Centro Quirales

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA
Trabajo de Tesis Doctoral
Estudio cromatogrfico de asociacin entre

solutos y selectores quirales en fase mvil.
Aplicacin al desarrollo de nuevas fases
estacionarias quirales.
Lic. Sonia Keunchkarian
Ao 2009
El presente trabajo de Tesis fue realizado en el Laboratorio de Separaciones

Analticas de la Divisin Qumica Analtica de la Facultad de Ciencias Exactas
de la Universidad Nacional de La Plata, bajo la direccin de la Dra. Cecilia B.
Castells. El mismo se pone a consideracin de las autoridades de la
Universidad Nacional de La Plata, con el objeto de acceder al grado acadmico
de Doctor de la Facultad de Ciencias Exactas.
Lic. Sonia Keunchkarian
Dra. Cecilia B. Castells

Directora
Agradecimientos
Con estas muy breves pero sinceras palabras quiero expresar mi
agradecimiento hacia mi Directora, la Dra. Cecilia Castells por el apoyo y la
dedicacin brindados durante las tareas realizadas que permitieron la
concrecin del presente trabajo de Tesis. Por su aporte al enriquecimiento de
mi formacin acadmica y por su cordial y amena forma de impartir
conocimientos.
Al Dr. ngel M. Nardillo por su predisposicin a prestar colaboracin y/o

conocimientos precisos en momentos fundamentales.
A mis compaeros de trabajo del Laboratorio de Separaciones Analticas por

los gratos momentos pasados durante el transcurso de las tareas diarias.
A todos Muchas Gracias!!!
A mi Familia
ndice.
Pgina
Captulo 1. Introduccin.
1.1. Definicin, origen e importancia de la quiralidad
1.2. Enantioseparaciones requeridas en la industria
Industria farmacutica
Industria agroqumica
Industria alimenticia
Industria petroqumica
1.3. Estrategias de separacin de enantimeros
Mtodos indirectos
Mtodos directos
1.4. Fases estacionarias quirales (FEQs)
FEQs tipo I
FEQs tipo II
FEQs tipo III
FEQs tipo IV
FEQs tipo V
FEQs constituidas por polmeros impresos
FEQs constituidas por antibiticos macrocclicos
4
7
7
8
8
12
12
12
13
15
17
18
19
20
22
1.5. Objetivos generales
24
Bibliografa
25
Captulo 2. Seccin Experimental.

2.1. Materiales
30
2.1.1. Reactivos y solventes
30
2.1.1.1. Adicin de selectores quirales en fase mvil
30
2.1.1.2. Sntesis de fases estacionarias quirales
30
2.1.1.3. Empaque de las columnas
31
2.1.1.4. Reaciones de derivatizacin de aminocidos
31
2.1.1.5. Fases mviles
33
Adicin de selectores quirales en fase mvil

i) Formacin de pares inicos
ii) Cromatografa lquida con intercambio de ligando quiral
(CILQ)
34
34
FEQs
35
34
2.1.2. Equipos
35
2.1.2.1. Adicin de selectores quirales en fase mvil
35
35
2.1.2.3. Empaque de las columnas
35
2.1.2.4. Reacciones de derivatizacin de aminocidos
36
2.1.2.5. Cromatografa
36
2.2. Estudio de los alcaloides cinconidina y quinina como aditivos

quirales en fase mvil
37
2.3. Sntesis de las fases estacionarias quirales
38
2.4. Reacciones de derivatizacin de aminocidos
41
Con cloruro de dabsilo (Dbs-Cl)

Con 2,4 dinitrofluorbenceno
Con 9- fluorenilmetilcloroformiato (FMOC-Cl)
2.5. Cromatografa
41
42
43
44

ii) Cromatografa lquida con intercambio de ligando quiral
(CILQ)
44
44
FEQs
45
Bibliografa
44
46
Captulo 3. Resultados y discusin

3.1. Estructura de los alcaloides de la familia de las cinconas
47

quirales en fase mvil
49
3.2.1. Formacin de pares inicos
49
3.2.2. Cromatografa lquida con intercambio de ligandos quirales

(CILQ)
52
3.2.2.1. Resultados cromatogrficos obtenidos con el modo CILQ
55
3.2.2.2. Discusin sobre el mecanismo de separacin quiral
59
61
3.3.1. Sntesis de las FEQs. Resultados y discusin
61
3.3.2. Columnas quirales basadas en cinconidina (FEQ-CD).

Resultados cromatogrficos
64
3.3.2.1. Modo CILQ
64
3.3.2.2. Modo cromatografa quiral de intercambio inico (CQII)
65
Comparacin entre las columnas con FEQ-CD-SE y

FEQ-CD-CE
69
3.3.3. Columnas quirales basadas en quinina (FEQ-QN).

Resultados cromatogrficos
71
3.3.3.1. Modo CQII
71
FMOC-derivados
71
DNP-derivados
Comparacin entre las columnas con FEQ-QN SE y CE
Comparacin entre las columnas con FEQ-CD y FEQ-QN
72
81
84
3.3.4. Influencia del pH de la fase mvil
87
3.3.5. Influencia de la concentracin del buffer
90
3.3.6. Influencia del tipo de modificador orgnico
92
3.3.7. Influencia de la temperatura
93
3.3.8. Columnas acopladas. Cromatografa bidimensional
105
Bibliografa
112
Captulo 4. Conclusiones.
119
Captulo 1. Introduccin.
1.1. Definicin, origen e importancia de la quiralidad

La evolucin qumica de la quiralidad comenz en 1801 con el descubrimiento
del hemihedrismo (diminutas modificaciones localizadas en forma asimtrica en
algunos de los bordes cristalinos) hallado en cristales tales como cuarzo y que
fuera reportado por el cristalgrafo Ren-Just Hay 1. En 1809 fue descubierta
la luz circularmente polarizada (tambin llamada luz plano-polarizada) por
Etienne Malus. Franois Arago realiz la primera observacin de la rotacin
ptica producida por una sustancia, al estudiar el efecto de la luz polarizada
sobre cristales de cuarzo 2. En 1815, el fsico Jean-Baptiste Biot observ que
ciertos compuestos orgnicos en estado no cristalino rotan el plano de la luz
polarizada 2 y entendi que este comportamiento se debe a ciertas propiedades
estructurales de las molculas, razn por la cual se refiri a estos compuestos
como sustancias moleculares activas.
Una apreciacin ms completa de la existencia de sustancias quirales fue
hecha unas dcadas ms tarde por el qumico Louis Pasteur 3, quien en 1848
realiz la primera separacin quiral en forma manual apartando los cristales
correspondientes a las formas dextro y levo del tartrato de sodio y amonio,
pticamente inactivo, en dos clases diferentes de cristales que eran imgenes
especulares entre s, proponiendo de esta forma la existencia de asimetra
molecular para ciertas sustancias.
El siguiente desarrollo fundamental ocurri en 1874, cuando los qumicos
Jacobus vant Hoff 4, 5 y Joseph LeBel 6 simultnea e independientemente
propusieron que las cuatro valencias del tomo de carbono se dirigen hacia los
vrtices de un tetraedro centrado en el carbono. Este descubrimiento llev al
desarrollo de la teora de la estructura tridimensional de las molculas que
finalmente proporcion la explicacin del fenmeno de asimetra molecular
descubierto por Pasteur y la existencia de ismeros pticos en las sustancias
quirales.
Los estereoismeros son molculas con la misma frmula molecular y los
mismos enlaces que difieren slo en el ordenamiento espacial de ciertos
tomos o grupos de tomos. Los estereoismeros que no se superponen con
sus imgenes especulares se conocen como ismeros pticos o enantimeros
y la mezcla de ambas formas moleculares, como mezcla racmica. Los
enantimeros tienen idnticas propiedades fsicas y qumicas en estado lquido,
slido o gaseoso cuando se encuentran puros y tambin en sus disoluciones
en todo tipo de solventes aquirales. Una molcula quiral es aquella que puede
existir en por lo menos dos formas enantiomricas. Los diastermeros son
estereoismeros que no son superponibles pero tampoco son imgenes
especulares entre s; dentro de este grupo se encuentran los ismeros cis-trans
y las molculas con ms de un centro quiral.
Un tomo de carbono con cuatro sustituyentes diferentes constituye un centro
quiral. Un ejemplo genrico de un par enantiomrico se muestra en la Figura
1
1.1. Adems del carbono, otros elementos como azufre, nitrgeno, fsforo y
boro producen centros quirales estables y algunas molculas con impedimento
a la libre rotacin de sus tomos tambin presentan quiralidad.
Figura 1.1. Formas enantiomricas de una molcula quiral. Comparacin con la

quiralidad de la palma de las manos.
Una molcula quiral se manifiesta como tal slo cuando es afectada por una
influencia quiral tal como la luz polarizada o reactivos quirales.
Tambin el ambiente biolgico es quiral y los enantimeros se comportan en l
como compuestos diferentes. Posiblemente el primero en reconocer que los
enantimeros tienen diferentes efectos biolgicos fue Piutti 7, en 1886, cuando
encontr que un ismero de la asparagina es dulce y el otro amargo. La
actividad farmacodinmica diferencial de los frmacos enantimeros se conoce
desde principios del siglo XX cuando Arthur Cushny, considerado el pionero en
el descubrimiento de la quiralidad en farmacologa, comprob la potencia
superior de la dextro-atropina respecto a la de la forma levo. Probablemente
esta sea una de las primeras manifestaciones de la influencia de la quiralidad
en farmacologa. Desde entonces, si bien se saba que la accin y el
metabolismo de la drogas puede ser enatioselectivo, no se dio importancia a
este conocimiento y recin fue en los ltimos veinte aos del siglo anterior
cuando se empezaron a desarrollar drogas ms seguras y efectivas.
Con el fin de racionalizar las diferencias observadas entre los enantimeros en
cuanto a su actividad farmacodinmica, en 1933 Easson y Stedman
propusieron un modelo de acoplamiento de tres puntos como base de las
interacciones enantioselectivas droga-receptor 8. El modelo, deducido a partir
de la diferente accin de los enantimeros de la epinefrina, se basa en que si
tres grupos de la molcula de un dado enantimero interaccionan con tres
sitios complementarios en el receptor quiral, el otro enantimero no podr
interactuar exactamente del mismo modo con el receptor, resultando entonces
en interacciones y, consecuentemente, en efectos biolgicos diferentes para
ambos enantimeros. Si bien este modelo, esquematizado en la Figura 1.2, es
demasiado simple, dado que no considera la posibilidad de que la interaccin

entre el frmaco y el receptor pueda producir cambios en la configuracin de
ambos, fue ampliado luego para explicar la enantioselectividad biolgica de
drogas quirales en general 9, y tambin se extendi su aplicacin para justificar
la retencin enantioselectiva en cromatografa 10.
Figura 1.2. Modelo de interaccin de tres puntos en el que se muestran las

posibles interacciones enantiomricas droga-receptor.
Fue Ariens, hacia fines de 1980, quien inst a la comunidad cientfica a tratar
con el debido rigor el tema de la estereoisomera 11-14. La toma de conciencia
respecto de la importancia de la quiralidad en mltiples campos fue coincidente
con el desarrollo de mtodos de separacin y anlisis de enantimeros cada
vez ms eficientes y, simultneamente, con avances en los mtodos de
sntesis asimtrica.
Actualmente resulta obvio aceptar que los estereoismeros interaccionan en
forma diferente con las macromolculas del organismo. Mientras se espera que
su proceso de difusin pasiva a travs de membranas celulares sea
equivalente para ambos, no es sorprendente que se observen diferencias en el
transporte activo, en la secrecin, en el enlace a protenas plasmticas, en el
metabolismo y en los efectos farmacolgicos que ambas molculas puedan
tener. Hay una infinidad de ejemplos que dan cuenta del efecto de la quiralidad
sobre la biosntesis y el metabolismo, algunos de ellos son los siguientes: la
produccin de glucosa en organismos vivos resulta en un nico compuesto, la
D-glucosa; se producen naturalmente slo los L-aminocidos; las enzimas en la
mayora de los casos slo son capaces de reconocer, unirse y catalizar
reacciones a partir de un ismero ptico especfico; la actividad hormonal de la
(-)-adrenalina es muchas veces superior a la de su enantimero; la (+)-efedrina
no slo no tiene actividad como droga sino que interfiere en la del otro ismero
ptico. Queda claro que el tratamiento de las propiedades de una mezcla
racmica constituye un tema complejo, y que es necesario, en todos los casos,
el estudio las propiedades qumicas de cada ismero individualmente as como

de su posible bioactividad.
Los compuestos quirales son objeto de inters tambin en numerosas
industrias. Es importante entonces, reconocer la extensin en que los
productos quirales afectan la vida cotidiana de los individuos y tambin la
produccin industrial 15.
1.2. Enantioseparaciones requeridas en la industria.

Industria farmacutica
La observacin de la accin enantioselectiva de las drogas quirales en los
inicios de la farmacologa moderna fue considerada como un hecho curioso y
hasta casi sin importancia dentro del perfil global de la actividad de la droga.
A principios de 1960 la produccin de medicamentos se vio duramente
afectada por la tragedia de la talidomida (imida del cido N-ftalilglutmico),
esquematizada en la Figura 1.3. Hasta entonces no se saba que el efecto
sedante y antiemtico de la droga es debido slo a uno de los enantimeros.
Recin en 1979 se reconoci que el S-(-)-enantimero tiene efecto
teratognico16, responsable de serias malformaciones en bebs recin nacidos
de mujeres a las que se les haba administrado la droga para combatir las
nuseas durante los primeros meses de embarazo.
O
H
N
O O
(S)-(-)-Talidomida
Forma teratogenica
N
N
(R)-(+)-Talidomida
Antinausea
Figura 1.3. Estructura de ambos enantimeros de la talidomida.
Estudios ms recientes mostraron que, an cuando la ingesta del frmaco se

limite a la del ismero R, ocurre una racemizacin de la molcula mediada por
el organismo17, 18 . Sin embargo, el hecho en s, difundido en mltiples regiones
del mundo, hizo tomar conciencia acerca de la relevancia de la quiralidad.
La Tabla 1.1 muestra algunos ejemplos de sustancias usadas como frmacos y
los diferentes efectos farmacolgicos de sus ismeros pticos.
Tabla 1.1. Efecto de la quiralidad sobre algunos productos farmacuticos.

Compuesto
Talidomida
Fluoxetina
Metorfano
Labetalol
Penincilamina
Ismero
S
R
S
R
L
D
S, R
R, R
D
L
Efecto farmacolgico
Teratognico
Sedante, antiemtico
Antimigraa
Antidepresivo
Narctico potente
Antitusgeno
Alfa-bloqueante
Beta-bloqueante
Antiartrtico
Txico
Actualmente las autoridades regulatorias exigen cada vez ms controles para

determinar la seguridad y efectividad de las drogas teraputicas quirales,
insistiendo en evaluar la actividad farmacolgica y los posibles efectos
adversos de cada enantimero en forma individual. La administracin de
drogas estereoqumicamente puras ofrece adems ventajas teraputicas como
la reduccin de la dosis necesaria, la simplificacin de los estudios de dosisrespuesta y la cancelacin de las interacciones entre los mismos enantimeros.
Por esta razn, la industria farmacutica es una de las que mayor demanda
exige de mtodos sencillos y adecuados de separacin de enantimeros y de
cuantificacin de exceso enantiomrico con altos niveles de detectabilidad. El
desarrollo de nuevas estrategias para atender estas demandas es objeto de
permanente estudio y, entre las tcnicas separativas ms exploradas se
encuentran las tcnicas cromatogrficas.
En respuesta al mayor conocimiento sobre la accin enantioselectiva de los
frmacos, en 1992 la Drug Information Association (DIA) auspici un foro sobre
quiralidad, con el objetivo de estimular los debates sobre los requisitos
reglamentarios en materia de drogas quirales19. En este encuentro las
autoridades regulatorias y representantes de la industria farmacutica de la
Comunidad Europea, Estados Unidos y Japn debatieron las cuestiones
reglamentarias relativas a los frmacos quirales. La regulacin de frmacos
quirales recomend la necesidad de justificar el desarrollo de medicamentos
enantiomricamente puros con datos relativos a la calidad, la seguridad, la
eficacia y la evaluacin de la relacin riesgo-beneficio. Los documentos de
orientacin de reglamentacin en el desarrollo de frmacos quirales, reflejo del
debate impulsado por el taller de DIA, se publicaron en EEUU y en la CE 20.
Principios de orientacin similares fueron adoptados por las autoridades
reguladoras en Japn y Canad. En estos documentos se especifica la
naturaleza y la calidad de la informacin que debe presentarse en el contexto
de solicitudes de nuevos medicamentos para sustancias quirales activas, que
deben abarcar los aspectos qumicos y farmacuticos y proporcionar datos
sobre los estudios preclnicos y clnicos para apoyar la eficacia demandada al
medicamento. Las guas directrices requieren que los demandantes
reconozcan la existencia de la quiralidad, y que efecten la separacin de los
enantimeros/estereoismeros de los frmacos candidatos. Las propiedades

fisicoqumicas, la farmacologa y los perfiles de toxicidad de todos los
enantimeros/estereoismeros deben ser establecidos. La eleccin final para la
puesta en el mercado como ismero nico o como racemato tiene que estar
plenamente justificada sobre la base de las propiedades qumicas y los
ensayos preclnicos y clnicos. El reconocimiento de la quiralidad como una
nueva cualidad en el desarrollo de medicamentos ha tenido desde entonces un
enorme impacto sobre las lneas de produccin de las industrias farmacuticas.
Un reporte del ao 1982 21 mostr que de 1675 drogas producidas el 28% eran
de origen natural o semi-sintticas, de ellas el 98% eran quirales y se
comercializ slo el ismero puro. Del 72% de las drogas sintticas, se saba
que el 40% era quiral pero la mayora (el 88% de ellas) se vendi como mezcla
de ismeros. La tendencia actual hacia la produccin y la comercializacin de
los enantimeros individuales es clara.
Un anlisis ms reciente de la distribucin de los medicamentos aprobados
mundialmente de acuerdo con su caracter quiral se da en la Figura 1.4 22.
Figura 1.4. Porcentaje de drogas aprobadas segn su caracter quiral entre

1983 y 2002.
Desde 1983 a 2002, el porcentaje de racematos disminuy de 32 a 8%,

mientras que las drogas enantiomricamente puras aumentaron de 25 a 58%.
No es sorprendente que las drogas quirales sean las mayores contribuyentes a
las ventas anuales de las compaas farmacuticas. Una distribucin similar
fue revelada de un anlisis de los nuevos compuestos aprobados por la UK
Medicines Control Agency en el lapso 1996-2000 23.
Industria agroqumica
La situacin en esta industria es similar a la de la industria farmacutica
aunque en menor escala. Muchos pesticidas y agroqumicos son quirales y la
necesidad de producirlos en la forma ms econmica y con la menor toxicidad
lleva a esta industria a intentar obtener el ismero puro. Un reporte de 1981 11
mostr que de 550 pesticidas, 98% eran productos sintticos de los cuales slo
el 17% eran quirales, pero menos del 8% de los mismos se comercializ como
enantimero puro. Si bien no todos los aspectos de la quiralidad han sido
explorados en esta industria, la investigacin est encaminada debido a la
creciente importancia que ha ido cobrando en el campo de la agricultura.
Industria alimenticia
En menor medida que en las anteriores, para esta industria son de inters las
separaciones quirales debido a que los procesos qumicos y bioqumicos
involucrados en la produccin de muchos alimentos originan diferentes
composiciones isomricas de algunos compuestos quirales. Un ejemplo tpico
lo constituye el control del proceso de fermentacin y el efecto del
almacenamiento cuando un ismero puro se racemiza con el paso del tiempo.
Esto ocurre, por ejemplo con el edulcorante aspartamo cuyo precursor, la
asparagina tiene un ismero (el R) con sabor dulce mientras que el otro
enantimero es amargo. En este caso, el anlisis quiral del precursor y del
edulcorante durante el almacenamiento es esencial para asegurar el sabor del
aspartamo as como el de las preparaciones que lo contengan. El aceite de
oliva es otro de los productos naturales que se controla en la composicin de
sus enantimeros, en este caso, para detectar posibles adulteraciones con
sustancia qumicas ms econmicas. Tambin se encuentra que la produccin
qumica de esencias y de fragancias es altamente dependiente de la
composicin enantiomrica para obtener la propiedad deseada. Algunos
ejemplos se muestran en la Tabla 1.2.
Tabla 1.2. Efecto de la quiralidad sobre aditivos alimenticios.

Compuesto
Carvona
Limoneno
Aspartamo
Ismero
R
S
R
S
R, R
S, R
Propiedad
Aroma a menta
Aroma a alcaravea
Aroma a naranja
Aroma a limn
Sabor dulce
Sabor amargo
Industria petroqumica
Muchos hidrocarburos son subproductos de la industria del petrleo y algunos
de ellos son de naturaleza quiral. Entre los ms importantes se encuentran los
derivados halogenados y los polialcanos que muchas veces son utilizados
tambin como precursores de formulaciones sintticas y de otros productos
quirales. Dada la importancia de la sntesis estereoespecfica, es necesario
controlar la produccin de estos precursores. Los materiales que se van
produciendo en diferentes yacimientos de petrleo pueden diferir en la
composicin de estereoismeros segn el momento en que se monitoree la
produccin. En sntesis, el control y anlisis de molculas quirales es de
considerable importancia tambin en la industria petroqumica.
1.3. Estrategias de separacin de enantimeros.

En la actualidad se dispone de numerosas alternativas aplicables a la
separacin y anlisis de enantimeros. Las clsicas tcnicas polarimtricas, de
degradacin enzimtica y de cristalizacin fraccionada utilizadas para el
anlisis enantiomrico presentan varias desventajas que fueron superadas por
las tcnicas analticas quirales que las han ido desplazando. Estas
metodologas incluyen cromatografa lquida (LC), cromatografa gaseosa (GC),
mtodos de membrana, biosensores y electroforesis capilar (CE). Un esquema
de las diversas metodologas utilizadas para la separacin enantiomrica se
muestra en la Figura 1.5.
Los mtodos cromatogrficos y electroforticos son muy sensibles,
reproducibles, confiables y permiten el anlisis enantiomrico en variadas
matrices. La GC empleando columnas capilares quirales es una metodologa
altamente eficiente; sin embargo, la mayor limitacin de la GC es que los
analitos deben ser voltiles, razn por la cual muchas veces es necesaria la
derivatizacin de los mismos. Esta desventaja hace que la GC sea el mtodo
de rutina elegido slo para la separacin de racematos voltiles. Entonces,
emerge la LC como la tecnologa ms adecuada para compuestos de baja
presin de vapor. Con el transcurso del tiempo varios tipos de LC fueron
desarrollados, entre ellos los ms importantes son la cromatografa lquida de
alta eficiencia (HPLC segn su sigla en ingls), la cromatografa con fluido
supercrtico (SFC), la cromatografa en capa delgada (TLC) y ms
recientemente la electrocromatografa capilar (CEC).
Entre las tcnicas de LC mencionadas, la de HPLC es la ms utilizada por ser
la que presenta mayores ventajas. Sensibilidad, reproducibilidad de los
resultados y tiempos de anlisis adecuados hacen que la HPLC sea la tcnica
de anlisis enantiomrico elegida por la mayora de los laboratorios.
Aproximadamente el 90% de las separaciones quirales de compuestos
farmacuticos se realizaron por HPLC. Debido al amplio rango de aplicacin de
la tcnica en separaciones quirales, varios selectores quirales se encuentran
disponibles en columnas para HPLC. La variedad de fases mviles utilizadas
incluyen el modo normal, el inverso, el polar inico y el polar orgnico. La
composicin de la fase mvil puede modificarse por el agregado de varios

solventes acuosos y orgnicos y la optimizacin de la separacin quiral puede
lograrse a partir del cambio de diversos parmetros experimentales.
Figura 1.5. Diferentes tcnicas de resolucin quiral.
El uso de un fluido supercrtico como fase mvil en cromatografa se report

hace ms de 30 aos, pero su uso ha cobrado mayor desarrollo ms
recientemente, especialmente en escala preparativa. El fluido supercrtico ms
comnmente usado es el dixido de carbono por ser compatible con la mayora
de los detectores, por tener presin y temperatura crtica bajas y por tener baja
toxicidad y costo. Su principal desventaja es su incapacidad para eluir
9
compuestos polares, si bien el comportamiento retentivo de este tipo de

sustancias puede mejorarse por el agregado de modificadores orgnicos. La
primera separacin quiral con SFC fue reportada por Mourier y colaboradores
en 1985 24 y luego se publicaron varios trabajos y revisiones en el tema 25-30.
La electrocromatografa capilar (CEC) es una tcnica hbrida que se basa en
los principios bsicos de electroforesis capilar y cromatografa. Su uso para
separaciones quirales fue reportado en varias publicaciones recientes 31, 32.
Caractersticas tales como sensibilidad, bajo lmite de deteccin,
reproducibilidad de resultados y alta velocidad de anlisis hacen de la CEC una
tcnica adecuada para este tipo de anlisis; sin embargo no es de uso comn
dado que an la tcnica no est del todo difundida.
El desarrollo de la TLC cuenta con una larga historia. La mayora de las
enantioseparaciones logradas se realizaron por la aplicacin de la tcnica a
diastermeros de los enantimeros a separar (metodologa indirecta, vase
ms adelante en el texto).
Actualmente, la electroforesis capilar (CE) marca la tendencia a seguir en el
desarrollo de las tcnicas analticas. Entre sus ventajas pueden mencionarse
su versatilidad, los relativamente bajos lmites de deteccin alcanzados, su bajo
costo y la rapidez del anlisis. Sin embargo, hay que mencionar que la CE no
se ha popularizado como tcnica analtica de rutina para el anlisis de
compuestos quirales ni tampoco de analitos aquirales.
Adems de las tcnicas separativas hasta aqu mencionadas, existen otras
alternativas para el anlisis enantiomrico que incluyen las tcnicas
espectroscpicas, el desarrollo de sensores y los mtodos de membrana.
Las medidas de rotacin ptica, las tcnicas de resonancia magntica nuclear
(NMR) y de espectroscopa infrarroja (IR) son capaces de discriminar una
mezcla racmica, pero estas metodologas son muy sensibles a interferencias
ocasionadas por impurezas quirales o aquirales presentes en las muestras
reales, perdiendo de esta forma precisin y sensibilidad.
Se describi en la literatura la aplicacin de biosensores para la discriminacin
quiral de los enantimeros de molculas de inters industrial, medicinal y
ambiental 33. Estos biosensores estn basados en polmeros impresos con alta
estabilidad y resistencia. Tambin se usan sensores de gas, donde una amida
quiral, fijada a una cadena de polisiloxano que cubre una superficie slida
(cuarzo, vidrio) 34, tiene una interaccin mucho mayor con una de las
antpodas pticas y produce de esta forma la enantiodiferenciacin.
La discriminacin quiral se obtiene tambin con el uso de membranas. Esta
tcnica se basa en el enriquecimiento de los enantimeros en soluciones
orgnicas a ambos lados de una membrana que impide que las dos fases
orgnicas se mezclen 35. Estas membranas son permeables para los
enantimeros, pero con el pasaje preferencial de uno de ellos sobre su
antpoda, resultando as en el enriquecimiento de slo uno de los
enantimeros. Hay disponibles varios tipos de membranas que incluyen
10
polmeros, lquidos soportados en slidos 36 y emulsiones lquidas 37. A pesar

de la capacidad de las membranas, el mtodo no es popular pues an est en
una etapa de desarrollo.
Como muestra de la relevancia que estos temas han ido cobrando, han sido
numerosos los textos publicados especializados en la aplicacin de tcnicas
cromatogrficas de anlisis enantiomrico 38-40. Se deben mencionar adems a
dos prestigiosas publicaciones peridicas dedicadas a todos los aspectos
qumicos, biolgicos y tecnolgicos de compuestos quirales: Enantiomer, Ed.
Gordon & Breach, comienza su edicin en 1996 y Chirality, Ed. Wiley, en 1989.
Una revisin muy reciente y completa, que an est en prensa, realizada por
Michael Lmmerhofer 41 sobre los aspectos termodinmicos del mecanismo de
reconocimiento quiral, muestra adems la vigencia e importancia del tema.
La Figura 1.6 muestra los resultados de una bsqueda bibliogrfica realizada a
travs de la base de datos Scopus para separaciones quirales. Puede verse
el importante aumento de las publicaciones cientficas sobre el tema a partir de
la dcada del 80 y tambin la posicin privilegiada de la tcnica de HPLC que
la identifica como la tecnologa de separacin enantiomrica ms popular,
seguida por la CE, GC y finalmente CEC. Adems el inters por la HPLC quiral
parece renovarse, mientras para las dems tcnicas declina.
Figura 1.6. Revisin del nmero de publicaciones cientficas dedicadas a la

resolucin de enantimeros empleando diferentes tcnicas de separacin en el
perodo 1970-2008.
La aplicacin de cualquiera de las metodologas separativas mencionadas para

la resolucin de enantimeros puede basarse en:
11
Mtodos indirectos. Son los mtodos basados en la reaccin qumica de la

mezcla racmica con un reactivo quiral (por ejemplo un quelante metlico o un
agente formador de pares inicos) para obtener un par diasteromrico. Los
diastermeros poseen diferentes propiedades fisicoqumicas y en
consecuencia pueden separarse por procedimientos habituales como
destilacin o recristalizacin fraccionadas, cromatografas clsicas, etc. Si es
necesario recuperar los enantimeros puros se requiere que, una vez
separados los diastermeros, se invierta la reaccin qumica que los form.
Una de las ventajas de estos mtodos indirectos es que los diastermeros
pueden ser separados mediante tcnicas convencionales. En HPLC se
emplean columnas aquirales usuales, significativamente ms econmicas, con
caractersticas apropiadas al tipo y polaridad del diastermero formado. Una
segunda ventaja es el amplio rango de aplicacin debido a la variedad de
reactivos quirales para derivatizacin disponibles y la facilidad con que estos
pueden cambiarse. Entre sus desventajas se puede citar: la alta pureza
enantiomrica que debe tener el reactivo quiral, muchas veces la seleccin del
sistema de deteccin est limitada por el reactivo elegido, la extensin del
tiempo total de anlisis.
Mtodos directos. Estos no requieren la formacin previa de diastermeros.
La resolucin directa de los enantimeros es posible utilizando tcnicas
separativas en las que el reconocimiento quiral ocurre mediante una molcula
pticamente activa denominada selector quiral que puede asociarse
transitoriamente con preferencia a uno de los enantimeros de la mezcla. Este
selector quiral forma parte de la fase estacionaria en HPLC.
Las desventajas citadas para los mtodos de separacin indirectos hacen que
en anlisis de rutina se prefiera utilizar fases estacionarias quirales cuando se
considera realizar el anlisis por HPLC 42.
Limitaremos la discusin siguiente a la separacin de compuestos quirales por
HPLC.

