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Un quimiostato andante
El sueo de la microbiologa industrial es convertir un substrato barato y abundante en un producto de gran valor.
Los microbilogos podran no estar de acuerdo en cuanto al producto ideal pero s en cuanto al substrato ideal.
Todos coinciden en que la celulosa el componente mayoritario de la pared de la clula vegetal es el
compuesto orgnico ms abundante en el mundo y probablemente el ms barato. Sin embargo, slo los
microorganismos pueden utilizar la celulosa como substrato y, por lo tanto, convertirla en algo til.
Al preguntarle a Robert Hungate, un microbilogo norteamericano de primera linea, si se descubriria alguna vez
una conversin microbiana de la celulosa de inters comercial, ste replic que ya exista - la vaca. La vaca y otros
rumiantes son fbricas andantes que utilizan los microorganismos para convertir la celulosa en carne y leche. Estos
rumiantes obtienen la celulosa (y pequeas cantidades de otros substratos) al ingerir hierba y otros forrajes que
mastican para desmenuzarlos en pequeas porciones que llegan al rumen, la gran cmara del estmago, constituido
por cuatro compartimientos. El rumen de la vaca es rico en bacterias y protozoos. Estos -y no la vaca- son los que
metabolizan la celulosa. La vaca no hace nada para obtener los nutrientes a partir de la celulosa. Sin embargo, los
obtiene en su mayor parte de los productos de la fermentacin microbiana producida en su rumen y de las clulas
microbianas que pasan de manera continua desde el rumen de la vaca al intestino, donde son digeridas y
absorbidas.
Hungate y sus colegas han demotrado que el rumen de la vaca funciona como un quimiostato, un aparato que se
utiliza para cultivar microorganismos. Los nutrientes llegan de forma continua al rumen, donde los
microorganismos crecen tambin sin parar, y parte de su contenido pasa continuamente al sistema digestivo. Esto
no significa que las vacas estn siempre comiendo. Por el contrario, los rumiantes aportan nutrientes al rumen de
manera regular, rumiando el forraje, es decir, masticando el forraje regurgitado. Cuando mastican, fluyen al rumen
fragmentos de forraje suspendidos en la saliva. La vaca no rumia siempre que no est comiendo, pero el aporte de
nutrientes al rumen es esencialmente continuo porque los fragmentos slidos de celulosa actan como reservorios
de nutrientes para los microorganismos.
Las vacas y otros rumiantes han alcanzado los objetivos que suean los microbilogos industriales - convertir la
celulosa en productos de valor. Adems, lo hacen eficaaanente, con mayor eficiencia que cualquier proceso
industrial conocido.
Comprender:
Cmo crecen los microorganismos: el tiempo de duplicacin y el crecimiento exponencial
Las fases de crecimiento de un cultivo microbiano
Los mtodos que se pueden utilizar para mantener los microorganismos creciendo continuamente
Qu tipos de nutrientes requieren los microorganismos para crecer
Las condiciones ambientales que permiten el crecimiento microbiano: la temperatura, la presin
hidrosttica, el pH y la fuerza osmtica
Cmo medir el crecimiento de una poblacin microbiana usando mtodos indirectos - midiendo la turbidez,
el peso seco, o la actividad metablica
Cmo medir el crecimiento de una poblacin microbiana mediante recuento directo, recuento en placa,
nmero ms probable y mediante filtracin
8.1 LAS POBLACIONES
Al estudiar el metabolismo y la gentica de los microorganismos, nos hemos centrado en un individuo - la forma
en que se mantiene y se reproduce una clula microbiana. En este captulo y en el siguiente, prestaremos atencin
a los grandes grupos - estudiando cmo las poblaciones de microorganismos aumentan mediante el crecimiento y
disminuyen o desaparecen como resultado de la muerte.
Estudiar las poblaciones requiere que observemos a los microorganismos desde una nueva perspectiva. Cuanto
estudiamos individuos, lo que hacemos es describir. Describimos las partes de la clula implicadas en un proceso
particular, cmo produce la clula las molculas que necesita para originar una nueva clula y cmo protege su
informacin gentica cuando sta pasa de una generacin a la siguiente. Sin embargo, cuando estudiamos
poblaciones, lo que hacemos es Contar. De las poblaciones queremos saber "cunto?","cunto ms?"o"cunto
menos?". El estudio de las poblaciones, ya sean microbianas o humanas, se realiza desde un punto de vista
matemtico.
A menos que digamos lo contrario, usaremos el trmino crecimiento microbiano para referirnos al crecimiento de
una poblacin, no al incremento en tamao de una clula individual. Las clulas microbianas individuales crecen,
pero la mayoria solo incrementan su tamao hasta alrededor del doble, antes de que se dividan en dos. La divisin
celular se traduce en crecimiento o incremento en el nmero de celulas de la poblacin (Figura 8.1).
En un ambiente favorable, una clula microbiana dada aumenta su tamao; y cuando ste se duplica, la clula se
divide. La mayora de las bacterias se alargan y se dividen mediante fisin binaria, o biparticin, cerca del ecuador
celular, para formar dos clulas hijas aproximadamente iguales. Algunos microorganismos unicelulares, incluidas
algunas bacterias, se replican por gemacin, formando una yema que crece y se separa de la clula parental.
Aunque tratamos el crecimiento en trminos de una poblacin bacteriana que se divide mediante fisin binaria, los
mismos principios se pueden aplicar para los microorganismos que se reproducen mediante gemacin (Captulo 5).
El crecimiento de los microorganismos filamentosos (aquellos que forman largos tubos) y de los microorganismos
con ciclos de vida complejos siguen reglas ms complicadas.
Durante un periodo de tiempo de duplicacin constante, una poblacin microbiana se encuentra en crecimiento
exponencial. Esto significa que durante cada tiempo de duplicacin, el nmero de clulas de la poblacin se
incrementa en un factor de dos, es decir, se duplica.
El concepto de crecimiento exponencial se ilustra mediante un paradigma matemtico acerca de los lirios
acuticos. Un lirio de agua produce una hoja nueva cada da, por cada hoja que tena
el da anterior. Comenzando con una unica hoja, el lirio cubre un estanque de media hectrea en unos 30 das.
Cunto tardar en cubrir un estanque de una hectrea? La respuesta correcta es 31 das, no 60, porque el tiempo de
duplicacin es de un da. En condiciones de crecimiento exponencial, los seres vivos se multiplican con una
asombrosa rapidez. Durante cada tiempo de duplicacin se producen tantas nuevas clulas como se haban
producido anteriormente de manera acumulada.
Figura 8.1 La mayora de las clulas microbianas se dividen por fisin binaria como se muestra en esta
micrografa electrnica de barrido de la bacteria Staphylococcus aureus. En la isin binaria, la clula replica su
DNA y proporciona una copia a cada clula hija.
