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MONOGRAFA
PRESENTADA POR
MAURICIO JOS CANTO LPEZ
EN OPCIN AL TTULO DE
UADY
FACULTAD DE
QUMICA
COMIT REVISOR
La Monografa titulada "DESCRIPCIN DE L A S CARACTERSTICAS DE T R E S
TCNICAS INMUNOLGICAS PARA MEDIR PROGESTERONA EN SANGRE Y SU
APLICACIN EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA" presentada por el
C.
Mauricio Jos Canto Lpez, en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al ttulo
de Qumico Farmacutico Bilogo, ha sido aprobada en su contenido cientfico y en
cuanto al cumplimiento de lo establecido en el Manual de Procedimientos de Licenciatura.
es
responsable
doctrinas en l emitidas.
de
las
AGRADECIMIENTOS ACADMICOS
NDICE
Resumen
Introduccin
Objetivos
General
Especficos
I.
Progestinas
II.
Progesterona
III.
II.2. Biosntesis
11
14
17
V.
18
Inmunoanlisis
20
20
30
IV.2.1. Antgeno
30
IV.2.2. Anticuerpo
31
IV.2.3. Trazador
32
32
Radioinmunoanlisis
36
VI.
VII.
37
40
Enzimoinmunoanlisis
41
44
46
Quimioluminiscencia
47
52
56
VIII.
Anlisis y discusin
57
IX.
Conclusin
64
Referencias bibliogrficas
65
Resumen
estructura
bsica
de
la
progesterona
es
el
INTRODUCCIN
aportadas en ste son el producto del anlisis de diversos estudios que se han
documentado acerca de los diferentes inmunoanlisis para la medicin de
progesterona, dentro de los cuales se aprecian un anlisis de costeo, con el fin
de reducir costos de operacin de las tcnicas produciendo uno de los
componentes, y con el mismo objetivo, se menciona la implementacin de un
mtodo alternativo de separacin, logrando una calidad comparable con la de
kits comerciales.4,13,14
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos especficos
I.
Progestinas
16
, la Figura 1,
II.
Progesterona
2, 12, 17
partir del colesterol sanguneo que proviene de la dieta, as como del colesterol
que se produce de novo en las clulas. La progesterona se forma durante la
fase folicular del ciclo, gran parte es convertida en estrgeno por las clulas de
la granulosa antes de que sta pueda abandonar los ovarios, al entrar a la fase
lutenica se habr formado ya demasiada progesterona, y por consiguiente
tendr que ser secretada, en gran medida, a la circulacin sangunea.12
II.2. Biosntesis
El
mevalonato
es
descarboxilado
hasta
producir
sobre
las
clulas
del
ovario,
lo
que
desencadena
la
esteroidognesis.
10
11
12
mineralocorticoides,
estrgenos
progesterona.
Estos
39, 40
14
15
16
III.
competitivos10
enzimoinmunoanlisis2,
como
el
radioinmunoanlisis6,
quimioluminiscencia9,
los
cuales
miden
17
19
IV.
