Realtime PCR

Indice
IBT-UNAM
Mtodos fsico-qumicos en
Biotecnologa (2006-II)
Presentado a:
Dr. Roberto P. Stock Silberman
Rodrguez M & Rodrguez W
Indice
INDICE
CAPITULO 1 INTRODUCCIN..................................................................................3
CAPITULO 2 RESEA HISTRICA ..........................................................................4
CAPTULO 3 PCR EN TIEMPO REAL ......................................................................7
3.1 DEFINICIN ............................................................................................................7
3.2 EL ENSAYO..............................................................................................................7
3.3 PRINCIPIO QUMICO DEL ENSAYO ..............................................................................8
3.3.1 Qumica no especfica .....................................................................................9
3.3.2 Primers marcados con fluorforos ................................................................12
3.4 INSTRUMENTACIN PARA EL PCR EN TIEMPO REAL .................................................19
3.5 ANLISIS DE LOS DATOS .........................................................................................23
3.4.1 Ensayos de cuantificacin absoluta ................................................................26
3.4.2 Ensayos de cuantificacin relativa .................................................................26
3.6 ESTRATEGIAS DE NORMALIZACIN .........................................................................30
3.6.1 Cuantificacin de ARN mensajero..................................................................31
CAPITULO 4 APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL .............................36
4.1 VIROLOGA ...........................................................................................................36
4.2 MICROBIOLOGA CLNICA (COSTA, J. 2004) ............................................................37
4.3 INVESTIGACIN BIOMDICA....................................................................................39
4.3.1 Validacin de los resultados de microarreglos de DNA.................................40
4.3.2 Identificacin de mutaciones .........................................................................40
4.4 ORGANISMOS GENTICAMENTE MODIFICADOS (GMO) (BUSTIN, 2005) ..................41
4.5 APLICACIONES FUTURAS Y PERSPECTIVAS (VALASEK ET AL., 2005) ........................41
CAPITULO 5 TRAMPAS DEL RT-PCR EN TIEMPO REAL.................................43
5.1. CALIDAD DEL ARN...............................................................................................43
5.2. DETECCIN NO ESPECFICA ....................................................................................44
5.3. DETECCIN ESPECFICA .........................................................................................45
5.4 LINEARIDAD DEL PASO DE REVERSOTRANSCRIPCIN ................................................46
5.5 ANLISIS DE LOS DATOS .........................................................................................48
5.6 EL NIVEL UMBRAL..................................................................................................50
CONCLUSIONES ........................................................................................................52
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.........................................................................53
Introduccin
CAPITULO 1
INTRODUCCIN
En los ltimos aos, la reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) ha

surgido como una metodologa robusta y ampliamente utilizada en investigacin biolgica
ya que puede detectar y cuantificar cantidades muy pequeas de secuencias especficas de
cidos nucleicos. Como herramienta de investigacin, la principal aplicacin de esta
tecnologa es la rpida y precisa valoracin de cambios en la expresin de genes como
resultado de la fisiologa, la fisiopatologa o la evolucin. Este mtodo puede ser aplicado
a sistemas modelo para medir respuesta a estmulos de tipo experimental y para adentrarse
en los cambios potenciales a nivel proteico y funcional. De este modo, la fisiologa puede
ser correlacionada con eventos moleculares para tener un mejor entendimiento de los
procesos biolgicos.
En el campo del diagnstico clnico de tipo molecular, el RT-PCR puede ser usado para
medir cargas virales o bacterianas, o en evaluacin del estado de enfermedades como el
cncer.
En la presente monografa se discuten los conceptos bsicos de la tcnica de PCR, la
qumica e instrumentacin del RT-PCR y se incluyen aplicaciones presentes, desventajas
y perspectivas futuras para esta tecnologa en las diferentes ramas de las ciencias
biomdicas y bioqumicas.
Esperamos que este documento sea una herramienta til para los nuevos estudiantes y
curiosos que quieren obtener informacin bsica de calidad y en idioma espaol acerca de
las tecnologas de punta para el desarrollo de procesos biolgicos, bioqumicos y
biotecnolgicos.
Resea Histrica
CAPITULO 2
RESEA HISTRICA
El concepto de producir muchas copias de una molcula especfica de ADN mediante un