Puesto que el crecimiento microbiano es exponencial, para la expresin grfica del crecimiento de una poblacin
microbiana se utiliza una escala exponencial (Figura 8.2). Aunque la misma informacin podra expresarse
utilizando una grfica aritmtica, o numerica sencilla, la grfica exponencial tiene ventajas significativas. El
numero de microorganismos de una poblacin que aumenta exponencialmente se incrementa lentamente al
principio y luego muy rpidamente. Por ejemplo, durante las tres primeras duplicaciones de una sola clula, slo
se producen siete nuevas celulas. Durante la sptima duplicacin, se originan 64 clulas y durante la duplicacin
vigsimo primera, ms de un milln. Si se expresa esta curva en una escala aritmtica, el incremento inicial apenas
se apreciar, mientras que las fases de crecimiento posteriores dispararan la grfica. Utilizando una escala
exponencial, la curva se convierte en una lnea recta, con una pendiente directamente relacionada con la tasa de
crecimiento de la poblacin. Esto es lgico si recordamos que por cada duplicacin la poblacin se duplica. En
otras palabras, el nmero total de clulas es igual a dos elevado a un exponente, y dicho exponente es el nmero de
generaciones que han transcurrido desde que la poblacin comenzo a aumentar. As, una poblacin que comienza
como una clula (20), se incrementa a dos clulas (21), luego a cuatro clulas (22), ocho clulas (23), 16 clulas (24),
y asi sucesivamente. La frmula general es N = 2n, donde N es el nmero de clulas en el cultivo despus de que
pasen n tiempos de duplicacin.
Por qu la grfica es una lnea recta y no una lnea en forma de escalera? Si una poblacin microbiana proviene
de una umea clula y tiene un tiempo de duplicacin constante, no se mantendra la poblacin constante durante
cada tiempo de duplicacin y luego se incrementara bruscamente - en forma de escalera? De hecho, este modelo,
denominado crecimiento sincrnico, no se produce en circunstancias ordinarias. Por el contrario, las clulas
individuales de la poblacin suelen dividirse antes o despus del tiempo de duplicacin de la poblacin, segn
un modelo de crecimiento asincrnico. Los tiempos de divisin efectivos se distribuyen alrededor del tiempo de
duplicacin, de manera que el incremento de la poblacin es uniforme y la grfica aumenta como una lnea recta.
Tiempo
Clulas/Mililitro
Notacin
Minutos
Horas
Nmero
Cientfica
Logaritmo
1000
103
3,0
20
0,33
2000
2X103
3,301
40
0,66
4000
4x103
3,602
60
1,00
8000
8x103
3,903
80
1,33
16000
1,6X104
4,204
100
1,66
32000
3,2x1O4
4,505
120
2,00
64000
6,4x104
4,806
140
2,33
128000
1,28x105
5,107
160
2,66
256000
2,56x105
5,408
180
3,00
512000
5,12x105
5,709
200
3,33
1024000
1,02x106
6,010
aa
(a)
Figura 8.2 Crecimiento exponencial de un cultivo bacteriano. (a) El nmero de clulas por mililitro en un cultivo
que crece exponencial mente se mide cada 20 minutos y se expresa como el nmero, de clulas o como el
logaritmo del nmero de clulas. (b) La expresin del logaritmo del nmero de clulas frente al tiempo es una
lnea recta. (c) La representacin del nmero de clulas frente al tiempo es una curva que tiene una pendiente muy
acusada. Puesto que el nmero de clulas se duplica cada 20 minutos, el tiempo de duplicacin es de 20 minutos y
la tasa de crecimiento es 3,0 (60/20) duplicaciones por hora. Un cultivo que crece con esta tasa se incrementa, en
200 minutos, desde 1000 hasta ms de 1 milln de clulas por mililitro.
Figura 8.3 Fases de crecimiento de un cultivo bacteriano (esta grfica se basa en el cultivo descrito en la Figura
8.2). La fase de muerte es una fase de declive exponencial, como la fase exponencial y, por tanto, es una lnea
recta, aunque se produce a una tasa mucho ms lenta.
Despus de aproximadamente un da en fase estacionaria, comienza la fase de muerte, y las clulas del cultivo
comienzan a morir. Durante esta fase, las clulas de la mayora de las especies mueren exponencialmente, pero a
una velocidad lenta - mucho menor que la tasa de incremento de las clulas durante la fase log. Generalmente, la
muerte se produce porque las clulas han agotado sus reservas intracelulares de ATP y no pueden reparar los
componentes celulares. Las clulas que no crecen no pueden generar nuevo ATP y, por tanto, se produce la muerte
cuando no existe suficiente energa para continuar la reparacin celular o para reiniciar el crecimiento, cuando
existan nutrientes disponibles.
La fase lag es, asimismo, un perodo en el que no hay crecimiento. Generalmente, se produce cuando las clulas en
fase estacionaria o en fase de muerte se inoculan en un medio de cultivo fresco. Aunque en la fase lag no se
produce crecimiento neto, existe una actividad metablica considerable, ya que las clulas se preparan para crecer.
Esta preparacin es necesaria porque los daos metablicos sufridos durante las fases estacionaria o de muerte
deben ser reparados completamente, antes de que las clulas puedan comenzar a crecer de nuevo. Si las clulas
empleadas para inocular (sembrar) un nuevo cultivo estn en la fase log, no existe fase lag, siempre que el nuevo
medio de cultivo sea el mismo que el viejo y las dems condiciones permanezcan idnticas.
La duracin de la fase lag depende de cunto tiempo haya estado el cultivo previo en fase estacionaria o de muerte,
o puede depender de un cambio en el medio. Si las clulas han estado en la fase estacionara slo brevemente, la
posterior fase lag podr durar slo unos minutos. Pero si han permanecido en la fase estacionara durante meses, la
subsiguiente fase lag de las clulas sobrevivientes puede durar muchas horas. Si un cultivo exponencial se pasa de
un medio pobre a uno rico, no existe fase lag. Pero el paso de un medio rico a uno pobre implica una fase lag de
varias horas, en la mayora de los cultivos bacterianos.
Figura 8.4 El quimiostato se utiliza para mantener una poblacin microbiana en un estado de crecimiento
constante. Una bomba peristltica aade al cultivo el medio estril desde un reservorio a una tasa constante. El
cultivo -que contiene las clulas y consume el medio parcialmente- sale con la misma tasa. Un quimiostato real
tiene muchos controles electrnicos.
continuo denominado quimiostato (Figura 8.4). Un quimiostato consta de una bomba peristltica, un reservorio,
un recipiente de cultivo, y un sistema de desage. La bomba aade una cantidad controlada de medio fresco desde
el reservorio, de manera continua, al cultivo. Al mismo tiempo, una cantidad idntica de cultivo sale
continuamente a travs del sistema de desague. En estas condiciones, el nmero de clulas en el vaso de cultivo no
cambia. El cultivo crece lo suficientemente rpido como para reemplazar las clulas que se pierden a travs del
sistema de desage.
La concentracin del nutriente limitante en el cultivo fija la tasa de crecimiento del mismo. El cultivo crece a la
misma velocidad con que se suministra el nutriente limitante, que es, asimismo, la misma con que se consume
parcialmente el medio de cultivo y salen las clulas mediante el sistema de desage. En el vaso de crecimiento del
quimiostato, las clulas permanecen indefinidamente en fase exponencial de crecimiento.
El cultivo continuo tiene aplicaciones industriales importantes (Captulo 29). Es una forma eficaz de producir
clulas microbianas o sus productos (tales como antibiticos y vitaminas), porque constantemente se obtiene un
cultivo denso que sale por el desage del vaso de crecimiento.
