos pueden verse en un lago cerca de Kesterton, en California (EE.UU.), que recibe el agua de
riego de suelos que contienen ms selenio de lo normal. Algunos animales del lago estn mutilados, y algunos
pjaros tienen el pico torcido y las alas deformadas.
El selenio es un material txico peligroso, pero algunas bacterias del lago generan ATP oxidando el selenio, de
manera parecida a como algunas bacterias obtienen su energa oxidando el azufre (Captulo 5). Y otras bacterias,
incluida Escherichia coli, incorporan el selenio en determinadas protenas en forma de selenocisteina. La
selenocisteina es un aminocido idntico a la cisteina, pero con un tomo de selenio en lugar del tomo de azufre
de la cisteina ordinaria. E. Coli contiene un monmero de selenocisteina en una enzima, la frmico
deshidrogenasa, que participa en el metabolismo central. Si el tomo de selenio es reemplazado por un tomo de
azufre, la enzima se vuelve prcticamente inactiva. Si el selenio reemplazara el azufre de otras cisteinas de esta
enzima o de cualquier otra enzima, presumiblemente tambin se haran inactivas.
Cmo puede el selenio reemplazar al azufre de esta cisteina y slo de ella? El fenmeno se produce de una
manera muy poco usual. La selenocisteina se produce a partir de un tipo especial de tRNA que sirve slo para este
propsito, y su incorporacin en la protena est codificada por un codn sin sentido (UGA). Por qu slo ste
codn sin sentido seala la incorporacin de selenocisteina? Presumiblemente, de alguna manera la estructura del

mRNA que rodea a este codn es nica. Pero, sin duda, el selenio, que puede ser txico, tambin puede ser
esencial.

Figura 8.5 Tasa de crecimiento de Escherichia coli en un medio rico a varias temperaturas. E. coli crece desde los
8oC hasta los 48oC. La tasa de crecimiento aumenta rpidamente a partir de 8 oC. A 37oC, la temperatura ptima de
crecimiento de E. coli, la tasa de crecimiento es de 2,8 duplicaciones por hora, y el tiempo de duplicacin de unos
21,4 minutos. A temperaturas ms elevadas, la tasa de crecimiento disminuye, y el crecimiento se detiene a 43 oC,
su temperatura mxima de crecimiento.
Las bacterias meslilas crecen mejor alrededor de 37 oC, la temperatura del cuerpo humano. Escherichia coli, que
crece de manera natural en el intestino de los seres humanos y de otros animales, es un mesfilo, al igual que la
mayora de las bacterias que causan enfermedades.
Las bacterias psicrfilas crecen a una tasa significativa a 5 oC, o por debajo de esta temperatura - a la cual
funciona normalmente un frigorfico. Cuando la leche se estropea en un frigorfico, frecuentemente tiene el olor
afrutado de Pseudomonas spp. o el olor ftido de Achromobacter spp., porque estas bacterias son psicrfilas. Por
el contrario, la leche que se vuehe agria a temperatura ambiente tiene un aroma ms agradable, debido al agriado,
semejante al yogurt o mantequilla, porque a esta temperatura predominan las bacterias del cido lctico que son
mesfilas.
Los psicrfilos se subdividen en dos grupos: estrictos y facultativos. Los termfilos se subdividen en
estenotermfilos, termfilos facultativos y termfilos extremos (Tabla 8.5). Los psicrflos facultativos tambin
se llaman psicrotrofos ("que crecen en el fro"), para indicar que pueden tolerar, ms que beneficiarse, de las bajas
temperaturas.
Qu determina la temperatura mxima o mnima a la cual es capaz de crecer un organismo? Sin duda, la
temperatura mxima de crecimiento est determinada por la estabilidad al calor de las protenas de un organismo.
Generalmente, las protenas son las macromolculas de una clula ms sensibles al calor y no puede darse
crecimiento a temperaturas a las que se desnaturalizan las protenas de una clula (Captulo 2). Los termfilos
crecen a temperaturas elevadas porque sus protenas son excepcionalmente estables al calor; los psicrfilos pueden
crecer slo a bajas temperaturas porque algunas de sus protenas son inusualmente sensibles al calor. La
estabilidad al calor refleja la estructura proteica total. Esto es, una mutacin que cambie cualquier aminocido de
una protena estable al calor con toda probabilidad disminuir su estabilidad al calor.
Tabla 8.5. Respuesta de crecimiento a distintas temperaturas entre los diversos grupos de bacterias
Clase
Propiedades
Psicrfilos (tambin llamados psicrotrofos) Crecen de forma apreciable por debajo de 5 oC
Psicrfilos estrictos
No crecen a o por encima de 20 oC
Psicrfilos facultativos
Pueden crecer por encima de 20 oC
Mesfilos
Crecen mejor a temperaturas moderadas, de unos 37 oC
Termfilos
Crecen por encima de 50 0C
Termfilos facultativos
Pueden crecer por debajo de 37 0C
Estenotermfilos
No pueden crecer por debajo de 37 0C
Termlilos extremos
Crecen por encima de 80 0C (algunos por encima de 100 0C)

Ambiente tpico
Agua de mar fra
Suelo y agua
Animales
Suelo
Abono
Fuentes termales

Las causas de la temperatura mnima de crecimiento son ms complejas, pero la mayora tienen la misma base.
Las interaciones hidrofbicas de las protenas se hacen ms dbiles cuando disminuye la temperatura, y la forma
de las protenas cambia ligeramente. La funcin de algunas protenas, incluidas las que regulan el metabolismo, es
particularmente sensible a dichos cambios, y por lo tanto, a bajas temperaturas, los mecanismos de regulacin
metablica se distorsionan y se detiene el crecimiento. Los mecanismos de regulacin de algunos termfilos
comienzan a degradarse a temperaturas elevadas, del orden de 37 0C Para estos organismos, como algunas
bacterias del suelo tales como Bacillus stearothermophilus, la temperatura del cuerpo humano es demasado fra
para su crecimiento. Sorprendentemente, estas bacterias se encuentran en suelos normales de climas templados, lo
cual indica lo caliente que puede estar la superlicie del suelo durante un da soleado.