proceso cclico utilizando una enzima ADN polimerasa y oligonucletidos que
funcionaran como primers fue expuesto por primera vez en un artculo en 1971 por
Kleppe y sus colegas. En ese momento la demostracin prctica de esta teora no fue
posible debido a la dificultad y el costo de produccin de los oligonucletidos, el no
contar con polimerasas termoestables y la ausencia de termocicladores automticos.
La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) fue llevada a cabo por Kary Mullis en 1983 (Saiki
et al., 1985; Mullis et al., 1987), razn por la que recibi el
Premio Nobel una dcada despus. La gran utilidad de esta
tcnica se difundi a principios de los ochenta por toda la
comunidad cientfica. Los nuevos equipos y las avanzadas
tcnicas de secuenciacin, as como los programas de
computacin para la manipulacin de datos que se fueron
sucediendo, permitieron el desarrollo de mejores ensayos
de PCR. La aparicin de la Internet hizo posible el acceso
a bases de datos como GenBank, EMBL y DDBJ, las
Dr. Kary Mullis
cuales permitieron la comparacin de secuencias en todo el
mundo. El uso de la Taq ADN polimerasa fue uno de los impulsos ms importantes dados
a la tecnologa de PCR (Saiki et al., 1988). Esta enzima fue incluso obtenida de forma
recombinante, con lo que se eliminaron funciones no deseadas de la enzima original. En
1990 ya se contaba con buffers de PCR, dNTPs, MgCl2 y Taq polimerasa de forma
comercial. El mejoramiento de los buffers increment considerablemente la actividad y la
estabilidad de las polimerasas.
Resea Histrica
A principios de los aos noventa Higuchi y sus colaboradores del Roche Molecular
Systems y de Chiron (1992; 1993) desarrollaron una tcnica de PCR en la cual incluyeron
el bromuro de etidio (EtBr) en el medio de reaccin, la cual se llev a cabo bajo la luz
ultravioleta. Desde el ao 1966, Le Pecq y Paoletti reportaron que este agente intercalante
del ADN de doble cadena fluoresce bajo la luz UV. Esta propiedad fue aprovechada para
grabar la acumulacin de ADN utilizando una videocmara. Esta sencilla reaccin
combinada con la videografa permiti el nacimiento del PCR en tiempo real, el cual
combina la enorme sensibilidad de la tcnica de PCR con la precisin que asegura el
monitoreo in situ de los productos generados por esta reaccin a travs del tiempo.
La primera compaa que desarroll la instrumentacin necesaria para llevar a cabo el
RT-PCR fue Applied Biosystems en el ao 1996, y desde entonces otras compaas como
BioGene, Bioneer, Bio-Rad, entre otras han desarrollado nuevos equipos. Una parte
importante de estas mquinas se utilizan en investigacin acadmica, y de acuerdo a un
estudio realizado en el ao 2003, de 406 investigadores entrevistados, el 48% piensa
realizar RT-PCR en su futuro trabajo (Arlington, 2003). La figura 2.1 muestra el numero
de publicaciones en la base de datos Medline que contienen la palabra real time y
PCR en el ttulo o en el resumen. Como vemos, ocurri un incremento del 43% entre el
2003 y 2004, donde aparecieron 3522 publicaciones (Valasek et al., 2005). Estos datos
demuestran que la tcnica de RT-PCR se perfila como uno de los mtodos de vanguardia
en las ciencias biomdicas, fundamentalmente en el diagnstico molecular y la fisiologa.
Figura 2.1 Curva de utilizacin de la

tcnica de PCR en tiempo real. Se
presenta el nmero de publicaciones
en la base de datos de Medline que
contienen las palabras Real-time y
PCR
Resea Histrica
Por qu el PCR en tiempo real?

Mediante la tcnica de PCR es posible amplificar un segmento de ADN de manera
exponencial, ya que despus de cada ciclo se duplica la cantidad de ADN que existe si la
reaccin ocurre con mxima eficiencia. La realidad es que las reacciones de PCR alcanzan
un plateau o meseta debido al agotamiento de los reactantes luego de numerosos ciclos
(Wittwer et al., 1997a). Adems, la autohibridacin de los productos cada vez ms
numerosos contribuye al efecto de meseta, por lo que se hace imposible calcular la
cantidad de ADN de partida midiendo la cantidad de producto final. Es esta caracterstica
del PCR convencional la que impone la necesidad del PCR en tiempo real. Dado que la
reaccin de PCR en sus inicios amplifica el ADN de manera eficiente, y existe una
correlacin entre el ADN de partida y el ADN formado durante la fase exponencial, es
posible cuantificar la cantidad de ADN de partida.
La principal meta del RT-PCR es distinguir y cuantificar de manera especfica una
secuencia de cido nucleico en una muestra incluso cuando sta se presenta en pequeas
cantidades. Durante la amplificacin, la velocidad en que se llega a un nivel determinado
de fluorescencia (umbral) correlaciona con la cantidad de ADN que tenemos al inicio.
Adems, el producto final puede ser caracterizado si se somete a incrementos de
temperatura para determinar en qu momento la doble cadena se separa. Este punto de
fusin es una propiedad nica que depende de la longitud y de la secuencia nucleotdica
del producto.
Otra de las ventajas de la tcnica de PCR en tiempo real es la cuantificacin de ARN. Esto
es posible gracias al uso de las reverso transcriptasas, enzimas que generan ADN
complementario (ADNc) a partir de un templado de ARN. Bajo condiciones apropiadas,
la cantidad de ADNc generado por reversotranscripcin es proporcional al nmero de
molculas de ARN presente en una muestra dada. Entonces este ADNc puede ser el
templado para una reaccin de PCR en tiempo real, utilizando su sensibilidad y precisin
para determinar cambios en la expresin de genes. Esta tcnica es conocida como RTPCR en tiempo real y se ha convertido en el mtodo ms popular para la cuantificacin de
los niveles de ARN mensajero (Bustin et al., 2000). Todo esto demuestra que la tcnica de
PCR en tiempo real permite cuantificar con alta precisin tanto los niveles de ADN como
los de ARN.
PCR en tiempo real
CAPTULO 3
PCR EN TIEMPO REAL
3.1 Definicin
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, tambin conocida como Real
Time PCR (RT-PCR) muestra la capacidad de monitorear el progreso de la reaccin de
PCR a medida que esta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso de PCR y
no al final como se realizaba antes. Este mtodo revolucion la forma en que se usaba la
tcnica de PCR para cuantificacin de ADN y ARN. El RT-PCR usa molculas de un
reportero fluorescente para monitorear la amplificacin de productos durante cada ciclo de
reaccin. Esta tcnica combina los pasos de amplificacin de ADN y la deteccin en un
nico ensayo y evita tener que preparar geles de electroforesis para detectar los productos
amplificados. Un anlisis apropiado de los datos y/o de la qumica tambin permite
eliminar la necesidad de realizar pruebas de Southern Blot o secuenciacin de ADN para
identificacin de los amplicones. Su simplicidad, especificidad y sensibilidad junto con su
potencial como tcnica en aplicaciones futuras y la evolucin hacia nuevos conocimientos
de la qumica, adems de la confiabilidad en la instrumentacin y protocolos mejorados,
han hecho del RT-PCT una tecnologa altamente competitiva para la deteccin de ADN y
ARN.
3.2 El ensayo
La tecnologa del RT-PCR est basada en la deteccin de una seal fluorescente
producida proporcionalmente durante la amplificacin del ADN blanco (Fig. 3.1). Antes
que revisar la cantidad de ADN blanco producido despus de un nmero fijo de ciclos, las
pruebas de RT-PCR determinan el punto en el tiempo durante el proceso de ciclado
cuando se detecta por primera vez la amplificacin de un producto de PCR. Este se
PCR en tiempo real
determina identificando el nmero del ciclo en el cual la intensidad de la emisin del