8.3.1 Nutricin
Todos los seres vivos utilizan compuestos qumicos presentes en el medio ambiente para construir las molculas
necesarias para fabricar nuevas clulas. Estos compuestos qumicos se denominan nutrientes.Sabemos que la
nutricin afecta al crecimiento de todos los organismos. Un ser humano, un animal o una planta bien alimentados
crecen mas rpidamente que otros mal alimentados. Para los microorganismos, particularmente las bacterias, el
efecto de la nutricin en la tasa de crecimiento es enorme. Por ejemplo, Eschenchia coli puede llegar a crecer 10
veces ms rpidamente en un ambiente rico en nutrientes, tal como el extracto de carne que en un ambiente
nutritivo pobre, como por ejemplo uno compuesto por succinato y sales. El medio con succinato y sales cubre
todas las necesidades esenciales de E. coli, pero el crecimiento en dicho medio requiere que la clula realice ms
procesos biosintticos. El resultado es un crecimiento ms lento.
Una tasa de crecimiento ms elevada significa que un cultivo alcanza sus mximos nmero y masa totales de
manera ms rpida que en un ambiente pobre en nutrientes. Sin embargo, un cultivo puede alcanzar la misma
densidad, al cabo de un tiempo suficiente, siempre que est presente la misma cantidad total de nutrientes.
El rendimiento, o mxima masa total, de un cultivo es directamente proporcional a la cantidad de nutrientes,
Los nutrientes que necesitan los microorganismos para crecer incluyen una fuente de carbono, de oxgeno, de
nitrgeno, de fsforo, de azufre, de elementos traza y de factores de crecimiento orgnicos. Las clulas utilizan
estos nutrientes para generar fuerza conductora o metabolitos precursores (Captulo 5). Tambin se requiere
hidrgeno para el crecimiento, pero nunca es un factor limitante en cualquier medio que permita el crecimiento.
Carbono El carbono es la base estructural de los compuestos bioqumicos. Los microorganismos autotrofos
obtienen su carbono a partir del dixido de carbono (C02) de la atmsfera, mientras que los microorganismos
heterotrofos obtienen el carbono a partir de los compuestos orgnicos del ambiente (Captulo 5).
Los microorganismos heterotrofos utilizan como fuente de carbono muchas molculas orgnicas diferentes. De
hecho, probablemente cualquier compuesto orgnico que se encuentra en la naturaleza es utilizado como fuente de
carbono por alguna especie bacteriana. Una de las fuentes ms comnmente utilizada por los microorganismos es
la glucosa, una hexosa que juega un papel central en el metabolismo. Consecuentemente, la glucosa es un
ingrediente comn de los medios de cultivo microbiolgicos. No obstante, frecuentemente se aaden a los medios
como fuente de carbono otros azcares, as como polisacridos, cidos orgnicos, alcoholes y aminocidos.
Para los quimioheterotrofos, las molculas orgnicas que contienen carbono, como la glucosa, proporcionan tanto
una fuente de energa para generar ATP, como los tomos de carbono necesarios para fabricar los compuestos
bioqumicos (Captulo 5). Las fuentes de carbono que son metabolizadas rpidamente permiten un crecimiento
relativamente rpido, mientras que las fuentes de carbono que son metabolizadas ms lentamente permiten slo un
crecimiento lento. Por ejemplo, en un medio de cultivo al que se aade glucosa como fuente de carbono en lugar
del aminocido lisna, Escherichia coli crece el doble de rpido que en un cultivo idntico excepto la adicin
mencionada.
Oxgeno Todos los microorganismos requieren oxgeno elemental para fabricar sus componentes bioqumicos,
pero no todos los microorganismos requieren oxgeno atmosfrico. La mayora de los microorganismos
heterotrofos obtienen el oxgeno a partir de la misma molcula que les sirve como fuente de carbono. La frmula
qumica de los hidratos de carbono (una fuente de carbono comn para los hetertrofos) es CH2O, que significa
que cada molcula de hidratos de carbono proporciona a la clula un tomo de oxgeno por cada tomo de
carbono. Los autotrofos, que generan energa a partir de la luz, obtienen la mayor parte de su oxgeno a partir del
CO2 fijado durante la fotosntesis. La mayora de los microorganismos aerobios tienen enzimas denominadas
oxigenasas que pueden aadir directamente oxgeno atmosfrico a las molculas orgnicas, pero sta es una fuente
minoritaria de oxgeno. Algunas enzimas permiten a los microorganismos utilizar el oxigeno presente en el agua
mediante reacciones hidrolticas.
Redescubridores de microbios
Los supervivientes
Cmo pueden sobrevivir las bacterias no formadoras de endosporas cuando dejan de crecer? Unas pocas horas
despus de que Escherichia coli (y otras bacterias no formadoras de endosporas) entra en la fase estacionaria de
crecimiento, comienza la fase de muerte. Aunque el declive de la fase exponencial puede ser muy lento, puede
ocurrir la muerte de todas las clulas del cultivo. Segn esto, sera slo una cuestion de tiempo la eliminacin de
todas las especies bacterianas? De hecho, esto no ocurre porque no todas las clulas mueren durante la fase de
muerte. Incluso despus de un ao de almacenamiento, un cultivo de E. coli en fase estacionara contiene ms de
un milln de clulas vivas por mililitro. Las clulas del cultivo mueren exponencialmente en cuatro o cinco das,
pero las clulas que permanecen sobreviven durante largos perodos de tiempo. Roberto Kolter, un microbilogo
de la Universidad de Harvard, encontr que las bacterias no formadoras de endosporas han desarrollado sus
propios mecanismos para sobrevivir perodos prolongados de escasez de nutrientes. La mayora de las clulas
mueren, pero unas pocas estn programadas para sobrevivir, lo cual es suficiente para preservar la especie.
Adems de utilizar el oxgeno como nutriente, los microorganismos que son capaces de una respiracin acrbica
usan el oxgeno para generar energa. Pero, para algunos organismos el oxigeno atmosfrico es txico. Algunas
enzimas son destruidas rapda e irreversiblemente por la exposicin al oxgeno atmosfrico. Un ejemplo extremo
es la ntrogenasa, enzima que permite a las bacterias fijadoras de nitrgeno utilizar el nitrgeno atmosfrico.
Como resultado, los microorganismos han desarrollado varios mecanismos para proteger incluso las enzimas
altamente sensibles al oxigeno y, por tanto, sobrevivir en presencia del oxgeno. Algunas cianobacterias fijadoras
de nitrgeno - que son acrbicas y producen oxgeno gaseoso mediante fotosntesis - protegen la nitrogenasa,
segregndola en clulas especializadas, denominadas heterocistes. Los heterocistes no producen oxgeno y son
impermeables al mismo. La bacteria fijadora de nitrogeno Azotobacter realiza una respiracin aerobica a una tasa
lo suficientemente evada como para mantener anaerbico el centro de la clula, donde est localizada la
ntrogenasa.
Adems del oxgeno, los organismos deben hacer frente a los compuestos txicos que contienen oxigeno y que se
producen durante el metabolismo acrbico. Entre estos agentes txicos se encuentran el perxido de hidrgeno
(H2O2) y los radicales libres, que son incluso ms txicos: superxido (O2) y el radical hidroxilo (OH), que se
forma a partir del superxido. Un radical libre es un compuesto con un electrn sin aparear que lo hace
extraordinariamente reactivo. Si se acumula superxido, los compuestos bioqumicos se oxidan rpidamente y las
clulas mueren.