Inmunoanlisis
54-56
20
[B]
V2
V1=k1[A]
V2=k2[B]
Dnde [A] y [B] representan a la concentracin de los reactivos y los
productos, V1 y V2 son las velocidades de formacin de productos y de reactivos
y K1 y K2 son las constantes de proporcionalidad de la reaccin de formacin y
disociacin del complejo. Los compuestos presentes en esta reaccin se
encuentran en equilibrio. Por consiguiente las velocidades de reaccin sern
iguales:
V1 = V2
k1[A] = k2[B]
Al despejar esta igualdad se obtiene:
[B]
[A]
k1 = Keq
k2
21
[Ag:Ac]
V2
V1 = k1 [Ac][Ag]
V2 = k2 [Ac:Ag]
Donde [Ac] y [Ag] son las concentraciones molares de los reactivos,
[Ag:Ac] la concentracin del complejo formado, K1 y K2 son las constantes de
formacin y disociacin del complejo, asi como V1 y V2 sus respectivas
velocidades.11
Cuando se alcanza el equilibrio en la reaccin de formacin del complejo
[Ag:Ac] las velocidades de reaccin son iguales:
V1 = V2
k1 [Ac][Ag] = k2 [Ac:Ag]
La relacin de las dos constantes de velocidad proporciona la constante
de equilibrio (Keq); sta tambin es conocida como la constante de afinidad, la
cual es una caracterstica clave para que un anticuerpo funcione correctamente
en un inmunoanlisis.55
Keq = k1 = [Ac:Ag]
k2
[Ac][Ag]
22
[Ac:Ag]
[Act] [Ac:Ag][Ag]
23
razn
24
64-66
El valor de la
25
Ag:Ac + Ag*:Ac
63
La
26
variables de progesterona sin marcar, y despus de incubar los tubos hasta que
la reaccin inmune alcance el equilibrio, se separan las fracciones unidas de las
libres y se mide la emisin de la seal del trazador en la fraccin unida. 66
Los datos obtenidos se pueden analizar de distintas formas para realizar
la grafica dosis respuesta, el valor de la ordenada puede ser calculada de
cualquiera de las siguientes formas:67
Como el porcentaje de la emisin de seal detectada en la fraccin unida de
cada tubo (B), dividida entre la emisin en la fraccin unida al anticuerpo en
ausencia de ligando no marcado (B0):
% B = B/ B0 * 100
Porcentaje de la emisin de la seal de la fraccin unida, dividida entre la
emisin total en cada tubo (T) antes de la separacin de fracciones:
% B/T = B/T * 100
Porcentaje de la seal de la fraccin unida, entre la seal de la fraccin libre (F):
% B/F = B/F * 100
Cualquiera de los valores obtenidos para la ordenada, sean estos %B,
%B/T o %B/F, pueden ser graficadas contra la concentracin de la dosis de
progesterona no marcada o con el logaritmo de la concentracin de sta. De
igual manera, puede ser graficada directamente la relacin de la seal emitida
por la fraccin unida sin modificaciones matemticas, contra la concentracin
de la progesterona no marcada o el logaritmo de la dosis.11, 67
Una de las curvas de calibracin que se utiliza con ms frecuencia es la
curva Logit-Log, que es la relacin entre el logaritmo de (% B/F) en la ordenada
y el logaritmo de la concentracin de progesterona en la abscisa. 67 Con esta
grafica se obtiene una lnea recta, con la cual es ms simple comparar los
resultados, pero resulta ser complicado de realizar de manera manual, por lo
que se requiere la ayuda de un programa de clculo para computadora para
27
28
68
29
IV.2.1. Antgeno
Para que las sustancias de inters a medir puedan ser cuantificadas por
medio de inmunoanlisis, es necesario que stas posean actividad antignica. 70
El antgeno o ligando frio11 se puede definir como cualquier sustancia
que puede ser especficamente unida por un anticuerpo o por un receptor de
linfocito B, pero que no necesariamente genera una respuesta inmune. Los
antgenos que se pueden unir a anticuerpo pueden ser desde molculas
pequeas como las hormonas, hasta macromolculas como protenas,
glicoprotenas y otros productos naturales. nicamente las macromolculas son
capaces de estimular por si mismas respuestas inmunitarias, estas molculas
se denominan inmungenos. A pesar del conocimiento de la diferencia entre
estos dos trminos se continua utilizando el trmino antgeno como sinnimo de
inmungeno.58, 62, 71
De
igual
manera,
las
molculas
pequeas
pueden
unirse
30
HAPTENO
Macromolculas
del
tipo
de
los Molculas pequeas como
carbohidratos complejos, fosfolpidos, simples, lpidos y hormonas
cidos nucleicos y protenas
Capaz de estimular una respuesta inmune
por si solo
azucares
IV.2.2. Anticuerpo
31
IV.2.3. Trazador
radioactivo,
enzimtico
quimioluminiscente. 11 Una
de
las
63, 66
La actividad
x100
33
Figura 12. Grfica para obtener el valor de la sensibilidad. Este valor se obtiene
restando dos desviaciones estndar al valor de la media de la respuesta obtenida con
el estndar cero (B0), e interpolando ste en la grfica dosis respuesta.(Modificado de Davies,
2005)
%CV=
s x 100
X
34
es decir, el
%Recuperacin =
valor observado
valor esperado
100
35
V.
