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ESPECTROFOTOMETRIA
a) Longitud de onda (): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del
movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm) y sus
equivalencias son: 1nm = 1m =10
10
m.
(h = Cte. de Planck =
6,62x 10
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2.
A.
FENMENO DE ABSORCIN
B.
FENMENO DE EMISIN
Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental
produciendo la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa
emitida y, en este fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia.
3.
LEYES DE ABSORCIN
Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta prdida de
intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia.
T = Is / I0 ;
%T = (Is / I0 ) x 100.
Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para evitar
este error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO, que
contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que
vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta
medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco.
Si el %T = 100
Si el %T = 0
4. LEY DE BEER
A = . b. c
Siendo:
1. Por comparacin con una solucin conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema
(P) y una estndar (S), podemos establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas:
2. A travs de una curva de calibracin: la curva de calibracin es la representacin
grfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la
Concentracin (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida
y se determinan sus A, construyndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez
ensayadas las soluciones problemas, su concentracin se averigua por interpolacin de
las A de las soluciones problema en la curva de calibracin.
Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del
cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin.
Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad se deja de
cumplir la Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La lectura de la
Absorbancia fuera de los lmites de linealidad se traduce en una concentracin
falsamente baja de cromgeno. En esta situacin, hay que diluir la muestra para que su
concentracin entre en los lmites de la linealidad.
Empleo de los Factores de Calibracin: Para reactivos estables y sistemas
fotomtricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo slo necesario
ensayar las muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F.
5. ESPECTROFOTMETRO
Tipos de lmparas:
Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro
visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes de un espectro continuo de energa radiante
entre 360-950 nm.
Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duracin y emiten
energa radiante de mayor intensidad.
Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la regin
ultravioleta entre 220-360 nm.
Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas
que se utilizan para calibracin de longitudes de onda, se emplean solo para
espectrofotmetros y cromatografa HPLC.
Precauciones:
Las subidas y bajadas bruscas de tensin producen sufrimiento de la lmpara y cambios
en las lecturas de la Absorbancia.
La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el
aparato.
2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que
la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda.
7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que
puede ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores
de seal como en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan
lectura digital y clculos automticos de concentraciones con relacin a las curvas de
calibracin.