Los seres vivos que sobreviven en presencia del aire han desarrollado sistemas para eliminar los radicales libres.
Todos los aerobios producen la enzima superxido dismutasa, que destruye el superxido convirtindolo en
oxgeno y perxido de hidrgeno
El perxido de hidrgeno, que es el producto de sta y de otras reacciones catalizadas por enzimas, es en si mismo
un oxidante txico. Se convierte en agua y oxgeno mediante la enzima catalasa.
El perxido de hidrgeno tambin es eliminado por las peroxidasas, enzimas que lo utilizan para oxidar ciertos
compuestos orgnicos. Los organismos que pueden tolerar la exposicin al oxigeno contienen superxido
dismutasa, y casi todos tambin contienen catalasa. Los organismos que pueden tolerar la exposicin al oxgeno
contienen superxido dismutasa, y casi todos tambin contienen catalsa. Los organismos que carecen de ambos
enzimas mueren rpidamente en un ambiente con oxgeno.
La relacin entre el oxgeno y el crecimiento varia enormemente de una especie microbiana a otra. Los aerobios
obligados pueden crecer tan solo en presencia de oxgeno porque para generar energa requieren oxgeno como
aceptor terminal de electrones. Los microaerfilos toleran menos oxgeno (o requieren eoncentraciones mayores
de CO2). stos pueden crecer slo a concentraciones reducidas de oxigeno (del 2 al 10 por ciento de oxgeno, en
comparacin con el 21 por ciento de oxgeno presente en el aire). Los anaerobios facultativos pueden crecer tanto
en presencia como en ausencia de oxgeno, porque cuando ste est disponible, lo utilizan como aceptor terminal
de electrones, pero cuando el oxigeno est ausente, utilizan otras rutas bioqumicas para generar energa.
Los anaerobios aerotolerantespueden generar energa sin oxgeno pero no mueren al ser expuestos al aire.
Los anaerobios obligados mueren en presencia del oxgeno, porque carecen de los enzimas necesarios para
eliminar el superxido(Tabla 8.1).
Nitrgeno El nitrgeno consttuye alrededor del 14 por ciento del peso seco de la mayora de los
microorganismos. Es un constituyente de las protenas y de los cidos nucleicos as como de algunos metabolitos
esenciales, de manera que todos los seres vivos requieren una fuente de este elemento. La forma de nitrgeno que
utilizan los microorganismos depende de su capacidad metablica y del ambiente en que se encuentran.
Probablemente, todos los microorganismos pueden usar amonaco (NH 3) como fuente de nitrgeno, porque esta
forma es la que se incorpora en la biosntesis. La mayora de los microorganismos pueden obtener amonaco a
partir de una variedad de compuestos orgnicos, incluidos los aminocidos, y algunos pueden utilizar formas
inorgnicas, entre las que se incluye el ion nitrato (NO3). Algunos pueden lijar el nitrgeno atrnosfrico gaseoso
(N2); estos organismos lijadores de nitrgeno prosperan en los ambientes en los que el nitrgeno es el nutriente
limitante.
Tabla 8.1. Relacin de las bacterias con el oxgeno
Aerobios estrictos
Requieren oxgeno
Catalas
Superxido
a
dismutasa
Presente Presente
Anaerobios
facultativos
Microaerfilos
Anaerobios
aerotolerantes
Anaerobios estrictos
Presente Presente
Clase Microbiana
Respuesta al oxgeno
Ejemplo
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia coli
Campylobacter jejuni
Streptococcus
pneumoniae
Methanococcus
vannielii
Fsforo El fsforo se encuentra en las celulas exclusivamente en la forma de ion fosfato (Pol 3-4) o de compuestos
orgnicos que contienen fosfato. Constituye alrededor del 3 por ciento del peso seco de los microorganismos. Es
un constituyente de los cidos nucleicos, de los fosfolpidos y de ciertos metabolitos esenciales. El fsforo entra en
la clula en forma de ion fosfato, porque la mayora de los compuestos orgnicos que contienen fosfato no pueden
pasar a travs de la membrana plasmtica. Cuando los microorganismos utilizan como fuente de fsforo un
compuesto orgnico que contiene fosfato, generalmente liberan el grupo fosfato fuera de la clula o en el
periplasma, mediante enzimas que son producidas por la propia clula. Posteriormente, el ion fosfato penetra en la
clula. El fosfato es el nutriente limitante en muchos lagos y arroyos, de manera que cuando se vierte fosfato de
los detergentes en estos sistemas acuticos, se produce eutroficacin, o aumento en el desarrollo de algas y de
otros microorganismos.
Funcin
Potasio
Magnesio
Calcio
Hierro
Manganeso
Molibdeno
Cobalto
Cobre
Zinc
K+
Mg2+
Ca2+
Fe2+/Fe3+
Mn2+
Mo2+
Co2+
Cu2+
Zn2+
Azufre El azufre es un constituyente minoritario pero esencial de la clula, constituyendo alrededor del 1 por
ciento del peso seco de la mayora de las clulas. Es un componente de dos aminocidos, de algunas especies de
RNA de transferencia y de ciertos metabolitos esenciales. Aunque el azufre entra en la biosntesis como sulfuro
(S2-), la fuente de azufre ms corriente, tanto en los medios de laboratorio como en la naturaleza, es el ion sulfato
(SO42-). El sulfato es abundante en el ocano, pero relativamente escaso en algunos lagos y suelos. La fuente
principal de azufre en muchos suelos son los compuestos que contienen sulfato orgnico, que los microorganismos
del suelo captan y convierten en sulfuro.
Elementos traza Adems de los elementos mayoritarios que necesitan para fabricar los compuestos bioqumicos,
los microorganismos requieren cantidades pequeas, aunque esenciales, de ciertos compuestos qumicos
inorgnicos, los elementos traza. Entre estos se incluyen el potasio y ciertos iones metlicos como son el cobre, el
cobalto, el hierro y el zinc. Los elementos traza cubren una variedad de funciones esenciales en la clula (Tabla
8.2). Algunos elementos traza son Cofactores, iones inorganicos que deben estar presentes para que una enzima
sea activa. Otros elementos traza forman parte de las coenzimas, molculas orgnicas que deben estar presentes
para que una enzima sea activa.
Aunque puede ocurrir, la disponibilidad de los elementos traza raramente limita el crecimiento microbiano, porque
se requieren en cantidades muy pequeas. Por ejemplo, aunque el hierro es abundante en la naturaleza, se
encuentra predominantemente en la forma de hidrxido de hierro (frrico), altamente insoluble, no disponible para
los microorganismos a menos que stos liberen compuestos que solubilizan el hierro,
denominados siderforos. Los tejidos vivos son una fuente particularmente pobre de hierro disponible. Por tanto,
la mayoria de las bacterias patgenas producen siderforos.