Radioinmunoanlisis
82, 83
Otro radioistopo utilizado es el tritio (H3), que emite radiaciones beta y que
tiene una vida media de 12.3 aos, pero requiere un tiempo mayor para el
conteo, y por tanto incrementa la duracin del ensayo, razn por la cual su uso
en RIA no es frecuente.62 En cambio, debido a sus caractersticas, el uso de
36
antgenos marcados con I125 posibilita el diseo de protocolos donde una de las
fracciones se queda en el tubo de ensayo cuya seal puede ser contada
directamente en trminos de cuentas por minuto (CPM) como emisiones de
radiacin gamma,62 mediante un contador de centelleo que detecta el numero
de desintegraciones por minuto (Fig. 13).83
Figura 13. RIA en fase slida que emplea I125. (Modificado de Ashihara, 2007)
37
Media
DS
CV (%)
0.34
0.82
1.5
3.3
18
30
0.03
0.04
0.06
0.12
0.7
0.8
8.8
4.9
4
3.6
3.9
2.7
Media
DS
CV (%)
0.31
0.84
1.4
3.3
18
28
0.03
0.06
0.08
0.13
1
1.1
9.7
7.1
5.7
3.9
5.6
3.9
Especificidad
En la tabla 4 se muestran las reacciones cruzadas que se observaron con otras
molculas diferentes a la progesterona pero con estructura relacionada:
38
Progesterona
Androstenediol
Corticosterona
Cortisol
Danazol
11-Desoxicorticoesterona
11-Desoxicorticoesterol
DHEA-SO4
20-Dihidroprogesterona
Estradiol
17-Hidroxiprogesterona
Medroxiprogesterona
Pregnano
5-Pregnan-3-ol-20-ona
5-Pregnan-3,20-diona
5-Pregnan-3,20-diona
Pregnenolona
5-Pregnen-3-ol-20-one-sulfato
Testosterona
100
ND
0.9
0.03
0.006
2.2
0.01
0.002
0.2
ND
3.4
0.3
ND
0.05
9
3.2
0.1
0.05
0.1
ND= No Detectable
Exactitud
Trescientas cuarenta muestras de suero de pacientes fueron sujetas a
ensayo con el procedimiento Progesterona Coat-A-Count y con el kit de
Progesterona IMMULITE, con concentraciones de progesterona que van desde
aproximadamente 0.17 a 18 ng/mL. La siguiente ecuacin define la relacin
lineal:
(CAC) = 1.05 (IML) + 0.13 ng/mL
R = 0.993
39
40
VI.