La separacin quiral en HPLC usando FEQs se basa en la formacin de
complejos diastermeros transientes entre los enantimeros del soluto y el
selector quiral (SQ) que en este caso forma parte de la fase estacionaria. La
diferente estabilidad de estos complejos es la responsable de que se obtengan
distintos tiempos de retencin para cada uno de los enantimeros del par.
Durante la dcada de 1980, se dio una irrupcin de numerosas FEQs
propuestas por la comunidad cientfica primero, y luego trasladadas a patentes
comerciales por lo que varios autores intentaron clasificar estas FEQs en base
al tipo de interacciones posibles entre selector quiral y analito. Wainer 43 en
1987, propuso la clasificacin que figura en la Tabla 1.3.
12
Esta clasificacin, oportunamente muy til para comprender los mecanismos de

enantioreconocimiento por los cuales las separaciones quirales son posibles,
ha quedado obsoleta por la aparicin de nuevas fases a partir de la dcada
posterior. Detallaremos a continuacin las caractersticas y propiedades de las
FEQs ms relevantes siguiendo el orden sugerido en la Tabla 1.3 y
describiendo a continuacin las FEQs desarrolladas con posterioridad.
Tabla 1.3. Clasificacin de FEQs.

Clasificacin
Tipo I
Tipo II
Tipo III
Tipo IV
Tipo V
Interacciones
Atractivas, puentes de hidrgeno, - , dipolares
Atractivas y formacin de complejos de inclusin
Formacin de complejos de inclusin dentro de cavidades
quirales
Mecanismo de intercambio de ligandos con complejos metlicos
Hidrofbicas y polares con protenas enlazadas a slice
FEQs tipo I (tipo Pirkle)

Son las fases quirales ms ampliamente investigadas y las que tienen mayor
cantidad de productos comercialmente disponibles (ms de 30 columnas
diferentes). Una molcula de relativamente bajo peso molecular con uno o dos
centros quirales se une qumicamente a la slice. Estas estructuras qumicas se
caracterizan por tener cerca del centro quiral ms de una de las siguientes
funciones: i) grupos aromticos capaces de actuar como aceptores o dadores
de electrones en interacciones , ii) grupos dadores o aceptores de puentes
de hidrgeno, iii) grupos electronegativos para interacciones dipolo-dipolo y iv)
grupos no polares voluminosos para posibles interacciones de van der Waals
y/o impedimento estrico.
Los analitos a separar deben tener grupos similares pero complementarios
para favorecer la discriminacin quiral. Dalgliesh 44 adapt el modelo de
interaccin de tres puntos para explicar la resolucin de enantimeros sobre
estas fases. Este modelo postula que el reconocimiento quiral es posible si se
establecen simultneamente tres tipos de interacciones (por lo menos dos de
ellas deben ser atractivas) entre el SQ de la FEQ y uno de los enantimeros.
La rigidez de la molcula quiral alrededor del centro asimtrico impedira que el
otro enantimero del par pueda establecer tambin tres interacciones, slo dos
interacciones seran posibles para este enantimero. La Figura 1.7
esquematiza una secuencia de formacin de una interaccin de tres puntos con
uno de los enantimeros del par.
La mayor contribucin a este tipo de fases fue hecha por el Prof. William Pirkle
y sus colaboradores de la Universidad de Illinois, quienes propusieron la
primera de estas fases a comienzos de 1980. Sus fases estacionarias iniciales
contenan trifluoroantriletanol ligado a la slice, con ellas se separaron solutos
13
aceptores de electrones debido a la interaccin con los grupos antrilo dadores

de electrones 45. Una fase posterior en la que se acrecentaba la naturaleza
dadora del grupo antrilo permiti mejorar la resolucin de los mismos
racematos, confirmando la importancia de las interacciones en el proceso
de separacin.
Figura 1.7. Formacin de una interaccin de tres puntos 46.

(a) El SQ forma una interaccin con el analito que involucra slo uno de los
sustituyentes del carbono asimtrico; (b) el SQ se enlaza a partir de dos de sus
sustituyentes; (c) el SQ se enlaza a partir de tres de sus sustituyentes con uno
de los enantimeros.
La alta resolucin obtenida hacia los enantimeros de N-3,5dinitrobenzoilfenilglicina llev a Pirkle a disear una segunda generacin de
FEQs conteniendo el grupo 3,5-dinitrobenzoilo postulando el concepto de
reciprocidad 47 esquematizado en la Figura 1.8, que establece que si un
enantimero inmovilizado de un compuesto A es capaz de distinguir los
enantimeros de otro compuesto B, entonces la inmovilizacin de un
enantimero de B tambin debera ser capaz de distinguir los enantimeros de
A. Con estas FEQs se separ un gran nmero de compuestos dadores de
electrones 48. Y por ltimo, desarroll un tercer tipo de fases fijando a la slice
un compuesto que contiene simultneamente un grupo aceptor y otro dador de
electrones, de modo que es posible separar tanto racematos dadores como
14
aceptores de electrones. Las columnas con estas FEQs pueden usarse con
fases mviles correspondientes a los modos normal e inverso de HPLC.
Desde entonces diferentes grupos de investigacin sintetizaron una gran
diversidad de FEQs de este tipo que permitieron resolver una amplia variedad
qumica de racematos, muchas de las cuales se ofrecen como columnas
comerciales.
Figura 1.8. Esquema del principio de reciprocidad para FEQs tipo I.
FEQs tipo II (polimricas)

Este tipo de FEQs est constituido por selectores quirales polimricos naturales
como los derivados de celulosa y de amilosa, o sintticos basados en
poliacrilatos y poliacrilamida.
La celulosa es un homopolmero natural de estructura altamente ordenada
constituida por cadenas lineales de unidades de (14) -D-glucosa. Estas
cadenas y sus derivados adquieren una estructura tridimensional definida,
muchos de ellos en forma helicoidal, por lo que, en principio podra existir
enantiodiscriminacin por el enorme nmero de centros quirales del polmero
natural y, adems, por su estructura espacial. Con el objetivo de aumentar la
selectividad de estos polmeros hacia enantimeros de distinta naturaleza
qumica se derivatizaron los grupos oxhidrilo. Hesse y Hagel 49 prepararon
inicialmente triacetato de celulosa microcristalina por acetilacin heterognea,
observando que el derivado mantena la estructura helicoidal original y,
posteriormente, tribenzoato de celulosa. Con esta ltima fase separaron
compuestos aromticos quirales.
Para mejorar las propiedades cromatogrficas de estos polmeros en los que la
lenta velocidad de difusin del analito compromete la transferencia de materia y
provoca el ensanchamiento de las bandas cromatogrficas, se propuso el
depsito del polmero sobre partculas de slice macroporosa. Wainer y Alembik
15
50
estudiaron la separacin de varios analitos sobre una fase de triacetato de

celulosa soportada sobre slice y propusieron un mecanismo dominado por
fuerzas de atraccin sobre las de inclusin.
El Prof. Yoshio Okamoto y sus colaboradores desarrollaron numerosas fases
basadas en steres y en carbamatos de celulosa y de amilosa adsorbidos
sobre slice macroporosa, las que constituyen actualmente las fases quirales de
mayor uso 51, 52. Las estructuras qumicas de algunas de las ms comunes se
muestran en la Figura 1.9.
Figura 1.9. Estructura qumica de los derivados ms importantes de celulosa y

amilosa incorporados a las FEQs de tipo II.
Estas FEQs fueron patentadas por la compaa Daicel. Se trata de fases

sumamente verstiles dado que los diferentes derivados de polisacridos
permiten una muy numerosa y variada cantidad de separaciones 53. Los
polmeros originalmente estaban adsorbidos sobre el soporte inorgnico y, en
consecuencia, estaba limitada la eleccin de solventes a usar en fase mvil.
Ms recientemente estos polmeros fueron ligados qumicamente a la
superficie, dando lugar a columnas que pueden ser usadas con fases
correspondientes al modo normal y tambin con fases del modo inverso
empleando solventes hidroorgnicos.
16
Polmeros sintticos se desarrollaron intentando imitar y mejorar las

propiedades de los naturales. Existen infinitas posibilidades de preparar FEQs
cubriendo la slice con polmeros sintticos preparados a partir de monmeros
quirales 54. Tales fases generalmente tienen amplia aplicabilidad, alta
capacidad, buena eficiencia y son compatibles con el uso de modificadores
orgnicos.
FEQs tipo III

Este es un grupo diverso de fases estacionarias que tienen en comn el
mecanismo de accin, que consiste en la inclusin del soluto dentro de una
cavidad quiral. Este tipo de FEQs incluye derivados de ciclodextrinas y de
teres corona.
Las ciclodextrinas son oligmeros (6 a 8 unidades) cclicos de D-glucosa. Su
estructura toroidal esquematizada en la Figura 1.10 contiene 30-40 centros
quirales.
Figura 1.10. Estructura toroidal de las ciclodextrinas.
El inters sobre las propiedades y posibles aplicaciones analticas de las

ciclodextrinas 55, 56 y sus derivados creci rpidamente. En el campo de las
separaciones quirales, estas molculas fueron fijadas sobre la superficie de
slice. Se comprob tempranamente que la separacin de molculas con
grupos aromticos prximos al centro quiral era particularmente favorable, la
parte aromtica es fuertemente incluida dentro de la cavidad hidrofbica de la
ciclodextrina quedando los grupos polares fuera de la misma con posibilidad de
interactuar con los oxhidrilos secundarios que forman el borde de la cavidad
mayor. Ambas interacciones pueden dar lugar a mecanismos de discriminacin
quiral. Si bien la eficiencia de estas columnas tiende a ser baja, la alta
17
selectividad de las ciclodextrinas permite separar variadas estructuras

utilizando fases mviles acuosas.
Los teres corona son politeres macrocclicos sintticos que pueden
complejarse selectivamente con cationes, dado que los tomos de oxgeno de
la funcin ter son dadores de electrones. El principio de reconocimiento
molecular que permite la separacin enantiomrica est basado en la
formacin de mltiples puentes de hidrgeno entre los grupos amino primarios
protonados del analito y los oxgenos del ter. Los tomos de oxgeno pueden
ser reemplazados por tomos de nitrgeno o azufre para obtiener un aza o tio
ter corona. La produccin de teres corona pticamente activos unidos a
soportes silceos o polimricos dio lugar a FEQs capaces de separar
compuestos con funciones amino 57 prximas al centro estereognico, como
por ejemplo aminocidos y sus derivados, aminoalcoholes y aminas primarias.
Figura 1. 11. teres corona empleados en FEQs en LC.

A. (3,3-difenil-1,1-binanaftil)-20-corona-6 empleado como SQ en FEQs
constituidas por cubiertas mviles.
B. cido (18-corona-6-2,3,11,12)-tetracarboxlico usado para la preparacin de
FEQs con el SQ inmovilizado sobre el soporte.
FEQs tipo IV
Estas fases se basan en la formacin de complejos de coordinacin mediados
por un metal de transicin. Es un caso especial de intercambio inico que
involucra la formacin reversible de un complejo metlico por coordinacin del
soluto actuando como ligando del in metlico y el otro ligando lo constituye la
fase ligada, que generalmente es un aminocido 58. Los complejos de
coordinacin se forman cuando los ligandos tienen electrones libres que
pueden ser donados hacia la capa incompleta de orbitales d de metales de
transicin. La cromatografa lquida con intercambio de ligandos quirales (CILQ)
aprovecha la capacidad del Cu(II) y de otros cationes divalentes para formar
complejos diasteromricos reversibles con molculas quirales bidentadas,
especialmente aminocidos. La separacin quiral en CILQ se basa en la
18
diferencia de estabilidad de los adsorbatos formados entre el aminocido

inmovilizado, el catin divalente y los enantimeros del analito.
La primera separacin quiral con esta tcnica fue reportada por Davankov 59 en
1971, quien separ aminocidos fijando S-prolina a una resina y saturando la
fase mvil con iones Cu(II). Las eficiencias eran muy bajas, los tiempos de
anlisis muy largos y las fases mviles complejas (buffers acuosos conteniendo
una sal del ion Cu(II)).
Gbitz 60 logr una significativa mejora en la eficiencia fijando diversos
aminocidos mediante una cadena alqulica a un soporte de slice y saturando
el sistema con Cu(II). En esas condiciones logr separar aminocidos
racmicos con muy alta enantioselectividad (= 5-10). La Figura 1.12 muestra
un esquema de interaccin de los enantimeros de fenilalanina con estas
fases.
Figura 1.12. Modelo de interaccin de (A) S-fenilalanina y (B) R-fenilalanina con

un complejo de formado por Cu(II) y S-prolina unida al soporte slido.
En 1983, Karger 61, 62 mejor an ms la enantioselectividad rodeando la

cadena alqulica que inmoviliza al ligando con grupos n-butil o n-decil
ampliando as la aplicabilidad de estas FEQs.
FEQs tipo V
Esta es una de las FEQs ms atractivas para el anlisis de productos
farmacuticos. Involucra el uso de protenas como selectores quirales por lo
que su uso permite estudiar las interacciones entre protena y analito con
actividad biolgica. La fijacin de protenas de origen animal a la slice y a
soportes polimricos produce FEQs altamente selectivas aunque de muy baja
capacidad. El estudio y desarrollo de este tipo de fases se debe al trabajo del
19
grupo del Prof. Stig Allenmark de la Universidad de Gteborgs en Suecia. Las

primeras fases desarrolladas perdan reproducibilidad y se deterioraban
rpidamente. La eficiencia y selectividad de estas fases son muy sensibles a
cambios en el pH y concentracin del buffer (usualmente fosfato) usado en la
fase mvil y tambin al tipo y porcentaje de modificador orgnico que contenga,
dado que la presencia de solvente orgnico lleva a la desnaturalizacin de las
protenas. Un ejemplo de este tipo de fases es la albmina de suero bovino
(BSA), que es una protena globular con funciones de transporte plasmtico. Su
estructura tiene diferentes tipos de sitios de interaccin con sustratos inicos.
La fijacin covalente de esta protena a un soporte de slice dio lugar a
columnas quirales capaces de separar una amplia variedad de compuestos
aninicos y neutros conteniendo grupos aromticos. La orosomucoide es otra
protena globular de transporte del suero humano con capacidad para fijar
molculas catinicas. Esta FEQ de tipo V es una de las ms usadas
actualmente. Adems del inters analtico, tiene aplicacin en estudios clnicos
y farmacolgicos 63, 64.
Si bien el mecanismo de interaccin estereoselectiva entre las diversas
protenas y los racematos es complejo y no est del todo elucidado, las
interacciones hidrofbicas y electrostticas parecen ser las dominantes y en
menor medida contribuyen las interacciones por puentes de hidrgeno y las de
transferencia de carga.
En la tabla 1.4 se listan las protenas ms usualmente utilizadas en este tipo de
fases disponibles en columnas comerciales.
Tabla 1.4. Protenas usadas para FEQs tipo V.

Protena
Albmina de suero bovino
Orosomucoide
Ovomucoide
Albmina de suero humano
Pepsina
Celobiohidralosa I
Solutos mejor
separados
cidos
cidos/bases
cidos/bases
cidos
Bases
Bases
Referencia
65
66
67
68
69
70
FEQs constituidas por polmeros impresos (Molecular Imprinting

Polymers)
Esta es una nueva clase de FEQs formadas por polmeros sintticos
preparados en presencia de una molcula quiral enantiomricamente pura que
acta como matriz. La tcnica de impresin molecular se esquematiza en la
Figura 1.13 y puede describirse como sigue:
a) Los monmeros funcionalizados se mezclan con la molcula matriz
(enantimero R o S) en solucin para formar un complejo
20
b) El complejo en solucin se copolimeriza con exceso de reactivo de

entrecruzamiento para formar una red polimrica altamente
entrecruzada
c) La molcula quiral sobre la que se imprimi el polmero se elimina por
extraccin o por inversin de la reaccin de complejacin
d) El polmero as sintetizado puede usarse para rellenar una columna
cromatogrfica con alta especificidad hacia el enantimero matriz o
hacia molculas anlogas
Molcula
matriz
Complejacin
Monmeros
en solucin
Polimerizacin
Extraccin
Figura 1.13. Principio de impresin molecular de polmeros.
El origen del concepto de impresin molecular se encuentra en las teoras de

formacin de anticuerpos. En el organismo, los anticuerpos se forman en
respuesta a ciertos antgenos y la unin entre ambos es fuerte y especfica.
Este proceso inspir a varios grupos de investigacin y los primeros polmeros
preparados consistieron en la formacin de complejos covalentes entre la
molcula matriz y grupos funcionales sobre los que se induca la
polimerizacin. Posteriormente, con el objetivo de imitar el mecanismo de
reconocimiento enzima-sustrato, se introdujo una tcnica de impresin basada
en interacciones no covalentes 15, permitiendo as la introduccin de grupos
funcionales especficos en posiciones definidas del polmero que podran
interaccionar en forma no covalente con el sustrato. Con esta tcnica de
impresin no covalente se separ un gran nmero de racematos con altos
factores de separacin. La retencin y selectividad del polmero resultante est
controlada principalmente por:
21
a) El nmero, intensidad y disposicin espacial de las interacciones entre los

sitios y el sustrato.
b) La rigidez de los sustituyentes de la molcula matriz: una molcula ms
rgida originar polmeros con sitios de geometra ms definida.
c) El tamao y la forma de la molcula matriz.
Estos polmeros son fciles de preparar, son trmica y mecnicamente
estables y su especificidad depende del enantimero elegido como matriz. Los
altos factores de separacin obtenidos con estos materiales los hace
especialmente tiles en cromatografa preparativa, sin embargo su principal
desventaja es la baja eficiencia cromatogrfica de las columnas empaquetadas
con los mismos.
FEQs constituidas por antibiticos macrocclicos

Una nueva clase de FEQs est basada en antibiticos macrocclicos. Fue
introducida por Daniel Armstrong en 1994 67, como una fase muy verstil para
la separacin de una amplia variedad de enantimeros. Algunas de ellas son
comercializadas actualmente por la firma ASTEC.
La estructura comn presentada por estas fases se esquematiza en la Figura
1.14, en la que se observa la formacin de una cesta compuesta por la fusin
de los anillos macrocclicos que contienen uniones ter y uniones peptdicas y
dejan pendientes molculas de hidratos de carbono. Las caractersticas ms
importantes de estas estructuras se describen en la Tabla 1.5.
Tabla 1.5. Caractersticas estructurales de los glicopptidos macrocclicos

usados en FEQs.
Peso molecular
Macrociclos
Centros
estereognicos
Molculas de
azcar
Sustituyente Cl
Punto isoelctrico
Vancomicina
Teicoplanina
Ristocetina A
1449
3
1877
4
2066
4
18
2
23
3
38
6
1
7,2
1
4-6,5
0
7,5
La estructura y funcionalizacin de los macrociclos posibilitan una variedad de

interacciones (-, puentes de hidrgeno, dipolares, electrostticas, estricas y
de inclusin) con los analitos que les confiere a estos materiales capacidad de
reconocimiento quiral.
22
Estas FEQs son capaces de operar en LC con fases mviles correspondientes

al modo normal, al inverso y al polar orgnico. Dado que los macrociclos son
unidos mediante mltiples enlaces covalentes con el soporte silceo, estas
FEQs no se ven alteradas al cambiar las condiciones de la columna de un
modo a otro.
La capacidad enantioselectiva de estas fases es diferente en cada modo
cromatogrfico, debido a que los mecanismos de reconocimiento quiral tambin
lo son. Este comportamiento particular representa una ventaja de este tipo de
fases que consiste en aplicar el principio de separaciones complementarias
71, 72
para ampliar la cantidad y variedad de los analitos a resolver.
Figura 1.14. Estructura qumica de los antibiticos macrocclicos utilizados en

FEQs comerciales.
23
1.5. Objetivo general.

El objetivo perseguido en este trabajo de tesis fue el desarrollo de nuevos
mtodos de separacin y anlisis enantiomrico de compuestos quirales por
cromatografa lquida (HPLC). La estrategia consisti en realizar una
evaluacin preliminar de la capacidad enantioselectiva de molculas quirales
emplendolas como aditivos de la fase mvil. Se seleccionaron los alcaloides
naturales cinconidina y quinina. De acuerdo a la capacidad de
enantioresolucin observada hacia los solutos (principalmente aminocidos
nativos y derivatizados con diversos reactivos), se utilizaron estas molculas
para desarrollar nuevas FEQs por anclaje covalente de tales selectores a un
soporte silceo. Estos materiales, exhaustivamente caracterizados, qumica y
cromatogrficamente se emplearon en la resolucin de mezclas racmicas de
aminocidos.
Objetivos especficos.
Las metas especficas de este trabajo son las que siguen:
1. Evaluacin de la capacidad de discriminacin de aditivos quirales
provenientes de alcaloides naturales de la familia de las cinconas,
especficamente de quinina y de cinconidina. Algunos derivados de
alcaloides de cincona, principalmente carbamatos, ya han sido estudiados
en su potencialidad como selectores quirales en fase mvil normal 73 y en
fase estacionaria 74-76 por Wolfgang Lindner en la Universidad de Viena.
Dichas fases fueron el antecedente que ha inspirado el presente trabajo de
tesis.
2. Estudio del(los) mecanismo(s) involucrado(s) en el reconocimiento quiral de
aminocidos.
3. Desarrollo de fases estacionarias de tipo "Pirkle" por modificacin de la
superficie del soporte con el(los) selector(es) unidos covalentemente.
Evaluacin de la influencia de la fijacin sobre la capacidad enantioselectiva
del material resultante.
4. Estudio crtico de la influencia de distintas condiciones cromatogrficas
(solventes, pH, temperatura, fuerza inica) sobre la retencin y la
enantioseparacin. Optimizacin de la enantioresolucin de aminocidos.
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29
Captulo 2. Seccin Experimental.

2.1. Materiales.
2.1.1. Reactivos y solventes.
2.1.1.1. Adicin de selectores quirales en fase mvil.
Cinconidina (Fluka) 98%.
Quinina sulfato dihidrato (Baker).
Acetato cprico (Baker).

Los reactivos utilizados y el tratamiento realizado a algunos de los mismos,
previamente a la reaccin de sntesis, se detallan a continuacin.
Slice (Nucleosil, Macherey-Nagel). Se utilizaron partculas esfricas de
slice porosa de 5 m de dimetro con diferentes tamaos de poros como
material de partida de las reacciones de sntesis. Las propiedades fsicas de las
partculas usadas se indican en la Tabla 2.1.
El material se sec en estufa de vaco a 180C durante 4 horas para eliminar
totalmente el agua fsicamente adsorbida 1.
Tabla 2.1. Propiedades fsicas de las partculas de slice.

Slice
Nucleosil 100
Nucleosil 120
Tamao
Volumen
promedio de especfico
poros
de poros
100
1 ml/g
120
0,65 ml/g
rea
Superficial
(BET)
350 m2/g
200 m2/g
Densidad del
lecho
0,36 g/ml
0,55 g/ml
(3-mercaptopropil)-trimetoxisilano (Aldrich) 95%.

Tolueno (Mallinckrodt). Secado con CaCl2 anhidro y purificado mediante
destilacin fraccionada inmediatamente antes de usar.
Piridina anhidra (Aldrich) 99%. Se sec por calentamiento a reflujo
durante 18 horas en presencia de CaO calcinado y luego (previa remocin del
slido) se la destil con una columna fraccionadora para purificarla de sus
productos de oxidacin.
Cloroformo (Merck) pa. Purificado mediante destilacin fraccionada
inmediatamente antes de usar.
30
Cinconidina (Fluka) 98%.

Quinina anhidra (Fluka) 98%.
Azoisobutironitrilo (AIBN) 98% (Aldrich).
1-hexeno (Aldrich).
2.1.1.3. Empaque de las columnas.

Acetona (Anedra).
Alcohol isoproplico (Anedra).
2.1.1.4. Reaciones de derivatizacin de aminocidos.