Factores de crecimiento orgnicos Muchos microorganismos pueden sintetizar todos los bloques bsicos
(aminocidos, nucletidos, monosacridos o disacridos) necesarios para fabricar las macromolculas a partir de
las fuentes nicas de los elementos que se acaban de estudiar. Pero si un microorganismo no puede sintetizar un
bloque bsico particular, ste debe ser suministrado a partir del ambiente. Estos bloques bsicos preformados se
denominan factores de crecimiento orgnicos. Pueden ser cualquiera de los diversos bloques bsicos estudiados
en el Captulo 5: aminocidos, purinas, pirimidinas, cidos grasos, etc. Las vitaminas, que son nutrientes que se
requieren en muy pequeas cantidades, fundamentalmente como precursores de los cofactores de las enzimas, son
factores de crecimiento orgnicos para algunos microorganismos.
La diversidad nutricional implica los diferentes requerimientos de factores de crecimiento orgnicos de los
microorganismos. Existe una gama considerable. Por ejemplo, Escherichia coli no necesita factores de crecimiento
orgnicos. Por el contrario, a Leuconostoc mesenteroides, una bacteria del cido lctico que agra la leche, deben
suministrrsele los 20 aminocidos esenciales, varias purinas y pirimdnas y 10 vitaminas (Tabla 8.3).
Si se encuentran en el medio ambiente los bloques bsicos preformados, la mayora de los microorganismos los
utilizan para aumentar su crecimiento. Los mecanismos de regulacin permiten a los microorganismos explotar
un ambiente de crecimiento rico, en el cual abundan los bloques bsicos preformados. De esta manera, el
microorganismo utiliza su capacidad metablica para sintetizar slo aquellos bloques bsicos que no se encuentran
disponibles en el medio ambiente. As, utilizan la capacidad metablica que ahorran para crecer ms rpidamente.
Para ello, producen ms ribosomas. Por ejemplo, cuando la bacteria Salmonella tiphimurium crece rpidamente en
un ambiente rico, tiene ms de 10 veces ms ribosomas por clula que cuando crece lentamente en un medio
pobre, porque debe sintetizar las protenas ms rpidamente para crecer a mayor velocidad. Esta relacin entre un
medio rico, la tasa de crecimiento y el nmero de ribosomas por clula se muestra en la Tabla 8.4. En un medio
pobre, compuesto por ejemplo, por sales y lisina (una fuente de carbono que utiliza S. Typhimuriom muy
lentamente), el tiempo de duplicacin es largo y las clulas del medio contienen slo el pequeo numero de
ribosomas que necesitan para crecer lentamente. En medios ms ricos, que contienen fuentes de carbono que
pueden ser utilizadas ms rpidamente (como la glucosa), o que son enriquecidos con bloques bsicos tales como
Temperatura Cada especie microbiana crece en un rango de temperatura, desde la temperatura mnima de
crecimiento, o temperatura ms baja que permite el crecimiento, hasta la temperatura mxima de crecimiento, o
temperatura ms elevada que permite el crecimiento. La mayora de las bacterias crecen en un intervalo de
temperatura de aproximadamente 40 grados Celsius. La mayora de los microorganismos eucariotas tienen un
intervalo ms estrecho. La temperatura ptima de una especie es aquella a la cual crece el microorganismo ms
rpidamente. Generalmente, la temperatura ptima es tan slo unos grados inferior a la temperatura mxima de
crecimiento. La tasa de crecimiento aumenta desde la temperatura mnima a la temperatura ptima, ya que las
reacciones qumicas, incluidas las reacciones catalizadas por las enzimas, se realizan mas rapidamente cuando
aumenta la temperatura (Figura 8.5). Sin embargo, por encima de la temperatura ptima, la tasa de crecimiento
disminuye rpidamente, porque algunos componentes celulares, especialmente las protenas, se inactivan ms
rpidamente de lo que pueden ser reemplazados.
Los microorganismos crecen a temperaturas extremas, temperaturas en las que la mayora de los demas seres vivos
no pueden crecer. En general, los microorganismos procariotas toleran temperaturas ms extremas que los
eucariotas. Ningn eucariota puede crecer en el punto de ebullicin del agua, aunque algunos hongos pueden
crecer a temperaturas inferiores al punto de congelacin - tan bajas como las que pueden tolerar algunas especies
bacterianas - y algunas algas crecen cerca del punto de congelacin del agua. EI crecimiento de algunas algas
rojas, denominadas algas de la nieve, origina enormes manchas rojas en las zonas montaosas nevadas, en las
cuales persiste la nieve durante largos perodos de tiempo y la luz es muy intensa.
Segn el intervalo de temperatura en el cual pueden crecer los microorganismos se dividen en tres categoras
diferentes. Los termfilos (amantes del calor) crecen a altas temperaturas. Los mesfilos (amantes de una
temperatura moderada) crecen a temperaturas intermedias, y los psicrfilos (amantes del fro) crecen a bajas
temperaturas. Aunque los psicrfilos son capaces de crecer a bajas temperaturas, estos microorganismos, al igual
que los otros, crecen ms rpidamente cerca de la temperatura mxima de crecimiento.
Las bacterias termfilas crecen a temperaturas superiores a 50 0C - una temperatura a la cual el agua causa dolor,
si se sumerge la mano en ella. El termfilo extremo Pyrodictium occultum puede crecer a 110 0C, diez grados
Celsius por encima del punto de ebullicin del agua pura al nivel del mar. P. occultum se encuentra en fuentes
termales.
Tabla 8.3. Comparacin de los ingredientes de los medios que se requieren para permitir el crecimiento de una bacteria
del cido lctico, Escherichia coli y una cianobacteria
Bacteria del cido lctico
Cianobacteria
Fuente del nutriente (Leuconostoc mesenteroides)
Carbono
Glucosa
Acetato sdico
Fuente nitrogenada
NH4Cl
Sales inorgnicas
KH2PO4
K2HPO4
MgSO47H2O
FeSO4
MnSO4
NaCl
50 g
40 g
6g
1,2 g
1,2 g
0,4 g
20mg
40mg
20mg
400 mg
484 mg Ninguno
800 mg
200 mg
100 mg
200 mg
200 mg
600 mg
124 mg
500 mg
Escherichia coli
Glucosa
2g
NH4Cl
Na2HPO4
KH2PO4
NaCl
Na2SO4
MgCl26H2O
CaCl2
FeCI6H2O
(Gleobacter Violaceus)
Ninguno
2g
Ninguno
6g
K2HPO4H2O
3g
MgSO7H2O
3g
CaCl2H2O
11 g Citrato frrico amnico
0,4 mg Na2CO3
11 mg Solucin de metales trazab
0,8 mg
Ninguno
40 mg
75 mg
36 mg
6 mg
20 mg
1 ml
Leucina
Lisina
Metionina
Prolina
Serina
Tirosina
Treonina
Triptfano
valina
Factores de crecimiento AdeninaS04
(bases)
Guanina HCl
Uracilo
Xantina
Factores de crecimiento TiaminaHCI
(vitaminas)
PiridoxinaHCI
PiridoxaminaHCI
PiridoxalHCI
Pantotenato
Riboflarina
Nicotinato
p-Aminobenzoato
Biotina
Folato
500 mg
500 mg
500 mg
200 mg
100 mg
200 mg
400 mg
80 mg
50 mg
20 mg Ninguno
20 mg
20 mg
20 mg
1 mg
Ninguno
2 mg
0,6 mg
0,6 mg
1,0 mg
1,0 mg
2,0 mg
0,2 mg
2,0 g
20 g
Ninguno
Ninguno
20 aminocidos
Cerebro-corazn
50
17000
32
42000
21
83000
20 aminocidos + sales
mRNA que rodea a este codn es nica. Pero, sin duda, el selenio, que puede ser txico, tambin puede ser
esencial.
