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CARRERA
PLAN DE ESTUDIOS
QFB
2009
PRCTICA
NMERO
CLAVE DE LA
ASIGNATURA
NOMBRE DE LA ASIGNATURA
INMUNOLOGA
NOMBRE DE LA PRCTICA
FECHA Y
DURACIN
7
Determinacin de anticuerpos contra HIV 1 y 2
1 sesin
1
INTRODUCCIN
El virus de inmunodeficiencia humana (HIV) es un retrovirus identificado en 1983 como el agente
etiolgico del Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Dos subtipos, el HIV-1 y el HIV-2,
pueden ser distinguidos. Las principales vas de trasmisin del HIV son el contacto sexual, la
contaminacion a travs de la sangre o productos sanguneos y la trasmisin de la madre al recin
nacido. Las principales clulas infectadas por el HIV son los linfocitos CD4, que desempean un papel
importante en el sistema de defensa inmunolgica del organismo. La progresiva declinacin del nivel de
CD4 durante el desarrollo de la enfermedad conduce al desarrollo de infecciones oportunistas que llegan
a compremeter la vida del husped.
El virus de HIV consiste en una molcula de RNA genmico protegida por una cpside y una envoltura.
La envoltura del HIV es el principal objetivo de la respuesta de los anticuerpos humorales. El diagnstico
serolgico de la infeccin de HIV se basa en la deteccin especfica de anticuerpos contra proteinas de
la envoltura del HIV.
2
OBJETIVOS
Determinar la presencia de anticuerpos anti HIV 1 y 2 en una muestra de sangre mediante un ensayo
inmuno-enzimtico indirecto de fase slida (EIA).
.
3
FUNDAMENTO
La prueba a desarrollar es un ensayo inmuno-enzimtico indirecto de fase slida (EIA). La fase slida es
un Peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente est sensibilizado en tres reas reactivas:
La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada fila contiene una solucin reactiva lista
para ser usada en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el Peine de una
fila a otra, con un perodo de incubacin en cada etapa. Para comenzar la prueba, se agregan muestras
de suero o plasma al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de Desarrollo. Luego se inserta
el Peine en los pocillos de la fila A. Los anticuerpos anti-HIV, en caso de estar presentes en las
muestras, se unirn especficamente a los pptidos sintticos en los puntos inferior y medio de los
dientes del Peine (Figura 1). Simultneamente, las inmunoglobulinas presentes en las muestras son
capturadas por los anticuerpos dirigidos contra inmunoglobulina humana del punto superior (Control
Interno). Los componentes no unidos son eliminados con un lavado en la fila B.
En la fila C y D, el capturado en los dientes reacciona con los anticuerpos anti- humano marcados con
fosfatasa alcalina (FA). En la fila siguiente, los componentes no unidos son eliminados mediante un
lavado. En la fila F, la fostafasa alcalina unida reacciona con componentes cromognicos. Los
resultados son visibles como puntos de color azul grisceo en la superficie del diente del Peine.
Figura 2. Peine.
Bandeja de desarrollo.
La Bandeja de Desarrollo consiste de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una (Figura 3). Los contenidos de
cada fila son los siguientes:
4
A
PROCEDIMIENTO
EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS
REACTIVOS:
Kit para determinacin de HIV 1 y 2 EIA fase slida.
MATERIALES:
MATERIAL DE APOYO
Material comn de laboratorio.
MATERIAL BIOLGICO:
Suero de paciente.
APARATOS E INSTRUMENTOS
Centrfuga.
Pipetas automticas de volumen variable 10 a 100 uL
B
DESARROLLO DE LA PRCTICA
PREPARACIN DE LAS MUESTRA BIOLGICA.
1. Extraccin de una muestra de sangre venosa.
a. Realizar la extraccin de una muestra de sangre total por puncin venosa en un tubo sin
anticoagulante.
b. Esperar 15 minutos para que la muestra coagule completamente.
c. Centrifugar la muestra para obtener el suero durante 5 minutos a 2500 r.p.m.
d. Concluido el proceso de centrifugacin verificar que el gel separador se encuentre entre
las dos fases de la sangre total y que el suero sea transparente y no presente hemlisis.
PROCEDIMIENTO.
Reaccin AntgenoAnticuerpo (Fila A de la Bandeja de Desarrollo).
1. Toma 50 l de la muestra con la pipeta. Perfora con la punta de la pipeta o el perforador la
cubierta de papel de aluminio de un pocillo en la fila A de la Bandeja de Desarrollo y vierte la
muestra en el fondo del pocillo. Mezcla vaciando y rellenando repetidamente la solucin con la
pipeta. Desecha la punta de la pipeta.