Cloruro de dabsilo (Dbs- Cl) (Aldrich).
2,4-dinitrofluorbenceno 99% (Aldrich).
9-fluorenilmetilcloroformiato (FMOC-Cl) puro 98% (Fluka).
n-Heptano (Sintorgan) grado HPLC.
Borato de sodio (Baker).
Potasio cloruro (Anedra). Reactivo analtico.
Acido clorhdrico fumante para anlisis (Merck).
Sodio carbonato anhidro (Anedra). Reactivo analtico.
Aminocidos. En la tabla 2.2 se detalla la estructura, abreviatura
asignada, forma comercial, procedencia y valores de pKa en agua de cada uno
de los aminocidos usados.
Tabla 2.2. Estructura, abreviatura, forma comercial, procedencia y pKa de cada

uno de los aminocidos usados.
Aminocido
Estructura a
DL--Alanina
Abreviatura
Forma
comercial
(Marca)
pKa1
pKa2
pKa3
Ala
(BDH)
2,34
9,87
--
Abu
(BDH)
2,29
9,83
--
Asn
Clorhidrato
(Aldrich)
2,10
8,80
--
cido
DL-2-aminobutrico
OH
NH2
O
H2 N
DL-Asparagina
OH
O
N H2
31
Asp
cido DL-asprtico
NH
DL-Arginina
H2 N
(BDH)
1,99
3,90
9,90
1,82
8,99
12,5
1,50
8,70
10,2
2,13
4,31
9,64
1,80
6,04
9,33
O
N
H
Clorhidrato
(Aldrich)
OH
N H2
Arg
L-Arginina
Clorhidrato
(BDH)
DL-Cistena
Clorhidrato
(Aldrich)
Cys
Clorhidrato
(BDH)
L-Cistena
cido D-glutmico
Glu
cido L-glutmico
(Aldrich)
(BDH)
Clorhidrato
(Aldrich)
D-Histidina
His
Clorhidrato
(Aldrich)
L-Histidina
D-Leucina
Leu
(Aldrich)
(BDH)
2,33
9,74
--
DL-iso-Leucina b
Ile
(BDH)
2,32
9,76
--
DL-nor-Leucina
Nor
(BDH)
2,34
9,83
--
2,16
9,06
10,5
2,13
9,27
--
L-Leucina
Clorhidrato
(Aldrich)
DL-Lisina
Lys
Clorhidrato
(BDH)
L-Lisina
DL-Metionina
Met
(BDH)
32
DL-Ornitina
Orn
Clorhidrato
(BDH)
1,71
8,69
10,8
DL--Fenilalanina
Phe
(BDH)
2,20
9,31
--
Pro
(Aldrich)
(BDH)
1,95
10,6
--
DL-Serina
Ser
(BDH)
2,19
9,21
--
DL-Treonina c
Tre
(BDH)
2,09
9,10
--
DL-Triptofano
Tri
(BDH)
2,46
9,41
--
2,20
9,11
10,1
2,29
9,74
--
DL-Prolina
L-Prolina
OH
NH
(Fluka)
DL-Tirosina
Tyr
(BDH)
L-Tirosina
DL-Valina
Val
(BDH)
BDH: The British Drug Houses, LTD

a: las estructuras mostradas corresponden a los L-aminocidos
b: la estructura del L-enantimero corresponde a la configuracin (2S, 3S)
c: la estructura del L-enantimero corresponde a la configuracin (2S, 3R)
2.1.1.5. Fases mviles.

Diclorometano (Merck).
Acido actico glacial (Anedra). Reactivo analtico.
Hidrxido de amonio (Carlo Erba).
Metanol anhidro (Mallinckrodt).
Acetonitrilo (J.T. Baker).
Agua destilada purificada en un sistema Milli-Q, modelo Simplicity 185
(Millipore, USA)
33
Todas las fases mviles fueron filtradas empleando membranas de Nylon

(Osmonics- Magna) de 0,22 m para las fases orgnicas o de celulosa (Micron
Separations) de 0,45 m para las acuosas.
A continuacin se detalla el procedimiento seguido para la preparacin de las
diferentes fases mviles utilizadas.
La fase mvil utilizada cuando se trabaj en el modo polar orgnico de
cromatografa lquida fue una disolucin de la sal acetato de cinconidina de
concentracin 0,5 mM preparada a partir de una mezcla equimolar de
cinconidina y de cido actico glacial disuelta en una solucin formada por 95%
de metanol y 5% de acetonitrilo.
Para el modo normal de cromatografa lquida, se emple una fase mvil
constituida por una sal bsica de quinina de concentracin 0,35 mM preparada
por la disolucin de sulfato de quinina en hidrxido de sodio aproximadamente
0,05 M, que luego de ser filtrada se disolvi en diclorometano seco, al que
luego se le adicion agua en cantidad suficiente para obtener una
concentracin entre 70 y 80 ppm.
ii) Cromatografa lquida con intercambio de ligandos quirales (CILQ)
Debido al conocido efecto que tienen los solventes orgnicos sobre las
constantes de disociacin de cidos y bases dbiles 2, 3, en todos los casos se
midi el ws pH de la fase mvil en el solvente mezcla a temperatura ambiente
(pH aparente o
s
w pH
siguiendo la nomenclatura sugerida por IUPAC 4).
En este caso la fase mvil fue una mezcla formada por 20% de metanol y 80%
de una solucin reguladora de amonaco y acetato de amonio de concentracin
0,1 M y ws pH variable entre 6,40 y 9,00, con una concentracin 0,5 mM de
cinconidina y 0,5 mM de acetato de cobre (II) que se prepar como se describe
a continuacin. En un matraz aforado se disolvi en agua destilada Milli-Q la
cantidad de hidrxido de amonio necesaria para obtener la concentracin del
buffer (0,1 M) y se agreg la cantidad de cido actico glacial suficiente para
obtener el ws pH aproximado alrededor del cual se busca la accin reguladora de
la solucin. Se adicion un volumen de metanol igual al 20% del volumen del
matraz, tambin la cinconidina y el acetato de cobre (II) y agua destilada hasta
casi llegar al aforo del matraz. Se ajust el ws pH deseado con el agregado de
gotas de una solucin concentrada de cido o base fuertes homogeneizando la
mezcla luego de cada agregado y finalmente se enras el matraz con agua
destilada.
El ws pH se midi con un electrodo de membrana de vidrio combinado (Metrohm)
conectado a un pHmetro (Fisher Scientific, accumet AR 25 pH/mV/Ion/meter).
34
La calibracin del electrodo se realiz diariamente con soluciones buffers

certificadas comerciales (Fisher Scientific) de pHs 4,00 0,01; 7,00 0,01 y
10,00 0,02 a 25C.
Fases estacionarias quirales

Las fases mviles en este caso consistieron en una mezcla de 72% de metanol
y 28% de un buffer formado por amonaco y acetato de amonio de
concentracin y ws pH variables. La forma de preparacin es idntica a la
descripta para la fase mvil anterior (la diferencia es que en este caso no se
agreg selector quiral ni sal de Cu(II)).
2.1.2. Equipos.
2.1.2.1. Adicin de selectores quirales en fase mvil.
Se emplearon las columnas cromatogrficas comerciales que se detallan a
continuacin. Se indica, en cada caso, las caractersticas qumicas, su marca
comercial, dimensiones (longitud y dimetro interno) y dimetro promedio de
partculas.
Columna de carbn graftico poroso Hypercarb (Phenomenex), 100 x 3 mm; 5
m
Columna de octadecilslice Eclipse XDB-C18 (Agilent), 75 x 4,6 mm; 3,5 m
Columna de octadecilslice Zorbax SB-C18 (Agilent) 75 x 4,6 mm; 3,5 m
2.1.2.2. Sntesis de fases estacionarias quirales.

Para realizar la purificacin de los reactivos por destilacin fraccionada y para
todas las etapas de sntesis se utiliz el siguiente material de vidrio: balones,
columnas Vigreux de varias dimensiones, condensadores, ampollas y diversos
adaptadores, todos ellos con bocas y/o cierres provistos con juntas
esmeriladas.
2.1.2.3. Empaque de las columnas.

Se mont un sistema para rellenar columnas cromatogrficas Alltech modelo
1666 (Alltech, USA) consistente en una bomba impulsora tipo Haskel capaz de
amplificar presiones hasta 10000 psig que, alimentada por un tubo de aire
comprimido, suministra el solvente impulsor hacia un reservorio de acero
inoxidable (de 20 mL de capacidad con cierres capaces de soportar las
presiones desarrolladas) donde se coloca el material de relleno cromatogrfico
35
disperso en el solvente de suspensin (slurry). La suspensin es rpidamente

impulsada en sentido descendente hacia la columna.
Se rellenaron columnas para cromatografa lquida de acero inoxidable, de 50
mm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno con terminaciones provistas con
sendos filtros de dimetro de poros promedio de 2 m (Alltech).
Las eficiencias de todas las columnas, empaquetadas a 4000-5000 psi, fueron
medidas empleando una fase mvil de metanol/agua. Se inyectaron molculas
neutras (benceno, tolueno, uracilo y fenol) y se determin el nmero de platos
tericos promedio. Las columnas cuyas eficiencias fueron menores a 800
platos fueron empaquetadas nuevamente.
2.1.2.4. Reacciones de derivatizacin de aminocidos.

En todos los casos las reacciones de derivatizacin se realizaron en tubos
Eppendorf de 1,5 mL de volumen. Se utilizaron micropipetas Eppendorf de 20,
200 y 1000 L para tomar los reactivos y tambin material de vidrio graduado y
aforado (pipetas, matraces, etc.) para la preparacin de las soluciones de
reactivos y buffers.
En los casos en que fue necesario se utiliz tambin el siguiente instrumental:
Centrfuga Eppendorf 5417 C/R
Vortex Genie 2 (Scientific Industries, USA)
Bao termosttico (Instrumentos Alycar, Ind. Argentina)
2.1.2.5. Cromatografa.
Se usaron dos equipos de HPLC, cuyas caractersticas se describen a
continuacin.
Un cromatgrafo lquido HP 1100 (Agilent, USA) equipado con los siguientes
mdulos: degasificador por vaco, bomba binaria y detector UV de longitud de
onda variable a los que se acopla un inyector manual Rheodyne 7125. La
columna se coloc dentro de una camisa que permiti la circulacin de agua
desde un bao termosttico con regulacin de la temperatura con una precisin
de 0,1C. Todos los mdulos que componen el instrumento son operados a
partir de un panel de control y los datos son adquiridos mediante una interfase
conectada a una computadora con el programa CSW Data Apex (Data Apex,
Repblica Checa).
Un cromatgrafo lquido HP 1100 (Agilent, USA) modular consistente en:
degasificador por vaco, bomba binaria, inyector automtico, compartimiento de
termostatizacin mediante un sistema Peltier con capacidad de termostatizar
independientemente a dos columnas, detector de arreglo de diodos (DAD) y
detector de fluorescencia (FLD). Todos los mdulos conectados a una Agilent
ChemStation for LC Systems que permite operar y adquirir los datos.
36
En la ltima parte de este trabajo de tesis se realizaron experiencias de

cromatografa lquida bidimensional mediante el acoplamiento de una columna
aquiral para la separacin de los analitos quirales entre s, con las columnas
empaquetadas con FEQ para la separacin de sus respectivos enantimeros
(como se describir en el Captulo 3, seccin 3.3.8). Como ambas columnas
operaban en forma simultnea pero con fases mviles diferentes se incorpor
una segunda bomba binaria que fue tambin controlada desde la ChemStation
y un cartucho de octadecilslice colocado entre dos de los puertos de la vlvula
de seis vas del equipo. Esta vlvula, que permiti el acoplamiento entre los
dos sistemas cromatogrficos, consta de dos posiciones que pueden
configurarse de modo que en una de ellas, el eluyente de la primera columna
atraviese el cartucho hacia el desecho y que al ser girada a la otra de sus
posiciones, en un determinado tiempo en el que una fraccin seleccionada del
eluyente de la primera columna estuviese en el cartucho, esta fraccin fuera
reinyectada en la segunda columna. Un esquema de la misma, en ambas
posiciones se muestra en la Figura 2.1.
Figura 2.1. Configuracin de la vlvula inyectora.

a) Posicin de la vlvula con la columna 2 en stand-by. b) Posicin para la
inyeccin del contenido del cartucho en la columna 2.

quirales en fase mvil.
Se realizaron estudios de formacin de pares inicos empleando cinconidina en
forma de catin en una fase mvil no acuosa para la resolucin de cidos
carboxlicos racmicos. Tambin con este alcaloide y una sal de Cu(II) se
estudi la posible enantioseparacin de aminocidos en el modo CILQ.
37
Las fases mviles de ambos estudios se describieron en el punto 2.1.1.5 y las

columnas cromatogrficas en 2.1.2.1.
2.3. Sntesis de las fases estacionarias quirales.
Se realizaron varias reacciones de sntesis con el objetivo de fijar
qumicamente los selectores quirales (SQs) cinconidina (CD) y quinina (QN) a
un soporte constituido por partculas esfricas de slice porosa usualmente
utilizadas en cromatografa lquida de alta eficiencia. Las primeras reacciones
se desarrollaron segn el procedimiento descripto por el grupo de trabajo de
Wolfgang Lindner de la Universidad de Viena (Austria) en 1996 5. Este
protocolo consiste en una modificacin en cuanto a las proporciones de los
reactivos respecto del procedimiento desarrollado con anterioridad por el grupo
de Piero Salvadori en la Universidad de Pisa en 1985 6. Ambos grupos
coinciden en trabajar en condiciones estrictamente anhidras, de esta forma
(Modelo de sntesis 1 (MS1)) se obtuvieron FEQs basadas en CD y QN.
Luego se encontr en la literatura 7, 8 que es posible aumentar la reactividad de
los grupos silanoles de la superficie de la slice para la reaccin de fijacin de
alcoxisilanos mediante el agregado de un contenido controlado de agua,
suficiente para formar una monocapa de molculas en la superficie. Entonces,
en las reacciones de sntesis siguientes se mantuvo el procedimiento de las
primeras, pero se adicion un paso previo consistente en la activacin de la
slice a partir del agregado del volumen de agua necesario para obtener dicha
monocapa sobre la superficie. Con este segundo procedimiento (Modelo de
sntesis 2 (MS2)) se obtuvo una FEQ basada en QN.
El esquema de sntesis seguido es el siguiente:
Etapa 1: Sntesis de mercaptopropilslice
La obtencin de este derivado reactivo de la slice se realiz suspendiendo 3g
de slice en 75 mL de tolueno dentro de un baln de vidrio de 200 mL de
capacidad que posee dos bocas con juntas esmeriladas. En una de las bocas
se coloc un condensador para permitir el reflujo y en la otra boca, una ampolla
conteniendo una solucin de 5,10 mL de 3-mercaptopropiltrimetoxisilano
disuelto en 5,10 mL de piridina. El baln se coloc sobre una platina de
calentamiento con agitacin magntica. Luego de calentar la suspensin cerca
de su punto de ebullicin, se agreg la solucin de a gotas desde la ampolla,
controlando el goteo a 6 gotas/minuto. Durante la adicin del reactivo
silanizante se mantuvo la agitacin magntica y un burbujeo muy suave de N2
introducido desde un fino tubo de vidrio que sale lateralmente del condensador
y fue conectado a travs de un tubo de goma de silicona al cilindro de gas. La
mezcla de reaccin se mantuvo a reflujo, en las mismas condiciones durante
36 horas.
El slido obtenido se filtr y lav varias veces en forma sucesiva con porciones
de 5 mL cada una de tolueno, dietilter y n-hexano. Finalmente se sec en una
estufa de vaco.
El esquema de la Figura 2.2 representa la reaccin de silanizacin descripta.
38
Etapa previa: Activacin de la superficie de la slice (slo para MS2)

En un baln de vidrio se colocaron 75 mL de tolueno, se le agregaron 56,0 L
de agua destilada Milli-Q (concentracin de agua en tolueno de 750 ppm) y 3g
de slice. La suspensin se coloc en un bao de ultrasonido durante 20
minutos con el objeto de desalojar el aire del interior de los poros de la slice y,
simultneamente agitar la suspensin. A continuacin se burbuje N2 antes de
continuar con el procedimiento descripto en el prrafo precedente (Etapa 1).
El volumen de agua a agregar se calcul a partir del conocimiento del rea
superficial de la slice utilizada (informada por el fabricante) y considerando que
la concentracin superficial de oxhidrilos es de 8 moles/m2 aproximadamente
1
. As se obtuvo una cantidad de 151 L de agua necesaria para formar una
monocapa. Debido a la rpida reaccin de hidrlisis que sufren los
alcoxisilanos se decidi agregar un volumen de agua menor con el fin de
preservar la integridad el reactivo, considerando adems que los clculos
mencionados son aproximaciones que pueden tener errores significativos.
Etapa 2: Sntesis de la FEQ
Mediante un mecanismo de adicin radicalario (anti-Markovnikov) del grupo tiol
de la mercaptopropilslice al doble enlace del SQ (cinconidina y/o quinina), en
presencia de un iniciador de radicales libres, se forma un enlace tioter que fija
covalentemente el SQ al soporte (ver Figura 2.2).
En un baln de vidrio de 200 mL de volumen se suspendi el material obtenido
en la etapa anterior en 50 mL de cloroformo, se le agreg 1,2 mmoles del SQ
correspondiente y 55 mg de AIBN como fuente de radicales libres. La mezcla
se calent y se mantuvo a reflujo durante 35 horas con agitacin magntica y
pasaje de N2.
El slido obtenido se filtr y lav sucesivamente con porciones de 5 mL de
cloroformo, metanol, acetonitrilo, nuevamente metanol y dietilter y por ltimo
se sec sobre P2O5.
Etapa 3: Reaccin de recubrimiento final (end-capping)
Para disminuir la cantidad de grupos sulfhidrilo de la mercaptopropilsilice,
remanentes de la segunda etapa de sntesis, se realiza esta reaccin de
adicin con 1-hexeno.
En un baln de vidrio de 200 mL de capacidad se suspendi 1,75g de la FEQ
obtenida en 50 mL de cloroformo. Se agreg 100 mg de AIBN y 1 mL de 1hexeno. La mezcla se mantuvo a reflujo con agitacin y pasaje de N2 durante
15 horas.
El slido obtenido se filtr y lav sucesivamente con varias porciones de 5 mL
de cloroformo, metanol y dietilter. Finalmente se sec en una estufa de vaco.
39
Figura 2.2. Esquema de sntesis de las FEQs.
Etapa 1
Etapa 2
40
Etapa 3
El contenido de selector quiral y la eficiencia de end-capping de todas las

FEQs fue calculado a partir de un anlisis elemental (de C, H, N y S) sobre
cada uno de los materiales, realizado en el Departamento de Qumica Analtica
de la Universidad de Barcelona (Espaa) y en Laboratorio UMYMFOR,
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA.
2.4. Reacciones de derivatizacin de aminocidos.

Se obtuvieron tres derivados de los aminocidos citados en la Tabla 2.1
mediante las reacciones de derivatizacin del grupo amino que se describen a
continuacin:
Con cloruro de dabsilo (Dbs-Cl)
La reaccin entre el grupo amino en posicin alfa y el cloruro de 1-sulfonil 4-((4(dimetilamino)fenil)diazenil)benceno, ocurre en medio alcalino, segn el
esquema de la Figura 2.3.
El protocolo de derivatizacin utilizado se obtuvo del Handbook de
derivatizacin para HPLC 9 y es el que se detalla a continuacin: se tomaron
41
600 L de una solucin acuosa de cada aminocido (600 nmoles), se le

agregaron 300 L de buffer carbonato 50 mM de pH 8,90 y 300 L del reactivo
derivatizante Dbs-Cl disuelto en acetona (9,9 mg/ 3ml). Se agit en vortex 5
minutos y se dej reaccionar en un bao de agua a 70C durante 10 minutos.
Se centrifug a 5000 rpm 5 minutos.
Se confirm la presencia de los derivados inyectndolos en una columna de
octadecilslice con un gradiente de buffer (cido actico/acetato de sodio 0,1
M; pH= 4,70) y acetonitrilo en la fase mvil y reproduciendo las dems
condiciones que figuran en la referencia citada.
Para el anlisis quiral se inyect una alcuota de 20 L. La deteccin se realiz
a 436 nm.
Figura 2.3. Esquema de reaccin de Dbs-Cl con aminocidos
Con 2,4 dinitrofluorbenceno

Este agente derivatizante (reactivo de Sanger) es muy til para introducir un
grupo cromforo en grupos amino, fenol y tiol por sustitucin nucleoflica. El
esquema correspondiente a la reaccin con un grupo amino primario (del
aminocido) se representa en la Figura 2.4.
Se probaron varios protocolos, que usaban diferentes soluciones buffer y
proporciones de los reactivos, con resultados poco auspiciosos. Finalmente
siguiendo el procedimiento dado por Paraskevas para derivatizar lisinopril 10 se
obtuvieron los dinitrofenil derivados en forma reproducible y cuantitativa.
Siguiendo este protocolo, adems, la presencia de 2,4-dinitrofenol, producto
secundario de la reaccin, es prcticamente indetectable en el cromatograma.
El procedimiento detallado para esta reaccin es el siguiente: se tomaron 185
L de una solucin acuosa de cada aminocido (entre 2 y 5 mg/mL) se le
agregaron 185 L de buffer borato 0,050 M de pH 8,30 conteniendo KCl 0,050
M; 70 L del reactivo derivatizante disuelto en acetonitrilo (0,032 M) y 735 L
adicionales de acetonitrilo. Se dej reaccionar en un bao de agua a 60C
42
durante 45 minutos. Luego se dej enfriar y se agreg HCl 1M hasta decolorar

(50 L aproximadamente) la solucin.
Se verific la obtencin de los derivados inyectndolos en una columna de
octadecilslice, empleando un gradiente de metanol y buffer en la fase mvil 11.
Se diluy a la mitad con acetonitrilo y se inyectaron volmenes entre 5 y 25 L
segn el aminocido. La deteccin se realiz a 365 nm.
Figura 2.4. Esquema de reaccin de 2,4-dinitrofluorbenceno con aminocidos.
Con 9- fluorenilmetilcloroformiato (FMOC-Cl)

Este agente derivatizante reacciona a temperatura ambiente rpida y
cuantitativamente con grupos amino primarios y secundarios dando
carbamatos estables que pueden detectarse por fluorescencia o absorcin en
la regin UV. El rendimiento de la derivatizacin es sensible al pH de la mezcla
de reaccin.
El esquema de la reaccin con un aminocido de estructura genrica se
muestra en la Figura 2.5.
Figura 2.5. Esquema de reaccin de FMOC-Cl con aminocidos.
43
Se ensayaron varios protocolos y el que permiti reproducir los resultados fue

una modificacin del utilizado por Einarsson 12. Los detalles se describen a
continuacin. Se tomaron 400 L de una solucin acuosa de cada aminocido
(3 mg/mL aproximadamente), se agregaron 100 L de buffer borato 0,2 M de
pH 7,70 y 500 L del reactivo derivatizante FMOC-Cl disuelto en acetona (15
mM). Se agit durante 40 segundos e inmediatamente se realizaron 4
extracciones con 0,5 mL de n-heptano cada una, que se desecharon.
Se corrobor la obtencin de los derivados por cromatografa lquida
empleando una columna de octadecilslice con una fase mvil de metanol y
buffer 9.
Se diluy 250 veces con acetonitrilo y se inyect 1 L. La deteccin se realiz
por fluorescencia con longitudes de onda de excitacin y emisin de 260 y 310
nm respectivamente.
Todos los derivados fueron filtrados a travs de membranas de 0,22 m antes
de ser inyectados en el cromatogrfo.
2.5. Cromatografa.
Adicin de selectores quirales en la fase mvil
Se realiz la adsorcin del SQ siguiendo la curva de ruptura (breakthrough
curve) esto es, haciendo circular la fase mvil conteniendo una dada
concentracin de SQ (ver 2.1.1.5) por una columna de carbn graftico hasta
que se observ un salto abrupto en la seal de la lnea de base registrada por
el detector a 254 nm. El ascenso de la seal es debido a que el SQ ya no es
retenido dentro de la columna por lo que, a partir de este momento, se
consider que la fase estacionaria est saturada con el SQ. En estas
condiciones se cromatografiaron varios profenos y otros cidos carboxlicos
quirales, a un caudal de 1mL/min, y a temperatura ambiente.
ii) Cromatografa lquida con intercambio de ligandos quirales

Se realizaron corridas cromatogrficas de aminocidos nativos, dabsilados y
dinitrofenilderivados en columnas aquirales convencionales (octadecilslice) con
las fases mviles conteniendo al SQ y una sal de Cu(II) (ver punto 2.1.1.5). En
todos los casos, previamente a la inyeccin de los analitos se satur el soporte
con el SQ a partir del pasaje de fase mvil a travs de la columna hasta
saturarla tal como se seal en el inciso anterior.
Se estudi la selectividad del sistema con fases mviles conteniendo 0; 5; 10 y
20% de metanol a un ws pH fijo (8,60) y luego, para un contenido fijo de metanol
44
de 5% se estudiaron la retencin y enantioselectividad a los

8,60 y 9,00.
s
w pH s
6,40; 7,40;
FEQs
i) Cinconidina (FEQ-CD)
Se cromatografiaron aminocidos nativos, sus derivados dabsilados y sus
dinitrofenilderivados con fases mviles consistentes en diversos gradientes:
metanol/buffer,
metanol/agua,
acetonitrilo/buffer,
acetonitrilo/agua
y
metanol/acetonitrilo, en algunos casos conteniendo Cu(II).
ii) Quinina (FEQ-QN)
Se cromatografiaron los derivados de aminocidos ya mencionados en las
columnas empaquetadas con las FEQs obtenidas y con fases mviles
correspondientes al modo inverso de cromatografa lquida (RPLC)
consistentes en mezclas hidroorgnicas, generalmente metanol/buffer. Las
composiciones de las mezclas variaron en los distintos experimentos de
optimizacin. En general esta composicin fue de 72% de metanol y 28% de un
buffer de ws pH adecuado.
Se estudi sistemticamente el efecto de las siguientes variables de la fase
mvil sobre la retencin y enantioselectividad de los analitos:
1) variacin del porcentaje de modificador
composiciones de 72, 64 y 56% de metanol.
2) variacin del
(72%) se trabaj
s
w pH de la fase mvil: para una
a ws pH s 5,00; 5,50; 6,00 y 7,00.
orgnico:
se
estudiaron
composicin fija de metanol
3) variacin de la concentracin de la sal del buffer constituyente de la fase

mvil: 0,05; 0,10 y 0,15 M.
4) cambio del modificador orgnico: sustitucin de metanol por acetonitrilo.
5) adems se trabaj a diferentes temperaturas (10, 20, 30 y 40C) para una
composicin fija de metanol y para cada condicin de ws pH de la fase mvil.
En todos los casos se determin el tiempo muerto de las diversas columnas

mediante la inyeccin de una solucin acuosa de KBr con deteccin a 230 nm.
45
Bibliografa.
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46
Captulo 3. Resultados y discusin.

Los alcaloides de cincona son productos naturales conocidos por su eficacia
teraputica, especialmente contra la malaria. Poseen numerosas aplicaciones; una
de las ms importantes reside en su particular estructura que les confiere
capacidad para inducir asimetra en variadas reacciones de sntesis. Numerosos
trabajos de revisin han discutido en detalle el uso de estos alcaloides en catlisis
quiral homognea y heterognea 1, 2.
Tambin en cromatografa, se propuso tempranamente el uso de estos alcaloides
como mediadores en separaciones quirales 3-5. Wolfgang Lindner y sus
colaboradores estudiaron exhaustivamente varios alcaloides derivados de cincona,
principalmente carbamatos obtenidos por la derivatizacin del grupo oxhidrilo del
C9, como fases estacionarias quirales en modo de intercambio inico 6-10 y dos de
estas columnas son comercializadas por Chiral Technologies, Inc..
En este captulo se describen con detalle los antecedentes respecto del uso de
estos alcaloides en distintas formas de cromatografa quiral, y se discuten junto a los
resultados obtenidos a lo largo de este trabajo de tesis.
3.1. Estructura de los alcaloides de la familia de las cinconas.