Figura 8.5 Tasa de crecimiento de Escherichia coli en un medio rico a varias temperaturas. E. coli crece desde los
8oC hasta los 48oC. La tasa de crecimiento aumenta rpidamente a partir de 8 oC. A 37oC, la temperatura ptima de
crecimiento de E. coli, la tasa de crecimiento es de 2,8 duplicaciones por hora, y el tiempo de duplicacin de unos
21,4 minutos. A temperaturas ms elevadas, la tasa de crecimiento disminuye, y el crecimiento se detiene a 43 oC,
su temperatura mxima de crecimiento.
Las bacterias meslilas crecen mejor alrededor de 37 oC, la temperatura del cuerpo humano. Escherichia coli, que
crece de manera natural en el intestino de los seres humanos y de otros animales, es un mesfilo, al igual que la
mayora de las bacterias que causan enfermedades.
Las bacterias psicrfilas crecen a una tasa significativa a 5 oC, o por debajo de esta temperatura - a la cual
funciona normalmente un frigorfico. Cuando la leche se estropea en un frigorfico, frecuentemente tiene el olor
afrutado de Pseudomonas spp. o el olor ftido de Achromobacter spp., porque estas bacterias son psicrfilas. Por
el contrario, la leche que se vuehe agria a temperatura ambiente tiene un aroma ms agradable, debido al agriado,
semejante al yogurt o mantequilla, porque a esta temperatura predominan las bacterias del cido lctico que son
mesfilas.
Los psicrfilos se subdividen en dos grupos: estrictos y facultativos. Los termfilos se subdividen en
estenotermfilos, termfilos facultativos y termfilos extremos (Tabla 8.5). Los psicrflos facultativos tambin
se llaman psicrotrofos ("que crecen en el fro"), para indicar que pueden tolerar, ms que beneficiarse, de las bajas
temperaturas.
Qu determina la temperatura mxima o mnima a la cual es capaz de crecer un organismo? Sin duda, la
temperatura mxima de crecimiento est determinada por la estabilidad al calor de las protenas de un organismo.
Generalmente, las protenas son las macromolculas de una clula ms sensibles al calor y no puede darse
crecimiento a temperaturas a las que se desnaturalizan las protenas de una clula (Captulo 2). Los termfilos
crecen a temperaturas elevadas porque sus protenas son excepcionalmente estables al calor; los psicrfilos pueden
crecer slo a bajas temperaturas porque algunas de sus protenas son inusualmente sensibles al calor. La
estabilidad al calor refleja la estructura proteica total. Esto es, una mutacin que cambie cualquier aminocido de
una protena estable al calor con toda probabilidad disminuir su estabilidad al calor.
Tabla 8.5. Respuesta de crecimiento a distintas temperaturas entre los diversos grupos de bacterias
Clase
Propiedades
Psicrfilos (tambin llamados psicrotrofos) Crecen de forma apreciable por debajo de 5 oC
Psicrfilos estrictos
No crecen a o por encima de 20 oC
Psicrfilos facultativos
Pueden crecer por encima de 20 oC
Mesfilos
Crecen mejor a temperaturas moderadas, de unos 37 oC
Termfilos
Crecen por encima de 50 0C
Termfilos facultativos
Pueden crecer por debajo de 37 0C
Estenotermfilos
No pueden crecer por debajo de 37 0C
Termlilos extremos
Crecen por encima de 80 0C (algunos por encima de 100 0C)
Ambiente tpico
Agua de mar fra
Suelo y agua
Animales
Suelo
Abono
Fuentes termales
Las causas de la temperatura mnima de crecimiento son ms complejas, pero la mayora tienen la misma base.
Las interaciones hidrofbicas de las protenas se hacen ms dbiles cuando disminuye la temperatura, y la forma
de las protenas cambia ligeramente. La funcin de algunas protenas, incluidas las que regulan el metabolismo, es
particularmente sensible a dichos cambios, y por lo tanto, a bajas temperaturas, los mecanismos de regulacin
metablica se distorsionan y se detiene el crecimiento. Los mecanismos de regulacin de algunos termfilos
comienzan a degradarse a temperaturas elevadas, del orden de 37 0C Para estos organismos, como algunas
bacterias del suelo tales como Bacillus stearothermophilus, la temperatura del cuerpo humano es demasado fra
para su crecimiento. Sorprendentemente, estas bacterias se encuentran en suelos normales de climas templados, lo
cual indica lo caliente que puede estar la superlicie del suelo durante un da soleado.
Presin hidrosttica La presin hidrosttica es la presin que se aplica a un lquido. Generalmente, la presin
hidrosttica se mide en atmsferas. Una atmsfera equivale a 1,0l3 Newton por metro cuadrado, la presin a la que
estamos expuestos en la superficie de la Tierra. Las bacterias ordinarias, tal como Escherichia coli, crecen a
presiones muy elevadas, del orden de 300 atmsferas. Las bacterias que se encuentran en el fondo del ocano
toleran hasta 1 500 atmsferas, suficientes para aplastar cualquier cosa excepto los recipientes de acero ms
resistentes. En cambio, la mayora de levaduras no pueden crecer a presiones superiores a 8 atmsferas, una
presin muy baja. Algunas bacterias, las barfilas (amantes de la presin), crecen ms rpidamente a presiones
superiores a 1 atmsfera y las barfilas obligadas crecen slo a presiones superiores a 1 atmsfera.
Una presin elevada no destruye una clula microbiana como ocurrira con un ser humano, porque el agua pasa
rpidamente a travs de la membrana celular. De esta manera, se iguala la presin dentro y fuera de la clula. Una
elevada presin puede detener el crecimiento microbiano, pero el efecto es bioqumico. El volumen molecular
cambia durante el curso de la mayora de las reacciones qumicas. La presin elevada inhibe cualquier reaccin
qumica que conlleve un incremento en el volumen molecular y favorece cualquier reaccin qumica que implique
una disminucin del volumen molecular. Algunas reacciones bioqumicas incrementan el volumen molecular y se
hacen ms lentas o prcticamente se paralizan al incrementar la presin. Sin embargo, las reacciones bioqumicas
esenciales de los barfilos disminuyen el volumen molecular y se realizan ms rpidamente cuando se incrementa
la presin.
Presin osmtica Todos los microorganismos necesitan agua lquida para crecer. Por esta razn, no pueden crecer
a temperaturas inferiores al punto de congelacin de su medio o por encima del punto de ebullicin. Una presin
osmtica elevada tambin priva a una clula del agua. Las membranas celulares son muy permeables al agua, de
manera que el agua entra o sale de una clula dependiendo de la presin osmtica relativa, o concentracin de
solutos disueltos en la clula y en su medio ambiente. Las bacterias mantienen una presin de turgencia positiva,
porque la presin osmtica de su contenido celular es mayor que la presin osmtica del medio ambiente (Captulo
4). La presin de turgencia suministra la fuerza a la clula para crecer. En los microorganismos eucariotas, en lugar
de la presin de turgencia, es el citoesqueleto el que proporciona la fuerza para agrandar la clula.
