Modelo de lnea celular de glioma proneuronal de murino para la evaluacin

de terapias anti-tumorales
Introduccin
Una gran parte de la investigacin en el glioblastoma (GBM) se basa en lneas
celulares seleccionadas artificialmente para crecer in vitro, lo que presenta
problemas para su uso como modelos de tumores. En primer lugar, el perfil
gentico de las lneas celulares a pases no refleja plenamente la observada en los
gliomas humanos. Adems, muchas de estas lneas celulares dan lugar a tumores
que no se parecen gliomas humanos histolgicamente. En consecuencia, los
resultados pre-clnicos a menudo no se traducen con precisin a las pruebas y la
prctica clnica. La bsqueda de mejores modelos de glioma es necesaria para
avanzar en el campo de la neurooncologa. Por otra parte, un modelo pre-clnico,
basado en la lnea de clulas que permite in vitro, as como en estudios in vivo
permitira para la prueba eficiente y completa de las terapias experimentales.
El glioblastoma se ha clasificado en cuatro categoras en funcin de expresin
basada en perfiles: proneural, neurales, mesenquimales y clsica. Proneurales
GBM, que incluye la mayora de GBM secundario y un subconjunto distinto de
GBM primaria, se caracteriza por p53, IDH1 / 2 mutaciones y amplificaciones
PDGFR. Recientemente, nuestro grupo gener un modelo de glioma de ratn
transgnico con un fenotipo proneural mediante la transformacin de sustancia
blanca progenitores gliales in vivo. Expresin de todo el genoma anlisis y
comparaciones entre especies con los datos del TCGA revel que los tumores de
ratn ms se parecan a la proneural subtipo de GBM y que tanto el ratn y los
gliomas proneural humanos fueron significativamente enriquecido para los genes
expresados por las clulas progenitoras de oligodendrocitos (OPC). Aqu,
mostramos que las clulas aisladas de estos tumores pueden ser cultivadas
durante varios pasajes al tiempo que conserva su fenotipo proneural y su
capacidad de generar tumores que recapitular GBM. Estas clulas de glioma de
ratn expresan luciferasa y por lo tanto, el crecimiento del tumor y la respuesta a
la terapia pueden ser seguidos por imgenes de bioluminiscencia basada en
luciferasa (BLI). Se describen los efectos logrados por la radioterapia, un estndar
de cuidado para GBM humano. Este modelo es una herramienta verstil para
evaluar nuevas terapias adyuvantes para proneural GBM.
Materiales y mtodos
La produccin e inyeccin de retrovirus
A 0.8 kb fragmento que codifica PDGF-B-hemaglutinina (HA) se lig en la regin
MCS1 y Cre se lig en la regin MCS2 de los vectores retrovirales pQCXIX. El uso

de estos constructos, se generaron virus deficientes en replicacin con VSV-G

capas como se describe anteriormente. Los ttulos virales se establecieron en
unidades formadoras de colonias (UFC) por incubacin de YFP_stop-lox
fibroblastos embrionarios de ratn con diluciones seriadas de retrovirus en pasos
de diez veces. A las 48 h, se contaron los grupos de clulas nmero YFP. Este
nmero se multiplic por el factor de dilucin para determinar la CFU. Entonces
virus se inyect en la materia blanca subcortical (estereotctica coordina con
respecto a bregma: 2,1 mm lateral, 2,1 mm rostral, 1,8 mm de profundidad) de los
ratones adultos utilizando una jeringa Hamilton con una aguja de calibre 33 (0,4 a
0,2 ll ll / min). Estos ratones han sido backcrossed B6 (Cg) -Tyrc-2J / J, o ratones
B6-albino, durante ms de 10 generaciones, resultando en ratones blancos que
son adecuados para BLI.
El aislamiento de clulas tumorales y la inyeccin
Todos los ratones desarrollaron tumores con inyeccin retrovirus. Siguiendo las
directrices del IACUC, los animales fueron sacrificados a la primera seal de la
morbilidad. Reseccin total Ex-vivo del tumor se realiz y las clulas tumorales se
aislaron utilizando clulas aisladas enzimticos digestion.The se cultivaron durante
un mximo de 15 pasajes en una proporcin de 2: 1 de medio basal en medios
B104 acondicionado. Este medio se suplement adicionalmente con PDGF-AA y
FGFb a una concentracin de 10 ng / ml. Inyeccin intracraneal del tumor recin
preparada cellswas realiz como se describi anteriormente para el retrovirus. Las
clulas 1,0 9 104, 2,0 9 104 y 9 105 1.0 fueron inyectadas en 3 ingenuo adultos
ratones transgnicos ms de 3 generaciones.
Resultados
La inyeccin de Pgf+Pten-/- p53-/-luciferasa+ de clulas del glioma condujeron a la
formacin de tumores de GBM como con una eficiencia del 100% para las clulas
tumorales pases para un mximo de 15 generaciones. Adems, estas clulas
conservan la capacidad de formacin de tumor durante al menos tres
generaciones de trasplante intracraneal serie. Esto es similar a lo que fue visto
despus de la inyeccin intracraneal de clulas recin aisladas en ratones NOD /
SCID. La comparacin de los genes especficos de subtipo basados en el nivel de
expresin de la lnea celular de ratn (n = 3) y los tumores inducidos por virus (n =
4) por la RNA-Seq a ordenados conjuntos de genes clasificador en el TCGA
produjo la correlacin ms fuerte con el subtipo proneural. Esta observacin se
resume, que muestra los coeficientes de correlacin de rango de la mediana de
Spearman entre los perfiles de expresin de los cuatro tumores de ratn o tres
lneas celulares de ratn y de los perfiles de expresin de los subtipos de GBM
humanos de la TCGA. Los tumores recapitulan las caractersticas histolgicas de