Enzimoinmunoanlisis
los
ensayos
inmunoenzimticos
se
encuentran
93
sino la actividad enzimtica del complejo formado.62 Esto ltimo puede lograrse
con la adicin de un sustrato en un segundo paso de incubacin. El tipo de
sustrato empleado es lo que va a definir si el inmunoanlisis es colorimtrico,
fluoromtrico o quimioluminiscente.83
En medicina veterinaria los EIA mas empleados para determinar
Progesterona son los del tipo colorimtrico8 y los quimioluminiscentes. El
mtodo colorimtrico funciona mejor con peroxidasa de rabano, ya que la
intensidad de la seal obtenida con sta enzima es mayor que la obtenida con
fosfatasa alcalina ante un substrato colorimtrico, brindando de esta manera
mayor sensibilidad al anlisis. El substrato que ms se usa comnmente con la
peroxidasa es el TMB (tetrametilbencidina),94 cuya reaccin genera un color el
cual es ledo por un espectrofotmetro que expresa el resultado en densidad
ptica79, stos resultados son graficados en la curva estndar para estimar la
concentracin del analto.83
41
91, 92
debido a que el
42
Figura 14. Pasos del ensayo IMMULITE. 1) El reactivo y la muestra son pipeteados
automticamente en el tubo el cual es incubado a 37C; 2) En el paso de lavado, la
unidad es centrifugada a alta velocidad sobre su eje vertical; 3) La fraccin no unida es
retirada eficientemente de la unidad de ensayo; 4) Se aade el substrato
quimioluminiscente a la unidad para lograr la emisin de la luz.(Modificado de Bapson, 2005)
43
Media
DS
CV%
0.93
1.9
4.3
7.9
0.15
0.15
0.35
0.5
16
7.9
8.1
6.3
Media
DS
CV%
0.81
1.7
3.9
7.2
0.13
0.17
0.31
0.42
16
10
7.9
5.8
44
Especificidad:
En la tabla 7 se muestran las reacciones cruzadas que se observaron con otras
molculas diferentes a la progesterona.
Tabla 7. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a la progesterona
observadas en el ensayo IMMULITE 1000 Progesterone.96
Componente
Progesterona
Androstendiona
Corticosterona
Cortisol
Danazol
11-Desoxicorticosterona
11-Desoxicortisol
Estradiol
17-Hidroxi-progesterona
Medroxi-progesterona
Pregnenolona
Testosterona
ND = no detectable
100
0.047
0.38
0.066
0.004
1.18
ND
ND
1.04
0.21
0.3
0.12
Exactitud:
El ensayo fue comparado con el IMMULITE 2000 Progesterona (L2KPW) en
182 muestras de pacientes. El intervalo de concentracin fue aproximadamente
de 0.2 a 20ng/mL. La relacin se define por la siguiente ecuacin:
(IML-LKPG)=1.19 (IML 2000-L2KPW) 0.60 ng/mL
r=0.969
45
83
95
46
VII.
Quimioluminiscencia
47
48
Figura 16. Pasos que se llevan a cabo en el sistema ADVIA Centaur. 1) En la celda
de reaccin, el anticuerpo marcado con ster de acridinio se une a la progesterona
presente en la muestra y a su vez a un derivado de la progesterona unido a partculas
paramagnticas, se incuba la celda a 37C. 2) Despus del perodo de incubacin, se
lleva a cabo la separacin magntica de la fase slida, el aspirado del lquido contenido
en la celda y la separacin por lavado de los anticuerpos no unidos a la fase slida. 3)
A la celda de reaccin donde se encuentra la fase slida se le aaden los reactivos
para, 4) iniciar la reaccin de quimioluminiscencia.(Modificado de Taylor, 2005; Kricka, 2005)
50
Figura 18. La reaccin de oxidacin del rutenio en la superficie del electrodo se lleva a
cabo en presencia de tripropilamina (TPA), que es oxidada simultneamente con el
rutenio al aplicarse un potencial elctrico y convertida en un catin radical que pierde
un protn y reacciona con el rutenio oxidado, resultando en el estado excitado de ste,
el cual decae a su estado basal con la emisin de un fotn. (Modificado de Myers, 2005)
51
Media (ng/mL)
1.57
12
30.2
8.83
20.8
Precisin Intraensayo
DS (ng/mL)
CV %
0.04
2.4
0.17
1.5
0.76
2.7
0.19
2.3
0.35
1.7
Precisin Interensayo
DS (ng/mL)
CV %
0.09
5.4
0.48
4.1
1.54
5.5
0.38
4.6
0.77
3.7
Precisin Interensayo
DS
(ng/mL)
0.02
CV %
SH 1
Media
(ng/mL)
0.73
DS
(ng/mL)
0.04
CV %
2.9
Media
(ng/mL)
0.79
SH 2
SH 3
3.01
32.4
0.04
0.3
1.4
0.9
3.13
35.3
0.09
0.7
2.8
2
PC U 1
PC U 2
4.89
19.3
0.05
0.14
1.1
0.7
5.26
20.4
0.17
0.38
3.3
1.8
52
4.8
Especificidad:
Las reacciones cruzadas observadas con otras molculas diferentes a la
progesterona se muestran en la tabla 10.105
Androstendiol
Androstendiona
Corticosterona
Cortisol
Danazol
DHEA-S
D-(-)-Norgestrel
Estradiol
Etisterona
Etinoldioldiacetato
Medroxiprogesterona
Noretindrona
Noretindrona acetato
Testosterona
4-Pregnen-11-17-diol-3,20-diona
11-Desoxicorticosterona
11-Desoxicortisol
5--Dihidrotestosterona
5--Dihidroprogesterona
5-Pregnen-3-ol-20-ona
5-Pregnan-3-ol-20-ona
6-Metil-17-hidroxi-progesterona acetato
6-Metilprednisolona
17-Hidroxipregnenolona
17-Hidroxiprogesterona
20-Hidroxi-4-pregnen-3-ona
0.002
0.136
0.687
0.005
0.002
0.009
0.008
0.009
0.002
n.d.