Si aumenta la concentracin de los solutos en el ambiente externo, la bacteria debe mantener positiva la presin de
turgencia. Para hacer esto, bombea hacia la clula iones potasio (K+) y/o compuestos osmoprotectores, tales
como el aminocido prolina, o sintetiza el disacrido trehalosa. Estos solutos mantienen dentro de la clula una
presin osmtica superior a la presion osmtica del exterior. Sin embargo, eventualmente, este incremento en la
presin osmtica interna daa enzimas esenciales e interfiere en el metabolismo de la clula. De esta manera los
ambientes con una elevada presin osmtica inhiben el crecimiento bacteriano. Una manera tradicional de
conservar los alimentos es aadir azcar o sal, que incrementan la presin osmtica y, por lo tanto, impiden el
crecimiento microbiano.
Aunque una elevada presin osmtica evita el crecimiento de la mayora de las bacterias, algunas especies,
denominadas halfilas (amantes de la sal), pueden vivir a concentraciones de sal extremadamente elevadas. Las
arqueobacterias denominadas halobacterias se desarrollan en aguas saturadas de sal. Las salinas, sistemas con
agua de mar que se deja evaporar para producir la sal de mesa, y algunos lagos desrticos tienen un color rojo
intenso debido a su presencia. Estas bacterias no slo toleran elevadas concentraciones intracelulares de sal, sino
que tambin dependen de la misma para la estabilidad de sus cubiertas celulares; cuando se colocan en agua
destilada, o en agua ordinaria, se lisan inmediatamente.
Cuando un incremento en la presin osmtica externa hace que salga agua de la clula, se produce la plasmolisis,
encogindose el citoplasma (Capitulo 4). Las consecuencias de la plasmolisis difieren segn el tipo de clula. En
las bacterias, la membrana plasmtica se separa de la pared celular rgida, pero generalmente, la clula puede
recuperarse de la plasmolisis (a menos que la presin osmtica sea extrema) incrementando su presin osmtica
interna (Figura 8.6). Los microorganismos eucariticos, particularmente los protozoos, son ms sensibles a la
plasmolisis, porque carecen de una pared rgida.
8.4.1 Turbidez
Debido a que todas las clulas de un cultivo axnico son aproximadamente del mismo tamao, su numero es
proporcional a su peso. En otras palabras, dos clulas pesan el doble que una clula, cuatro clulas pesan el doble
que dos, y as sucesivamente. De esta manera, podemos estimar el tamao de una poblacin microbiana a partir de
su peso total. Generalmente, los microbilogos no recogen de manera laboriosa las clulas y las pesan. En su lugar,
utilizan un instrumento ptico denominado espectrofotmetro (Figura 8.7). Un espectrofotmetro mide la
cantidad de luz que transmite una solucin o un cultivo lquido de clulas microbianas. Cuanto mayor masa de
clulas tenga un cultivo, mayor ser su turbdez, se transmitir menos luz y la lectura en el espectofotmetro ser
mayor. Puesto que un espectrofotmetro mide con exactitud lo que vemos cuando examinamos visualmente un
cultivo liquido, no es muy sensible con respecto al nmero de clulas bacterianas. Para que el lquido se vea
turbio, el cultivo liquido debe contener alrededor de 10 millones de clulas bacterianas de un tamao intermedio
por mililitro y, por lo tanto, un espectrofotmetro no es til para detectar una pequea contaminacin,es decir, la
presencia de un pequeo nmero de clulas microbianas no deseadas. Al igual que para la mayora de los cultivos
bacterianos, el espectrofotmetro tambin puede emplearse para cultivos de levaduras.
Figura 8.6 La plasmlisis de una clula bacteriana separa la membrana plasmtica de la pared celular, excepto en
las uniones Bayer, lugares en los que la membrana plasmtica se une a la membrana externa mediante la pared
celular (Captulo 4). Esta micrografa electrnica de transmisin muestra la plasmolisis de Escherichia coli.
Generalmente, el espectrofotmetro se utiliza para estimar masa de un cultivo relativamente denso, y poder as
registrar crecimiento de una poblacin microbiana (Figura 8.7). Para medir la masa o el nmero de clulas con un
espectrofotmetro, necesano, en primer lugar, preparar una curva patrn, o grfica en la que se relacionan las
medidas del espectrofotmetro con la masa celular de un determinado cultivo. Generalmente los distintos tipos de
bacterias producen una turbidez diferent Posteriormente, se puede determinar a partir de la grfica la masa celular
que se corresponde con cualquier lectura en el espectrofotmetro. Las curvas patrn tambin pueden obtenerse
para relacionar las lecturas en el espectrofotmetro con el nmero clulas de un cultivo.
Como cualquier otro instrumento, el espectrofotmetro tiene ventajas y desventajas. Sus medidas son rpidas y
reproducibles. Sin embargo, slo puede utilizarse para cultivos relativamente densos, y no puede distinguir entre
clulas muertas y vivas. Tampoco puede utilizarse con clulas que tiendan a formar agregados, porque dejan de
suspenderse rpidamente y desaparece la turbidez.
Figura 8.7 El espectrofotmetro. (a) El espectrofotmetro mide la turbidez, es decir, la cantidad de luz que
transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia. La clula bacteriana dispersa la luz, de manera que no
es detectada por el detector sensible a la luz. (b) El tubo de la izquierda no tiene clulas bacterianas y est
transparente. El de la derecba contiene alrededor de mil millones (10 9) de clulas por mililitro y, por lo tanto, est
turbio. (c) La curva patrn relaciona la absorbancia con el nmero de clulas bacterianas por mililitro. Una vez que
se obtiene, esta curva puede usarse para convertir cualquier medida de absorbancia en nmero de clulas. Por
ejemplo, a partir de esta curva, una lectura de 1,6 unidades de absorbancia significa que el cultivo contiene 100
millones (108) de clulas por mililitro.
8.4.2 Peso seco
El nmero de clulas de un cultivo se puede medir dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco de una
clula individual. El peso seco de las clulas de un cultivo se determina separndolas del medio, desecndolas y
pesndolas. Para obtener una medida precisa, se requieren alrededor de 25 ml de un cultivo relativamente denso.
Las clulas se separan mediante filtracin (Captulo 3) o mediantecentrifugacin. Una centrfuga es un
instrumento que hace girar unos recipientes denominados tubos de centrfuga a una velocidad elevada, generando
una fuerza centrfuga que hace que las partculas pequeas, incluidas las clulas microbianas, se vavan al fondo del
tubo. Luego, se lavan las clulas, se resuspenden en agua destilada y se filtran o centrifugan de nuevo. Despus del
segundo lavado, las clulas se desecan en un horno a 1050C durante unas 24 horas y luego se enfran en un
desecador, para evitar que capten la humedad del aire. Un desecador es una cmara que se mantiene con una
humedad muy baja, bien qumicamente o mecanicamente, y que se utiliza para desecar los materiales o para
mantenerlos desecados. Finalmente, se pesan las clulas.