Presin hidrosttica La presin hidrosttica es la presin que se aplica a un lquido. Generalmente, la presin
hidrosttica se mide en atmsferas. Una atmsfera equivale a 1,0l3 Newton por metro cuadrado, la presin a la que
estamos expuestos en la superficie de la Tierra. Las bacterias ordinarias, tal como Escherichia coli, crecen a
presiones muy elevadas, del orden de 300 atmsferas. Las bacterias que se encuentran en el fondo del ocano
toleran hasta 1 500 atmsferas, suficientes para aplastar cualquier cosa excepto los recipientes de acero ms
resistentes. En cambio, la mayora de levaduras no pueden crecer a presiones superiores a 8 atmsferas, una
presin muy baja. Algunas bacterias, las barfilas (amantes de la presin), crecen ms rpidamente a presiones
superiores a 1 atmsfera y las barfilas obligadas crecen slo a presiones superiores a 1 atmsfera.
Una presin elevada no destruye una clula microbiana como ocurrira con un ser humano, porque el agua pasa
rpidamente a travs de la membrana celular. De esta manera, se iguala la presin dentro y fuera de la clula. Una
elevada presin puede detener el crecimiento microbiano, pero el efecto es bioqumico. El volumen molecular
cambia durante el curso de la mayora de las reacciones qumicas. La presin elevada inhibe cualquier reaccin
qumica que conlleve un incremento en el volumen molecular y favorece cualquier reaccin qumica que implique
una disminucin del volumen molecular. Algunas reacciones bioqumicas incrementan el volumen molecular y se
hacen ms lentas o prcticamente se paralizan al incrementar la presin. Sin embargo, las reacciones bioqumicas
esenciales de los barfilos disminuyen el volumen molecular y se realizan ms rpidamente cuando se incrementa
la presin.

pH La escala de pH mide la concentracin de iones de hidrgeno e hidroxilo de una solucin e ndica si el


ambiente es cido, por debajo de pH 7; alcalino, por encima de pH 7; o neutro, prxima al pH 7 (Captulo 2). En
general, las bacterias crecen mejor a un pH ligeramente alcalino (bsico). Los hongos crecen mejor a un pH
ligeramente cido, y los protozoos y las algas a un pH neutro. sin embargo, existen excepciones, especialmente
entre las bacterias. Los acidfilos (amantes del cido), viven en ambientes con un pH extremadamente bajo. Por
ejemplo, algunos acidlilos crecen en la lixiviacin cida de los desechos de las minas, en las cuales los valores de
pH son muy bajos, del orden de pH 1,0 - la acidez del cido sulfrico. Los alcalfilos (amantes de las bases) viven
en ambientes con un pH extremadamente alto. Por ejemplo, algunos alcallilos crecen en los lagos alcalinos,
frecuentes en los desiertos del oeste de Norteamrica. En stos, los valores de pH son muy elevados, de alrededor
de 12,0 - la alcalinidad de las cremas o lquidos depiladores.
La mayora de las bacterias sobreviven en ambientes con un intervalo de pH relativamente amplio, ajustando su
pH intracelular. Mediante diferentes mecanismos, bombean iones de hidrgeno fuera o dentro de la clula. Por
ejemplo, Escherichia coli puede crecer en ambientes con un intervalo de pH entre 5,0 y 8,0. Pero,
independientmente del pH externo, el pH interno se mantiene en un valor muy cercano a 7,6 - el valor ptimo para
su metabolismo. E. coli, al igual que la mayora de las dems bacterias, pueden realizar reacciones metablicas
vitales slo dentro de un intervalo de pH limitado, porque muchas de sus enzimas funcionan adecuadamente slo
en un intervalo estrecho de pH (Captulo 2).

Presin osmtica Todos los microorganismos necesitan agua lquida para crecer. Por esta razn, no pueden crecer
a temperaturas inferiores al punto de congelacin de su medio o por encima del punto de ebullicin. Una presin
osmtica elevada tambin priva a una clula del agua. Las membranas celulares son muy permeables al agua, de
manera que el agua entra o sale de una clula dependiendo de la presin osmtica relativa, o concentracin de
solutos disueltos en la clula y en su medio ambiente. Las bacterias mantienen una presin de turgencia positiva,
porque la presin osmtica de su contenido celular es mayor que la presin osmtica del medio ambiente (Captulo
4). La presin de turgencia suministra la fuerza a la clula para crecer. En los microorganismos eucariotas, en lugar
de la presin de turgencia, es el citoesqueleto el que proporciona la fuerza para agrandar la clula.
Si aumenta la concentracin de los solutos en el ambiente externo, la bacteria debe mantener positiva la presin de
turgencia. Para hacer esto, bombea hacia la clula iones potasio (K+) y/o compuestos osmoprotectores, tales
como el aminocido prolina, o sintetiza el disacrido trehalosa. Estos solutos mantienen dentro de la clula una
presin osmtica superior a la presion osmtica del exterior. Sin embargo, eventualmente, este incremento en la
presin osmtica interna daa enzimas esenciales e interfiere en el metabolismo de la clula. De esta manera los
ambientes con una elevada presin osmtica inhiben el crecimiento bacteriano. Una manera tradicional de
conservar los alimentos es aadir azcar o sal, que incrementan la presin osmtica y, por lo tanto, impiden el
crecimiento microbiano.
Aunque una elevada presin osmtica evita el crecimiento de la mayora de las bacterias, algunas especies,
denominadas halfilas (amantes de la sal), pueden vivir a concentraciones de sal extremadamente elevadas. Las
arqueobacterias denominadas halobacterias se desarrollan en aguas saturadas de sal. Las salinas, sistemas con
agua de mar que se deja evaporar para producir la sal de mesa, y algunos lagos desrticos tienen un color rojo
intenso debido a su presencia. Estas bacterias no slo toleran elevadas concentraciones intracelulares de sal, sino
que tambin dependen de la misma para la estabilidad de sus cubiertas celulares; cuando se colocan en agua
destilada, o en agua ordinaria, se lisan inmediatamente.