2. Repite el paso 1 para las dems muestras, incluyendo un control positivo y uno negativo
provistos en el kit. Usa un nuevo pocillo en la fila A y cambia la punta de la pipeta para cada
muestra o control.
3. Inserta el Peine (con el lado impreso hacia ti.) en los pocillos de la fila A que contienen las
muestras y los controles. Mezcla: Retira e inserta el Peine en los pocillos varias veces.
4. Deja el Peine en la fila A durante exactamente 10 minutos. Activa el cronmetro. Mezcla dos
veces ms durante la incubacin. Hacia el final de los 10 minutos, perfora el papel aluminio en la
fila B usando el perforador. No abras ms pocillos de los necesarios.
5. Al cumplirse los 10 minutos, saca el Peine de la fila A. Retira el lquido adherido a las puntas
de los dientes apoyndolos sobre un papel absorbente limpio. No toques la superficie frontal del
diente.
Primer Lavado (Fila B).
6. Inserta el Peine en los pocillos de la fila B. Agita: inserta y retira vigorosamente el Peine en los
pocillos durante al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repite el lavado varias
veces agitando en el transcurso de 2 minutos; mientras tanto, perfora el papel aluminio de la fila
C. Despus de dos minutos, retira el Peine y retira el lquido adherido como en el paso 5.
Unin del Conjugado (Fila C).
7. Inserta el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcla el Peine varias veces como en el paso 3.
Programa el cronmetro para 10 minutos. Mezcla como en el paso 4. Perfora el papel aluminio
de la fila D. Despus de 10 minutos, retira el Peine y absorbe el lquido adherido.
Incubacin en el Conjugado (Fila D).
8. Inserta el Peine en los pocillos de la fila D. Agita como en el paso 7. Espera 2 minutos; mientras
tanto, perfora el papel aluminio en la fila E. Despus de dos minutos, retira el Peine y
absorbaeel lquido adherido.
Lavado (Fila E).
9. Inserta el Peine en los pocillos de la fila E. Agita. Espere 2 minutos; mientras tanto, perfora el
papel aluminio de la fila F. Despus de dos minutos, retira el Peine y absorbe el lquido
adherido.
Reaccin de Color (Fila F).
10. Inserta el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcla como en el paso 3. Programa el cronmetro
para 10 minutos. Mezcla como en el paso 4. Despus de 10 minutos, retira el Peine.
Detencin de la Reaccin (Fila E).
11. Inserta de nuevo el Peine en la fila E. Despus de un minuto, retira el Peine y djalo secar al
aire.
C
EXPRESIN DE RESULTADOS E INFORME DE LA PRUEBA.
Validacin.
A fin de confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son vlidos,
deben cumplirse las siguientes tres condiciones (ver Figura 5):
1. El Control Positivo debe producir tres puntos en el diente del Peine.
2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control Interno) y no otros puntos.
3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior (Control Interno). Esto tambin
confirma que la muestra ha sido agregada.
Si cualquiera de estas tres condiciones no se cumple, los resultados de la prueba no son vlidos y las
muestras y controles deben ser reexaminados.
5
INTERPRETACIN Y CONCLUSIONES
Se elaboraran de acuerdo a los resultados obtenidos y la importancia diagnstica de la prueba.
6
ANEXOS
REFERENCIAS
Gnann Beelaert G et. al. 2002. Comparative evaluation of eight commercial enzyme linked immunosorbent assays and 14 simple
assays for detection of antibodies to HIV. Journal of Virology Methods, 105 (2): 197-206.
Constantine NT. 1999. HIV antibody testing, p. 105-112. In P.T. Cohen, M.A. Sande, and P.A. Volberding (ed.), The AIDS
knowledge base, 3rd ed. Lippincott-Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.
Gilmore, N. 1996. Blood and blood product safety, p. 287-301. In J. Mann and D. Tarantola (ed.), AIDS in the World, vol II. Oxford
University Press, Oxford, England.
Grant AD, De Cock KM. 2001. HIV infection and AIDS in the developing world. British Med. Journal, 322: 1475- 1478.
Janssen RS et al. 1998. New testing strategy to detect early HIV-1 infection for use in incidence estimates and for clinical and
prevention purposes. JAMA 280:42-48.
Schacer TW, Hugu JP, Shea T, et al. 1998. Biological and virological characteristics of primary HIV infection. Ann. Intern. Med.
128: 613-620.
UNAIDS/WHO. 2002. Joint UN programme on HIV/AIDS (UNAIDS) Report on the Global HIV/AIDS epidemic, p. 1-226. Geneva.
8
MECANISMO DE EVALUACIN
Puntualidad y asistencia
40%
Bitcora
20%
Reporte
20%
Conocimientos previos
20%
9
10