reportero marcado se levanta sobre el ruido de fondo.
Desnaturalizacin
Primer
Sonda
Fluorescena
Alineamiento del primer/ hibridizacin de sonda

Polimerasa
Hibridado
Extensin
Fig. 3.1 Representacin esquemtica de un ensayo de RT-PCR usando el mtodo Taqman
Este nmero del ciclo est referido como el ciclo umbral o threshold cycle (Ct). El Ct se
determina en la fase exponencial de la reaccin de PCR y es inversamente proporcional al
nmero de copias del blanco. Por lo tanto cuanto ms alto es el nmero de copias iniciales
de los cidos nucleicos a amplificar, ms pronto se observa un aumento significativo en
la fluorescencia, y son ms bajos los valores de Ct. Los ensayos de RT-PCR son
altamente reproductivos (Fig. 3.2(A)) y pueden discriminar fcilmente entre valores
diferentes de cantidad de templado (Fig. 3.2 (B)).
3.3 Principio qumico del ensayo
El RT-PCR puede utilizar fluorforos generales de unin no especfica a ADN como el
Bromuro de Etidio o el SYBR Green I, sondas de hidrlisis (Sondas 5 nucleasa), sondas
de hibridizacin, molecular beacon o sondas de secuencias especficas (Ej. Scorpions).
Fluorescencia
PCR en tiempo real
Fluorescencia
Ciclos
Ciclos
Fig. 3.2 Reproducibilidad y precisin del RT-PCR. Anlisis de una placa de 96 pozos que contiene rplicas
del mismo templado. El ensayo fue llevado a cabo en un instrumento Stratagene MX 4000 usando el mtodo
Taqman. El promedio de Ct para las 96 reacciones es 230.3. (B) Dos reacciones mezcladas, ajustadas por
triplicado. Una contiene 1x103 copias de templado de ADN y marca un Ct de 23.10.15. La otra tiene 2x103
copias de templado de ADN y marca un Ct de 24.10.1. Esto corresponde exactamente al valor esperado de
DCt de 1. (Bustin, S. 2005)
3.3.1 Qumica no especfica

En general, los agentes intercalantes usados en la qumica no especfica son fluorforos
que aumentan notablemente la emisin de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble
cadena (ADNdc). El ms utilizado en RT-PCR es el SYBR Green I (Fig. 3.3), el cual
interacciona con el surco menor del ADNdc, emitiendo 1000 veces ms fluorescencia que
cuando est libre en solucin. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un
aumento proporcional de la fluorescencia emitida. El SYBR Green I absorbe luz en una
longitud de onda de 480 nm y la emite a 520 nm. (Fig. 3.4) (Valesek M y Repa J, 2005).
PCR en tiempo real
Figura 3.3. Representacin de la interaccin de SYBR green I con el ADN de doble cadena.
Figura 3.4 Fluorescencia del SYBR green I con el