Cuando un incremento en la presin osmtica externa hace que salga agua de la clula, se produce la plasmolisis,
encogindose el citoplasma (Capitulo 4). Las consecuencias de la plasmolisis difieren segn el tipo de clula. En
las bacterias, la membrana plasmtica se separa de la pared celular rgida, pero generalmente, la clula puede
recuperarse de la plasmolisis (a menos que la presin osmtica sea extrema) incrementando su presin osmtica
interna (Figura 8.6). Los microorganismos eucariticos, particularmente los protozoos, son ms sensibles a la
plasmolisis, porque carecen de una pared rgida.

LUCHANDO CONTRA EL FRIO


Puesto que los microorganismos crecen en un amplio intervalo de temperaturas, se enfrentan a desafios
ambientales impensables para los seres humanos, de sangre caliente. Uno de los mayores retos es mantener una
fluidez de la membrana adecuada. Las membranas estn compuestas por fosfolpidos; por lo tanto, como la
mayora de los lipidos, solidifican con el frio y se hacen lquidos con el calor. Para funcionar adecuadamente, las
membranas deben mantener el grado de fluidez adecuado en un intervalo de temperatura. ¿Cmo lo hacen?
De la siguiente manera: la composicin en cidos grasos de los fosfolpidos de sus membranas cambia con la
temperatura ambiental.
El efecto de la composidn de cidos grasos en la fluidez de los lpidos es enorme. En el refrigerador, el aceite de
oliva soldifica, pero el de maz se mantiene fluido. Esto sucede porque el aceite de maz, es rico en cidos grasos
insaturados (contienen dobles enlaces), y el aceite de oliva tiene cidos grasos ms saturados (no contienen dobles
enlaces). A la temperatura ambiente, el aceite de maz es ms fluido que el aceite de oliva. Pero al mezclar el aceite
de maz y el de olva en las proporciones adecuadas, se puede obtener un nivel de fluidez intermedio a temperatura
ambiente, en el refrigerador o a cualquier temperatura intermedia.
Este mismo proceso ocurre en los microorganismos. Cuando disminuye la temperatura de crecimiento, una alta
proporcin de los cidos grasos de los fosfolpidos de las membranas son insaturados, y as su fluidez es ptima a
cualquier temperatura de crecimiento. En Escherichia coli este preciso ajuste se hace de una manera muy sencilla.
Los cidos grasos se sintetizan mediante una ruta metablica ramificada. Una rama lleva a cidos grasos saturados
y la otra a cidos grasos insaturados. Una enzima cerca del punto de ramificacin, en la parte insaturada, es
sensible a las elevadas temperaturas. Cuando aumenta la temperatura, su actividad disminuye, y se fabrican ms
cidos grasos mediante la rama "saturada". Cuando disminuye la temperatura, ocurre lo contrario. El resultado es
una fluidez constante a todas las temperaturas.

8.4 MEDIDA DEL NMERO DE MICROORGANISMOS


La medida del crecimiento y muerte de los microorganismos en el laboratorio requiere tcnicas especiales.
Algunas tcnicas son medidas indirectas. Estas miden una propiedad - la turbidez, el peso seco, o una actividad
metablica - de la masa de clulas de una poblacin. Otras tcnicas son directas. Las medidas directas incluyen
los recuentos directos al microscopio o recuento electrnico, el recuento en placa, o el clculo del nmero
ms probable (NMP). (A veces la filtracin es una etapa preliminar en las medidas directas.)
El recuento directo al microscopio o el recuento electrnico proporcionan un recuento de todas las clulas, tanto
las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide slo las clulas vivas de una poblacin, es decir,
aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"). Los recuentos en placa y el NMP son
recuentos de viables. Cuando se usa la filtracin, se obtiene un recuento de viables. Cada una de estas tcnicas
tienen sus ventajas y sus inconvenientes.

8.4.1 Turbidez
Debido a que todas las clulas de un cultivo axnico son aproximadamente del mismo tamao, su numero es
proporcional a su peso. En otras palabras, dos clulas pesan el doble que una clula, cuatro clulas pesan el doble
que dos, y as sucesivamente. De esta manera, podemos estimar el tamao de una poblacin microbiana a partir de
su peso total. Generalmente, los microbilogos no recogen de manera laboriosa las clulas y las pesan. En su lugar,
utilizan un instrumento ptico denominado espectrofotmetro (Figura 8.7). Un espectrofotmetro mide la
cantidad de luz que transmite una solucin o un cultivo lquido de clulas microbianas. Cuanto mayor masa de
clulas tenga un cultivo, mayor ser su turbdez, se transmitir menos luz y la lectura en el espectofotmetro ser
mayor. Puesto que un espectrofotmetro mide con exactitud lo que vemos cuando examinamos visualmente un
cultivo liquido, no es muy sensible con respecto al nmero de clulas bacterianas. Para que el lquido se vea
turbio, el cultivo liquido debe contener alrededor de 10 millones de clulas bacterianas de un tamao intermedio
por mililitro y, por lo tanto, un espectrofotmetro no es til para detectar una pequea contaminacin,es decir, la
presencia de un pequeo nmero de clulas microbianas no deseadas. Al igual que para la mayora de los cultivos
bacterianos, el espectrofotmetro tambin puede emplearse para cultivos de levaduras.

Figura 8.6 La plasmlisis de una clula bacteriana separa la membrana plasmtica de la pared celular, excepto en
las uniones Bayer, lugares en los que la membrana plasmtica se une a la membrana externa mediante la pared
celular (Captulo 4). Esta micrografa electrnica de transmisin muestra la plasmolisis de Escherichia coli.