La medida del peso seco es tediosa y requiere un cierto tiempo; adems, la muestra debe contener ms de unos 10
millones de clulas, No obstante, tiene ciertas aplicaciones. Por ejemplo, debe utilizarse para construir la curva
patrn que relaciona las medidas en el espectrofotmetro con las de la masa celular.
cultivo, refleja la masa de clulas presente en el mismo, Asimismo, la tasa de utilizacin de un substrato, como el
oxgeno o la glucosa, refleja la masa celular.
Finalmente, la tasa de reduccin de determinados colorantes, es otra forma de estimar la masa microbiana. Por
ejemplo, el azul de metileno se vuelve incoloro cuando es reducido por los componentes de la cadena de transporte
de electrones de los microorganismos. Consecuentemente, en ausencia de oxgeno, que oxida el azul de metileno,
la tasa de decoloracin de este compuesto mide la masa microbiana. La tasa de reduccin del colorante es una
medida muy indirecta y, por lo tanto, no es una medida precisa de la masa microbiana. Sin embargo, la tcnica
puede utilizarse con materiales complejos, como el suelo o la leche, sin necesidad de usar instrumentos.
Figura 8.8 Recuento microscpico directo. La cmara de recuento de Petroff-Hauser se usa, junto a un
microscopio, para realizar un recuento directo de clulas. Consta de un porta que tiene unos pocillos supericiales
(de 0,02 mm de profundidad). En el fondo del porta hay grabada una rejilla de 1 mm2, dividida en 25 cuadrados
grandes, cada uno de los cuales est dividido en 16 cuadrados ms pequeos. De esta manera, el volumen total de
la rejilla es de 0,02 (un quinceavo) mm3, y cada cuadrado grande es un veinticincoavo de esta cantidad.
Figura 8.9 Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer lugar, la
muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estril y se mezclan
adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilucin apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10 -5).
Posteriormente se aade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendindolo en la superficie de la misma
(mtodo de extensin en placa) o mezclndolo con el medio (mtodo de vertido en placa). Las placas se incuban y
se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadsticas, las placas deben contener entre 30 y
300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias.
Dicho error es la imprecisin que resulta inevitable, con independencia de lo cuidadosamente que se hagan las
disoluciones y las inoculaciones, porque las muestras no son siempre representativas de la poblacin total en
conjunto. Algunas muestras de un cultivo contendrn ms clulas que otras, pero en el 95 por ciento de los casos,
el nmero real de clulas viables no difiere del nmero determinado en ms del doble de la raz cuadrada del
nmero de colonias recontadas.
Figura 8.10 El mtodo del nmero ms probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el factor
de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen slo un organismo y los otros, ninguno. A partir
del nmero, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1),
puede determinarse el nmero ms probable de clulas estadisticamente (11,0) en la primera de las tres diluciones,
mediante una tabla de nmeros ms probables (Tabla 8.6). Este valor, multiplicado por el factor de dilucin nos
proporciona el nmero de clulas viables de la muestra.
NMP
NMP
0,18
2,3
0,20
3,1
0,40
3,3
0,45
4,6
0,68
4,9
0,68
7,0
0,93
9,5
0,78
7,9
1,1
11,0
1,1
14,0
1,4
13,0
1,3
17,0
1,7
22,0
1,7
28,0
2,1
24,0
2,2
35,0
2,6
54,0
2,7
92,0
160,0
8.4.7 Filtracin
Los mtodos que dependen de la formacin de colonias (recuento en placa) o del desarrollo de turbidez (nmero
ms probable) pueden detectar una nica clula microbiana viable, pero debido a razones prcticas, slo se utiliza
alrededor de un mililitro de la muestra corno inculo para la placa o para el tubo. Por lo tanto, no se detectan las
poblaciones con menos de una clula por mililitro. Supongamos que queremos determinar las bacterias que existen
en una piscina. La muestra debe concentrarse antes de proceder al recuento. La concentracin de los
microorganismos de las muestras se hace, generalmente, mediante filtracion sguiendo el mismo mtodo descrito
en el Capitulo 3. Para ello, se hace pasar un volumen conocido de lquido o de aire a travs de un filtro de
membrana, haciendo vacio. Los poros del filtro son lo suficientemente pequeos como para que no puedan pasar
las clulas microbianas. Posteriormente se coloca el filtro en un medio slido adecuado y se incuba. El nmero de
colonias que se desarrollan es el nmero de clulas microbianas viables en el volumen de fluido que se filtr.
Generalmente, los resultados se expresan como organismos presentes por litro (Figura 8.11).
Los diversos mtodos de determinacin del nmero de microorganismos se resumen en la Tabla 8.7.
RESUMEN
LAS POBLACIONES (p. 192)
1. El crecimiento microbiano se refiere al crecimiento de una poblacion - un aumento en el nmero de clulas, no
un aumento en el tamao de una clula individual.
5. Un cultivo microbiano pasa tpicamente por cuatro fases distintas de crecimiento: la fase lag, la fase log, la fase
estacionaria y la fase de muerte. Las fases lag y de muerte no se producen a veces en un cultivo determinado.
6. Generalmente, la fase lag se produce cuando las clulas en fase estacionaria o en fase de muerte se inoculan en
un medio de cultivo fresco. Es un perodo de no crecimiento, pero existe una actividad metablica considerable, ya
que las clulas se preparan para crecer.
7. La fase log no contina indefinidamente debido a factores como la reduccin de nutrientes o a la acumulacin
de productos txicos.
8. Durante la fase estacionaria no se produce un incremento neto de la masa, pero las clulas se hacen ms
pequeas y sintetizan componentes que les ayudan a sobrevivir durante los perodos de no crecimiento.
9. Durante la fase de muerte, las clulas mueren exponencialmente, pero a una tasa ms baja de la que crecen en la
fase log. Generalmente la muerte se produce porque las clulas agotan sus reservas intracelulares de ATP y no
pueden reparar los componentes celulares.
10. En condiciones naturales, los nutrientes entran de manera continua en el ambiente de una clula a bajas
concentraciones, de manera que la tasa de crecimiento es fijada por la concentracin del nutriente mas escaso, o
nutriente limitante.
11. En el laboratorio, se consigue un cultivo continuo con un quimiostato. La concentracin del nutriente limitante
en el cultivo fija la tasa de crecimiento del mismo.
12. Las clulas de una colonia estn en fases diferentes de crecimiento dependiendo de su localizacin. Las clulas
que crecen en la superficie de una colonia son acrbicas y las que estn en el centro son anaerbicas.
10. La filtracin se hace antes de medir un nmero pequeo de microorganismos en grandes volmenes de lquido
o gas.
PREGUNTAS DE REVISIN
LAS POBLACIONES
1. A qu se rofiere el trmino crecimiento microbiano?
LECTURAS RECOMENDADAS
Ingraham, J. L.; Maaloe, O. y Niedhardt, F. C. 1983. Growth of the bacterial cell. Sunderland, Mass: Sinauer.
Kolter, R. 1992. Life and death in stationary phase. ASM News 58:75-79
Marr, A. G. 1991. Growth rate of Escherichia coli. .Microbiological Reviews 55:3l6-33.
Mynell, G. G., y Mynell, E. 1970. Theory and practice in experimental bacteriology. New York: Cambridge
University Press.
Fuente:
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/58/texthtml/cap805.htm