ADN de doble cadena.
Una ventaja importante en la qumica no

especfica es que el diseo y ajuste de los
ensayos es directo y los costos de materiales
son bajos (sin tener en cuenta el costo del
aparato de RT-PCR). Esto hace que sea
particularmente atractivo para el anlisis de
polimorfismos de nucletidos simples (SNP),
el cual ha llegado a ser el marcador de
seleccin para la identificacin de mltiples
genes asociados con enfermedades complejas
como cncer o diabetes.
Los polimorfismos biallicos pueden ser detectados por la combinacin de

amplificaciones aleloespecficas con la deteccin de SYBR Green I. Las amplificaciones
alelo especficas toman ventaja de la inhabilidad relativa de la Taq polimerasa para
extender primers que estn mal apareados con su blanco en el extremo 3. El ensayo es
llevado a cabo en dos tubos separados, cada uno de los cuales contiene un par de primers
especficos de una u otra variante de SNP. Aunque estarn siendo amplificados los alelos
con errores de apareamiento, esto ocurre mucho menos eficientemente que para los alelos
bien apareados, retardando su amplificacin y obteniendo valores de Ct mucho mayores.
La especificidad del ensayo puede ser mejorada con el uso de primers tipo tallo-asa para
el PCR alelo-especfico, ya que estos son mejores que los lineales porque discriminan
entre secuencias cercanas relacionadas. (Hazbon, et al., 2004)
10
PCR en tiempo real
El uso de anlisis de curvas de disociacin para identificar diferentes amplicones, evita la

necesidad de realizar reacciones de amplificacin separadas. Siguiendo el ensayo de PCR,
el producto de ADNdc es fundido en ADN de cadena sencilla (ADNcs) por un ciclo en el
que se incrementa la temperatura y colectando los datos de fluorescencia en cada escaln
de temperatura. La magnitud de la reduccin en la fluorescencia del SYBR green se debe
a su relajamiento desde el ADNdc, suministrando una cantidad de ADNdc disociado en
cada paso, mostrado en cada ciclo de la curva de disociacin. (Fig. 3.5).
Fig. 3.5 Anlisis de la curva de disociacin de
SYBR Green I. A primera vista, se observa la
velocidad en que se pierde el SYBR green I a
medida que aumenta la temperatura. El ejemplo
muestra un rango de datos entre 72C y 90C. El
pequeo pico en 74,5 C se debe probablemente
a la formacin de producto dimrico, ya que este
es el nico pico que ocurre en la muestra NTC.
EL pico principal aparece alrededor de 85,5C
aunque hay algunos con una diferencia de perfil
fcilmente distinguible y un pico en 86.5C.
Estos diferentes perfiles muestran diferentes
productos de PCR. (Bustin, S. 2005)
Adems, como diferentes amplicones pueden fundir a diferentes temperaturas, el SYBR

Green I puede ser usado para distinguir diferentes alelos por su temperatura de fusin
(Tm). Por ejemplo, la enfermedad de Huntington es causada por un nmero expandido de
repeticiones CAG en el gen de Hungtington y la curva de disociacin de un sujeto normal
muestra un nico pico de fusin, mientras que los individuos que padecen la enfermedad
presentan dos picos. (Elenitoba-Johnson, et al., 2001).
Muchos sistemas de tubos cerrados que han sido desarrollados pueden usarse en
combinacin con el anlisis de punto de fusin de productos del PCR para identificar
tanto variantes homocigotas como heterocigotas, (Wittwer, et al., 2003) y ha sido posible
desarrollar ensayos triples que usan SYBR Green I y curvas de disociacin para
identificar diferentes genes blanco en el mismo tubo. (Hernndez, et al., 2003).
El principal inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido
que se unen de manera indistinta a los productos generados inespecficamente o a dmeros
de primers, muy frecuentes en las reacciones de PCR. Para mejorar la especificidad se
11
PCR en tiempo real
deben emplear condiciones de reaccin ptimas y una seleccin cuidadosa de primers

para disminuir el riesgo de formacin de dmeros. (Costa, J., 2004). Adems, es
recomendable iniciar reacciones de sntesis de ADN a temperaturas elevadas (Hot start
PCR), lo cual disminuye de forma notable el riesgo de amplificaciones inespecficas.
3.3.2 Primers marcados con fluorforos
A pesar de su atractivo, hay varios problemas asociados con el uso de marcadores no
especficos. En particular, hay un ensanchamiento del rango de fusin y la compresin de
la Tm entre genotipos, lo cual puede dar resultados ambiguos. Adems, los agentes
intercalantes de ADNdc pueden redistribuirse durante la fusin liberando el agente desde
los heterodplex de bajo punto de fusin y redistribuyndose hacia los de alto punto de
fusin.
El uso de primers marcados para el anlisis de fusin evita estos problemas pues tienen la
ventaja de que no se usan sondas especficas para cada ensayo. El uso de un primer con
fluorforo marcador y otro primer sin marcar posibilita obtener perfiles de fusin del
amplicn inmediatamente despus de que se completa la reaccin de PCR y resultan en
curvas de fusin de forma distinta para diferentes alelos, incluyendo aquellos que tienen
diferencias en una nica base. (Grundy et al., 2003)
Otro mtodo hace uso del principio de transferencia de energa fluorescente mediante
resonancia (FRET). En este, se presenta una interaccin dependiente de la distancia entre
los estados excitados de dos marcadores diferentes, en los cuales la excitacin se
transfiere de una molcula donadora a una molcula aceptora a distancias alrededor de 70
100 sin la emisin de un fotn. Como resultado, la emisin del fluorforo reportero es
reprimida. En general, uno de los primers de amplificacin tiene el reportero y un
dominio represor unido a una estructura tallo-asa en su extremo 5 .Cuando est en
solucin, la emisin de fluorescencia del reportero es reprimida. Una seal fluorescente
slo se genera cuando los oligonucletidos marcados se incorporan en el producto de
amplificacin. (Fig. 3.6).
12
PCR en tiempo real
Sonda
beacon
Gen blanco
Emisin de fluorescencia
Fig. 3.6 Sondas marcadas con fluorforos. a) El