Generalmente, el espectrofotmetro se utiliza para estimar masa de un cultivo relativamente denso, y poder as
registrar crecimiento de una poblacin microbiana (Figura 8.7). Para medir la masa o el nmero de clulas con un
espectrofotmetro, necesano, en primer lugar, preparar una curva patrn, o grfica en la que se relacionan las
medidas del espectrofotmetro con la masa celular de un determinado cultivo. Generalmente los distintos tipos de
bacterias producen una turbidez diferent Posteriormente, se puede determinar a partir de la grfica la masa celular
que se corresponde con cualquier lectura en el espectrofotmetro. Las curvas patrn tambin pueden obtenerse
para relacionar las lecturas en el espectrofotmetro con el nmero clulas de un cultivo.

POR QU EL CHAMPN SE ENVASA EN UNA BOTELLA TAN PESADA?


La mayora de los microorganismos pueden soportar elevadas presiones hudrostticas. Pero las levaduras son una
excepcin sorprendente. stas dejan de crecer y de fermentar a tan slo 8 atmsferas de presin. Aunque no se
sabe por qu la levadura es tan sensible a la presin, este hecho constituye una ventaja para la obtencin del vino.
Los productores de vino alemanes explotan la sensibilidad a la presin de las levaduras para disminuir la tasa de la
fermentacin por levaduras que convierten el zumo de uva en vino. As se previene la formacin de calor y el dao
que se puede causar al sabor del vino. Realizan la fermentacin en tanques de acero cerrados y dejan que aumente
la presin debido a la produccin de dixido de carbono, hasta que se modera la tasa de fermentacion.
La sensibilidad de las levaduras a la presin es incluso ms critica en la obtencin del champn. Las burbujas de
dixido de carbono del champn se forman en una fermentacin secundaria que se realiza generalmente en la
botella. Para asegurarse de que se producir una determinada cantidad de dixido de carbono, se aade una
cantidad calculada de azcar. No existe prcticamente riesgo de que se produzca demasiado dixido de carbono y
explote la botella. La fermentacin se detiene cuando la presin en la botella alcanza las 8 atmsferas, una presin
que la pesada botella de champn puede soportar perfectamente.

Como cualquier otro instrumento, el espectrofotmetro tiene ventajas y desventajas. Sus medidas son rpidas y
reproducibles. Sin embargo, slo puede utilizarse para cultivos relativamente densos, y no puede distinguir entre
clulas muertas y vivas. Tampoco puede utilizarse con clulas que tiendan a formar agregados, porque dejan de
suspenderse rpidamente y desaparece la turbidez.

Figura 8.7 El espectrofotmetro. (a) El espectrofotmetro mide la turbidez, es decir, la cantidad de luz que
transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia. La clula bacteriana dispersa la luz, de manera que no
es detectada por el detector sensible a la luz. (b) El tubo de la izquierda no tiene clulas bacterianas y est
transparente. El de la derecba contiene alrededor de mil millones (10 9) de clulas por mililitro y, por lo tanto, est
turbio. (c) La curva patrn relaciona la absorbancia con el nmero de clulas bacterianas por mililitro. Una vez que
se obtiene, esta curva puede usarse para convertir cualquier medida de absorbancia en nmero de clulas. Por
ejemplo, a partir de esta curva, una lectura de 1,6 unidades de absorbancia significa que el cultivo contiene 100
millones (108) de clulas por mililitro.
8.4.2 Peso seco
El nmero de clulas de un cultivo se puede medir dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco de una
clula individual. El peso seco de las clulas de un cultivo se determina separndolas del medio, desecndolas y
pesndolas. Para obtener una medida precisa, se requieren alrededor de 25 ml de un cultivo relativamente denso.
Las clulas se separan mediante filtracin (Captulo 3) o mediantecentrifugacin. Una centrfuga es un
instrumento que hace girar unos recipientes denominados tubos de centrfuga a una velocidad elevada, generando
una fuerza centrfuga que hace que las partculas pequeas, incluidas las clulas microbianas, se vavan al fondo del
tubo. Luego, se lavan las clulas, se resuspenden en agua destilada y se filtran o centrifugan de nuevo. Despus del
segundo lavado, las clulas se desecan en un horno a 1050C durante unas 24 horas y luego se enfran en un
desecador, para evitar que capten la humedad del aire. Un desecador es una cmara que se mantiene con una
humedad muy baja, bien qumicamente o mecanicamente, y que se utiliza para desecar los materiales o para
mantenerlos desecados. Finalmente, se pesan las clulas.
La medida del peso seco es tediosa y requiere un cierto tiempo; adems, la muestra debe contener ms de unos 10
millones de clulas, No obstante, tiene ciertas aplicaciones. Por ejemplo, debe utilizarse para construir la curva
patrn que relaciona las medidas en el espectrofotmetro con las de la masa celular.

8.4.3 Actividad metablica


La actividad metablica puede utilizarse, mediante varios procedimientos, para medir indirectamente la cantidad
de clulas microbianas. La tasa de formacin de productos metablicos, tales como gases o cidos, que produce un

cultivo, refleja la masa de clulas presente en el mismo, Asimismo, la tasa de utilizacin de un substrato, como el
oxgeno o la glucosa, refleja la masa celular.
Finalmente, la tasa de reduccin de determinados colorantes, es otra forma de estimar la masa microbiana. Por
ejemplo, el azul de metileno se vuelve incoloro cuando es reducido por los componentes de la cadena de transporte
de electrones de los microorganismos. Consecuentemente, en ausencia de oxgeno, que oxida el azul de metileno,
la tasa de decoloracin de este compuesto mide la masa microbiana. La tasa de reduccin del colorante es una
medida muy indirecta y, por lo tanto, no es una medida precisa de la masa microbiana. Sin embargo, la tcnica
puede utilizarse con materiales complejos, como el suelo o la leche, sin necesidad de usar instrumentos.