La estructura general de estos alcaloides se caracteriza por tener un sistema de dos
anillos, uno de ellos aromtico de quinolena conectado a un biciclo aliftico de
quinuclidina a travs de un puente de -CH(OH)-, creando una funcin
hidroxilamina adyacente a la molcula aromtica. Unl sustituyente vinilo aparece en
el C3 del anillo quinuclidnico. En la Figura 3.1 se muestran las estructuras de cuatro
de los alcaloides pertenecientes a esta familia.
Estos alcaloides contienen 5 centros estereognicos: N1, C3, C4, C8 y C9, cuya
configuracin absoluta es S, R y S respectivamente, para los tres primeros centros
en todos los alcaloides naturales pertenecientes a esta familia y son variables las de
C8 y C9. El nmero total de estereoismeros es de 16 (y no de 25) debido a que las
configuraciones absolutas de los centros de N1 y de C4 del sistema bicclico son
interdependientes.
Quinina y quinidina son diastermeros entre s, y tambin lo son cinconina y
cinconidina. En la Tabla 3.1 se muestran las configuraciones absolutas y el
sustituyente presente en el C6 del anillo de quinolena para cada uno.
47
10
3
(R)
3
N1
(R)
8 (S)
H
O
6'
8 (R)
OH
(S)
( R)
N1
OH
(S)
(S)
6'
4'
Quinina
Quinidina
3
(R)
N1
(R)
8 (S)
H
8 (R)
OH
(S)
(R)
N1
OH
(S)
(S)
Cinconidina
Cinconina
Figura 3.1. Estructura de las molculas de quinina, quinidina, cinconidina y

cinconina.
Tabla 3.1. Estructura y propiedades cido-base de los alcaloides citados.

Molcula
Quinina
Cinconidina
Quinidina
Cinconina
Sustituyente
en C6
OCH3
H
OCH3
H
Configuracin absoluta
1S, 3R,4S, 8S, 9R
1S, 3R,4S, 8S, 9R
1S, 3R,4S, 8R, 9S
1S, 3R,4S, 8R, 9S
pKa1a
4,13
5,80
5,40
5,85
pKa2a
8,52
10,03
10,0
9,92
a: CRC Handbook of Chemistry and Physics, Internet Version, 2005.
La complejidad estructural de estas molculas determina que puede haber rotacin

alrededor de los siguientes enlaces simples:
48
1) Las ms importantes son alrededor de los enlaces simples C4-C9 y C9-C8

que son los que conectan los dos anillos de la molcula y son las que
determinan las principales conformaciones de la misma.
2) Tambin son importantes conformacionalmente las producidas alrededor del
enlace C9-O9 dado que permiten la posibilidad de enlace de hidrgeno
intramolecular entre el nitrgeno quinuclidnico N1 y el grupo oxhidrilo en el
C9.
3) Los sustituyentes vinilo y metoxi tambin pueden rotar libremente alrededor
de los enlaces C3-C10 y C6-O6, respectivamente. Adems hay rotacin
alrededor del enlace O6-CH3 en el sustituyente metoxi.
Estudios combinados de RMN, rayos X y clculos computacionales acerca de las
conformaciones que adoptan las molculas de estos alcaloides mostraron que la
conformacin de menor energa (anti-cerrada-) es la misma para quinina y
quinidina y cinconidina y sta no admite la formacin de puente de hidrgeno
intramolecular entre N1 y O9 11-14. En esta conformacin, el enlace C9-C8 est
aproximadamente en ngulo recto con el anillo quinolnico, el grupo OH se
direcciona hacia el H1 (unido al C3 del anillo de quinolena), y los enlaces C4-C9 y
C8-N1 se hallan prcticamente alineados. A esta conformacin preferencial se le ha
denominado Open(3).
En la Tabla 3.1 tambin se informan los valores de pKa1 y pKa2 de estos alcaloides
en agua a 25C correspondientes a la separacin del hidrgeno del N quinolnico y
del quinuclidnico, respectivamente.
3.2. Estudio de los alcaloides cinconidina y quinina como aditivos quirales en

fase mvil.
3.2.1. Formacin de pares inicos.
En el anlisis enantiomrico por cromatografa lquida, adems del uso de FEQs, es
posible agregar aditivos quirales a la fase mvil con el fin de promover la separacin
de enantimeros empleando columnas de HPLC con fases estacionarias no
quirales. Esta misma estrategia es la que se emplea en la separacin enantiomrica
de mezclas racmicas por electroforesis capilar 15, 16. Fueron varios los aditivos que
han sido propuestos en la bibliografa. Entre ellos, se ha descripto la resolucin de
ismeros pticos mediante el uso de quelatos metlicos quirales, protenas,
ciclodextrinas y sus derivados, antibiticos macrocclicos, teres corona pticamente
activos, y tambin contraiones quirales 17.
La cromatografa quiral por formacin de pares inicos empleando contraiones
enantiomricamente puros fue reportada por primera vez hacia fines de la dcada
de 1970. Yoneda 18 us contraiones quirales disueltos en fases mviles acuosas
para la resolucin de complejos metlicos pticamente activos. Knox y Jurand
usaron una sal interna o zwitterion quiral (L-leucil-L-leucil-L-leucina) en un buffer
de fosfato para resolver los enantimeros de triptofano y glicilfenilalanina 19. El
49
mecanismo de enantioreconomiento propuesto en este tipo de cromatografa lquida

quiral se atribuye a una complejacin estereoselectiva (formacin del par inico)
entre el contrain quiral presente en la fase mvil y cada uno de los iones
enantiomricos del analito. Estas reacciones de complejacin tienen distinta
constante de asociacin. Estos complejos diastermeros (pares inicos) formados
en la fase mvil podrn tambin, eventualmente, presentar una distribucin selectiva
entre la fase mvil y la fase estacionaria no quiral 20.
Cuando un cido (compuesto dador de protones) y una base (compuesto aceptor de
protones) reaccionan en un solvente aprtico de baja polaridad pueden formar un
par inico interaccionando por atraccin electrosttica y/o formacin de puentes de
hidrgeno entre sus componentes. La ausencia de un solvente polar que compita
por las interacciones electrostticas con alguno de los componentes, incrementa la
energa de interaccin entre los componentes del par. Por esta razn es que
primero se intentaron varias opciones de separaciones en el modo normal de
cromatografa lquida utilizando fases estacionarias (adsorbentes) consistentes en
slice modificada (funcionalizada). Las fases mviles consistieron en solventes
orgnicos de baja polaridad a los que previamente se les elimin el agua disuelta
empleando tamices moleculares con el objeto de minimizar la adsorcin de agua
sobre los soportes polares, modificando as las propiedades adsorbentes de las
fases. Eventualmente se ha agregado tambin al eluyente un modificador orgnico
en baja proporcin con el fin de regular la retencin.
Pettersson y Schill 21 separaron algunos aminoalcoholes racmicos (propranolol,
oxprenolol, alprenolol y metoprolol) empleando columnas de slice con funciones
diol, ciano, nitro y etilo y con cido (+)-10-canforsulfnico como contrain quiral
disuelto en diclorometano con 0,5% de 1-pentanol. Los
valores de
enantioselectividad obtenidos por los autores variaron entre 1,06 y 1,11. El estudio
de la estabilidad y reproducibilidad de este sistema cromatogrfico mostr que tanto
la retencin como la enantioselectividad de los solutos fueron muy sensibles al
contenido de agua de la fase mvil. Con diclorometano seco (menos de 30 ppm de
agua) la retencin disminuye en forma constante durante los 2-4 das necesarios
para la estabilizacin del sistema. Desde un punto de vista prctico, el tiempo de
estabilizacin reportado por los autores hace inviable al mtodo.
En un trabajo posterior, Pettersson y No 22 emplearon quinina en forma de acetato
disuelta en diclorometano conteniendo entre 0,5 y 1% de 1-pentanol y usando como
adsorbente slice con funciones diol para la separacin de enantimeros de cidos
carboxlicos y sulfnicos. Se informaron enantioselectividades entre 1,30 y 1,50.
Sobre este sistema se estudi posteriormente el efecto de diversas variables que
inciden sobre la retencin y estereoselectividad (anin de la sal de quinina,
componentes de la fase mvil, funcionalizacin del adsorbente, estabilidad y
reproducibilidad del sistema cromatogrfico y estructura del contrain quiral y de los
analitos). Del completo estudio que realizaron estos autores, se concluy que
utilizando una fase mvil conteniendo 80 ppm de agua las condiciones
cromatogrficas se estabilizan en menos de una hora y que no hay diferencias
significativas en la retencin durante el tiempo que dura el estudio. Los
cromatogramas mostrados en los trabajos hasta aqu citados muestran picos que, si
bien alcanzan buena resolucin, presentan lneas de base ruidosas y con deriva y
muchos picos de sistema, caractersticas que dificultan las condiciones de
50
integracin de los picos en el caso en que se necesite obtener las cantidades

relativas de cada enantimero.
En el ao 1991 se introdujo comercialmente 23 un nuevo soporte inorgnico, el
carbn graftico poroso (PGC). Entre sus ventajas se encuentra que es
extremadamente estable frente a altas concentraciones de cidos y bases
(concentraciones superiores a 10 M) y a altas temperaturas y, si bien su superficie
no puede funcionalizarse por reaccin qumica, pueden adsorberse fuertemente
molculas de moderado a alto peso molecular 24. Muchas separaciones de ismeros
geomtricos que son difciles y/o imposibles sobre fases convencionales de slice
ligada pueden realizarse exitosamente sobre PGC 24. Adems, esta fase es
fuertemente hidrofbica y su superficie rgida y plana, consistente en capas de
tomos de carbono de estructura hexagonal, brinda una alternativa a las fases
usadas en cromatografa en modo inverso con la ventaja de la homogeneidad de
todos los sitios de adsorcin de su superficie 25. En consecuencia la retencin y
selectividad de los solutos sobre esta fase debera ser menos sensible a diferencias
en el contenido de agua de los solventes de la fase mvil. Sobre este soporte se
separaron enantimeros de cidos carboxlicos (algunos ejemplos son ibuprofeno,
ketoprofeno, naproxeno, cidos canforsulfnico y trpico y diversos derivados de los
cidos propinico y actico) con altos valores de enantioselectividad usando
quinina como contrain en una fase mvil de diclorometano con 50% de hexano
conteniendo adems concentraciones equimolares de un cido carboxlico. La
retencin y enantioselectividad se regul modificando la concentracin de quinina y
tambin por el agregado de un modificador orgnico polar (metanol y 2-propanol) 26.
Karlsson y Pettersson 27 compararon la separacin quiral de aminas usando
columnas rellenas con PGC y con slice funcionalizada con grupos diol utilizando Nbenzoxicarbonil-glicil-L-prolina (L-ZGP) como contrain quiral disuelto en
diclorometano (con 30-500 ppm de agua). Si bien la enantioselectividad y simetra
de los picos obtenidos dependi de la estructura de cada analito, la mayor ventaja
que present la fase de PGC en comparacin con la de slice es que el tiempo en
que se alcanza el equilibrio del sistema cromatogrfico fue mucho menor (menos de
15 volmenes de columna contra los 300 necesarios en la columna de diol). De
acuerdo con los autores, la enantioselectividad obtenida para este sistema en
diclorometano saturado en agua sugiri la posibilidad de reconocimiento quiral en
las fases mviles polares que se emplean en el modo inverso de cromatografa
lquida. Cuando emplearon L-ZGP disuelto en metanol con 5% de agua y la columna
de PGC lograron la separacin de aminas poliaromticas con una
enantioselectividad que oscil entre 1,06 y 1,25 27. Tambin sobre este soporte se
separaron cidos, steres y aminoalcoholes de cierta hidrofobicidad con el contrain
quiral (2R,3R)-diciclohexiltartrato (DCHT) disuelto en un buffer fosfato de pH= 3.
Esta es una alternativa al uso de FEQs ya que en este caso, el el contrain DCHT
se encuentra adsorbido dinmicamente en forma de monocapa sobre la superficie
del soporte 28.
Compuestos bsicos de inters biolgico como son anestsicos locales,
neurolpticos y -bloqueantes 29 fueron separados con PGC y cido (-)-2,3: 4,6- diO-isopropiliden-2-ceto-L-gulnico ((-)-DIKGA) en fases mviles polares. Con una
fase de 20% de buffer acetato (pH= 4,7) y 80% de metanol se separaron
enantimeros con enantioselectividades entre 1,06 y 1,29 y con otra 5 mM NaOH en
51
2-propanol con 10% de acetonitrilo se separ otro grupo de compuestos con

enantioselectividades entre 1,20 y 1,53.
A partir de estos relativamente numerosos antecedentes, se intent reproducir las
condiciones de separacin utilizadas por el grupo de trabajo citado utilizando la
columna de carbn graftico (PGC) debido a las ventajas mencionadas respecto de
los soportes silceos. En nuestro estudio se eligi como selector quiral cinconidina
como formador de pares inicos en fase mvil dado que este alcaloide an no haba
sido utilizado. Se cromatografiaron cidos dbiles quirales de la familia de los
profenos (ibuprofeno, ketoprofeno, suprofeno e indoprofeno), norfloxacina y
ofloxacina y los cidos quirales canforsulfnico, mandlico y fenilsuccnico con fases
mviles consistentes en diversos solventes: diclorometano, diclorometano
previamente secado en tamiz molecular y mezclas acetonitrilo/metanol todos
conteniendo cinconidina en forma de sal (acetato) en concentracin 0,5 mM. La
temperatura de la columna se mantuvo a 25C y la deteccin UV se realiz a 254
nm. En ninguna de las experiencias realizadas, en las que se estudiaron varias
condiciones cromatogrficas, fue posible la resolucin de los enantimeros hasta la
lnea de base.
Debido a los resultados negativos obtenidos con el mencionado alcaloide se decidi
emular el sistema cromatogrfico descripto en la bibliografa, utilizando ahora
quinina como contrain quiral en la fase mvil. Se cromatografiaron los mismos
analitos en las condiciones de fase mvil ya descriptas para cinconidina y tampoco
pudieron reproducirse las enantioselectividades experimentales obtenidas por el
grupo de investigacin de Karlsson y Pettersson. Dados todos los fracasos
obtenidos con esta metodologa, se decidi poner fin a los ensayos de separacin
por formacin de pares inicos.
3.2.2. Cromatografa lquida con intercambio de ligandos quirales.

La tcnica de cromatografa por intercambio de ligandos quirales (CILQ) introducida
a principios de 1970 por Davankov y Rogozhin 30 fue la primera tcnica de
cromatografa lquida exitosamente empleada en la separacin de ismeros pticos
de aminocidos y de otros solutos capaces de formar compuestos de coordinacin
con iones metlicos (-hidroxicidos, -aminoalcoholes, etc.).
El mecanismo de reconocimiento quiral est basado en la formacin de complejos
ternarios lbiles entre los enantimeros del analito, un catin metlico divalente de
transicin y el selector quiral y an pequeas diferencias en la estabilidad de
complejos formados por los dos enantimeros puede llevar a su
enantiodiscriminacin. Estos equilibrios de coordinacin pueden ocurrir en la fase
mvil o en la estacionaria. Los selectores quirales ms ampliamente estudiados y
utilizados con xito han sido los aminocidos y sus derivados N-sustituidos.
La combinacin de una columna aquiral convencional con un eluyente conteniendo
un aditivo quiral para CILQ fue primeramente desarrollada Karger y colaboradores 31
quienes usaron triaminas quirales en presencia de Zn(II) y de otros cationes
metlicos de transicin para separar dansil aminocidos racmicos en una columna
52
de octilslice, obteniendo valores de enantioselectividad tan altos como 2 y hasta 2,5

para aminocidos con grupos polares adicionales.
Gil-Av y sus colaboradores 32, 33 tambin reportaron la separacin de los
enantimeros de aminocidos a partir de la formacin de complejos ternarios con
Cu(II) y uno de los enantimeros de prolina, para los que obtuvieron valores de
enantioselectividad entre 2 y 4. Tambin con este tipo de complejo formado en fase
mvil se logr separar dansil derivados de aminocidos con selectividades entre
1,10 y 1,90 34.
Los selectores quirales tambin pueden ser parte constituyente de la fase
estacionaria ya sea ligados covalentemente 35 o adsorbidos en forma hidrofbica al
soporte no quiral. En el primero de los casos se us un derivado de L-histidina para
separar los enantimeros de aminocidos complejndolos con Cu(II) 36, alcanzando
valores de enantioselectividad de hasta 2. Muy buena resolucin quiral de varios
aminocidos se obtuvo con el complejo formado por Cu(II) y (S)-N,Ncarboximetilundecil-leucinol utilizando tanto fases mviles totalmente acuosas como
mezclas hidroorgnicas 37.
Debido a las interacciones hidrofbicas entre grupos hidrfobos de los ligandos que
actan como selectores quirales y la superficie de la octadecilslice se desarrollaron
varias FEQs dinmicamente adsorbidas sobre el soporte. La ventaja de las
columnas preparadas con estas fases es que se puede disponer de ellas de forma
rpida y econmica ya que se preparan in situ haciendo circular a travs de la
columna una solucin conteniendo el selector quiral en forma de complejo con el
metal de transicin. Se trata de una estrategia muy verstil dado que se puede
cambiar el selector quiral fcilmente segn las caractersticas de los enantimeros a
separar. La enantioselectividad del sistema cromatogrfico depende del cubrimiento
superficial de SQ, del tipo de molcula utilizada, de la concentracin del catin
metlico y de la presencia de otros modificadores que puedan estar presentes en la
fase mvil 38, 39. Entre los SQs utilizados en este tipo de FEQs se encuentra N-ndecil-L-histidina cuyo complejo con Cu(II) se utiliz para separar racematos de
aminocidos nativos para los que se obtuvieron enantioselectividades menores a
1,60. Los autores tambin estudiaron los parmetros experimentales que inciden
sobre la eficiencia, la retencin y la selectividad de la columna 40, 41. Otro grupo de
investigacin utiliz un derivado de D-penincilamina y un derivado de cido (R,R)tartrico ambos complejados con Cu(II) para la separacin directa de cidos
carboxlicos y aminas quirales 42 alcanzando enantioselectividades entre 1,06 y
2,61. Algunos de los SQs adsorbidos en forma hidrofbica sobre soportes de
octadecilslice
que se emplearon exitosamente para separar aminocidos
racmicos todos ellos formando complejos con el catin Cu(II) son: derivados Nsustituidos de S-fenilglicinol 43, sal monosdica de S-N,N-carboximetildodecilleucinol 44, teres corona quirales 45 y L-acilcarnitinas 46, entre otros.
A partir de los antecedentes hasta aqu mencionados y el concepto bsico de que
para la aplicacin de la CILQ los ligandos deben ser capaces de formar complejos
con el catin metlico en cuestin a travs de la donacin de pares electrnicos
libres de los mismos hacia los orbitales parcialmente vacantes del metal, se pens
que podra ser factible la formacin de estos complejos entre ciertos alcaloides
naturales y el in Cu(II). Debido a la estructura de los alcaloides de la familia de las
53
cinconas, en la que un grupo oxhidrilo y un amino terciario se disponen en dos

carbonos adyacentes, se postul que podran formarse complejos bivalentes con
cationes de transicin como el Cu(II). La Figura 3.2 muestra la estructura postulada
para los complejos entre cinconidina, el metal Cu(II) y ambas formas enantiomricas
de un aminocido genrico.
O
R
O
HN Cu N
O
CD-Cu(II)-D-aa
CD-Cu(II)-L-aa
Figura 3.2. Estructura de los complejos ternarios formados entre CD, Cu(II) y D o Laas.
La diferencia en las estructuras tridimensionales de ambos complejos podra dar

lugar a la enantioseparacin. Como se discuti en la introduccin las posibilidades
son: distintas constantes de complejacin entre D y L y/o distintas constantes de
particin del complejo diastermero con la superficie hidrofbica.
Si bien no se hallaron referencias bibliogrficas que indicaran la formacin de un
complejo de coordinacin entre el Cu(II), un aminocido y quinina, existan
antecedentes sobre la formacin de complejos metlicos de Cu(II) y quinina, en la
que estas sustancias fueron incorporadas a un electrodo de pasta de carbono y el
mismo se utiliz para la determinacin del ion ioduro 47. Tambin se describe en la
literatura la extraccin lquido-lquido de cinconas por formacin de complejos
mixtos mediados por alguno de los metales divalentes Cu(II), Co(II) y Zn(II) con
cido snico (pticamente activo) 48.
Bajo la hiptesis de formacin de un complejo como el de la Figura 3.2, se evalu
un sistema compuesto por una fase mvil conteniendo cantidades equimolares del
in Cu(II) y el alcaloide cinconidina en una solucin hidroorgnica regulada a ws pH = 8
y una columna aquiral tpica (octadecilslice) para ser empleadao en la
enantioseparacin de aminocidos, en el modo de cromatografa de intercambio de
ligandos quirales (CILQ). Se cromatografiaron aminocidos nativos as como sus
dabsil (Dbs-aas) y dinitrofnil (DNP-aas) derivados. Se analiz la influencia de
distintas variables de la fase mvil sobre la retencin y enantioseparacin como ws pH
(se relizaron medidas a 6,40; 7,40; 8,50 y 9,00) y porcentaje de modificador
orgnico (en el rango de 0 a 20% de metanol) agregado con el objetivo de optimizar
la retencin y enantioresolucin de las mezclas racmicas. Tambin se estudi el
efecto de la sustitucin de metanol por acetonitrilo como modificador orgnico.
54
3.2.2.1. Resultados cromatogrficos obtenidos con el modo CILQ.

Empleando una fase mvil de ws pH =8,58 constituida por 80% de buffer de
concentracin 0,1 M y 20% de metanol conteniendo 0,5 mM CD y 0,5 mM Cu(II) se
logr la separacin de los enantimeros de fenilalanina (Phe) y de triptofano (Tri) sin
derivatizar con enantioselectividades de 1,51 y 1,15 respectivamente en una
columna de octadecilslice. Los cromatogramas correspondientes a ambas
separaciones se muestran en las Figuras 3.3 y 3.4. Los aminocidos valina (Val),
prolina (Pro) y metionina (Met) no pudieron ser separados en estas condiciones
dado que presentaron un tiempo de retencin cercano al tiempo muerto de la
columna, esto es, su retencin fue casi nula debido al carcter altamente hidroflico
de los mismos.
Figura 3.3. Cromatograma de Phe.

Condiciones: fase mvil 20% MeOH, 80% buffer ws pH =8,60 con 0,5 mM CuAc2 y 0,5
mM CD. Caudal 1mL/min; temperatura ambiente; deteccin a 254 nm.
Figura 3.4. Cromatograma de Tri. Obtenido en iguales condiciones cromatogrficas

que el cromatograma anterior.
55
Debido a la escasa retencin observada para algunos analitos, se busc aumentar

la hidrofobicidad de la fase mvil modificando su contenido de metanol. En la Tabla
3.2 se muestran los valores de factor de retencin (k), de enantioselectividad () y
de enantioresolucin (Rs) obtenidos en cada caso.
Tabla 3.2. Efecto de la variacin del contenido de MeOH sobre la retencin,

enantioselectividad y enantioresolucin de aminocidos. Fase mvil de ws pH entre
8,50 y 8,60 con 0,5 mM CD y 0,5 mM Cu(II).
Aminocido
Met
Phe
Pro
Tri
Nor
Val
Ile
Tre
Ser
n.r.: no retenido
10% MeOH
k1
k2
0,64 0,77 1,20
5,76 9,63 1,67
0,25 0,25 1,00
19,05 32,06 1,68
2,22 2,22 1,00
n.r
n.r
n.r
n.r
Rs
<1
4,4
-4,0
--
k1
1,03
-0,30
-2,87
0,61
1,61
0,04
1,00
5% MeOH
k2
1,29 1,26
-0,30 1,00
-2,87 1,00
0,74 1,21
2,19 1,36
0,16 4,00
1,22 1,22
Rs
<1
--<1
1,22
<1
<1
La disminucin en el contenido de metanol permiti aumentar la retencin de varios

aminocidos, posibilitando as la discriminacin quiral que no ocurra con un
contenido de 20% de modificador orgnico en el eluyente. Tambin se observ que
cuando la fase mvil no contiene metanol los picos se deforman y se pierde
resolucin.
Las mejores enantioresoluciones se consiguieron con 5% de metanol y a
8,50 y 8,60.
s
w pH
entre
A ws pH = 6,42 la retencin disminuy drsticamente. Por otra parte, a ws pH s mayores

a 9,00 se deforma notablemente el perfil de los picos, perdindose
enantioresolucin.
Todos los cromatogramas obtenidos en las condiciones mencionadas muestran
picos adicionales a los correspondientes a los analitos. Si bien se intent
minimizarlos utilizando la misma fase mvil como solvente de muestra para los
aminocidos a inyectar, estos picos de sistema fueron inevitables y dificultaron la
interpretacin de los cromatogramas. Para evitar estos mltiples picos de sistema,
los aminocidos fueron derivatizados. Esto no slo aumenta la especificidad de la
seal al tomar el registro a 436 nm (longitud de onda absorbida selectivamente por
los derivados) sino que tambin se consigue aumentar la detectabilidad de los picos.
56
El primer agente derivatizante utilizado fue el reactivo de Sanger. De los dinitrofenilaminocidos (DNP-aas) obtenidos no pudo separarse ninguno. Posiblemente la
causa fue la desactivacin que ejercen los grupos nitro sobre el anillo aromtico y
en consecuencia, el par electrnico libre del grupo amino en estos compuestos
derivados, que es el que se coordina con el metal, estara comprometido en la
conjugacin del anillo aromtico.
Posteriormente se derivatizaron las muestras de aminocidos con cloruro de
dabsilo. Los derivados obtenidos (Dbs-aas) son mucho ms hidrofbicos que los
aminocidos nativos, por lo que la retencin de los mismos en la columna de
octadecilslice es significativamente mayor. Se busc optimizar la enantioseparacin
para Dbs-Val, ensayando diversos gradientes de fase mvil, ricos en agua
inicialmente para lograr la separacin y luego con fuerza eluyente creciente. Los
resultados se muestran el la Tabla 3.3.
Tabla 3.3. Valores de factor de retencin, enantioselectividad y enantioresolucin

para distintos gradientes de fase mvil para Dbs-Val.
Gradiente
1
2
3
4
5
6
7
k1
49,16
102,4
37,40
32,80
19,50
23,30
21,60
k2
50,46
106,6
38,60
33,90
20,44
24,15
22,50
1,03
1,04
1,03
1,03
1,05
1,04
1,04
B: MeOH
A: 80% buffer 0,1 M; 20% MeOH con 0,5 mM CD y 0,5 mM Cu(II),
Rs
<1
2,01
1,18
1,20
1,21
1,31
1,21
s
w pH =8,50
Gradiente 1: 20% B durante 30, 50% B a los 50, 50% B hasta el final.
Gradiente 2: 30% B durante 85, sube a 50% B y sigue isocrtico hasta el final.
Gradiente 3: 20% B, 50% B a los 30, isocrtico hasta el final.
Gradiente 7: 37.5% B, 50% B a los 20, isocrtico hasta el final.
En la Figura 3.5 se muestra un cromatograma donde se superponen las seales

obtenidas con Dbs-Val para las corridas cromatogrficas hechas con los gradientes
detallados. El primer pico en todos los cromatogramas corresponde a 4dimetilaminoazobenceno-4-sulfonato, subproducto del exceso de reactivo de
derivatizacin.
57
Figura 3.5. Cromatogramas superpuestos para Dbs- Val obtenidos con los
gradientes de fase mvil detallados al pie de la Tabla 3.3. Caudal 1mL/min;
temperatura ambiente; deteccin a 436 nm.
A partir de estos ensayos, se eligi la condicin descripta como Gradiente 5 para la

separacin de otros aminocidos dado que fue la condicin con la que se logr
mayor enantioselectividad, menor tiempo de anlisis junto con una
enantioresolucin adecuada. Los resultados obtenidos para otros Dbs-aas se
muestran en la Tabla 3.4.
Tabla 3.4. Valores de factor de retencin, enantioselectividad y enantioresolucin

para para Dbs-aas cromatografiados con el Gradiente 5.
Dbs-aa
Met
Tre
Phe
Nor
Abu
k1
18,87
11,10
26,50
29,30
15,42
k2
19,37
11,79
26,79
30,30
15,91
1,03
1,06
1,02
1,03
1,03
Rs
<1
1,00
<1
<1
<1
A continuacin se muestra en la Figura 3.6 un cromatograma conjunto para los

derivados separados en la condicin mencionada.
58
Figura 3.6. Cromatograma conjunto para las seales de Dbs-Val, Met, Tre, Phe, Nor
y Abu.
Condiciones: Gradiente 5 en la fase mvil. Caudal 1mL/min; temperatura ambiente;
deteccin a 436 nm.
3.2.2.2. Discusin sobre el mecanismo de separacin quiral.