GBM humano, incluyendo la proliferacin glomeruloide vascular, necrosis

pseudoempalizada, y bordes difusamente infiltrantes. Las tinciones
inmunohistoqumicas mostraron la mayora de las clulas tumorales fuertemente
positiva para PDGFR alfa y Olig-2, mientras que la tincin GFAP se observ
predominantemente en los astrocitos distribuidos por todo el tumor, estos
resultados son consistentes con el patrn de tincin observado en los tumores
iniciales, inducidos por virus.
Tratamientos prometedores contra el cncer que merecen los ensayos clnicos y la
definicin de las caractersticas moleculares de los pacientes que se beneficiarn
de estos tratamientos son retos formidables. La superacin de este tema es clave
para el desarrollo de terapias eficaces para el GBM, para los que existen
subgrupos moleculares distintos. Se presenta un modelo de ratn de proneural
GBM que consiste en Pgf+Pten-/- p53-/-luciferasa+ de clulas del glioma. Nos
caracterizamos este modelo cellbased, y mostramos sus caractersticas como un
modelo prctico y relevante para la prueba pre-clnica. Para ilustrar su utilidad,
hemos probado la respuesta a la terapia de radiacin, un componente principal de
la norma de atencin para esta enfermedad.
Este modelo basado en clulas combina las ventajas de los modelos de tumores
de ingeniera y de base de retrovirus genticamente. Los tumores se generaron
con alteraciones genticas bien definidas comnmente visto en GBM humano.
Adems, este modelo ofrece la posibilidad de la manipulacin gentica y la
experimentacin in vitro as como in vivo. Adems, este modelo recapitula con
precisin las caractersticas histopatolgicas del GBM incluyendo necrosis
pseudoempalizada, infiltracin difusa, y la proliferacin vascular. Estas
caractersticas histolgicas contrastan agudamente con xenoinjertos humanos a
partir de lneas celulares establecidas tradicionales todava en uso, que tienden a
crecer como racimos densos de clulas tumorales con poca invasin. Modelos
basados en clulas de glioma alternativos con un perfil histolgico ms realista
estn disponibles, pero generalmente se basan en preparaciones de clulas de
glioma humano que requieren los ejrcitos de roedores inmunodeficientes para
experimentos in vivo. Este problema podra potencialmente dar lugar a
interacciones cruzadas artificiales microambiente especies entre las clulas
husped y el tumor, y limitar el estudio de la inmunologa tumoral. Una alternativa
a los modelos de lneas celulares incluyen retrovirus / transgnica sistemas
gliomas ratn, que son modelos de gran alcance, pero implica ratn transgnico y
recursos relacionados con los virus que pueden no estar disponibles para algunos
investigadores. El uso de lneas celulares generadas a partir de modelos de
ratones transgnicos de retrovirus / proporciona una alternativa conveniente y

accesible, y ofrece la posibilidad de anlisis in vitro para complementar los

estudios in vivo.
Otro punto fuerte de este sistema basado en clulas es la capacidad para la
cuantificacin no invasiva del crecimiento tumoral por BLI, que puede representar
un indicador ms sensible de la respuesta a la terapia que la supervivencia global.
Adems, las imgenes de la luciferasa de serie permite la monitorizacin
longitudinal de la dinmica de crecimiento tumoral en el contexto de terapias y
puede ser til para la evaluacin de tratamientos y sus combinaciones. Usando
este enfoque, amplias gamas de terapias anti-tumorales pueden ser examinados
in vitro utilizando esta lnea celular antes de proseguir ms costosa en
experimentos in vivo, ya sea en los tumores basadas en lnea de retrovirus o de
clulas.
En este estudio, hemos demostrado que el PDGF PTEN - / - p53 - / -? Lneas
celulares se parecen especficamente el perfil de expresin gnica de humano
proneural GBM. Las lneas celulares analizadas se ampliaron ms de 6 pases en
cultivo y conservan el fenotipo proneural. Silber y Schulte han informado
recientemente de lneas celulares de glioma humano que mantienen un perfil de
expresin proneural mientras crecido in vitro en medio libre de suero. Nuestro
modelo basado en clulas es un buen complemento a estas lneas como dado su
origen murino, que permite su implantacin en huspedes inmunocompetentes.
Presentamos un modelo murino con GBM proneural parecido gentico e
histolgico a GBM proneural humano y mostrar una respuesta modesta a la
radioterapia. Por estas razones, le ofrecemos este cmodo modelo de lnea celular
de glioma a la comunidad de investigacin neurooncologa como una herramienta
para evaluar nuevos tratamientos para esta enfermedad devastadora. En futuros
estudios, ser importante identificar las alteraciones genticas y epigenticas que
se acumulan en este modelo, y caracterizar cmo se relacionan con las
alteraciones que se producen en los diferentes tipos de gliomas humanos
proneurales.