diseo original usa un p r i m e r con una
estructura tallo-asa que tiene en su extremo 5
un fluorforo y un represor al final de la
estructura. b) Durante el primer ciclo de PCR
los primers se extienden y se vuelven
templados durante los siguientes ciclos de
PCR. Esto lineariza la estructura tallo-asa,
separa el donador y aceptor y resulta en
emisin de fluorescencia desde el fluorforo
(Mocelln et al., 2003)
Gen blanco
La sntesis de primers marcados se ha simplificado mucho recientemente mediante el uso

del mismo tipo de estructuras tallo-asa, pero solamente con un fluorforo reportero, el
cual se autoreprime con base en la secuencia que sigue. Estos primers, conocidos como
LUX, se reprimen cuando estn libres en solucin, fluorescen dbilmente cuando se
desnaturalizan y emiten una luz fuerte cuando se incorporan al ADN. La fluorescencia
diferencial de los primers marcados permite el uso de PCR para determinacin especfica
de alelos en un solo tubo. (Fig. 3.7)
Fig 3.7. Primers LUX. Un primer contiene un

fluorforo, el otro no se encuentra marcado. El
primer fluorognico tiene una secuencia corta final
de 46 nucletidos en el extremo 5 que es
complementaria al extremo 3 del primer. La
estructura tallo-asa resultante provee un a represin
ptima del fluorforo atacado. Cuando se incorpora
el primer dentro del producto de A D N d c, el
fluorforo deja de reprimir y se emite una seal.
(Bustin, S. 2005)
13
PCR en tiempo real
Sondas de hibridizacin especficas

Son sondas marcadas con dos tipos de fluorforos, un donador y un aceptor. El proceso
tambin se basa en la transferencia de energa fluorescente mediante resonancia (FRET)
entre las dos molculas. Las ms utilizadas son las sondas de hidrlisis, conocidas
comercialmente como Taqman, las sondas conocidas como molecular beacons, los
scorpions y las sondas FRET.
a) Sondas de hidrlisis: Son oligonucletidos marcados con un fluorforo donador en el
extremo 5 que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3 que
absorbe la fluorescencia liberada por el donador. Para que esto ocurra, las molculas
donadora y aceptora deben estar espacialmente prximas. Adems, el espectro de emisin
de la primera se ha de solapar con el espectro de absorcin de la segunda. En la tabla 3.1
se relacionan los fluorforo ms empleados y sus espectros de excitacin y emisin.
Mientras la sonda est intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el
aceptor. Sin embargo, durante la amplificacin de ADN templado, la sonda se hibrida con
su cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la cadena, en su accin de
sntesis, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que tiene actividad 5 exonucleasa,
hidroliza el extremo libre 5 de la sonda, producindose la liberacin del fluorforo
donador. Como donador y aceptor estn ahora espacialmente alejados, la fluorescencia
emitida por el primero es captada por el detector (Fig. 3.8).
Las sondas de hidrlisis ofrecen precisin similar que la que ofrecen los ensayos seguidos
con SYBR Green I (Wilheim et al., 2003a), pero stas adems dan gran seguridad de
alcanzar la especificidad. Debido a esto, el uso de sondas de hidrlisis es un mtodo
recurrente para la genotipificacin. Dos sondas fluorognicas, marcadas con dos
marcadores espectralmente diferentes, pueden ser utilizadas para discriminar entre alelos
nativos y mutantes. Si se detecta la amplificacin de una muestra de ADN desconocido
por la identificacin del fluorforo del alelo nativo y no por la del alelo mutado, la
muestra se considera como homocigoto del tipo nativo y, de forma inversa, si se encuentra
fluorescencia del marcador de identificacin del mutante, se clasifica como homocigoto
de la cepa mutante. Si se presentan marcajes de ambos fluorforos, esta se designa como
heterocigota para los dos alelos.
14
PCR en tiempo real
TABLA 3.1 Principales molculas fluorescentes empleadas como marcadores en la PCR a tiempo real
(Costa J, 2004)
Fig. 3.8 Resumen de la qumica asociada a las sondas Taqman
15
PCR en tiempo real
b) Molecular beacons: Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molcula
donadora en el extremo 5 y una aceptora en el extremo 3 pero, adems, presentan una
estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unin especfica
con el ADN diana.
Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no est hibridada, lo que conlleva a
que donador y aceptor estn muy cerca uno de otro. En esta conformacin la fluorescencia
emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo.
Sin embargo, al hibridar con el ADN blanco la sonda se abre, alejndose donador y
aceptor, pudindose detectar la fluorescencia emitida por el primero (Fig. 3.9).
Fig. 3.9 Molecular beacons
El uso de los molecular beacons proporciona un nivel adicional de especificidad, ya que