8.4.4 Recuento directo


Un recuento directo es un recuento de las clulas individuales de una poblacin microbiana. El recuento directo
puede hacerse visualmente, utilizando un microscopio y un porta especial denominadocmara de
recuento. Existen muchos tipos de cmaras de recuento, pero la cmara de Petroff-Hauser, llamada as en honor
de los que la desarrollaron, tal vez sea la ms utilizada en los laboratorios de microbiologa (Figura 8.8). Todas las
cmaras de recuento poseen una profundidad conocida y tienen marcados unos cuadrados de dimensiones tambin
conocidas. De esta manera, cada cuadrado que observamos al microscopio representa un volumen determinado de
lquido; por ejemplo, un microlitro (0,001 l). Se puede calcular cuntas clulas estn presentes en 1 ml o en
cualquier otro volumen del cultivo, contando las clulas de varios cuadrados y haciendo la media. Puesto que las
clulas vivas y las muertas tienen un aspecto parecido observadas al microscopio, el recuento directo es un
recuento total de clulas.
El recuento directo tambin puede hacerse electrnicamente, con un instrumento denominado contador
Coulter. El recuento electrnico es posible porque las clulas microbianas no conducen la electricidad tan bien
como el medio en el que estn suspendidas. Se coloca en una cmara del contador un volumen determinado del
cultivo y se hace pasar a travs de un pequeo poro (de unos 15 m de dimetro) a otra cmara, mediante una
bomba de vaco. El poro forma parte de un circuito elctrico, de manera que cada vez que pasa una clula a travs
del mismo, la conductividad del circuito disminuye y la presencia de la clula es detectada electrnicamente en el
contador.
Los dos mtodos principales de recuento directo - microscpico y recuento electrnico - dan resultados
semejantes, pero se usan en situaciones muy diferentes. El recuento microscpico no requiere de un equipo caro,
tan slo se necesita una cmara de recuento, no muy cara, adems del microscopio ptico que existe en cualquier
laboratorio de microbiologa. Pero es un proceso tedioso y lento. Por el contrario, el recuento electrnico requiere
un equipo caro, pero es muy rpido y preciso, si las clulas son las nicas partculas presentes (el recuento
electrnico tambin se usa en los laboratorios clnicos para contar las clulas sanguneas). El recuento
microscpico es necesario si la muestra contiene partculas extraas, como clulas sanguneas o fragmentos de
suelo. Una persona que realiza un recuento microscpico puede discriminar entre las clulas microbianas y las
partculas extraas, pero si tienen aproximadamente el mismo tamao, el contador electrnico las contar como
clulas.

Figura 8.8 Recuento microscpico directo. La cmara de recuento de Petroff-Hauser se usa, junto a un
microscopio, para realizar un recuento directo de clulas. Consta de un porta que tiene unos pocillos supericiales
(de 0,02 mm de profundidad). En el fondo del porta hay grabada una rejilla de 1 mm2, dividida en 25 cuadrados
grandes, cada uno de los cuales est dividido en 16 cuadrados ms pequeos. De esta manera, el volumen total de
la rejilla es de 0,02 (un quinceavo) mm3, y cada cuadrado grande es un veinticincoavo de esta cantidad.

8.4.5 Recuento en placa


Para realizar un recuento en placa se utilizan los mtodos de extensin o de vertido en placa, empleados para
cultivar los microorganismos, que se describieron en el Captulo 3. La tcnica consiste en diluir de manera seriada,
generalmente diez veces por cada dilucin, una muestra del cultivo y luego sembrar una pequea cantidad de cada
dilucin en una placa o bien mezclarla con el medio a sobrefusin. A continuacin, la placa debe ser incubada en
las condiciones adecuadas. Una vez que se han formado colonias visibles, generalmente despus de un da, se
seleccionan para el recuento de colonias las placas en las que stas estn bien separadas. Las placas que tienen
entre 30 y 300 colonias ofrecen una buena relacin entre la rapidez del recuento y la precisin en el resultado
obtenido. El nmero de colonias de una placa, junto con la dilucin de la muestra que se inocul en ella, nos
permite calcular la concentracin de clulas presente en la muestra original (Figura 8.9). El recuento en placa es
un recuento de viables, Se basa en el principio de que una nica clula viable originar una colonia visible, cuando
se siembre en una placa de agar.
La ventaja del mtodo de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas condiciones de
incubacin adecuadas, puede detectarse incluso una nica clula viva. Ademas, el recuento en placa no requiere un
equipo complicado. Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muy preciso, porque la
precisin depende del recuento de un nmero elevado de colonias. La precisin aumenta con el nmero de
colonias que se recuentan, ya que disminuye el error debido al muestreo.

Figura 8.9 Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer lugar, la
muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estril y se mezclan
adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilucin apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10 -5).
Posteriormente se aade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendindolo en la superficie de la misma
(mtodo de extensin en placa) o mezclndolo con el medio (mtodo de vertido en placa). Las placas se incuban y
se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadsticas, las placas deben contener entre 30 y
300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias.
Dicho error es la imprecisin que resulta inevitable, con independencia de lo cuidadosamente que se hagan las
disoluciones y las inoculaciones, porque las muestras no son siempre representativas de la poblacin total en
conjunto. Algunas muestras de un cultivo contendrn ms clulas que otras, pero en el 95 por ciento de los casos,
el nmero real de clulas viables no difiere del nmero determinado en ms del doble de la raz cuadrada del
nmero de colonias recontadas.

Figura 8.10 El mtodo del nmero ms probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el factor
de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen slo un organismo y los otros, ninguno. A partir
del nmero, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1),
puede determinarse el nmero ms probable de clulas estadisticamente (11,0) en la primera de las tres diluciones,
mediante una tabla de nmeros ms probables (Tabla 8.6). Este valor, multiplicado por el factor de dilucin nos
proporciona el nmero de clulas viables de la muestra.