En CILQ, a diferencia de lo que ocurre en otras tcnicas de separacin quiral, la
interaccin entre el SQ y los enantimeros no es directa, sino que est mediada por
el catin metlico que coordina simultneamente a ambos formando un complejo
ternario con ligandos mixtos, cuyo equilibrio de formacin se presenta comnmente
como:
Fase mvil
Am
Mm
Sm
AMSm
Fase estacionaria
As
Ms
Ss
AMSs
Donde A representa a cada uno de los enantimeros del analito; M es el catin

metlico (ion Cu(II) en este caso); S es el SQ (CD); AMS es el complejo ternario
formado con cada enantimero del par racmico y los superndices m y s se refieren
a las fases mvil y estacionaria, respectivamente.
Con el fin de determinar el rol del in Cu(II) se cromatografiaron varios de los
aminocidos que fueron resueltos en las experiencias descriptas, en idnticas
condiciones de fase mvil, pero sin el agregado del in Cu(II) y se observ, en todos
los casos, la desaparicin de la capacidad de enantioreconocimiento del sistema,
confirmando de esta forma que el catin Cu(II) est involucrado en el mecanismo de
reconocimiento quiral y que no se trata de una enantioseparacin por formacin de
un par inico entre el SQ y el analito.
59
Para modelar los complejos se tom como base el ligando cinconidina en la

conformacin Open(3) 14 reportada por Urakawa y colaboradores como la ms
estable en solventes no polares.
Se model la geometra de los complejos ternarios constituidos por las formas D o L
del aminocido alanina, el ion Cu(II) y CD con el paquete de programas Hyperchem
5.0 14 para luego optimizar las mismas de acuerdo a la Teora del Funcional de la
Densidad, usando los funcionales de Becke para el intercambio 49 y los de Lee,
Yang y Parr 50 para la correlacin y que constituyen el mtodo BLYP, usando el
paquete de programa Gaussian 03 51-53 .
Posteriormente se efectu el anlisis vibracional al mismo nivel de teora para
verificar que las coordenadas optimizadas corresponden a mnimos en la superficie
de energa potencial y no a puntos de ensilladura. En la Figura 3.7 se muestran los
dos ismeros y en la Tabla 3.5 los principales parmetros de los mismos, indicando
las longitudes de enlace (LE) de cobre con oxgeno y con nitrgeno del aminocido
y de cobre con oxgeno y con nitrgeno del ligando (cinconidina), respectivamente.
Tambin se indica el ngulo de torsin () entre los tomos de oxgeno, cobre,
nitrgeno e hidrgeno.
La diferencia de energa entre los dos complejos es de 0,173 Kcal/mol y el complejo
L es el de ms baja energa. Si se considera que estas diferencias energticas se
corresponden a la variacin de (G), se puede calcular una enantioselectividad
de 1,34, valor que es superior a las enantioselectividades obtenidas
experimentalmente, aunque las diferencias son razonables para este tipo de
clculos en los que se ignora los efectos del solvente adems de los efectos
entrpicos.
Complejo D
Complejo L
Figura 3.7. Estructura conformacional de los complejos ternarios formados por CD,
Cu (II) y D o L alanina. Cdigo de colores: esferas de color gris: tomos de
carbono; azules: nitrgeno; rojas: oxgeno; blancas: hidrgeno y verdes: cobre.
60
Tabla 3.5. Parmetros de los complejos ternarios formados por CD, Cu(II) y D o L
alanina.
Parmetro
Complejo L
Complejo D
LE Cu-O(alanina)/
1,866
1,863
LE Cu-N(alanina)/
1,862
1,856
LE Cu-O(cinconidina)/
1,828
1,831
LE Cu-N(cinconidina)/
1,958
1,959
O-Cu-N-H/grados
31,608
-27,723
Desde un punto de vista cromatogrfico, si bien fueron varios los analitos que
lograron separarse con valores de enantioresolucin adecuados con la modalidad
de CILQ, las dificultades para lograr el equilibrio del sistema en tiempos razonables
y la escasa reproducibilidad en los tiempos de retencin de los derivados, sugeran
fuertemente cambiar el sistema de enantioreconocimiento para obtener una
metodologa ms robusta.
3.3. Fases estacionarias quirales (FEQs).

3.3.1. Sntesis de las FEQs. Resultados y discusin.
Las Tablas 3.6 y 3.7 muestran los resultados obtenidos del anlisis elemental de las
distintas FEQs sintetizadas.
Tabla 3.6. FEQ basada en Cinconidina (FEQ-CD). Resultados del anlisis elemental
y contenido de selector quiral.
Slice
120
rea
superficial
(m2/g)
200
Modelo
de
sntesis
MS1
SE
Anlisis
elemental
7,65%C
0,70%N
1,87%S
1,14%H
Cubrimiento
de grupos
SH
Cubrimiento
de SQ
(rendimiento
Etapa 1)
(rendimiento
Etapa 2)
0,633 mmol
SH/g slice
0,294 mmol
SQ/g material
(39,6%)
(46,4%)
SE: sin end-capping
61
La estimacin de la densidad de grupos mercaptopropilo qumicamente ligados en la

Etapa 1 de la sntesis se realiz a partir del porcentaje de azufre y siguiendo la
reaccin representada en la Figura 2.2 (Captulo 2. Seccin experimental.).
El contenido de selector quiral CD incorporado en la segunda fase de la sntesis se
calcul sobre la base del porcentaje de nitrgeno. En la ltima columna de la Tabla
3.6 se informa el nmero de mmoles de selector por gramo de slice. El rendimiento
de la segunda reaccin se calcula teniendo en cuenta los mmoles de CD que se
incorporaron respecto del nmero de grupos tioles disponibles.
Finalmente, el anlisis elemental para la FEQ basada en CD luego de realizar la
reaccin de end-capping arroj un contenido de carbono de 7,80%. A partir de este
valor se estim en 0,021 mmoles la cantidad de grupos sulfhidrilo adicionales
cubiertos.
Tabla 3.7. FEQ basada en Quinina (FEQ-QN). Resultados del anlisis elemental y
contenido de selector quiral.
Slice
120
100
Area
superficial
(m2/g)
200
350
Modelo
de
sntesis
MS1
SE
MS2
SE
Anlisis
elemental
Cubrimiento
de grupos
SH
Cubrimiento
de SQ
(rendimiento
Etapa 1)
(rendimiento
Etapa 2)
7,69% C
0,63% N
1,79% S
1,12% H
0,603 mmol
SH/g slice
0,263 mmol
SQ/g material
(37,7%)
(43,6%)
11,27%C
0,91%N
3,45%S
1,83%H
1,259mmoles
SH/g slice
0,431 mmol
SQ/g material
(45,0%)
(34,2%)
SE: sin end-capping
Para la FEQ basada en QN con end-capping el anlisis de carbono dio 8,03% para
la reaccin realizada segn el MS1 y 12,04% para el MS2, con estos valores se
calcula un cubrimiento adicional de los grupos remanentes de 0,047 y 0,107 mmoles
respectivamente.
De acuerdo a los resultados del anlisis elemental se pueden realizar las siguientes
observaciones:
a) An cuando las condiciones de reaccin fuesen excelentes, como mximo 4
moles/m2 de grupos silanoles (0,8 y 1,4 mmol/g, respectivamente para slice
con 200 y 350 m2/g), son capaces de reaccionar qumicamente con el
reactivo silanizante debido al impedimento estrico provocado
62
fundamentalmente por los grupos laterales del tomo de silicio del

alcoxisilano reactante. Ese nmero disminuye sensiblemente cuando
aumenta la longitud de la cadena del silano incorporado 54-56.
b) Los resultados de las Tablas 3.6 y 3.7 indican que se incorporaron 3,2; 3,0 y
3,6 moles/m2 de grupos mercaptopropilsilano en las fases FEQ-CD, FEQQN (MS1) y FEQ-QN (MS2), respectivamente, indicando claramente que las
reacciones de silanizacin, en todos los casos, fueron razonablemente
eficientes.
c) Para la FEQ basada en QN, cuya sntesis se realiz a partir de dos
materiales de distinta rea superficial y, adems, siguiendo dos
procedimientos de sntesis, se observa que hay un aumento en el
rendimiento de la Etapa 1 de la reaccin y que ste incremento es superior a
la relacin de aumento del rea especfica del material de partida, por lo que
se concluye que la activacin de los grupos silanoles superficiales de la slice
realizado segn el procedimiento MS2 permiti aumentar la eficiencia de la
silanizacin.
d) Los valores de densidad superficial de SQ obtenidos son comparables, e
incluso superiores a los que figuran en la literatura. Maier y colaboradores 8
sintetizaron cuatro fases en las que se fijaban tert-butil carbamoil derivados
de quinina, quinidina, cinconina y cinconidina y reportaron eficiencias de 0,29;
0,25; 0,31 y 0,20 mmoles de SQ/g para una slice de rea superficial de 308
m2/g. Cabe mencionar que en la mayora de los reportes no se aclara si el
contenido de SQ es relativo a la masa de material original o relativo al
resultante luego de la sntesis. En otros trabajos, los mismos autores
informan concentraciones de SQ que van desde 0,13 a 0,35 mmoles SQ/g de
slice 6, 57. Los mismos autores, poseen la propiedad intelectual de una
patente sobre el desarrollo de FEQs basadas en derivados de alcaloides de
la familia de las cinconas. En la misma, se informa que, para una FEQ
anloga a la sintetizada en nuestro laboratorio, la concentracin de selector
es de 0,32 mmoles de SQ/g de slice 58. El grupo de Salvadori 59 estima en
0,39 mmoles de SQ/g de slice el cubrimiento obtenido para la fijacin de
quinina y de un derivado de la misma. Para determinar este valor, los autores
realizaron una determinacin espectrofotomtrica de los productos de
hidrlisis alcalina de las respectivas FEQs.
e) En el caso de la FEQ obtenida con el procedimiento MS2, el rendimiento en
la Etapa 2 ha sido menor. A pesar de este menor rendimiento, el contenido
de SQ es ampliamente superior a todos los publicados.
Un estudio de la estabilidad de la columna rellena con FEQ-QN con end-capping

se muestra en la Figura 3.8, donde se represent la variacin del factor de retencin
ambos enantimeros de DNP-Phe y de DNP-Ile en funcin del uso de la columna
empleando fases mviles conteniendo soluciones buffer de fuerza inica 0,1 M y de
varios ws pH s . Los resultados indican que la estabilidad de estas columnas ha sido
razonable luego de un prolongado uso de la columna con fases mviles
relativamente agresivas.
63
Figura 3.8. Estabilidad de la columna basada en FEQ-QN CE.
3.3.2. Columnas quirales basadas en cinconidina (FEQ-CD). Resultados

cromatogrficos.
3.3.2.1. Modo CILQ

Dados los resultados obtenidos segn la modalidad de CILQ en la fase mvil, a
partir del uso de CD como SQ en la separacin quiral de los Dbs-aas, se intent
separar estos analitos teniendo ahora al SQ fijo como parte constituyente de la fase
estacionaria. Se utiliz una fase mvil de ws pH = 8,70 formada por 80% de buffer 0,1
M; 20% de metanol y 0,5 mM Cu(II). Se emplearon distintas composiciones de
modificador orgnico para realizar eluciones isocrticas, as como diversos
gradientes, pero no fue posible la resolucin de ningn racemato. Los mismos
resultados se obtuvieron al tratar los dinitrofenil derivados (DNP-aas) as como los
aminocidos nativos. Para estos ltimos, se estudi tambin su retencin sobre esta
fase quiral con diversas fases mviles: mezclas metanol-agua, acetonitrilo-agua y
una fase polar no acuosa de metanol-acetonitrilo y con ninguna de ellas se logr
una retencin adecuada de los analitos, y en los casos en que hubo retencin, la
enantioseparacin fue nula.
Estudios realizados por varios grupos de investigacin muestran que la
conformacin predominante del alcaloide CD depende fuertemente de la polaridad
(constante dielctrica) del solvente de disolucin 11, 60. El cambio en la estructura
conformacional implica una modificacin espacial en la disposicin relativa del par
electrnico libre del nitrgeno quinuclidnico y del oxhidrilo unido al C9 cambiando
en consecuencia, la capacidad de coordinacin del alcaloide. En estas experiencias
hay, efectivamente, un cambio en la polaridad de la fase mvil. Para la modalidad
de CILQ (fase mvil usada con un contenido de 20% de metanol) la constante
dielctrica tiene valores entre 71 y 64 para temperaturas entre 20C y 40C y para la
modalidad que emplea la FEQ-CD (fase mvil con 80% de metanol), la constante
dielctrica del medio vara desde aproximadamente 41 a 36 entre 20C y 40C. 61,
62
. Dado que se supone que la fijacin del alcaloide al soporte silceo a travs del
64
grupo vinilo que se encuentra en el C3 no afectara la estructura conformacional de

los centros quirales de C8 y C9, se atribuye la prdida en la capacidad de
enantioreconocimiento a la disminucin en la polaridad de la fase mvil.
3.3.2.2. Modo de Cromatografa Quiral de Intercambio Inico (CQII)

La potencial aplicacin de estas columnas como intercambiadores inicos quirales
se estudi con aminocios racmicos derivatizados con el reactivo de Sanger (DNPaas), empleando una fase mvil conteniendo 72 % de metanol y 28 % de buffer,
s
w pH =6,40. Las mediciones se realizaron en las columnas con FEQ-CD con y sin
tratamiento de end-capping y en un intervalo de temperatura entre 10 y 40C. Los
resultados obtenidos se informan en las Tablas 3.8 y 3.9.
En todos los casos k1 y k2 designan a los factores de retencin del primer y segundo
enantimero del par. Los tiempos de retencin fueron tomados en el mximo de los
picos. La enantioselectividad se calcul como el cociente k2/k1.
65
Tabla 3.8. Factores de retencin, de enantioselectividad y de enantioresolucin para DNP-aas a diferentes temperaturas en la
columna con FEQ-CD sin end capping.
s
w pH =
DNPaa
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Asp
Lys
Tyr
k1
5,43
5,12
5,41
5,70
5,60
5,34
19,79
8,20
6,89
5,88
4,17
2,23
6,45
5,37
2,04
5,20
10C
k2
7,18
5,69
6,30
6,23
6,61
7,04
22,36
9,25
7,75
6,57
4,68
2,23
6,45
5,37
2,04
5,20
1,32
1,11
1,16
1,09
1,18
1,32
1,13
1,13
1,12
1,12
1,12
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Rs
1,2
<1
<1
<1
<1
1,2
<1
<1
<1
<1
<1
------
k1
4,42
4,07
4,40
4,55
4,33
4,38
14,12
6,32
5,25
4,65
3,38
1,78
5,15
4,05
1,67
4,11
20C
k2
5,72
4,48
5,05
4,93
5,04
5,64
15,79
7,05
5,86
5,15
3,74
1,78
5,15
4,05
1,67
4,11
1,30
1,10
1,15
1,09
1,16
1,29
1,12
1,12
1,12
1,11
1,11
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Rs
1,2
<1
<1
<1
<1
1,3
<1
<1
<1
<1
<1
------
6,40
k1
3,41
3,25
3,45
3,58
3,45
3,57
26,98
4,65
4,07
3,51
2,73
1,45
4,06
3,20
1,37
3,26
30C
k2
4,29
3,61
3,89
3,86
3,94
4,50
29,45
5,13
4,49
3,85
3,00
1,45
4,06
3,20
1,37
3,26
40C
1,26
1,11
1,13
1,08
1,14
1,26
1,09
1,10
1,10
1,09
1,10
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Rs
1,2
<1
<1
<1
<1
1,3
<1
<1
<1
<1
<1
------
k1
2,96
2,64
2,88
2,94
2,91
2,99
7,43
3,69
3,34
3,02
2,31
1,16
3,28
2,67
1,13
2,62
k2
3,66
2,80
3,22
3,12
3,28
3,69
8,11
4,01
3,65
3,30
2,49
1,16
3,28
2,67
1,13
2,62
1,24
1,06
1,12
1,06
1,13
1,23
1,09
1,09
1,09
1,09
1,08
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Rs
1,2
<1
<1
<1
<1
1,3
<1
<1
<1
<1
<1
------
66
Tabla 3.9. Factores de retencin, de enantioselectividad y de enantioresolucin para DNP-aas a diferentes temperaturas con la
FEQ-CD con end capping.
s
w pH =
DNPaa
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Asp
Lys
Tyr
k1
11,93
12,97
12,90
15,31
13,24
11,78
27,41
24,90
17,46
15,98
9,81
2,65
15,44
19,54
9,22
22,21
10C
k2
16,15
14,12
14,91
15,31
16,14
15,92
31,01
28,32
19,16
15,98
10,99
2,65
15,44
19,54
9,22
22,21
1,35
1,09
1,16
1,00
1,22
1,35
1,13
1,14
1,10
1,00
1,12
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Rs
1,2
<1
<1
-<1
1,2
<1
<1
<1
-<1
------
k1
9,43
9,82
10,08
11,44
10,19
9,36
18,45
17,01
12,90
12,05
7,65
2,02
11,78
14,07
3,58
13,79
20C
k2
12,41
10,43
11,50
11,44
11,98
12,30
20,63
18,97
14,09
12,05
8,43
2,02
11,78
14,07
3,58
13,79
1,32
1,06
1,14
1,00
1,18
1,31
1,12
1,12
1,09
1,00
1,10
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Rs
1,2
<1
<1
-<1
1,2
<1
<1
<1
-<1
------
6,40
k1
7,65
7,76
8,52
8,94
8,06
7,66
12,99
12,80
10,01
9,53
6,16
1,70
9,36
10,47
4,07
10,56
30C
k2
9,82
8,19
9,60
8,94
9,33
9,84
14,22
14,06
10,76
9,53
6,64
1,70
9,36
10,47
4,07
10,56
40C
1,28
1,05
1,13
1,00
1,16
1,28
1,10
1,10
1,07
1,00
1,08
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Rs
1,2
<1
<1
-<1
1,2
<1
<1
<1
-<1
------
k1
6,04
6,04
6,39
6,73
6,20
6,09
8,71
8,93
7,97
6,96
5,07
1,30
7,18
7,57
1,29
7,65
k2
7,57
6,04
7,09
6,73
7,08
7,63
9,45
9,64
7,97
6,96
5,07
1,30
7,18
7,57
1,29
7,65
1,25
1,00
1,11
1,00
1,14
1,25
1,08
1,08
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Rs
1,0
-<1
-<1
1,1
<1
<1
<1
--------
67
En ambas columnas se observa una disminucin en la retencin y en la

enantioselectividad al aumentar la temperatura.
En las Figuras 3.9 y 3.10 se muestran los cromatogramas de DNP-Pro y de DNPSer como ejemplos de una de las mejores y una de las peores enantioseparaciones
obtenidas, respectivamente con las columnas con FEQ-CD con y sin end-capping.
Figura 3.9. Cromatograma de DNP-Pro obtenido con las columnas con FEQ-CD con
(CE) y sin (SE) tratamiento de end-capping. Condiciones: fase mvil 72% MeOH,
28% buffer, ws pH =6,40. Caudal 1mL/min; temperatura de la columna 20C; deteccin
a 365 nm.
Figura 3.10. Cromatograma de DNP-Ser obtenido con las columnas con FEQ-CD
con (CE) y sin (SE) tratamiento de end-capping, en iguales condiciones
cromatogrficas que el registro anterior.
68
Comparacin entre las columnas con FEQ-CD-SE y FEQ-CD-CE

La Figura 3.11 muestra los valores de factores de retencin de los DNP-aas en la
columna con tratamiento de recubrimiento en funcin de los valores
correspondientes a la columna sin tratamiento, a 10, 20 y a 40C. Claramente existe
una correlacin entre las retenciones en ambas columnas, que es prcticamente
independiente de la temperatura. Los puntos en la columna CD-CE se ubican por
encima de la lnea que corresponde a una recta de ordenada cero y pendiente uno
(lnea de puntos), indicando que la columna con tratamiento de end-capping
resulta ms retentiva, pero el mecanismo de retencin en ambas columnas es
similar; adems la dependencia de la retencin con la temperatura tambin sera
similar.
Figura 3.11. Comparacin de la retencin (izquierda) y de la enantioselectividad

(derecha) de DNP-aas en la columna con FEQ-CD-CE en funcin del valor
correspondiente en FEQ-CD-SE en idnticas fases mviles y a tres temperaturas
diferentes. Temperaturas: : 10C; : 20C; : 40C.
Cuando se comparan los factores de enantioseparacin obtenidos en ambas

columnas (Figura 3.11 (derecha)) se observa que no existen diferencias aparentes
entre ellos, dado que todos los valores se dispersan alrededor de una recta de
pendiente unitaria y ordenada al origen igual a cero.
La retencin de un dado soluto quiral en una FEQ puede, muchas veces, tener dos
componentes. Un componente enantioselectivo, caracterstico de cada enantimero
que, eventualmente, podr ser de igual magnitud para ambos y, simultneamente
una contribucin debida a interacciones no-enantioselectivas (ne) con la fase slida,
que ser equivalente para ambos solutos; ambas contribuyen a la retencin
observable, por lo que la enantioselectividad ser:
69
k R,ap
k S,ap
k R,q + k ne
k S ,q +k ne
= ap
(1)
kR,q y kS,q se refiere a los factores de retencin de las formas R y S (arbitrariamente

elegidos) de un soluto quiral, kne es el componente no-estereoselectivo a los
factores de retencin experimentales y ki,ap y ap son los factores de retencin y de
enantioselectividad experimentales, respectivamente.
Es evidente de esta ecuacin que cuando la retencin no-enantioselectiva es
importante, la selectividad aparente es menor que la enantioselectividad intrnseca
al proceso de separacin quiral.
Algunas alternativas han sido propuestas en la literatura para soslayar el
inconveniente de determinar el verdadero factor de enantioseparacin. Una de ellas,
fue propuesta por Jung y colaboradores 63, quienes introdujeron el concepto de
incremento en la retencin, R, en cromatografa de gases, experimentalmente
accesible a partir de la medicin de la retencin relativa entre el analito y una
sustancia estndar en una columna quiral conteniendo una dada concentracin de
selector en el solvente aquiral y tambin en una columna conteniendo solamente al
solvente matriz donde slo ocurren las interacciones no-enantioselectivas. En esta
aproximacin, la sustancia seleccionada como estndar no debe interaccionar con
el selector quiral.
Fornstedt y colaboradores 64, 65 sugirieron un mtodo para la deconvolucin de la
retencin en las magnitudes correspondientes a ambas contribuciones para
propranolol en una fase quiral a base de la protena celulasa. Para distinguirlas, los
autores determinaron las isotermas de adsorcin de cada enantimero en un rango
extendido de concentraciones y luego ajustaron los datos a un modelo de isoterma
tipo bi-Langmuir y estimaron los parmetros del ajuste no lineal. Para este tipo de
fase estacionaria, donde la cantidad de protena ligada a la superficie es usualmente
baja, y en consecuencia, el nmero de selectores quirales accesibles es limitado, las
interacciones inespecficas en otras regiones de la superficie de la protena o con el
soporte de slice sern importantes en magnitud y se justifica este sofisticado
anlisis del comportamiento retentivo.
Las FEQs de tipo Pirkle, poseen una mucho ms alta densidad de selectores
quirales covalentemente unidos al soporte. En el caso particular de las fases
desarrolladas en esta tesis, los alcaloides se encuentran ligados a
mercaptopropilslice en concentraciones de entre 300 y 400 moles/g (ver Tablas
3.6 y 3.7), y algunas de estas fases han sido subsecuentemente sometidas a una
segunda reaccin qumica para suprimir las potenciales interacciones con los
grupos tioles residuales.
Por lo expuesto, resulta bastante sorprendente que el tratamiento de end-capping
provoque un aumento significativo en la retencin de estos DNP-aas, pero
esencialmente no modifique la enantioselectividad respecto de la fase sin
tratamiento. Se podra imaginar, a priori, que si la introduccin de cadenas
hidrocarbonadas provoca un aumento de la retencin, este aumento se debera
70
atribuir a interacciones hidrofbicas no-enantioselectivas y, en consecuencia, sera

esperable una disminucin en la enantioselectividad con respecto a la fase sin
tratamiento de end-capping. Pirkle estudi el efecto del end-capping sobre la
enantioselectividad de una FEQ basada en un ster derivado de alanina 66
empleando como eluyente una fase mvil de n-hexano y 2-propanol y encontr que
la enantioselectividad slo cambia en aquellas fases con bajo cubrimiento superficial
de SQ (0,036-0,083 mmol/g). Los resultados experimentales obtenidos, sin
embargo, sugieren que el tratamiento de end-capping le confiere mayor
hidrofobicidad a la superficie y que las cadenas lineales de C6 podran tener
tambin algn tipo de participacin en el proceso de enantioreconocimiento.
3.3.3. Columnas
cromatogrficos.
quirales
basadas
en
quinina
(FEQ-QN).
Resultados
Modo de Cromatografa Quiral de Intercambio Inico (CQII)

En este caso, se utiliz directamente la FEQ basada en QN sintetizada con el MS2,
como un intercambiador aninico. Para esto se utilizaron fases mviles constituidas
por metanol y un buffer para resolver racematos de aminocidos derivatizados con
el reactivo de Sanger (DNP-aas) y con 9-fluorenilmetilcloroformiato (FMOC-aas). En
las siguientes secciones se discute el efecto sobre la retencin y enantioselectividad
de las diferentes variables cromatogrficas estudiadas.
FMOC-derivados
Con la FEQ-QN se logr resolver las mezclas racmicas de los DNP-aas, con
retencin y selectividad variables, en todas las condiciones cromatogrficas de
medida. Cuando los racematos de FMOC-aas fueron cromatografiados en idnticas
condiciones experimentales se encontr que no ocurra separacin. Algunas de las
condiciones se describen en la Tabla 3.10, donde se informa un nico tiempo de
retencin para el par enantiomrico ya que no se observ deformacin alguna en
ninguno de los perfiles de los picos eluidos.
71
Tabla 3.10. Tiempo de retencin (en minutos) de la mezcla racmica en la columna

con FEQ-QN con end-capping para las condiciones experimentales especificadas.
FMOC-aa
Ser
Val
Ala
Leu
Tri
Abu
Tre
Arg
Ile
s
w pH =
6,00
40C
100%B 90%B
5,073
-4,998 9,099
-8,651
-8,710
--8,992
4,722 7,911
-5,201
5,294 9,985
20C
90%B
11,116
12,200
11,602
13,780
-10,419
-13,613
s
w pH =6,70
40C
90%B
2,642
3,298
3,046
-5,544
3,159
2,599
1,519
3,521
El grupo de investigacin de Lindner report la separacin quiral de FMOC-Leu con