es muy poco probable que falsos amplicones o primers-dmeros posean secuencias blanco
para ellos, la generacin de fluorescencia es exclusiva de la sntesis de los amplicones
analizados. (En: www.molecularbeacons.org)
c) Scorpions: Son molculas bifuncionales que contienen un primer covalentemente
unido a una sonda (Fig. 3.10). Las molculas tambin contienen un fluorforo que puede
interactuar con un represor (quencher) para reducir la fluorescencia. Cuando las
molculas se usan en una reaccin de PCR, el fluorforo y el represor se separan
generando un incremento en la luz emitida (Fig. 3.11). Las ventajas de los scorpions se
basan en que la sonda est acoplada fsicamente al primer. Esto significa que la reaccin
que se lleva a cabo para generar la seal es un cambio unimolecular. En contraste con las
colisiones bimoleculares requeridas por otras tecnologas tales como Taqman o
molecular beacons. Las ventajas de un cambio unimolecular son significativas, pues la
reaccin es instantnea y ocurre antes que cualquier reaccin inespecfica o colateral
16
PCR en tiempo real
Fig. 3.10. Elementos de un primer Scorpions
como los realineamientos de los amplicones o el plegamiento inadecuado del templado.

Esto conduce a seales ms fuertes, a un diseo ms confiable de la sonda, a tiempos de
reaccin ms cortos y a una mejor discriminacin. Los scorpions son primers con una
estructura tallo-asa que contiene un fluorforo y un represor. La estructura tallo asa est
separada del primer por un bloqueador, el cual es una estructura con modificaciones
qumicas que previene que se copie la estructura tallo asa del primer. Durante la reaccin
de PCR, los primers scorpions se extienden para formar los productos del PCR. En la
etapa de alineamiento del ciclo de PCR, las secuencias de la sonda en la cola del primer se
curvan para hibridar la secuencia blanco en el producto del PCR (Fig. 3.11). Como la cola
del scorpion y el producto del PCR forman parte de la misma hebra de ADN, la
interaccin es intermolecular. La secuencia blanco generalmente se escoge para estar a 3
bases del extremo 3 del primer scorpion.
d) Sondas FRET: El sistema se compone de dos sondas que se unen a secuencias
adyacentes del ADN blanco. Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3 y la otra
un aceptor en el extremo 5. Cuando las sondas estn hibridadas, los dos fluorforos estn
prximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energa al aceptor que, a su vez, emite
la fluorescencia que detecta el lector del equipo (Fig. 3.12).
17
PCR en tiempo real
Fig. 3.12 Sondas FRET
Fig. 3.11 Reaccin de un primer Scorpion
Fig. 3.12 Sondas FRET
18
PCR en tiempo real
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un

aumento de hibridacin de las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporcin
de fluorescencia emitida. El empleo de sondas garantiza la especificidad de la deteccin y
permite identificar polimorfismos o mutaciones puntuales, pero su costo es ms elevado
que el SYBR Green I y la optimizacin de las condiciones de la reaccin resulta ms
difcil.
e) Otras sondas
Hay ms qumicas de sondas disponibles, todas con ventajas y desventajas. Entre ellas se
cuentan los Hybeacons, los cuales requieren solo un fluorforo y hace uso de las
propiedades de represin del ADN. Esto los hace fciles de disear y sintetizar. (French et
al., 2002). Las sondas Light up estn compuestas de naranja de tiazol conjugada a
pptidos de cidos nucleicos (PNA) y combina las excelentes propiedades de los PNA,
que permiten el uso de sondas ms cortas con un extraordinario aumento en la
fluorescencia. Las sondas Eclipse son sondas lineales que tienen un marcador del surco
menor (MGB su sigla en ingls), un represor en el extremo 5 y el fluorforo en el
extremo 3 (Bustin et al, 2004a).
3.4 Instrumentacin para el PCR en tiempo real
Un requerimiento imprescindible para llevar a cabo con efectividad esta tcnica es la
utilizacin de una instrumentacin adecuada que permita detectar la seal fluorescente y
grabar el proceso de la reaccin de PCR. Los instrumentos deben emitir y detectar
longitudes de onda especficas simultneamente, por lo que el basamento qumico de esta
tcnica y la instrumentacin estn estrechamente relacionados.
Hasta el momento existen tres formas fundamentales para suministrar la energa de
excitacin para los fluorforos: mediante lmparas, diodos emisores de luz (LED) o lser.
Las lmparas son instrumentos de emisin de amplio espectro, mientras que el de los
LEDs y lsers es ms restringido. Los equipos que presentan lmparas (generalmente de
tungsteno halgeno o cuarzo tungsteno halgeno) pueden incluir filtros que limitan la luz
emitida a longitudes de onda de excitacin especficas. Entre ellos se encuentran el ABI
Prism 7000 de Applied Biosystems, el Mx4000 y Mx3000P de Stratagene, y el iCycler iQ
de Bio-Rad. El sistema de LED est representado por el LightCycler de Roche, el
SmartCycler de Cepheid, el Rotor-Gene de Corbett y el DNA Engine Opticon 2 de MJ
19
PCR en tiempo real
Research. La nica mquina que utiliza lser para la excitacin hasta el momento es el
ABI Prism 7900HT (Valasek et al., 2005).
Para colectar los datos, la energa de emisin de los fluorforos tambin debe ser
detectada en longitudes de onda especficas. Los detectores estn representados por
cmaras acopladas a dispositivos de carga, tubos fotomultiplicadores u otro tipo de
fotodetectores. Generalmente se emplean filtros o canales para detectar pequeos rangos
de longitudes de onda. Usualmente se pueden detectar varias longitudes de onda discretas
simultneamente, lo que permite correr mltiples ensayos en un solo tubo de reaccin.
Otra porcin importante de la instrumentacin consiste en un termociclador efectivo para
llevar a cabo las reacciones de PCR. Es muy importante que estos mantengan una
temperatura consistente a lo largo de todos los tubos de ensayo dado que pequeas
desviaciones de la temperatura resultan en errores graves de cuantificacin (Wilhelm et
al., 2000; Zuna et al., 2002). Un bloque de calentamiento (Peltier o por resistencia) o el
calentamiento por aire, o una combinacin de ambos, son los ms utilizados. Los bloques
calentadores cambian la temperatura ms lentamente que los calentadores de aire, lo que
resulta en ciclos ms largos.
La instrumentacin del PCR en tiempo real no estara completa sin un hardware de
computacin y un software de anlisis de datos apropiado. Los softwares simplifican el
anlisis de los datos arrojando los resultados en forma de grficos que muestran la
amplificacin y disociacin de los productos. Las curvas de amplificacin permiten el
anlisis cintico y la cuantificacin del ADN de partida, mientras que las curvas de
disociacin revelan las caractersticas, entre ellas la pureza, del producto final de la
reaccin.
El primer termociclador de PCR en tiempo real fue
producido por Appied Biosystems de forma comercial en
1997, el ABI 7700 (Fig. 3.13). El sistema de deteccin de
este equipo consiste en un termociclador conectado a un
lser y a un sistema ptico CCD (dispositivo de carga
acoplada, el cual genera una respuesta elctrica
proporcional a la luz que capt). Este equipo detecta un
Fig. 3.13 ABI 7700
rango de fluorescencia desde 500 a 660nm. La
fluorescencia se induce emitiendo luz lser simultneamente a todas las muestras a travs
20
PCR en tiempo real
de un arreglo mltiple de fibras pticas. Las emisiones de fluorescencia resultantes de la