8.4.6 Nmero ms probable


El mtodo del nmero ms probable (NMP), al igual que el mtodo de recuento en placa, nos proporciona un
recuento de viables. Se basa en el principio de que una nica clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo
turbio. El NMP requiere la realizacion una serie de diluciones seriadas al dcimo de la muestra de cultivo, en un
medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo (Figura 8.10). Posteriormente, se incuban las
muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el
microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o ms clulas microbianas
a partir de la muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna clula permanecern
transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilucin, se alcanzar un punto en el cual algunos tubos
contendrn tan slo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran
ninguna clula, se puede determinar el numero ms probable de microorganismos presentes en la muestra original,
utilizando para ello una tabla estadstica. La Tabla 8.6 muestra una tabla del NMP.
La precisin del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que se usan, aunque cinco tubos por
dilucin se considera como una relacin apropiada entre la precisin y la economa. El mtodo del NMP se utiliza
para contar microorganismos que son dificiles de cultivar en medio slido. Tambin se usa para determinar el
nmero de clulas de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio lquido detcrminado. Por ejemplo, puede
emplearse para determinar la contaminacin del agua potable, determinando el nmero de bacterias que pueden
crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias probablemente sean Escherichia coli provenientes de
aguas residuales contaminadas, y la presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de
contaminacin.
Tabla 8.6. Tablas del nmero ms probable
Nmero de tubos con turbidez inoculados a partir
de tres diluciones sucesivas

NMP

Nmero de tubos con turbidez inoculados a partir


de tres diluciones sucesivas

NMP

0,18

2,3

0,20

3,1

0,40

3,3

0,45

4,6

0,68

4,9

0,68

7,0

0,93

9,5

0,78

7,9

1,1

11,0

1,1

14,0

1,4

13,0

1,3

17,0

1,7

22,0

1,7

28,0

2,1

24,0

2,2

35,0

2,6

54,0

2,7

92,0

160,0

8.4.7 Filtracin
Los mtodos que dependen de la formacin de colonias (recuento en placa) o del desarrollo de turbidez (nmero
ms probable) pueden detectar una nica clula microbiana viable, pero debido a razones prcticas, slo se utiliza
alrededor de un mililitro de la muestra corno inculo para la placa o para el tubo. Por lo tanto, no se detectan las
poblaciones con menos de una clula por mililitro. Supongamos que queremos determinar las bacterias que existen
en una piscina. La muestra debe concentrarse antes de proceder al recuento. La concentracin de los
microorganismos de las muestras se hace, generalmente, mediante filtracion sguiendo el mismo mtodo descrito
en el Capitulo 3. Para ello, se hace pasar un volumen conocido de lquido o de aire a travs de un filtro de
membrana, haciendo vacio. Los poros del filtro son lo suficientemente pequeos como para que no puedan pasar
las clulas microbianas. Posteriormente se coloca el filtro en un medio slido adecuado y se incuba. El nmero de
colonias que se desarrollan es el nmero de clulas microbianas viables en el volumen de fluido que se filtr.
Generalmente, los resultados se expresan como organismos presentes por litro (Figura 8.11).
Los diversos mtodos de determinacin del nmero de microorganismos se resumen en la Tabla 8.7.

RESUMEN
LAS POBLACIONES (p. 192)
1. El crecimiento microbiano se refiere al crecimiento de una poblacion - un aumento en el nmero de clulas, no
un aumento en el tamao de una clula individual.

Figura 8.11 Filtracin.

Tabla 8.7. Mtodos de determinacin del nmero de microorganismos.


Microorganismos para
Tipo de
Mtodo
Usos / Limitaciones
los que se utiliza
recuento
Indirecto
Turbidez
La mayoria de las bacterias Total
Determina la turbidez con un espectrofotmetro; rpido y
y levaduras
reproducible; la suspensin debe contener ms de unos l0 millones de
clulas por ml; se requiere una curva patron
Peso seco
Cualquier microorganismo Total
Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducible
Actividad
Cualquier microorganismo Viables
Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso; puede utilizarse con
metablica
viable
materiales complejos
Directo
Recuento
Cualquier microorganismo Total
Muy til para el recuento de un tipo de clulas de una mezcla; requiere
microscpico
unicelular
un cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos
Recuento
Cualquier microorganismo Total
Muy til para el recuento de clulas de un cultivo axnico; rpido y
electrnico
unicelular
preciso; no debe estar presente material extralio
Recuento en
Cualquier microorganismo Viables
Muy sensible - puede detectar incluso una clula; lento y tedioso; para
placa
unicelular viable
evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran nmero de
colonias
Numero ms
Cualquier microorganismo Viables
Utilizado para microorganismos que son dificiles de cultivar en medio
problable
viable
slido y para determinar contaminacin por Escherichia coli en aguas;
requiere un cierto tiempo
Filtracin
Cualquier microorganismo Viables
Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un
viable
pequeo nmero de clulas a partir de grandes volmenes de un
lquido o de un gas

CMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS (pp.192-196)


1. El tiempo de duplicacin es el perodo que requieren las clulas de una poblacin microbiana para crecer,
dividirse y dar lugar a dos nuevas clulas por cada una de las que existan anteriormente.
2. La tasa de crecimiento se mide normalmente como el tiempo de duplicacin por hora.
3. El crecimiento exponencial significa que durante cada tiempo de duplicacin, el nmero de clulas de la
poblacin se incrementa por un factor de dos. La frmula es N = 2n, donde N es el nmero de clulas en el cultivo
despus de que han pasado n tiempos de duplicacin.
4. El crecimiento microbiano se representa grficamente en una escala logartmica.