FEQs formadas por diversos carbamatos quinina y otros alcaloides de la familia 8.
Sin embargo, no pudieron separar FMOC-Pro con una FEQ derivada de quinina
(anloga a la sintetizada en nuestro laboratorio) 58. Park y colaboradores separaron
dieciseis FMOC-aas en una columna de un carbamato de quinina enlazado a slice
del que, desafortunadamente, no informan su estructura 67.
DNP-derivados
En las Tablas siguientes se informa la retencin, la enantioselectividad y la
enantioresolucin para los DNP-aas a distintas temperaturas y ws pH s. Las medidas
se realizaron a cuatro temperaturas en el intervalo entre 10C y 40C con la misma
composicin de la fase mvil y las mediciones se repitieron con cuatro fases mviles
de distinto ws pH , tanto en la columna sin tratamiento de recubrimiento final como en
la columna tratada. Las tablas estn organizadas segn el ws pH de la fase mvil.
Al igual que en el caso anterior k1 y k2 representan los factores de retencin del
primer y segundo enantimero del par. Los tiempos de retencin fueron tomados en
el mximo de los picos.
72
Tabla 3.11. Factores de retencin, de enantioselectividad y de enantioresolucin para DNP-aas sobre FEQ-QN-SE a distintas
temperaturas. ws pH =7,07.
s
w pH =7,07
DNPaa
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
His
Asp
Asn
Lys
Tyr
Glu
Orn
k1
8,12
8,22
11,65
10,77
12,39
23,50
33,62
20,16
17,16
10,33
7,89
3,18
13,92
35,16
9,59
9,84
116,09
115,97
97,00
2,28
10C
k2
10,45
10,94
15,44
12,95
16,73
32,82
52,61
24,61
21,46
12,80
10,59
3,77
17,26
42,79
10,40
10,68
135,76
136,07
97,00
2,85
1,29
1,33
1,33
1,20
1,35
1,40
1,56
1,22
1,25
1,24
1,34
1,19
1,24
1,22
1,08
1,09
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Rs
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0,8
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< 0,8
< 0,8
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k1
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k1
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30C
k2
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40C
k2
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Rs
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< 0,8
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0,8
-< 0,8
73
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w pH =6,32
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Ser
Val
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Nor
Abu
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Asp
Asn
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Tyr
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10C
k2
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Rs
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1,16 0,8
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-1,00
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k1
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1,98
20C
k2
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1,58
30C
k2
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11,76 1,12
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7,05 1,08
7,20 1,08
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41,15 1,00
1,86 1,18
Rs
1,7
1,8
1,8
1,2
1,9
2,0
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1,5
1,5
1,8
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1,2
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< 0,8
< 0,8
1,0
0,8
-< 0,8
k1
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5,30
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32,72
1,28
40C
k2
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8,42 1,23 1,9
15,01 1,27 2,1
26,97 1,38 2,9
11,41 1,17 1,4
9,93 1,18 1,5
8,19 1,18 1,5
5,79 1,23 1,8
1,99 1,13 0,8
9,16 1,17 1,2
9,47 1,09 < 0,8
3,78 1,14 1,0
5,54 1,05 < 0,8
5,58 1,05 < 0,8
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46,71 1,14 0,8
-32,72 1,00
1,52 1,19 0,8
74
s
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Nor
Abu
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Arg
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-11,41
-18,05
----
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1,31
Rs
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1,20
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-8,11
1,93
20C
k2
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16,69
12,96
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2,77
13,84
-8,87
1,93
1,24
1,27
1,24
1,26
1,32
1,32
1,19
1,21
1,20
1,27
1,15
1,20
Rs
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1,6
1,7
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1,4
1,7
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1,00
--
k1
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-12,68
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5,73
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7,21
6,46
1,57
30C
k2
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9,79
10,48
-14,86
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10,31
7,09
2,15
10,59
7,21
6,98
1,57
1,22
1,23
1,23
1,24
1,28
Rs
1,4
1,8
1,5
1,8
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1,19 1,4
1,19 1,4
1,24 1,7
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-1,08 <0,8
1,00
--
k1
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1,52
7,04
6,97
5,10
1,28
40C
k2
6,94
6,64
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7,64
8,01
14,00
10,98
9,63
9,71
5,61
1,69
8,13
6,97
5,43
1,28
Rs
1,20 1,6
1,20 1,7
1,21 1,7
1,22 1,7
1,21 1,7
1,25 2,0
1,16 1,3
1,17 1,2
1,42 1,4
1,21 1,6
1,12 <0,8
1,15 1,3
1,00
-1,07 <0,8
1,00
--
75
s
w pH =5,06
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Pro
Ser
Ala
Leu
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Asn
Orn
k1
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10,26
10,46
--16,34
12,87
7,93
2,66
12,83
---
10C
k2
11,88
13,08
13,25
--19,74
15,59
9,99
3,06
15,21
---
1,22
1,28
1,27
Rs
1,3
1,6
1,5
1,21 1,2
1,21 1,3
1,26 1,5
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1,19 1,1
k1
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15,56
12,56
10,12
6,49
2,09
10,09
7,74
1,67
20C
k2
9,54
10,14
10,83
12,34
18,30
14,97
12,05
8,01
2,38
11,82
8,28
1,67
Rs
1,21 1,4
1,24 1,7
1,24 1,6
1,35 2,2
1,18 1,2
1,19 1,3
1,19 1,3
1,23 1,6
1,14 <0,8
1,17 1,1
1,07 <0,8
1,00
--
k1
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11,75
9,71
8,01
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1,67
7,97
6,15
1,36
30C
k2
7,69
7,93
8,53
9,59
13,64
11,41
9,42
6,44
1,88
9,21
6,52
1,36
Rs
k1
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1,22 1,6 5,69
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1,18 1,3 6,42
1,21 1,5 4,42
1,12 <0,8 1,40
1,16 1,2 6,38
1,06 <0,8 4,99
1,00
-1,13
40C
k2
6,26
6,30
6,81
7,52
10,38
8,84
7,44
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1,51
7,29
5,19
1,13
Rs
1,18 1,4
1,19 1,5
1,20 1,6
1,23 1,9
1,15 1,2
1,16 1,3
1,16 1,3
1,19 1,4
1,07 <0,8
1,14 1,1
1,04 <0,8
1,00
--
76
Tabla 3.15. Factores de retencin, de enantioselectividad y de enantioresolucin para DNP-aas sobre FEQ-QN-CE a distintas
s
w pH =7,03
DNPaa
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Cys
His
Asp
Asn
Orn
Lys
Tyr
Glu
k1
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12,32
16,32
17,12
18,73
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28,52
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16,18
10,08
2,82
22,35
13,51
6,49
10,33
10,34
2,19
145,20
149,13
126,99
10C
k2
15,65
16,35
21,43
20,51
25,04
48,97
106,43
34,78
33,22
20,09
13,54
3,32
27,36
15,51
7,78
11,86
11,92
2,19
172,36
171,11
126,99
1,28
1,33
1,31
1,20
1,34
1,36
1,55
1,22
1,25
1,24
1,34
1,18
1,22
1,15
1,20
1,15
1,15
1,00
1,19
1,15
1,00
Rs
1,9
2,3
2,2
1,5
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1,6
1,7
1,6
2,4
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1,6
1,2
1,3
0,8
0,9
-1,2
<0,8
--
k1
9,54
9,01
12,20
12,53
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24,89
45,02
19,76
18,09
12,90
7,63
2,11
16,51
10,62
5,59
7,12
6,99
1,80
104,96
87,20
75,67
20C
k2
11,96
11,61
15,70
14,78
18,22
32,81
66,95
23,72
23,67
15,70
9,95
2,42
19,90
12,07
6,58
7,96
7,55
1,80
122,18
99,98
75,67
1,25
1,29
1,29
1,18
1,31
1,32
1,49
1,20
1,31
1,22
1,30
1,15
1,21
1,14
1,18
1,12
1,08
1,00
1,16
1,15
1,00
Rs
1,9
2,3
2,3
1,5
2,4
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1,7
1,8
1,8
2,3
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1,7
<0,8
1,3
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0,9
-1,3
1,1
--
k1
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1,53
67,22
68,93
62,91
30C
k2
Rs
9,07 1,24 1,4
8,51 1,26 2,1
11,83 1,26 2,2
10,94 1,16 1,5
13,61 1,28 3,4
22,76 1,29 2,2
43,98 1,43 3,4
16,74 1,18 1,7
16,23 1,21 1,9
11,65 1,20 1,8
7,48 1,27 2,2
2,02 1,14 0,9
14,51 1,19 1,6
9,73 1,12 < 0,8
5,57 1,16 1,2
6,31 1,10 <0,8
6,22 1,09 <0,8
1,53 1,00
-77,94 1,16 1,2
78,24 1,14 1,0
62,91 1,00
--
k1
5,67
5,00
6,97
6,90
7,92
12,66
20,45
10,03
9,80
7,17
4,45
1,39
9,46
7,43
4,07
4,53
4,55
1,18
46,71
44,20
45,23
40C
k2
Rs
6,91 1,22 1,9
6,12 1,22 1,9
8,64 1,24 2,2
7,91 1,15 1,4
9,87 1,25 2,2
15,91 1,26 2,2
28,26 1,38 3,2
11,72 1,17 1,6
11,65 1,19 1,6
8,46 1,18 1,6
5,51 1,24 2,0
1,55 1,12 < 0,8
11,04 1,17 1,4
8,07 1,09 <0,8
4,70 1,16 1,0
4,93 1,09 <0,8
4,93 1,08 <0,8
1,18 1,00
-53,76 1,15 1,2
49,59 1,12 1,0
45,23 1,00
--
77
s
w pH =6,32
DNPaa
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Cys
His
Asp
Asn
Orn
Lys
Tyr
Glu
k1
23,25
23,97
30,24
32,52
17,50
32,72
72,62
31,18
45,50
32,85
19,01
3,46
22,97
18,63
4,99
13,48
13,52
0,81
217,45
172,40
85,92
10C
k2
29,58
31,80
39,52
38,83
22,86
43,54
110,68
37,34
56,25
40,35
25,43
4,03
27,87
21,47
5,68
15,14
15,19
0,81
250,09
196,53
85,92
Rs
1,27 2,0
1,33 2,5
1,31 2,5
1,19 1,7
1,31 1,6
1,33 1,7
1,52 2,3
1,20 1,1
1,24 1,8
1,23 2,2
1,34 2,4
1,16 0,9
1,21 1,2
1,15 <0,8
1,14 1,3
1,12 <0,8
1,12 <0,8
1,00
-1,15 1,0
1,14 2,3
-1,00
k1
14,26
13,99
18,61
19,43
13,91
24,72
50,27
29,72
27,36
24,58
14,69
2,52
18,19
15,44
4,45
10,70
10,73
1,09
141,62
135,79
93,34
20C
k2
17,80
18,00
23,83
22,84
17,89
32,15
73,48
35,48
33,37
29,84
19,13
2,88
21,78
17,49
5,13
11,92
11,96
1,09
163,85
154,29
93,34
Rs
1,25 2,0
1,29 2,3
1,28 2,3
1,18 1,5
1,29 1,7
1,30 1,8
1,46 2,1
1,19 1,5
1,22 1,8
1,21 1,8
1,30 2,4
1,14 <0,8
1,20 1,6
1,13 <0,8
1,15 1,3
1,11 0,8
1,12 0,8
1,00
-1,16 1,3
1,14 0,8
-1,00
k1
11,36
10,73
14,18
14,65
13,35
18,41
31,05
21,72
20,28
18,52
11,37
2,10
14,76
11,80
3,96
8,14
8,24
1,66
96,21
95,98
75,98
30C
k2
14,00
13,47
17,86
17,02
17,01
23,38
43,64
25,65
24,40
22,18
14,44
2,38
17,45
13,27
4,53
8,95
9,05
1,66
110,93
108,18
75,98
Rs
1,23 2,0
1,26 2,1
1,26 2,2
1,16 1,4
1,27 2,0
1,27 1,8
1,41 2,3
1,18 1,6
1,20 1,8
1,20 1,8
1,27 2,3
1,13 0,9
1,18 1,3
1,12 <0,8
1,14 1,0
1,10 <0,8
1,10 <0,8
1,00
-1,15 1,1
1,13 1,0
-1,00
k1
8,04
8,08
10,71
10,73
10,56
15,82
22,05
15,52
14,86
18,25
11,60
1,71
9,37
8,24
3,32
5,75
5,92
1,30
59,87
58,96
59,60
40C
k2
9,69 1,21
9,89 1,22
13,23 1,24
12,29 1,14
13,18 1,25
17,49 1,11
29,92 1,36
18,08 1,17
17,60 1,18
21,65 1,19
14,42 1,24
1,92 1,12
10,90 1,16
9,06 1,10
3,76 1,14
6,25 1,09
6,44 1,09
1,30 1,00
68,68 1,15
66,25 1,12
59,60 1,00
Rs
1,4
1,5
1,7
1,0
1,0
1,8
1,4
1,2
1,4
1,8
2,3
<0,8
1,2
<0,8
1,0
<0,8
<0,8
-1,2
1,0
--
78
s
w pH =5,66
DNPaa
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Cys
k1
13,92
14,23
17,71
20,08
19,75
38,94
71,34
31,40
26,24
19,52
11,57
2,99
21,88
17,73
10C
k2
17,26
18,37
22,53
23,49
26,10
51,25
106,05
37,35
31,78
23,57
14,97
3,42
26,00
20,59
1,24
1,29
1,27
1,17
1,32
1,32
1,49
1,19
1,21
1,21
1,29
1,14
1,19
1,16
Rs
1,5
1,9
1,9
1,2
2,1
2,2
2,9
1,4
1,5
1,5
1,9
<0,8
1,2
0,8
k1
11,31
11,20
14,17
15,19
15,78
28,66
40,82
23,43
20,18
15,35
9,29
2,29
17,06
13,65
20C
k2
13,82 1,22
14,11 1,26
17,75 1,25
17,64 1,16
20,13 1,28
36,92 1,29
62,09 1,52
27,54 1,18
24,13 1,20
18,33 1,19
11,75 1,26
2,70 1,18
20,03 1,17
15,70 1,15
Rs
1,7
2,0
1,9
1,3
2,1
2,1
2,9
1,4
1,5
1,5
2,0
<0,8
1,4
0,9
k1
9,79
9,42
12,04
12,63
13,21
22,80
39,41
18,68
16,63
12,79
8,00
1,97
14,25
11,28
30C
k2
11,82 1,21
11,62 1,23
14,85 1,23
14,50 1,15
16,58 1,25
28,77 1,26
54,76 1,39
21,72 1,16
19,66 1,18
15,09 1,18
9,92 1,24
2,20 1,12
16,54 1,16
12,80 1,13
Rs
1,5
1,8
1,8
1,2
1,9
2,0
2,9
1,4
1,4
1,5
1,8
<0,8
1,3
0,8
k1
7,97
7,52
9,65
10,08
10,38
17,59
29,32
14,27
13,07
10,22
6,48
1,62
11,40
8,98
40C
k2
9,51 1,19
9,06 1,21
11,72 1,21
11,43 1,13
11,88 1,14
21,73 1,24
39,66 1,35
16,41 1,15
15,27 1,17
11,91 1,17
7,87 1,21
1,77 1,09
13,07 1,15
10,04 1,12
Rs
1,5
1,6
1,7
1,1
1,2
1,9
2,7
1,3
1,3
1,3
1,6
<0,8
1,2
<0,8
79
s
w pH =4,99
DNPaa
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Cys
k1
14,21
14,39
18,94
21,14
21,64
42,57
82,11
34,94
28,78
21,15
11,70
3,86
23,00
19,34
10C
k2
17,23
18,28
23,65
24,65
27,36
54,65
118,00
40,77
34,32
25,24
14,71
4,32
27,00
22,25
Rs
1,21 1,4
1,27 2,0
1,25 1,8
1,17 1,2
1,26 1,9
1,28 2,0
1,44 2,8
1,17 1,3
1,19 1,4
1,19 1,4
1,26 1,8
1,12 <0,8
1,17 1,3
1,15 0,8
k1
10,34
10,91
14,66
16,20
16,71
31,36
55,21
25,97
19,57
16,21
9,35
3,01
16,02
14,88
20C
k2
12,05
13,58
18,03
18,63
20,79
39,50
76,64
30,00
23,31
19,12
11,54
3,42
18,34
16,92
Rs
1,16 1,5
1,24 2,0
1,23 1,8
1,15 1,3
1,24 2,0
1,26 2,0
1,39 2,8
1,16 1,3
1,19 1,4
1,18 1,5
1,23 1,9
1,14 <0,8
1,14 1,3
1,14 0,9
k1
7,95
8,61
11,56
12,87
13,26
-27,14
19,51
15,06
12,84
7,76
2,31
13,79
10,04
30C
k2
9,37
10,51
14,03
14,65
16,23
-38,44
22,34
17,70
15,00
9,42
2,54
15,90
11,24
1,18
1,22
1,21
1,14
1,22
Rs
1,6
1,9
1,8
1,3
2,0
1,42 2,7
1,15 1,3
1,18 1,2
1,17 1,5
1,21 1,9
1,10 <0,8
1,15 1,4
1,12 0,8
k1
8,03
7,42
9,38
10,34
11,22
-29,27
14,96
13,03
10,35
6,64
1,92
11,00
9,82
40C
k2
9,45
8,84
11,23
11,63
13,45
-38,41
16,97
15,06
11,94
7,93
2,08
12,57
10,90
1,18
1,19
1,20
1,13
1,20
Rs
1,5
1,7
1,8
1,4
1,8
1,31
1,13
1,16
1,15
1,19
1,08
1,14
1,11
2,8
1,3
1,2
1,4
1,7
1,1
1,3
0,8
80
Los resultados indican que la retencin de los diferentes analitos en estas

columnas depende primariamente de la atraccin coulmbica, que puede
considerarse como el mecanismo de interaccin primario, seguido de la
hidrofobicidad y la aromaticidad de la molcula. La reaccin de derivatizacin
confiere a todos los solutos un grupo dinitrofenil con capacidad aceptora de
electrones , por lo que la interaccin de estos grupos con el anillo de quinolena
de la quinina (dador de electrones ) es altamente posible. Ms an, la reaccin
del reactivo con aminocidos con grupos -amino (como lisina), oxhidrilos
fenlicos (tirosina) y, con menor rendimiento, con grupos imidazol (histidina) da un
producto con dos residuos DNP- por molcula de aminocido 68, 69. Las altsimas
retenciones observadas para lisina y tirosina (no as histidina) sugieren la
formacin de los derivados con dos grupos dinitrofenilo DNP2 Lys y DNP2 -Tyr.
Comparacin entre las columnas con FEQ-QN-SE y FEQ-QN-CE
Con el fin de determinar si existen diferencias en la enantiodiscriminacin entre las
columnas basadas en quinina con y sin tratamiento de recubrimiento final, se
compar el comportamiento entre ambas respecto a la retencin y
enantioselectividad hacia los DNP-aas. Para analizar la retencin se trazaron
grficos del factor de retencin del primer enantimero del par para la columna
con cubrimiento final en funcin del mismo factor para la columna sin este
cubrimiento, ambas columnas en iguales condiciones de temperatura y ws pH . Para
estudiar la enantioselectividad se trazaron grficos del factor de enantioseparacin
para cada racemato en la columna con tratamiento en funcin del mismo factor en
la columna sin tratamiento, en iguales condiciones de temperatura y ws pH . En la
Figura 3.12 se muestran los valores de k1 a ws pH = 6,24 y a todas las temperaturas
(grfico de la izquierda) y tambin los valores de en las mismas condiciones
(grfico de la derecha). Se repite el grfico en la Figura 3.13 para las retenciones
obtenidas a ws pH = 7,03 y a todas las temperaturas. Una correlacin similar fue
observada para todos los ws pH s.
81

(derecha) entre las columnas con FEQ-QN con y sin cubrimiento final a ws pH =
6,24. Temperaturas: : 10C; : 20C; : 30C; : 40C.

(derecha) entre las columnas con FEQ-QN con y sin cubrimiento final a ws pH =
7,03. Temperaturas: : 10C; : 20C; : 30C; : 40C
82
Al igual que con la fase basada en cinconidina, en ambas figuras se observa que
la distribucin de los puntos tiene un alto grado de correlacin, evidenciando que
en ambas columnas el mecanismo de retencin hacia los DNP-aas es
bsicamente el mismo. Los analitos son, en general, ms retenidos en la columna
conteniendo la fase ms hidrofbica, sobre todo a ws pH 6,20. A ws pH 7,03, y a las
temperaturas ms altas, las excepciones son arginina y cistena que se retienen
un 10-15% ms en la columna ms polar. Sin embargo, la comparacin de estas
columnas con las columnas de FEQ-CD indica que las diferencias de retencin en
columna con end-capping y columna sin tratamiento es mucho menor que las
diferencias de retencin exhibidas por la columna a base CD (comparar con la
Figura 3.11).
Los grficos de la derecha de las Figuras 3.12 y 3.13 muestran que no hay
diferencias significativas en las enantioselectividades entre ambas columnas, por
lo tanto al igual que con las columnas con FEQ-CD, se concluye que no hay
diferencias significativas en la capacidad de enantioreconocimiento hacia DNPaas.
En la Figura 3.14 se muestran algunos de los cromatogramas obtenidos con las
columnas conteniendo FEQ-QN con y sin tratamiento de end-capping.
Figura 3.14. Cromatogramas para DNP-Ser (izquierda) y DNP-Ala (derecha)

obtenidos con las columnas con FEQ-QN con (CE) y sin (SE) tratamiento de endcapping. Condiciones: fase mvil 72% MeOH, 28% buffer, ws pH =6,30. Caudal
1mL/min; temperatura de la columna 20C; deteccin a 365 nm.
.
83
Comparacin entre las columnas con FEQ-CD y FEQ-QN

La comparacin entre columnas conteniendo los dos selectores quirales se
muestra en la Figura 3.15, en la que se grafic la retencin del primer enantimero
de cada DNP-aa en las columnas basadas en quinina respecto de los
correspondientes valores en las columnas con CD.
Figura 3.15. Factores de retencin de los DNP-aas en columnas basadas en

quinina en funcin de la retencin en columnas basadas en cinconidina. (A)
columnas sin tratamiento, (B) columnas con tratamiento de recubrimiento final
(end-capping). Fase mvil: 72% MeOH, 28% buffer ws pH = 6,40. Temperaturas:
: 10C ; : 20C; : 30C; : 40C. Lnea de puntos: iguales valores en ambos
ejes.
Las diferencias retentivas son significativamente ms importantes en las columnas

sin tratamiento de recubrimiento (Figura 3.15 A). Los derivados DNP2-lisina y
DNP2-tirosina y, aunque en menor medida, DNP-fenilalanina, son
sistemticamente mucho ms retenidos en la columna con FEQ-QN a todas las
temperaturas. Los factores de retencin de los dems derivados con slo un grupo
dinitrofenilo/molcula en la columna con FEQ-QN son entre dos y tres veces
mayores que los valores correspondientes en FEQ-CD. Esta diferencia retentiva
sistemtica en FEQ-QN es prcticamente independiente de la temperatura.
Considerando las contribuciones no-enantioselectivas y la enantioselectiva a la
retencin ki,ap (ecuacin (1)), se puede escribir que:
84
ki,ap = kq + kne =
nne + n q
nm
= K ne ne + K q q
(2)
donde n indica el nmero de moles de soluto, los subndices m, ne y q indican fase

mvil, sitios no-enantioselectivos y quirales, respectivamente, K representa a la
constante de distribucin, y a la fraccin de sitios de un tipo dado.
Las posibles explicaciones para una diferencia retentiva tan significativa entre
ambos tipos de columnas pueden tener dos orgenes. Un posible origen de estas
diferencias podra estar relacionado con las distintas propiedades fsicas de los
dos materiales usados como soporte. La FEQ-QN fue desarrollada sobre slice de
350 m2/g, y la FEQ-CD sobre slice de 200 m2/g, aunque ambos materiales dan
lechos con distinta densidad (ver Tabla 2.1 del Captulo 2). Si se compara el rea
especfica en relacin al volumen de lecho, ambos materiales son comparables:
126 m2/mL y 110 m2/mL, para el material usado para la sntesis de FEQ-QN y de
FEQ-CD, respectivamente. Esto es, el rea superficial de material por columna, o
bien los valores de ne en ambos casos son similares. Si se considera ahora la
densidad superficial de selectores quirales, la columna basada en quinina (FEQQN) contiene 0,431 mmol/g, de acuerdo con el anlisis elemental basado en el
tomo de nitrgeno. Esta concentracin especfica de selector, sobre este lecho
de menor densidad, permite estimar en 0,155 mmol SQ/mL. Un clculo similar
para la columna conteniendo la FEQ-CD arroja 0,162 mmol SQ/ mL. Las
diferencias en el contenido de selector quiral por unidad de volumen de lecho
difieren en menos de un 5%. En sntesis, como en ambos casos se usaron
columnas de igual dimetro y longitud (igual volumen de lecho), no existen
diferencias ni en la relacin de reas entre FEQ-QN y FEQ-CD, ni en el
cubrimiento de SQ que permitan explicar las diferencias retentivas entre ambas
columnas.
El otro posible origen de las diferencias en factores de retencin es la magnitud de
las constantes de equilibrio involucradas. La heterogeneidad de la superficie
induce a pensar en ms de un sitio de interaccin no-enantioselectivo para el
soluto, adems de las interacciones con el selector quiral. Estrictamente, se ha
definido a la constante Kne para indicar la suma de las posibles contribuciones
debidas a interacciones con grupos silanoles remanentes y con los grupos SH
que no reaccionaron. En el caso de que existiese alguna contribucin a la
retencin de estos analitos por adsorcin inespecfica sobre estos sitios no
quirales de la superficie, esta debera ser similar en ambas columnas, dado que la
relacin entre rea/volumen slo difiere en un 13% entre ambos materiales.
Esta comparacin sugiere que la diferencia retentiva debe atribuirse a las las
interacciones especficas con el selector quiral, esto es, a las diferencias
estructurales entre ambos selectores. Ambas molculas de alcaloide poseen
exactamente la misma configuracin absoluta en todos sus centros quirales y
tambin el arreglo estructural de ambas molculas en su estado de menor energa
en solvente agua es igual 13, 70, lo que indica que la nica diferencia entre ambos
85
selectores es la existencia del sustituyente metoxi en el anillo de quinolena del

alcaloide quinina. El efecto inductivo del sustituyente le confiere una mayor
densidad electrnica al anillo aromtico, propiedad que es complementaria a la
deficitaria densidad de electrones sobre el anillo aromtico de los 2,4dinitrofenilaminocidos.
En la Figura 3.15 B se comparan las retenciones entre las columnas con
tratamiento de recubrimiento. La retencin de los DNP-aas es mayor en FEQ-QNEC a todas las temperaturas, con la excepcin de la correspondiente a DNPasprtico. El tratamiento de end-capping les confiere a ambas columnas mayor
hidrofobicidad y los DNP-aas son sensibles a este cambio: son todos ms
retenidos en las columnas conteniendo fases con tratamiento, pero el incremento
en k es mucho ms importante para la fase FEQ-CD (comparar la Figura 3.11 con
las Figuras 3.12 y 3.13). Esta comparacin nuevamente sugiere que la retencin
debida a la interaccin enantioselectiva de los DNP-aas es la predominante en la
fase basada en quinina. La introduccin de un nuevo sitio no-enantioselectivo de
cadenas de n-hexilo donde tienen lugar interacciones hidrofbicas conduce a un
incremento constante en los valores de kap, que ser similar en ambas columnas
(FEQ-QN-CE y FEQ-CD-CE). Sin embargo, esta contribucin constante provoca
un aumento relativo en ki, ap mucho ms significativo en la columna de CD.
El modelo de interaccin SQ- analito propuesto se esquematiza en la Figura 3.16
para quinina y un DNP-aa genrico, en l se indican con flechas las diversas
interacciones posibles entre los diferentes sitios del SQ y del analito.
Figura 3.16. Modelo de interaccin SQ- analito para la FEQ-QN y DNP-aas.