0.812
0.01
n.d.
0.02
0.338
0.296
0.392
0.04
20.7
0.858
0.211
0.257
n.d.
0.018
1.3
0.016
n.d.=no detectable
Exactitud: se compar el ensayo Elecsys Progesterone II con el ensayo
Elecsys Progesterone usando muestras clnicas, y se obtuvo la siguiente
correlacin:
53
Nmero de muestras: 88
Regresin lineal
y = 0.90x + 0.50
r = 0.998
Las concentraciones de las muestras eran de aproximadamente entre 0.2 y 44
ng/mL.
El mtodo quimioluminiscente directo ADVIA Centaur Progesterona
presenta las siguientes caractersticas analticas106:
Sensibilidad analtica: 0.15 ng/mL
Precisin
Para obtener la precisin se analizaron seis muestras seis veces, en cada una
de diez series, en tres sistemas, durante un perodo de tres das (tabla 11).
Tabla 11. Coeficientes de variacin intraensayo e interensayo del ensayo Progesterona
de ADVIA Centaur.106
Media (ng/mL)
1.2
1.5
7.2
11.9
20.9
48.7
CV intraensayo
(%)
12.4
7.2
3.7
2.5
3.2
2.5
CV interensayo
(%)
2.6
5.7
3.9
3.1
1.9
4.2
CV total (%)
12.7
9.2
5.4
3.9
3.7
4.8
Especificidad.
El ensayo Progesterona de ADVIA Centaur presenta una elevada
especificidad para la progesterona. Se aadieron los siguientes compuestos a
Multidiluyente 3 y se determin el Valor aparente de progesterona. El porcentaje
de reactividad cruzada es el resultado aparente en comparacin con la cantidad
agregada (tabla 12).
54
Cortisol
ND
11-desoxicorticosterona
Corticosterona
0.08
0.95
Testosterona
Aldosterona
ND
ND
Pregnenolona
Androstenodiol
0.46
ND
17-hidroxiprogesterona
11-desoxicortisol
0.31
ND
Danazol
Prednisolona
ND
ND
17-estradiol
Estrona
ND
ND
Estriol
Clomifeno
ND
ND
Bromocriptina
ND
ND=No detectable
Exactitud:
Se compar el ensayo Progesterona ADVIA Centaur con el ensayo
Progesterona
ACS:180,
realizando
el
anlisis
de
230
muestras
con
55
56
VIII.
Anlisis y discusin
57
58
59
estuche
60
61
resultados
reproducibles
de
los
mtodos
de
referencia,
62
63
IX.
Conclusin
Debido a la importancia de la funcin de la progesterona en la
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Garca,
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C.;
Martnez,
M.
I.
Ventajas
del
mtodo
de
de
radiaciones
emitidas
por
isotopos
radiactivos
usados.
En
73
83.-
25)
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exciting
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in
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