5. Un cultivo microbiano pasa tpicamente por cuatro fases distintas de crecimiento: la fase lag, la fase log, la fase
estacionaria y la fase de muerte. Las fases lag y de muerte no se producen a veces en un cultivo determinado.
6. Generalmente, la fase lag se produce cuando las clulas en fase estacionaria o en fase de muerte se inoculan en
un medio de cultivo fresco. Es un perodo de no crecimiento, pero existe una actividad metablica considerable, ya
que las clulas se preparan para crecer.
7. La fase log no contina indefinidamente debido a factores como la reduccin de nutrientes o a la acumulacin
de productos txicos.
8. Durante la fase estacionaria no se produce un incremento neto de la masa, pero las clulas se hacen ms
pequeas y sintetizan componentes que les ayudan a sobrevivir durante los perodos de no crecimiento.
9. Durante la fase de muerte, las clulas mueren exponencialmente, pero a una tasa ms baja de la que crecen en la
fase log. Generalmente la muerte se produce porque las clulas agotan sus reservas intracelulares de ATP y no
pueden reparar los componentes celulares.
10. En condiciones naturales, los nutrientes entran de manera continua en el ambiente de una clula a bajas
concentraciones, de manera que la tasa de crecimiento es fijada por la concentracin del nutriente mas escaso, o
nutriente limitante.
11. En el laboratorio, se consigue un cultivo continuo con un quimiostato. La concentracin del nutriente limitante
en el cultivo fija la tasa de crecimiento del mismo.
12. Las clulas de una colonia estn en fases diferentes de crecimiento dependiendo de su localizacin. Las clulas
que crecen en la superficie de una colonia son acrbicas y las que estn en el centro son anaerbicas.

QU NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA CRECER? (pp. 196-203)

Nutricin (pp. 196-201)


1. Los nutrientes son compuestos qumicos procedentes del medio ambiente que son utilizados por una clula para
sintetizar las molculas necesarias para fabricar nuevas clulas.
2. Todos los microorganismos requieren una fuente de carbono para crecer, porque el carbono es la base estructural
de los compuestos bioqumicos.
3. El oxgeno desempea un papel complejo en el metabolismo microbiano - como nutriente, como aceptor de
electrones y como generador de productos txicos, Los microorganismos que son capaces de una respiracin
aerbica utilizan el oxgeno gaseoso para generar energa.
4. Los compuestos txicos que contienen oxgeno son productos del metabolismo aerbico. Entre ellos se
encuentran el perxido de hidrgeno y los radicales libres superxido y el radical hidroxilo.
5. Los aerobios estrictos pueden crecer tan slo en presencia de oxgeno. Los microaerfilos toleran menos
oxgeno. Los anaerobios facultativos pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxgeno. Los
anaerobios aerotolerantes no requieren oxgeno pero no mueren al ser expuestos a l. Los anaerobios estrictos
mueren en presencia de oxgeno.
6. Todos los seres vivos requieren alguna forma de nitrgeno (un constituyente de las protenas y de los cidos
nucleicos, as como de determinados metabolitos esenciales), de fsforo (un constituyente de los acidos nucleicos,
de los fosfolpidos y de ciertos metabolitos esenciales) y de azufre (un componente de dos aminocidos, de
algunos tipos de tRNA, y de determinados metabolitos esenciales).
7. Los elementos traza son compuestos qumicos inorgnicos, que se requieren en cantidades pequeas, aunque
son esenciales, tales como el potasio, el hierro y el zinc, que los microorganismos necesitan para crecer. Algunos
elementos traza son cofactores.
8. Los factores de crecimiento orgnicos son bloques bsicos esenciales. Si un microorganismo no puede sintetizar
un determinado bloque bsico en particular, debe ser suministrado a partir del ambiente. Los factores de
crecimiento orgnicos pueden ser aminocidos, purinas, pirimidinas, cidos grasos o vitaminas.
9. La diversidad nutricional se refiere a los diferentes requerimientos de factores de crecimiento orgnicos de los
microorganismos.
10 Los microorganismos crecen en un ambiente rico, utilizando los bloques bsicos preformados, incluso aunque
sean capaces de fabricarlos.

El ambiente no nutritivo (pp. 199-203)


1. Cada especie microbiana crece en un intenvalo de temperatura, desde la temperatura mnima de crecimiento a
una temperatura mxima de crecimiento. La temperatura ptima de una especie es aquella a la cual crece ms
rpidamente.
2. Los termfilos crecen mejor a temperaturas superiores a los 50 0C. Los mesfilos crecen mejor a temperaturas
cercanas a los 37 0C, la temperatura del cuerpo humano. Los psicrfilos crecen a 5 0C o por debajo de sta
temperatura, la temperatura de un frigorfico.
3. La estabilidad al calor de las protenas de los microorganismos determina la temperatura mxima a la cual puede
crecer. La temperatura minima est determinada por el debilitamiento de las interacciones hidrofbicas de las
protenas.
4. La presin hidrosttica es la presin que se aplica a un lquido. La mayora de los microorganismos toleran altas
presiones hidrostticas. Los barfilos crecen mejor (facultativos) o slamente (estrictos) a presiones superiores a 1
atmsfera.
5. En general, las bacterias crecen mejor a un pH ligeramente alcalino, y los hongos crecen mejor a un pH
ligeramente cido. Los acidfilos viven en un ambiente con un pH extremadamente bajo, mientras que los
alcalfilos viven en ambientes con un pH elevado.
6. Las bacterias mantienen una presin de turgencia positiva. la presin osmtica del interior de la clula es mayor
que la presin osmtica de su ambiente externo. Determinadas especies bacterianas, las halfilas, requieren
elevadas presiones osmticas externas.
7. La plasmolisis se produce cuando un incremento en la presin osmotica externa hace que salga agua de la
clula, encogindose el citoplasma.