86
Los factores de enantioselectividad en columnas con ambos tipos de selector

quiral se representaron en la Figura 3.17. Se muestra slo la comparacin entre
columnas sin tratamiento de cubrimiento final, dado que los mismos fueron
estadsticamente equivalentes entre las columnas conteniendo igual selector con y
sin tratamiento de recubrimiento. Se observa claramente que la columna con FEQQN discrimin un mayor nmero de DNP-aminocidos racmicos que la columna
con FEQ-CD y, adems, los factores de enantioselectividad de los racematos
separados en ambas columnas, son sistemticamente superiores. Esto es, la
columna conteniendo FEQ-QN es significativamente superior en su capacidad de
enantioreconocimiento hacia los DNP-aas en comparacin con la columna basada
en FEQ-CD.
Figura 3.17. Grfico comparativo de factores de enantioselectividad entre las

columnas con FEQ-QN-SE y FEQ-CD-SE. Fase mvil ws pH = 6,40. Temperatura
20C.
En lo que sigue se detalla el estudio completo de las variables cromatogrficas

que pueden afectar la enantioresolucin de DNP-aas empleando columnas
basadas en FEQ-QN.
3.3.4. Influencia del pH de la fase mvil.

Las medidas se realizaron en fases mviles de composicin constante a cuatro
valores de ws pH en el intervalo entre 5,00 y 7,00. Las medidas se repitieron a
cuatro temperaturas diferentes entre 10C y 40C, tanto en la columna sin
tratamiento de recubrimiento final como en la columna tratada.
87
En la Figura 3.18 se muestra la dependencia del factor de retencin del primer

enantimero que eluye con el ws pH en las columnas basadas en quinina con y sin
tratamiento de cubrimiento final. En ella se observa un comportamiento que se
repiti a otras temperaturas y para la mayora de los analitos. La retencin de los
DNP-aas en las condiciones cromatogrficas ensayadas muestran un mximo
valor para un ws pH entre 6,0 y 6,5 unidades. La disminucin en los factores de
retencin a ws pH mayor que 7 se atribuye a la prdida parcial de la carga positiva
debida al in hidrgeno unido al nitrgeno quinuclidnico. El pKa2 en agua de la
quinina es de 8,5 71, que corresponde a la disociacin del protn sobre el nitrgeno
quinuclidnico. En la mezcla de metanol y agua al 72%, se estim que el valor del
pKa2 decrece a ws pKa2 = 7,7 72, 73. Esto es, a un ws pH de 7,05, la relacin entre
forma neutra y protonada del alcaloide ([QN]/[QNH+]) es de 0,22 unidades, lo que
implica que aproximadamente un 20% del alcaloide carece de carga positiva.
Figura 3.18. Factores de retencin de DNP-aas en funcin del ws pH para la

columna con FEQ-QN-SE a 40C (izquierda) y con FEQ-QN-CE a 20C (derecha).
Por otra parte, a ws pH alrededor de 5,5 y 5,0, tambin ocurre una disminucin
sistemtica en los factores de retencin de prcticamente todos los solutos. Dicha
disminucin se atribuye al comportamiento cido-base del soluto. En la Tabla 2.2
88
del Captulo 2, se recopilaron los valores de de pKa1 y pKa2 de los aminocidos

nativos en agua. El comportamiento general al disminuir la constante dielctrica
del solvente por mezclado de agua con metanol es un aumento en el pKa
correspondiente a un cido carboxlico (pKa1 de los aminocidos) y una
disminucin de los pKa correspondientes a la disociacin del protn asociado a un
nitrgeno tanto aliftico como aromtico (pKa2 en el caso de aminocidos). A partir
de los valores medidos en agua se pueden estimar los valores de pKa1 y pKa2 en
un medio conteniendo 72% de metanol, ws pKa1 y ws pKa2 , respectivamente 72. Las
diferencias en pKa1 en (72/28) metanol/agua respecto de agua son entre 1,01 y
1,05 unidades de pH, por lo que los ws pKa1 de todos los aminocidos nativos son
entre 3,1 y 3,7. Esto es, en las fases mviles estudiadas, conteniendo un buffer
cuyo ws pH vari entre 5,00 y 7,10, el grupo carboxlico se encuentra como anin.
El anlisis del pKa correspondiente al grupo amino resulta ms complejo. La
inclusin de un grupo 2,4-dinitrofenilo para formar DNP-aas convierte al N primario
aliftico en una anilina N-sustituda, mucho menos bsica. De la bibliografa se
extrajeron valores de pKa a 25 C de molculas con grupos amino con estructuras
similares, dado que no se hallaron los pKa de estos aminocidos N-sustitudos.
As, por ejemplo, los valores de pKa en agua de N-Metilanilina y de N-Etilanilina
son 4,85 y 5,12 respectivamente 71. Ms an, si se considera que el anillo
aromtico tiene dos grupos nitro como sustituyentes, los valores de pKa pueden
ser an menores.
De este anlisis se infiere que a valores de
s
w pH
entre 6 y 7 de los bufferes, los
DNP-aas estarn como aniones, pero a ws pH s cercanos a 5, una fraccin del

soluto se encontrar como zwitterin, dando como resultado cromatogrfico una
disminucin en la retencin en estas columnas conteniendo QNH+.
La influencia del ws pH del eluyente sobre la enantioselectividad se puede observar
grficamente en la Figura 3.19. Aunque las diferencias son poco significativas, se
observa una disminucin sistemtica en la enantioseparacin de todos los DNPaas al disminuir el ws pH . Este perfil se repite a todas las temperaturas, y tambin
en las fases sin tratamiento de recubrimiento final.
89
Figura 3.19. Factores de enantioseparacin de DNP-aas en funcin del

la columna con FEQ-QN-CE a 10 C.
s
w pH
para
3.3.5. Influencia de la concentracin del buffer.

Se estudi el efecto que tiene la concentracin del buffer (fuerza inica) que forma
parte de la fase mvil sobre la retencin de los DNP-aas en la columna con FEQQN sin end-capping. En estas experiencias se mantuvo una composicin de
solventes y de ws pH constantes y las medidas se realizaron a dos temperaturas
diferentes: a 20C y 40C. Los resultados se muestran en la Tabla 3.19.
Tabla 3.19. Factores de retencin para DNP-aas a

inica de la fase mvil a 20C y a 40C.
s
w pH =6,03
0,05M
20C
DNP-aa
Pro
Ser
Ala
Met
Arg
k1
40,12
38,40
42,63
-3,29
k2
50,91
49,88
55,22
-3,78
40C
k1
k2
24,26 29,73
21,77 26,63
24,97 30,95
34,40 40,06
1,97 2,25
s
w pH =
6,03 y distinta fuerza
0,10M
20C
40C
k1
k2
k1
k2
26,23 33,18 16,25 19,88
25,40 32,92 14,72 17,99
27,91 36,04 16,64 20,58
--25,50 29,80
3,20 3,67 1,90 2,16
0,15M
40C
k1
k2
9,97 12,14
8,98 10,94
10,51 12,94
16,09 18,76
1,75 2,06
90
La Figura 3.20 muestra los factores de retencin de los solutos estudiados en

funcin de la concentracin molar de buffer a 40C. La retencin de todos los
derivados disminuye significativamente al aumentar la concentracin de sal. Esta
disminucin en k indica la prevalencia del mecanismo de intercambio inico sobre
las interacciones hidrofbicas en la retencin de estos analitos en este tipo de
columnas. En estas condiciones se observa un comportamiento similar al que
exhiben analitos inicos en cualquier sistema de intercambio inico: disminucin
en la retencin al aumentar la fuerza inica. Sin embargo, la enantioselectividad
de los racematos estudiados en ningn caso cambia con la fuerza inica. La Tabla
3.20 informa los valores de enantioselectividad obtenidos.
Figura 3.20. Efecto de la concentracin de buffer sobre la retencin de DNP-aas a

s
w pH = 6,03 y a 40C.
Tabla 3.20. Efecto de la concentracin del buffer sobre la enantioselectividad de
DNP-aas a ws pH = 6,03 a 20C y a 40C.
s
w pH =6,03
DNP-aa
Pro
Ser
Ala
Met
Arg
0,05M
20C 40C
1,27 1,23
1,30 1,22
1,30 1,24
-1,16
1,15 1,14
0,10M
20C 40C
1,27 1,22
1,30 1,22
1,29 1,24
-1,17
1,15 1,14
0,15M
40C
1,22
1,22
1,23
1,17
1,18
91
3.3.6. Influencia del tipo de modificador orgnico.

El cambio de metanol por acetonitrilo (ACN) se realiz con el fin de estudiar el
efecto sobre la forma de los picos y sobre la enantioselectividad.
La Tabla 3.21 informa los resultados de factor de retencin y de
enantioselectividad de algunos aminocidos derivatizados que fueron
cromatografiados en la columna con FEQ-QN sin end-capping a igual ws pH , en
dos fases mviles de distinta composicin pero de aproximadamente la misma
fuerza eluotrpica.
Tabla 3.21. Factores de retencin, de enantioselectividad y de asimetra (A) para

DNP-aas con fases mviles de aproximadamente la misma fuerza eluyente
compuestas por MeOH y por ACN.
DNP-aa
Pro
Nor
Phe
Tri
Ala
MeOH
20% buffer 100mM
s
w pH =5,50
k2
A
k1
6,82
8,51
1,25 1,9-1,6
8,90 10,97 1,23 1,0-1,0
13,08 16,99 1,30 1,8-1,9
24,36 34,66 1,42 1,8-1,8
8,55
8,55
1,00
2,3
ACN
30% buffer 100 mM
s
w pH = 5,50
k1
k2
A
5,93
7,06
1,19 1,0-1,4
11,25 13,08 1,16 1,3-1,4
13,48 16,48 1,22 1,3-1,5
18,60 24,37 1,31 1,5-1,4
7,88
7,88
1,00
1,8
A: el primero y el segundo valor de la columna corresponden a los factores de

asimetra del primero y segundo enantimero, respectivamente.
Se observa que en todos los casos, la retencin de ambos enantimeros es similar

entre 80% metanol y 70% acetonitrilo, pero en la fase mvil conteniendo
acetonitrilo, la enantioselectividad es sistemticamente menor aunque tambin lo
es la asimetra observada en los picos cromatogrficos. La Figura 3.21 se muestra
comparativamente los cromatogramas de derivados de triptofano y de fenilalanina
en fases mviles conteniendo metanol o acetonitrilo como modificadores
orgnicos.
92
Figura 3.21. Cromatogramas para DNP-Tri y DNP-Phe con fases mviles de

aproximadamente eluotrpicas constituidas por MeOH/buffer y ACN/buffer.
Cromatogramas A: DNP-Tri y B: DNP-Phe. Fase mvil 80% MeOH, 20% buffer,
s
w pH = 6,07 a 20 C.
C: DNP-Tri y D: DNP-Phe. Fase mvil 70% ACN, 30% buffer, ws pH = 6,20 a 20 C.
3.3.7. Influencia de la temperatura.

La temperatura de la columna es una variable importante que determina la
retencin, la enantioselectividad y, consecuentemente, la enantioresolucin en
cualquier separacin enantiomrica, y su influencia es fundamental en
cromatografa de gases. El comportamiento usualmente observado es que tanto
los factores de retencin como la enantioselectividad disminuyen al aumentar la
temperatura de la columna.
Cuando se emplean FEQs, las enantioseparaciones son posibles si existe una
diferencia en las constantes de los equilibrios de complejacin entre el soluto
93
quiral i y la FEQ. En estos equilibrios se considera implcitamente que las

interacciones entre analito y componentes de la fase mvil (solventes, iones, etc.)
son aquirales y no contribuyen al proceso enantioseparativo. Existen, sin embargo,
evidencias de que el rol del solvente en muchos casos no es slo el de modular la
retencin sino que su presencia e interaccin con el entorno quiral relacionado a
algunas fases estacionarias afecta tambin la enantioselectividad 74, 75.
La dependencia de la retencin de soluto i con la temperatura puede expresarse
segn la siguiente ecuacin fundamental:
Hio Sio
+
+ ln
ln k i =
RT
R
(3)
donde ki es el factor de retencin, R la constante universal de los gases, T la

temperatura absoluta, Hi y Si son, respectivamente, las entalpas y entropas
molares de transferencia de i entre fases, y es la relacin de fases. Combinando
la expresin (1) con el factor de enantioselectividad (= k2/k1, donde 1 y 2 se
refiere al orden de elucin de los enantimeros) y la relacin de Gibbs-Helmholtz,
se puede escribir que:
(G) = -RT ln = (H) - (S) T
(4)
donde (G), (H) y (S) expresan diferencias entre enantimeros para la

energa libre, la entalpa y la entropa de adsorcin desde la fase mvil a la
correspondiente FEQ. Si estas cantidades son independientes de la temperatura,
como es usualmente el caso, del grfico de (ln ) vs (1/T) se puede obtener
fcilmente (H) y de la diferencia con (G) se puede calcular (S).
Desde el punto de vista fisicoqumico, (H) es una medida de la diferencia de
las interacciones relativas entre enantimeros al ser transferidos de la fase mvil
al selector quiral correspondiente de la FEQ. El trmino entrpico, (S), es una
medida del cambio en el estado de orden inducido por la interaccin especfica
entre cada enantimero y el selector quiral. Valores negativos de (H) indican
una transferencia desde fase mvil ms exotrmica para el enantimero
preferencialmente adsorbido en la fase quiral. Valores negativos de (S) pueden
interpretarse como un aumento en el orden o una prdida en los grados de libertad
asociados al proceso de enantioreconocimiento. Usualmente, la formacin de
asociaciones intermoleculares altamente ordenadas conlleva una prdida
significativa de los grados de libertad y, en consecuencia, representan un proceso
termodinmicamente desfavorable. Esta prdida de entropa puede compensarse
(al menos parcialmente) por el proceso de desolvatacin parcial que ocurre como
consecuencia de la formacin del complejo enantimero-FEQ. En las situaciones
en que este proceso de desolvatacin domina, (S) ser positivo y, entonces, el
proceso de enantioseparacin se favorece al aumentar la temperatura.
94
De la ecuacin (1) surge que si (H) y (S) poseen el mismo signo, deber
existir una temperatura en la cual las contribuciones al reconocimiento quiral de
origen entlpicas y entrpicas se compensen mutuamente. Esta temperatura,
llamada temperatura de isoelucin, TISO, ser igual a (H)/(S); cuando se
alcance dicha temperatura, los enantimeros coeluyen. Koppenhfer 76 predijo que
ms all de dicha temperatura ocurre una inversin en el orden de elucin entre
ambos enantimeros, y la enantioseparacin aumenta al aumentar ms la
temperatura, lo cual ha sido experimentalmente confirmado 77-80 . Desde un punto
de vista prctico, y trabajando con columnas quirales empleando un fludo
supercrtico como fase mvil, Stringham y colaboradores 81 propusieron modificar
la naturaleza qumica del solvente fuerte usado como eluyente con el objetivo de
disminuir las usualmente altas temperaturas de isoelucin y controlar las
separaciones en el intervalo de temperaturas donde la entropa domina la
separacin. Esta regin de temperaturas tendra la ventaja de lograr mejoras en
las eficiencias por una mejora en la cintica de transferencia de masa y, adems,
una disminucin en el tiempo de anlisis.
Numerosos estudios sobre el efecto de la temperatura fueron descriptos tambin
en HPLC usando varias FEQs. Algunos ejemplos incluyen estudios realizados con
fases de Pirkle 82-85, con ciclodextrinas ligadas a slice 86, 87, fases basadas en
protenas 88-90 y en polisacridos 75, 91-95. Sin embargo, muy pocos estudios fueron
realizados con selectores quirales intercambiadores de iones 10, 96, 97.
Tambin en cromatografa lquida, el conocimiento de la dependencia entre
selectividad y temperatura para un racemato en particular en una dada FEQ
facilita la eleccin de la temperatura ptima para una separacin. Usualmente se
observa que tanto los factores de retencin como la enantioselectividad siguen
una relacin de vant Hoff clsica, aunque tambin en HPLC se han informado
algunos pocos ejemplos de separaciones entrpicamente controladas 75, 86, 88, 89, 91,
93, 98
, y algunos ejemplos en los que la relacin entre el ln k y (1/T) no es lineal,
siendo sin embargo lineal la relacin entre (ln ) y (1/T) 83, lo que sugiere que el
origen de los factores que causan la no-linealidad en los grficos de ln k no estn
vinculados con el proceso de reconocimiento quiral.
Los factores de retencin de los DNP-aas eluidos de todas las columnas y en
todas las condiciones se representaron como ln ki vs (1/T). En las Figura 3.22, se
muestran los grficos de vant Hoff correspondienes a los dos enantimeros de
cinco aminocidos de distinta polaridad, eluidos de la columna FEQ-QN con fase
mvil de ws pH = 6,24. En el grfico inferior se represent la dependencia de la
enantioseparacin con la inversa de la temperatura.
95
Figura 3.22. Grficos de vant Hoff para DNP-alanina, metionina, treonina, histidina
y cido asprtico en la columna FEQ-QN a ws pH = 6,24 (arriba). Dependencia de la
enatioselectividad con (1/T) (abajo).
Se muestran en las Figuras 3.23 y 3.24 los grficos de vant Hoff para los mismos
solutos en la misma columna con fase mvil regulada a ws pH = 7,03 y en la
columna FEQ-CD SE eluidos con buffer a ws pH = 6,40, respectivamente. Grficos
similares fueron obtenidos en todas condiciones experimentales.
Se observa en las figuras que los grficos de ln ki vs 1/T fueron satisfactoriamente
lineales en el estrecho rango de temperatura estudiado (10-40C) con desvos
estndar para los ajustes menores a 0,05 y unos pocos casos menores a 0,1.
96
Figura 3.23. Grficos de vant Hoff para DNP-alanina, metionina, treonina, histidina
y cido asprtico en la columna FEQ-QN a ws pH = 7,03 (arriba). Dependencia de la
97
Figura 3.24. Grficos de vant Hoff para DNP-alanina, metionina, treonina y cido
asprtico en la columna FEQ-CD a ws pH = 6,40 (arriba). Dependencia de la
Las propiedades termodinmicas de transferencia de los enantimeros entre fase

mvil y fase estacionaria quiral Hi y (H) fueron calculados a partir de una
regresin por cuadrados mnimos de los factores de retencin y de
enantioselectividad con la inversa de la temperatura absoluta, respectivamente, y
(S) se obtuvo de la diferencia entre energa libre y entalpa segn:
Hi = -R ln ki/(1/T)
(5)
(H) = -R ln /(1/T)
(6)
(S) = [(H) - (G)]/T
(7)
donde todos los parmetros han sido ya definidos.
98
Como se discuti en la seccin 3.3.2.2., debe tenerse en cuenta que los trminos
enantioselectividad y retencin usados en las expresiones (2) a (4) aluden a los
datos experimentales, por lo que las funciones termodinmicas deducidas sern
valores aparentes, dado que las interacciones no-enantioselectivas, aunque
pequeas en las condiciones en que se realizaron las mediciones, no han sido
consideradas. Por lo tanto, las cantidades informadas a continuacin deben
considerarse como estimaciones semi-cuantitativas de los parmetros
termodinmicos y no como mediciones exactas de estas funciones. Esto es, debe
aclararse que las afirmaciones que se realicen a partir de estos valores, se basan
en la observacin de un gran nmero de sistemas, cuyos valores individuales no
pueden considerarse exactos pero que en el conjunto se comportan en una misma
direccin.
En las Tablas 3.22 a 3.24 se informan los resultados obtenidos.
99
Tabla 3.22. Propiedades termodinmicas para el equilibrio de transferencia de DNP-aas a las fases basadas en quinina
en condiciones de ws pH = 6,24.
FEQ- QN (SE)
Soluto
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Cys
His
Asp
Asn
Lys
Tyr
Glu
H1 a
kJ.mol-1
-18.0 (0.6)b
-20.7 (0.6)
-19.3 (0.6)
-21.5 (0.7)
-20.2 (0.7)
-23.7 (0.4)
-26.3 (0.1)
-25.7 (0.5)
-22.6 (0.7)
-21.0 (0.6)
-18.6 (0.6)
-16.2 (0.8)
-17.5 (0.3)
-16.8 (0.5)
-8.7 (0.1)
-8.7 (0.4)
-18 (0.2)
-31.4 (0.6)
-31.7 (0.7)
-17.6 (0.4)
(H)
kJ.mol-1
-1.23 (0.02)a
-2.08 (0.02)
-1.40 (0.05)
-1.06 (0.02)
-1.83 (0.03)
-2.06 (0.02)
-2.7 (0.1)
-1.01 (0.06)
-1.10 (0.02)
-1.14 (0.02)
-1.97 (0.02)
-0.74 (0.07)
-1.13 (0.04)
-1.5 (0.2)
-0.4 (0.2)
-1.2 (0.1)
-1.0 (0.3)
-0.6 (0.1)
-0.87 (0.05)
-
(G)c,
kJ.mol-1
-0.602
-0.607
-0.606
-0.397
-0.628
-0.713
-0.951
-0.443
-0.481
-0.475
-0.624
-0.351
-0.467
-0.319
-0.322
-0.217
-0.216
-0.393
-0.361
-
FEQ- QN (CE)
-T(S)d
kJ.mol-1
0.63
1.47
0.79
0.66
1.20
1.35
1.78
0.57
0.62
0.66
1.35
0.39
0.66
1.19
0.05
0.98
0.78
0.22
0.51
-
RT ln k1
kJ.mol-1
5.57
5.52
5.88
6.15
6.04
7.57
8.94
7.24
6.69
6.11
5.02
2.34
6.17
6.33
3.47
5.20
5.23
11.30
11.16
9.68
H1b
kJ.mol-1
-25 (2)a
-26 (3)
-25 (2)
-27 (2)
-12 (2)
-18 (1)
-30 (1)
-18 (3)
-27 (2)
-15 (3)
-11 (2)
-16 (4)
-21 (3)
-20 (2)
-10 (1)
-21 (2)
-20 (2)
-31 (1)
-26 (4)
-9 (4)
(H)
kJ.mol-1
-1.3 (0.1)a
-2.0 (0.1)
-1.35 (0.04)
-1.02 (0.04)
-1.1 (0.1)
-4.2 (0.6)
-2.86 (0.02)
-0.7 (0.1)
-1.1 (0.1)
-0.87 (0.03)
-1.81 (0.03)
-0.8 (0.2)
-1.0 (0.1)
-1.1 (0.2)
-0.1 (0.3)
-0.8 (0.1)
-0.8 (0.1)
-0.08 (0.1)
-0.4 (0.1)
-
(G), -T(S)d RT ln k1
-1
kJ.mol-1 kJ.mol-1 kJ.mol
-0.539
0.74
6.48
-0.615
1.38
6.43
0.75
7.13
-0.602
-0.394
0.62
7.23
-0.613
0.46
6.42
-0.641
3.57
7.82
-0.925
1.94
9.56
-0.432
0.24
8.27
-0.484
0.57
8.06
-0.472
0.40
7.80
0.57
6.55
-0.643
e
e
-0.342
0.45
2.42
-0.438
0.59
7.07
-0.304
0.78
6.67
-0.347
-0.22
3.64
-0.263
0.55
5.77
-0.266
0.57
5.78
-0.355
-0.28
12.07
-0.311
0.07
11.97
11.06
a: subndice 1 se refiere al enantimero menos retenido.