interaccin con los fluorforos viajan en reversa y son detectadas por la cmara CCD, las
cuales son medidas cada 7 segundos y posteriormente se analizan por el software. Este
instrumento puede utilizarse para anlisis basados en agentes intercalantes, molecular
beacons y sondas de hidrlisis. Las corridas demoran aproximadamente 2 horas.
Posteriormente, Roche Diagnostics comenz la distribucin del Light Cycler (Fig. 3.14),
el cual utiliza pequeos capilares de vidrio como tubos de reaccin (Wittwer et al., 1989;
1997b; ). Estos capilares se colocan en un muestrario en forma de carrusel dentro de una
cmara de aire termostatada, cuya rotacin asegura la homogeneidad de la temperatura del
sistema. La combinacin de un volumen de muestra pequeo, la forma cilndrica de los
capilares y el ajuste de la temperatura mediante el aire, permite obtener gradientes de
temperatura muy pronunciados que se traducen en tiempos ms
cortos de reaccin, con el consecuente incremento de la
especificidad. Este sistema utiliza un potente diodo emisor de luz
azul para la excitacin en vez de un delicado lser y la
fotodeteccin se realiza con tres diodos que tienen tres filtros de
longitudes de onda diferentes, lo cual permite combinar distintos
fluorforos simultneamente. Una corrida completa de PCR con
40 ciclos puede tomar slo de 15 a 20 minutos..
Fig. 3.14. Light Cycler
El Rotor-Gene de Corbett
Research (www.corbettlifescience.com, Fig. 3.15)
utiliza un diseo de rotor de centrfuga que tiene
numerosas ventajas (Fig. 3.16):
1-Uniformidad ptica: Cada tubo pasa frente la
misma fuente de luz excitatoria, la cual atraviesa las
paredes laterales, y la fluorescencia emitida retorna al
mismo sistema de deteccin, en este caso un tubo
fotomultiplicador. Esto determina que no haya
necesidad de realizar la calibracin ptica del equipo,
Fig. 3.15. El Rotor-Gene
por lo que no se necesita un fluorforo de normalizacin.
21
PCR en tiempo real
El Rotor-Gene utiliza varios LEDs de diferentes longitudes de onda que estn. acoplados
a un filtro de banda estrecha. Este equipo adems tiene un paso ptico pequeo y menos
complejo que el de los sistemas que utilizan fibra ptica, los cuales tienden a ser lentos,
frgiles y caros. De acuerdo a las necesidades del operador, el sistema de deteccin cuenta
con filtros band pass (que permiten el paso de rangos discretos de longitudes de onda y
por ende se prefieren para los ensayos de multiplexing) y filtros high pass (a travs de
los cuales pasan todas las longitudes de onda por encima de un valor de corte
determinado, lo que incrementa la sensibilidad de la deteccin).
2-Rpida recoleccin de los datos: Todos los tubos pasan por el detector cada 150
milisegundos.
3- Al igual que en el Light Cycler, la rotacin garantiza la uniformidad de la temperatura
del aire del sistema. Adems no hay diferencia entre los tiempos de equilibracin trmica
entre pozos durante los cambios de temperatura. Los fabricantes garantizan que entre
muestra y muestra la variacin de temperatura es menor a 0.01 grados Kelvin. El rotor
opera a velocidad normal cuando est calentando (Aproximadamente 500 rpm), y al
enfriar incrementa la velocidad, por lo que la fuerza centrifuga que se ejerce sobre cada
muestra asegura que no haya condensacin y las burbujas de aire son eliminadas
automticamente.
Fig. 3.16. Vista Interior del Roto-Gene
22
PCR en tiempo real
3.5 Anlisis de los datos