MEDIDA DEL NMERO DE MICROORGANISMOS (pp. 203-210)


1. Algunos mtodos de medida son indirectos, y miden una propiedad la turbidez, el peso seco, o una actividad
metablica - de la masa de clulas de una poblacin. Otros mtodos son directos, contando las clulas
individuales.
2. El recuento al microscopio o el recuento electrnico dan un recuento total - un recuento de todas las clulas,
vivas y muertas. Un recuento de viables es un recuento de tan slo las clulas vivas, es decir, aquellas que son
capaces de reproducirse. El recuento en placa y el NMP son recuentos de viables.
3. La turbidez se mide con un espectrofotmetro. El espectrofotmetro mide la cantidad de luz que transmite un
cultivo lquido de clulas microbianas. Se utiliza una curva patrn para relacionar las medidas en el
espectrofotmetro con la masa celular o con el nmero de clulas de un cultivo particular.
4. Para la determinacin del peso seco se separan las clulas del medio, se desecan y se pesan.
5. Hay varios procedimientos por los que se puede usar la actividad metablica para medir el nmero de clulas: la
tasa de formacin de productos metablicos, tales como gases o cidos, que produce un cultivo; la tasa de
utilizacin de un substrato, como el oxgeno o la glucosa; la tasa de reduccin de determinados colorantes.
6.El recuento microscpico sc hace con un porta especial determinado cmara de recuento, como la cmara de
Petroff-Hauser .A partir de la prolundidad del pocillo y de la rejilla, se puede determinar el nmero de clulas de
un volumen determinado de muestra.
7.El recuento electrnico se hace con un contador Coulter. El recuento electrnico es posible porque las clulas
microbianas no conducen la electricidad tan bien como su medio.
8. En el recuento en placa, se diluye varias veces al dcimo o al centsimo una muestra del cultivo, y
posteriormente, se inocula o se mezcla en una placa y se incuba. Se seleccionan las placas que tienen entre 30 y
300 colonias y se recuentan.
9. El nmero ms problable <NMP> se basa en el principio de que una nica clula viva puede desarrollarse y
producir un cultivo turbio. Despus de varias diluciones seriadas al dcimo, se incuban los tubos problema. Los
tubos que se ponen turbios recibieron una o ms clulas. Determinando la dilucin media a la que los tubos no
reciben clulas, se puede calcular, utilizando una tabla del NMP, el nmero de microorganismos que estaban
presentes de manera ms probable en la muestra original.

10. La filtracin se hace antes de medir un nmero pequeo de microorganismos en grandes volmenes de lquido
o gas.

PREGUNTAS DE REVISIN
LAS POBLACIONES
1. A qu se rofiere el trmino crecimiento microbiano?

CMO CRECEN LOS MICROORGANISMOS


1. Qu es el tiempo de duplicacin? Por qu se usa frecuentemente la tasa de crecimiento, en lugar del tiempo de
duplicacin?
2. Explique esta frase: los microorganismos crecen exponencialmente.
3. Nombre, secuencialmente, las fases de crecimiento de un cultivo. Explique cada una de ellas.
4. Cmo se mantiene un cultivo continuo en el laboratorio?
5. En condiciones naturales, qu fija normalmente la tasa de crecimiento?
6. Defina el trmino colonia. Cmo afecta la localizacion en una colonia a la fase de crecimiento de una clula?
Cmo afecta la localizacin al acceso del oxgeno?

QU NECESITAN LOS MICROORGANIMOS PARA CRECER?


1. Qu son los nutrientes? Explique la funcin de cada uno de estos nutrientes: carbono, oxgeno, azufre,
elementos traza, factores orgnicos de crecimiento.
2. Explique esta frase: el oxgeno juega un papel complejo en el metabolismo microbiano. Utilice el
trmino radical libre en su explicacin.
3. Explique las distintas relaciones que tienen con el oxgeno los siguientes tipos de micoorganismos: aerobios
obligados, microaerfilos, anaerobios facultativos, anaerobios aerotolerantes y anaerobios obligados.
4. A qu se refiere la diversidad nutricional?
5. Qu es un ambiente de crecimiento rico? Cmo explotan los microoroanismos un ambiente de crecimiento
rico?
6. Nombre los factores fsicos significativos para un microorganismo en un ambiente no nutritivo. Nombre los
factores qumicos ms significativos.
7. Explique cmo crecen las distintas especies en un intervalo de temperaturas. Utilice estos trminos en su
comentario: temperatura mnima de crecimiento, temperatura mxima de crecimiento, teniperatura ptima.
Explique qu determina la temperatura maxima y mnima.
8. Defina los siguientes trminos: termfilos, mesfilos, psicrlilos.
9. Qu es la presin hidrosttica? Por qu los microorganismos pueden soportar elevadas presiones
hidrostrticas? Hasta qu punto es perjudicial la presin hidrosttica para los microorganismos?
10. Qu valores de pH prefieren las bacterias? Y los hongos? Qu son los acidfilos y los alcalfilos? Si las
funciones metablicas requieren un intervalo de pH relativamente estrecho, cmo pueden las bacterias existir en
ambientes con un amplio intervalo de valores de pH?
11. Un qu se diferencian las halfilas de otras bacterias? Cmo mantienen las bacterias la presin de turgencia?
Qu es la plasmolisis?

MEDIDA DEL NMERO DE MICROORGANISMOS


1. Un qu se diferencian los mtodos directos e indirectos de medida de las poblaciones de los microorganismos?
Cul es la diferencia entre un recuento total y un recuento de viables?
2. Indique si cada uno de los siguientes mtodos de medida es directo o indirecto y si de un recuento total o de
viables; describa el procedimiento y explique las ventajas y desventajas.
a. turbidez
b. peso seco
c. actividad metablica
d. microscopia directa
e. recuento electrnico directo
f. recuento en placa
g. nmero ms probable (NMP)
h. filtracin
Preguntas de ensayo
1. Discuta las ventajas y desventajas del cultivo continuo para la obtencin de antibiticos.
2. Discuta el efecto de la riqueza de un medio y de la concentracin de un nutriente en la tasa de crecimiento.

LECTURAS RECOMENDADAS

Ingraham, J. L.; Maaloe, O. y Niedhardt, F. C. 1983. Growth of the bacterial cell. Sunderland, Mass: Sinauer.
Kolter, R. 1992. Life and death in stationary phase. ASM News 58:75-79
Marr, A. G. 1991. Growth rate of Escherichia coli. .Microbiological Reviews 55:3l6-33.
Mynell, G. G., y Mynell, E. 1970. Theory and practice in experimental bacteriology. New York: Cambridge
University Press.
Fuente:
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/58/texthtml/cap805.htm

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