b: entre parntesis: desvios estndar de (H) y de H1 , estimados del desvo estndar en las pendientes de los grficos.
c: calculado de RT ln (20C).
d: calculado como (G) - (H)
e: valores a 30C
100
Tabla 3.23. Propiedades termodinmicas para el equilibrio de transferencia de DNP-aas las fases basadas en quinina en
condiciones de ws pH = 7,03.
FEQ- QN (SE)
Soluto
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
His
Asp
Asn
Lys
Tyr
Glu
H1a
kJ.mol-1
-16.8 (0.6)b
-20.0 (0.2)
-15 (1)
-20.9 (0.1)
-23 (3
-28 (2)
-26.1 (0.9)
-27 (2)
-26 (3)
-19.3 (0.7)
-22 (2)
-15 (2)
-15 (2)
-12.7 (0.6)
-18 (1)
-19 (1)
-27 (2)
-32 (1)
-25 (2)
(H)
kJ.mol-1
-1.37 (0.03)a
-2.24 (0.02)
-1.70 (0.03)
-1.24 (0.03)
-2.2 (0.4)
-2.40 (0.07)
-3.1 (0.1)
-1.15 (0.07)
-1.36 (0.05)
-1.25 (0.04)
-2.21 (0.04)
-1.17 (0.04)
-1.39 (0.08)
-1.2 (0.2)
-0.5 (0.5)
-0.6 (0.5)
-0.4 (0.3)
-0.8 (0.1)
-
(G)c,
kJ.mol-1
-0.568
-0.616
-0.631
-0.409
-0.606
-0.729
-0.976
-0.452
-0.494
-0.484
-0.690
-0.380
-0.485
-0.491
-0.249
-0.249
-0.414
-0.370
-
FEQ- QN (CE)
-T(S)d
kJ.mol-1
0.80
1.62
1.07
0.83
1.58
1.67
2.14
0.69
0.86
0.76
1.57
0.79
0.90
0.73
0.29
0.33
-0.05
0.35
-
RT ln k1
kJ.mol-1
4.84
4.41
5.34
5.05
4.92
6.39
7.69
6.02
5.55
4.97
3.95
2.16
5.76
4.29
4.71
4.75
10.72
10.59
10.02
H1b
kJ.mol-1
-15 (1)a
-18 (2)
-17 (2)
-18 (3)
-17 (2)
-22 (2)
-26 (2)
-22 (2)
-19 (1)
-16 (1)
-16 (2)
-12 (2)
-17 (1)
-7 (2)
-19 (3)
-16 (3)
-25 (1)
-25 (4)
-21 (4)
(H)
kJ.mol-1
-1.21 (0.01)a
-2.09 (0.04)
-1.50 (0.04)
-1.09 (0.03)
-1.77 (0.07)
-1.93 (0.03)
-2.85 (0.01)
-1.09 (0.01)
-1.11 (0.09)
-1.29 (0.03)
-2.09 (0.05)
-1.4 (0.2)
-1.18 (0.06)
-1.0 (0.2)
-1.4 (0.1)
-1.4 (0.8)
-0.7 (0.2)
-0.6 (0.1)
-
(G)c -T(S)d RT ln k1
-1
-0.557
0.66
5.78
-0.628
1.46
5.79
-0.622
0.88
6.48
-0.408
0.68
6.60
-0.659
1.11
6.82
-0.676
1.26
8.42
-0.970
1.88
9.99
-0.448
0.64
7.85
-0.505
0.60
7.68
-0.483
0.81
6.46
-0.657
1.43
5.29
2.11
-0.459
0.73
7.25
-0.407
0.56
4.20
-0.276
1.17
5.35
-0.191
1.21
5.35
-0.371
0.35
11.82
-0.334
0.20
11.89
11.50
a, b, c, d: Ver Tabla 3.22.
101
Tabla 3.24. Propiedades termodinmicas para el equilibrio de transferencia de DNP-aas a la FEQ-CD en condiciones de
s
w pH = 6,40.
Soluto
Pro
Ser
Val
Ala
Leu
Phe
Tri
Met
Nor
Abu
Tre
Arg
Ile
Asp
Lys
Tyr
FEQ- CD (SE)
H1b
kJ.mol-1
-15 (1)a
-16.3 (0.1)
-15.7 (0.5)
-16.4 (0.3)
-16.2 (0.7)
-14.3 (0.2)
-16.4 (0.2)
-19.9 (0.7)
-17.9 (0.5)
-17 (1)
-14.6 (0.3)
-15.9 (0.3)
-16.7 (0.3)
-17.3 (0.8)
-14.6 (0.2)
-16.9 (0.2)
(H)
kJ.mol-1
-1.7 (0.1)a
-1.0 (0.6)
-1.06 (0.05)
-0.7 (0.1)
-1.10 (0.06)
-1.60 (0.01)
-1.0 (0.2)
-0.92 (0.07)
-0.73(0.05)
-0.61 (0.09)
-0.98 (0.07)
-
(G)c,
kJ.mol-1
-0.631
-0.229
-0.338
-0.200
-0.370
-0.616
-0.273
-0.268
-0.266
-0.251
-0.251
-
FEQ- CD (CE)
-T(S)d
kJ.mol-1
1.11
0.73
0.72
0.47
0.73
0.98
0.68
0.52
0.47
0.36
0.73
-
RT ln k1
kJ.mol-1
3.62
3.42
3.61
3.69
3.57
3.60
6.45
4.49
4.04
3.74
2.97
1.41
3.99
3.41
1.25
3.45
H1b
kJ.mol-1
-16.6 (0.4)a
-18.6 (0.3)
-16.7 (1.3)
-20.0 (0.5)
-20.1 (0.4)
-16.1 (0.4)
-27.6 (0.8)
-24.8 (0.9)
-19.2 (0.5)
-20 (1)
-16.2 (0.3)
-17 (1)
-18.6 (0.5)
-23.1 (0.5)
-42.4 (12)
-16.7 (27)
(H)
kJ.mol-1
-1.89 (0.03)
-1.9 (0.5)
-1.01 (0.04)
-1.6 (0.2)
-1.86 (0.04)
-1.07 (0.09)
-1.26 (0.04)
-2.1 (0.8)
-2.64 (0.8)
-
(G)c -T(S)d RT ln k1
-1
-0.669
1.22
5.47
-0.146
1.76
5.57
0.69
5.63
-0.321
5.94
-0.394
1.20
5.66
-0.667
1.19
5.45
-0.265
0.81
8.86
-0.266
0.99
6.91
-0.214
1.93
6.23
6.07
-0.237
2.40
4.96
1.72
6.01
6.45
3.11
3.25
a, b, c, d: Ver Tabla 3.22.
102
Se observa en estas Tablas que los valores de diferencias en entalpas de todos los
solutos son negativos o, en unos pocos casos, los valores de (H) son
prcticamente cero.
La tendencia general es que todos los parmetros termodinmicos (absolutos y
relativos) son mayores en las fases basadas en quinina que en cinconidina. La nica
excepcin es la DNP-prolina, nico aminocido cuya estructura posee un grupo
amino terciario cclico. Esta estructura ms rgida determina que el
enantioreconocimiento hacia este aminocido en la columna basada en CD sea
similar a los obtenidos en las columnas FEQ-QN. El resto de los aminocidos
exhiben (G) muy inferiores en las fases FEQ-CD.
En la Figura 3.25 se representaron los valores de (H) en funcin de T(S) a
25C de los DNP-aas en las columnas basadas en quinina. Es evidente que las
enantioseparaciones en estos sistemas son dominadas por la diferencia en las
entalpas de transferencia, y la magnitud de las contribuciones entrpicas a la
energa libre, desfavorables al proceso de discriminacin, estn sistemticamente
relacionadas a las diferencias entlpicas. Los coeficientes de correlacin entre estas
magnitudes para todos los solutos son mayores a 0,93, en ambas columnas para los
dos ws pH s ensayados.
Figura 3.25. Grficos de (H) vs T(S) de DNP-aas en las columnas basadas

en quinina sin (izquierda) y con (derecha) tratamiento recubrimiento final. Fase mvil
de ws pH = 7,03.
Como se discuti ms arriba, (H) mide la diferencia entre las interacciones entre
cada enantimero y el selector quiral de la FEQ. El enantimero ms retenido del
par tiene valores ms negativos de Hi sugiriendo una mayor magnitud para las
interacciones atractivas con el selector quiral. Esto es, podra suponerse que el
enantimero ms retenido del par formar un complejo ms estable debido a
interacciones ms fuertes con la superficie quiral comparado con el enantimero
menos retenido. Esto podra explicar tambin los valores negativos de (S); el
enantimero ms retenido por el selector quiral adquiere una conformacin ms
103
rgida que el menos retenido disminuyendo ms su entropa. En una descripcin

ms completa debera considerarse que, como parte del proceso retentivo, la
molcula de soluto desplaza un nmero de molculas de solvente adsorbidas sobre
la FEQ. Si cada uno de los enantimeros desplaza distinto nmero de molculas de
solvente y/o distinto nmero de contraiones aninicos al interaccionar con el selector
quiral, habr una contribucin diferente al (S) y los valores experimentales de
(S) sern el balance neto resultante del proceso completo de
enantioreconocimiento.
Desde un punto de vista prctico, solamente dos solutos exhibieron factores de
enantioseparacin prcticamente independientes de la temperatura; son los
aminocidos bsicos Lys e His en la columna FEQ-QN-CE a ws pH = 6,24. En
prcticamente el resto de estos sistemas, el cambio de (H) controla las
separaciones, por lo tanto, una disminucin en la temperatura siempre dar como
resultado un aumento en la enantioselectividad. Las enantioresoluciones tambin
fueron mayores a 10C 20C. Las mejoras en las eficiencias observadas a
temperaturas ms altas no compensan prcticamente en ningn caso la disminucin
en la enantioselectividad al aumentar la temperatura.
Schurig y colaboradores introdujeron el concepto de factor de reconocimiento
quiral 99, = -(Gi) /-Gi, cuyo valor permite estimar la relacin entre capacidad
de enantioreconocimiento y fuerza de las interacciones enantioselectivas en
cromatografa de gases. El concepto aplicado a un grupo de molculas quirales
intenta hallar si existe una correlacin entre la energa libre de interaccin con el
selector quiral y la diferencia en energa libre responsable del reconocimiento quiral
(Gi). Ms all del concepto, los autores reportaron valores de aleatorios para
un grupo de teres cclicos separados en una columna quiral conteniendo un
quelato de Ni(II). La hiptesis de la existencia de alguna correlacin similar para los
sistemas en estudio en esta tesis fue evaluada en grficos de RT ln ki vs (Gi).
La Figura 3.26, representativa de grficos en todas las columnas y condiciones de
s
w pH , indica claramente que no existe correlacin alguna cuando se incluyen todos
los analitos. Sin embargo, cuando se omiten los puntos correspondientes a lisina y
tirosina, la dispersin disminuye significativamente. Estos dos solutos corresponden
a los dos analitos que reaccionan con dos grupos dinitrofluorobenceno por molcula
de aminocido (en el OH fenlico de tirosina y en el grupo -amino de la cadena
lateral la lisina) 69, 100. La retencin de estos dos solutos es significativamente
superior a la del resto de los DNP-aas, incluyendo los relativamente hidrofbicos
como fenilalanina. Esto es, la inclusin de un segundo grupo dinitrofenilo le confiere
un adicional de retencin que decrece la enantioselectividad aparente. El coeficiente
de correlacin para el grfico de la Figura 3.26, para el resto de los puntos
(exceptuando a lisina y tirosina) es 0,39. El mismo patrn de comportamiento fue
observado con la otra columna y en otras condiciones de ws pH de fase mvil.
Ninguna correlacin fue observada, en cambio, con las columnas basadas en
cinconidina.
104
Figura 3.26. Grfico de (G) en funcin de la retencin de los DNP-aas en la

columna FEQ-QN (CE). Fase mvil: 72% MeOH, 28% buffer ws pH = 7,03. Smbolos
abiertos: derivados de lisina y de tirosina.
3.3.8. Columnas acopladas. Cromatografa bidimensional.

La gran complejidad de ciertas muestras, como las de origen biolgico y ambiental
entre otras, ha llevado al desarrollo de tcnicas cromatogrficas con mayor
capacidad de picos y, en consecuencia con mayor poder de resolucin que
permiten, si es necesario, excluir las interferencias debidas a la matriz. El poder de
resolucin de la tcnica de HPLC puede aumentarse significativamente
introduciendo tcnicas de LC multidimensional. Con esta modalidad, la muestra es
separada por una combinacin de columnas cromatogrficas con caractersticas de
separacin complementarias 101.
La ventaja ms importante de una separacin bidimensional respecto a una
separacin unidimensional es el incremento enorme en la capacidad de picos
(definida como el nmero mximo de picos que puede acomodarse en un intervalo
dado de tiempo con una resolucin tal que satisfaga las necesidades del anlisis)
como resultado de la relacin-producto entre la capacidad de picos de la primera y
segunda dimensin. El alcance y el potencial de las separaciones
multidimensionales fueron descriptas en detalle por Giddings 102, por Paola et al. 103
y por Carr et al. en una revisin reciente de 2D-LC rpida 104.
La cromatografa multidimensional puede realizarse segn el modo off-line u online. En el primero de ellos, las fracciones que eluyen de la primera columna son
colectadas manualmente o por un colector de fracciones y son re-inyectadas en una
segunda columna. Las ventajas de este modo consisten en la simpleza de su
105
aplicacin dado que no requiere de instrumental complementario y que las fases

mviles no deben ser necesariamente compatibles. Sin embargo, es un
procedimiento laborioso, el tiempo que lleva el anlisis es largo y muchas veces
hay prdidas de muestra importantes. Las tcnicas on-line tienen la ventaja de
poder ser automatizadas mediante el uso de una vlvula controladora que permita la
introduccin de fracciones del eluyente de la primera columna en la segunda unidad.
La automatizacin mejora la calidad y continuidad del anlisis as como tambin
disminuye su tiempo y la probabilidad de prdida de la muestra. La principal
limitacin de esta modalidad es que el sistema de fases mviles utilizado en el
acoplamiento debe ser compatible, tanto en miscibilidad como en la fuerza y
viscosidad de los solventes 105. Esto es debido a que el eluyente de la primera
columna es el solvente de inyeccin de la muestra que entra en la segunda.
Los experimentos de LC con columnas acopladas pueden realizarse en los equipos
de HPLC comerciales combinando columnas, fases mviles y detectores y pueden
subdividirse en sistemas homomodales y heteromodales 106.
LC-LC homomodal: en estos sistemas la mejora cromatogrfica ocurre acoplando
columnas de selectividad similar. El principal objetivo es optimizar una separacin
que ya es satisfactoria, por ejemplo concentrando una muestra o disminuyendo el
tiempo de anlisis.
LC-LC heteromodal: en estos sistemas, esencialmente se vara el mecanismo de
separacin durante el proceso, pueden obtenerse cambios en la selectividad
cambiando la naturaleza de la fase estacionaria para que tengan caractersticas de
separacin complementarias. El trmino LC-LC y en forma ms general LC
multidimensional, usualmente se refiere a estos sistemas, que involucran modos de
separacin tan diferentes como sea posible (ortogonales) y con los cuales se logran
diferencias relativas en la retencin de los analitos 107.
Probablemente el enriquecimiento de trazas y el clean-up de las muestras sean las
aplicaciones ms importantes de estos mtodos de separacin, cuyo inters
aument rpidamente en los ltimos aos, particularmente en anlisis de muestras
de origen ambiental y biolgico que demandan determinaciones precisas de
compuestos presentes en muy bajas concentraciones en matrices complejas.
El acoplamiento LC-LC heteromodal ha sido muy utilizado tambin como tcnica de
separacin quiral. El orden en la combinacin de una columna aquiral y una quiral
es variable y dependiente del tipo de restriccin que haya que superar, como por
ejemplo: poca cantidad de muestra, baja concentracin del analito, una matriz
compleja, monitoreo de pureza ptica 108-113.
Dos modalidades son posibles. El modo de LC bidimensional LCxLC
(comprehensive) se caracteriza por la conexin on-line entre las dos columnas y
por la transferencia de cada fraccin que eluye de la primera columna hacia la
segunda. Este mtodo provee informacin qumica completa de la muestra. La
operacin de este sistema debe ser totalmente automatizada. En el modo
bidimensional heart-cut, slo fracciones elegidas del eluyente de la primera
columna son analizadas en la segunda.
106
Luego de estudiar la retencin y enantioselectividad hacia los DNP-aas de las

columnas quirales basadas en las diferentes fases estacionarias sintetizadas (FEQCD y FEQ-QN ambas con y sin tratamiento de end-capping), se propuso evaluar la
posibilidad de resolver diferentes DNP-aas entre s adems de enantioresolver cada
mezcla racmica. La observacin de los resultados con las distintas columnas y
condiciones revel la existencia de algunas mezclas relativamente complejas. A
modo de ejemplo en las Figuras 3.27 y 3.28 se muestran los valores para los
tiempos de retencin de los DNP-derivados de Ile, Ser, Val, Ala y Tre,
cromatografiados a 10C y a 40C con una fase mvil de igual composicin y
s
w pH =6,40 sobre las cuatro FEQs mencionadas.
25,00
20,00
tr (min)
Ile
15,00
Ser
Val
10,00
Ala
Tre
5,00
0,00
tr1
tr2
FEQ-QN-CE
tr1
tr2
FEQ-QN-SE
tr1
tr2
FEQ-CD-CE
tr1
tr2
FEQ-CD-SE
Figura 3.27. Tiempos de retencin de DNP-aas cromatografiados a

10C sobre columnas con distintas FEQs.
s
w pH =6,40
10,00
9,00
tr (min)
8,00
7,00
Ile
6,00
Ser
5,00
Val
4,00
Ala
3,00
Tre
2,00
1,00
0,00
tr1
tr2
FEQ-QN-CE
tr1
tr2
FEQ-QN-SE
tr1
tr2
FEQ-CD-CE
tr1
tr2
FEQ-CD-SE
Figura 3.28. Tiempos de retencin de DNP-aas cromatografiados a

40C sobre columnas con distintas FEQs.
s
w pH =6,40
107
Puede verse que en todos los casos la situacin es similar, los diez picos
cromatogrficos correspondientes a los cinco pares de enantimeros eluyen de la
columna en forma solapada, impidiendo la resolucin de la mezcla. Esta co-elucin
de los analitos se observa para todas las variables cromatogrficas estudiadas. Es
decir, tanto la enantioselectividad como la selectividad en todas las condiciones son
similares.
Se realiz entonces la comparacin entre la retencin de los DNP-aas en una
columna no quiral convencional (octadecilslice) con las columnas con FEQ-CD y
FEQ-QN con y sin cubrimiento final. Se compar el factor de retencin de cada
DNP-aa para la columna aquiral operada con un gradiente de fase mvil de MeOH y
buffer de pH 4,50 a 40C con los obtenidos para cada condicin de ws pH y de
temperatura y para cada una de las columnas quirales.
En la Figura 3.29 se muestran los grficos obtenidos para la comparacin entre la
columna no quiral y las columnas con FEQ-QN con y sin end-capping.
Figura 3.29. Comparacin del factor de retencin para DNP-aas entre una columna
aquiral y las columnas con FEQ-QN con y sin cubrimiento final.
Condiciones: a) Columna aquiral (Eclipse XDB-C18): fase mvil A= buffer pH 4,57;
B= MeOH. Gradiente de 15 a 75% B en 45 minutos. Temperatura 40C; caudal 2
mL/min
b) Columna quiral: fase mvil 72% MeOH, 28% buffer ws pH =6,32; temperatura 20;
caudal 1mL/min; deteccin a 365 nm.
En estos grficos se puede observar una gran dispersin de los puntos (r2=0,24 y
0,21), esto sugiere que el mecanismo de separacin que opera en ambas columnas
es diferente y en consecuencia podran combinarse ambas para mejorar la
resolucin de una mezcla medianamente compleja de estos DNP-aas racmicos.
108
Con este propsito se acopl la columna quiral FEQ-QN con end-capping a

continuacin de la de octadecililslice, cada una de ellas operada con las fases
mviles que ya se describieron constituyendo de esta forma un sistema acoplado
heteromodal en modo heart-cut. El acople se realiz empleando una vlvula de
seis vas e interponiendo un cartucho de octadecilslice, como se describi en
detalle en la seccin 2.1.2.5. Esta configuracin relativamente sencilla permiti que
fracciones elegidas del eluyente de la primera columna fueran analizadas en la
columna quiral o que, alternativamente, se dirigieran a los desechos.
Trabajando de esta forma se logr la resolucin parcial de las mezclas 1 a 4, en las
condiciones que se describen a continuacin.
Mezcla 1: formada por DNP-derivados de Arg, Asn, Tre, Val, Met, y Tri.
Mezcla 2: formada por DNP-derivados de Ala, Ser, Tre, Ile y Val.
Mezcla 3: formada por DNP-derivados de Arg, Pro, Met, Tri y Abu.
Mezcla 4: formada por DNP-derivados de Arg, Pro, Met, Tri, Abu y Nor.
Columna 1: Eclipse XDB-C18; dimensiones 7,5x 0,46 cm.

Fase mvil: gradiente de MeOH y buffer de pH 4,50.
Temperatura de la columna 1: 40C.
Caudal de la fase mvil 1: 2mL/min.
Columna 2: empaquetada con FEQ-QN con cubrimiento final.

Fase mvil: varios gradientes de MeOH y buffer de ws pH =6,25.
Temperatura de la columna 2: 20C.
Caudal de la fase mvil 2: 1mL/min.
En las Figuras 3.30 a 3.33 se muestran los cromatogramas obtenidos en las

condiciones mencionadas.
109
Figura 3.30. Cromatograma de la mezcla 1 resuelta con columnas acopladas.
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118
Captulo 4. Conclusiones.
Del anlisis de los resultados experimentales obtenidos en el presente trabajo,
se desprenden las siguientes conclusiones:
Formacin de pares inicos
Se obtuvo una incapacidad separativa total mediante esta tcnica.
Cromatografa lquida con intercambio de ligandos quirales (CILQ)
Se logr la enantioresolucin de aminocidos racmicos (nativos y dabsilados)
con esta modalidad a partir de la formacin de complejos ternarios mixtos entre
cada uno de los enantimeros, el ion Cu(II) y el alcaloide cinconidina.
Se comprob que el ion Cu(II) es un partcipe necesario en la formacin de
dichos complejos y se model, empleando modelos moleculares, la estructura
conformacional de los mismos.
Si bien se logr la enantioresolucin de varios racematos, las dificultades
experimentales asociadas a esta modalidad cromatogrfica llevaron a la
bsqueda e implementacin de otras estrategias de separacin quiral ms
reproducibles.
Desarrollo de fases estacionarias quirales (FEQs)
Se desarrollaron diversos protocolos de sntesis que permitieron la fijacin
covalente de los alcaloides cinconidina y quinina sobre partculas de slice de
uso cromatogrfico. A ambas FEQs se les realiz posteriormente un
tratamiento de cubrimiento final de los grupos reactivos remanentes. Se
lograron cubrimientos superficiales de selector quiral elevados y comparables
con los publicados en las referencias bibliogrficas. Tambin se comprob que
la estabilidad de estas columnas es relativamente alta.
Con las FEQs sintetizadas basadas en cinconidina (FEQ-CD) y quinina (FEQQN) se empaquetaron columnas para HPLC y se estudi la capacidad de
enantioreconocimiento de las mismas hacia aminocidos derivatizados
utilizndolas como columnas intercambiadoras de aniones quirales (CQII).
Con ambas FEQs se logr resolver con enantioselectividades variables,
dinitrofenilderivados de aminocidos. Con la FEQ-QN se obtuvo un mayor
nmero de racematos resueltos, diecinueve de los veinte derivados ensayados;
en comparacin con la FEQ-CD, que resolvi once de los diecisis derivados
estudiados. En todos los casos en que se hall enantioseparacin con ambas
columnas, sta fue mayor con la basada en FEQ-QN. En estas columnas la
119
retencin depende de las interacciones electrostticas entre el selector quiral

(carga positiva sobre el nitrgeno quinuclidnico del alcaloide) y el analito
(carga negativa del carboxilato del aminocido), de la interaccin entre
electrones del anillo aromtico de quinolena con los electrones del
dinitrofenil-sustituyente de los analitos, y en menor medida, de la hidrofobicidad
del analito. Si bien se postula que el mecanismo de retencin y de
enantioreconocimiento es esencialmente el mismo, las mejoras observadas
para la columna basada en quinina se atribuyen a la diferencia qumica en la
estructura de ambos selectores quirales, ms precisamente, al efecto inductivo
ejercido por el sustituyente metoxi sobre el anillo aromtico del SQ de quinina,
complementario del carcter electroflico de los dinitrofenil-derivados.
La comparacin de la retencin y enantioselectividad de estos analitos en las
columnas conteniendo FEQ-CD con y sin tratamiento de cubrimiento final,
muestra que el tratamiento de end-capping le confiere mayor hidrofobicidad a
la FEQ y por lo tanto, la retencin de los analitos en ella es mayor. La
constancia en los valores de enantioselectividad entre ambas columnas es
explicable si se les atribuye a las cadenas lineales de C6 alguna participacin
en el mecanismo de enantioreconocimiento.
Del estudio sistemtico de la influencia de las variables cromatogrficas sobre
la retencin y enantioselectividad de estos analitos en la columna con FEQ-QN,
surgen estas conclusiones:
El ws pH de la fase mvil afecta el grado de ionizacin del selector quiral y de los
analitos y, en consecuencia, la retencin de estos ltimos. La retencin es
mxima a ws pH entre 6,0 y 6,5 aunque la enantioselectividad decrece
sistemticamente al disminuir el ws pH .
El aumento de la concentracin del buffer constituyente de la fase mvil
disminuye la retencin de los analitos en la columna. Este es un
comportamiento general en los sistemas donde el mecanismo predominante es
el de intercambio inico. El aumento de la fuerza inica del eluyente no afecta,
sin embargo, el proceso de reconocimiento quiral.
La enantioselectividad en este sistema cuando se usa metanol como
modificador orgnico en la fase mvil es mayor que cuando se usa acetonitrilo.
Esto indica que el rol del solvente fuerte no se limita a controlar la retencin de
los analitos sino que probablemente posea alguna participacin en el
mecanismo de discriminacin quiral.
El efecto de la temperatura sobre la capacidad de enantioreconocimiento de
estas columnas hacia dinitrofenil-aminocidos fue establecida a partir de los
grficos de logaritmo de enantioselectividad en funcin de la inversa de la
temperatura, aceptablemente lineales en el rango estudiado. El aumento de la
temperatura dentro del rango entre 10C y 40C provoca la disminucin de la
retencin y de la enantioselectividad de todos estos solutos en todas las
condiciones estudiadas, lo que indica que la diferencia en las entalpas de
interaccin de ambos enantimeros con la fase quiral domina el proceso de
120
enantioreconocimiento en prcticamente todos los casos. Finalmente, si bien

se hall que las diferencias (S) correlacionan con las variaciones de
entalpa (H), no se observa relacin entre la energa libre de retencin y la
correspondiente variacin en (G). Las diferencias en las constantes de
equilibrio para los complejos enantimero-SQ que hacen posible el proceso de
discriminacin quiral son muy sutiles y, en consecuencia, difciles de modelar y
de predecir.
Columnas acopladas
La modificacin de ninguna de las diversas variables cromatogrficas del
sistema (temperatura, ws pH y fuerza inica de la fase mvil) permiti la
resolucin de mezclas medianamente complejas de dinitrofenil-aminocidos
racmicos.
El acoplamiento de una columna con FEQ-QN a continuacin de una de
octadecilslice operadas con fases mviles que permitan la constitucin de un
sistema bidimensional heteromodal en modo heart-cut posibilit la resolucin
exitosa de las mezclas mencionadas.
121

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS

Trabajo de Tesis Doctoral

Estudio cromatogrfico de asociacin entre

Lic. Sonia Keunchkarian

El presente trabajo de Tesis fue realizado en el Laboratorio de Separaciones

Lic. Sonia Keunchkarian

Dra. Cecilia B. Castells

Al Dr. ngel M. Nardillo por su predisposicin a prestar colaboracin y/o

A mis compaeros de trabajo del Laboratorio de Separaciones Analticas por

A todos Muchas Gracias!!!

1.2. Enantioseparaciones requeridas en la industria

1.5. Objetivos generales

Captulo 2. Seccin Experimental.

2.1.1. Reactivos y solventes

2.1.1.1. Adicin de selectores quirales en fase mvil

2.1.1.2. Sntesis de fases estacionarias quirales

2.1.1.3. Empaque de las columnas

2.1.1.4. Reaciones de derivatizacin de aminocidos

2.1.1.5. Fases mviles

Adicin de selectores quirales en fase mvil

2.1.2.1. Adicin de selectores quirales en fase mvil

2.1.2.2. Sntesis de fases estacionarias quirales

2.1.2.3. Empaque de las columnas

2.1.2.4. Reacciones de derivatizacin de aminocidos

2.2. Estudio de los alcaloides cinconidina y quinina como aditivos

2.3. Sntesis de las fases estacionarias quirales

2.4. Reacciones de derivatizacin de aminocidos

Con cloruro de dabsilo (Dbs-Cl)

Adicin de selectores quirales en fase mvil

Captulo 3. Resultados y discusin

3.2. Estudio de los alcaloides cinconidina y quinina como aditivos

3.2.1. Formacin de pares inicos

3.2.2. Cromatografa lquida con intercambio de ligandos quirales

3.2.2.1. Resultados cromatogrficos obtenidos con el modo CILQ

3.2.2.2. Discusin sobre el mecanismo de separacin quiral

3.3. Fases estacionarias quirales (FEQs)

3.3.1. Sntesis de las FEQs. Resultados y discusin

3.3.2. Columnas quirales basadas en cinconidina (FEQ-CD).

3.3.2.1. Modo CILQ

3.3.2.2. Modo cromatografa quiral de intercambio inico (CQII)

Comparacin entre las columnas con FEQ-CD-SE y

3.3.3. Columnas quirales basadas en quinina (FEQ-QN).

3.3.3.1. Modo CQII

3.3.4. Influencia del pH de la fase mvil

3.3.5. Influencia de la concentracin del buffer

3.3.6. Influencia del tipo de modificador orgnico

3.3.7. Influencia de la temperatura

3.3.8. Columnas acopladas. Cromatografa bidimensional

1.1. Definicin, origen e importancia de la quiralidad

Figura 1.1. Formas enantiomricas de una molcula quiral. Comparacin con la

demasiado simple, dado que no considera la posibilidad de que la interaccin

Figura 1.2. Modelo de interaccin de tres puntos en el que se muestran las

el estudio las propiedades qumicas de cada ismero individualmente as como

1.2. Enantioseparaciones requeridas en la industria.

Figura 1.3. Estructura de ambos enantimeros de la talidomida.

Estudios ms recientes mostraron que, an cuando la ingesta del frmaco se

Tabla 1.1. Efecto de la quiralidad sobre algunos productos farmacuticos.

Actualmente las autoridades regulatorias exigen cada vez ms controles para

enantimeros/estereoismeros de los frmacos candidatos. Las propiedades

Figura 1.4. Porcentaje de drogas aprobadas segn su caracter quiral entre

Desde 1983 a 2002, el porcentaje de racematos disminuy de 32 a 8%,

Tabla 1.2. Efecto de la quiralidad sobre aditivos alimenticios.

1.3. Estrategias de separacin de enantimeros.