El anlisis cuantitativo de los datos se traduce en la evaluacin de las curvas de
amplificacin, en las que se representa la fluorescencia detectada versus el nmero de
ciclos de PCR (Fig. 3.17). La sensibilidad del equipo est determinada por el ciclo al cual
la fluorescencia emitida se incrementa por encima del ruido de fondo. El nmero de
copias del templado se puede determinar con alta precisin a partir del nmero de ciclos
que se suceden para que la seal alcance un determinado nivel de fluorescencia llamado
umbral, el cual debe interceptar la curva en la fase exponencial, y es determinado de
manera arbitraria. Este punto debe seleccionarse entre dos ciclos sucesivos, por lo que
debe ser un nmero fraccionario.
Fig. 3.17. Curva de amplificacin
Ploteo Rn vs Nmero de ciclo, donde Rn = (Rn+) (Rn-) siendo:

Rn+ = Intensidad de emisin del PCR con molde
Intensidad de emisin de la referencia pasiva
Rn- = Intensidad de emisin del PCR sin molde (NTC)
Intensidad de emisin de referencia pasiva
23
PCR en tiempo real
Donde la referencia pasiva debe ser un cido nucleico idntico a la muestra que estamos
analizando pero sin el fragmento de secuencia correspondiente al templado, de esta forma
tenemos un control negativo perfecto.
Las curvas de amplificacin constan de tres partes diferentes:
1)
La fase inicial donde no se puede medir a acumulacin del producto de PCR pues
hay pocos cambios en la seal de fluorescencia, lo que define la lnea basal

2)
La fase exponencial, donde la fluorescencia cambia a medida que se forman ms
productos
3)
La fase de meseta, donde no se distinguen cambios en la fluorescencia a pesar de
que se siguen acumulando productos

Para cada muestra, el nmero de ciclos necesarios para interceptar el valor umbral se
llama ciclo umbral o threshold cycle (Ct). El Ct es inversamente proporcional al
nmero de copias iniciales del ADN muestra. Por tanto, si graficamos el logaritmo de la
cantidad inicial de ADN de estndares de concentracin conocida versus el Ct, el
resultado es una lnea recta. En cada corrida de PCR en tiempo real debemos analizar
muestras estndar de concentracin inicial conocida, de esta forma estamos determinando
el rango dinmico de deteccin de nuestro mtodo, requisito indispensable para publicar
resultados de calidad. Se pueden analizar diferentes diluciones decimales del mismo
estndar, preferentemente en cuadruplicados. Para presumir la reproducibilidad de
nuestros resultados, debemos tener desviaciones estndar menores a 0.2 unidades de Ct.
Por cada unidad de Ct que cambia en el resultado de una amplificacin, se incrementa al
doble la concentracin inicial de muestra calculada.
Para lograr una mayor exactitud en la cuantificacin es necesario calcular al eficiencia de
la amplificacin.
Durante la fase exponencial, la seal S puede ser representada por la ecuacin 1 (Wilhelm
y Pingoud, 2003):
S= pNoc
(1)
Donde p es un factor de proporcionalidad que relaciona la concentracin del producto de

PCR y la seal S, No es la cantidad de templado, es la eficiencia de la amplificacin
(12; donde =2 significa una eficiencia del 100%) y c es el nmero de ciclo.
24
PCR en tiempo real
Si despejamos c tenemos la siguiente ecuacin:

c= -(log)-1(logNo +logp-logS)
(2)
donde m=-(log)-1 y b= -(log)-1(logp-logS) y resulta la ecuacin 3:

c= mlogNo + b
(3)
Esta ecuacin describe la relacin lineal entre los valores de Ct y el logaritmo de la

concentracin de templado No. Los parmetros m y b pueden determinarse por regresin
lineal a partir de valores (S;Ct) de estndares de templado de concentracin conocida.
Despejando No obtenemos:
No = 10(Ct-b)/m
(4)
La eficiencia puede ser entonces calculada como:

= 10-1/m
(5)
Si sustituimos en la ecuacin 4, obtenemos la ecuacin 6:

No = (b-Ct)
(6)
El mximo valor de es 2.0 (si se duplica la cantidad de producto en cada ciclo), pero los
valores experimentales de fluctan entre 1.5 y 1.9. Si la eficiencia es baja disminuye la
sensibilidad del ensayo pero permite cuantificaciones con mayor precisin (mayor
reproducibilidad entre repeticiones).
El error en los valores de Ct resultan del ruido de fondo y del mtodo de clculo de Ct. En
ensayos altamente optimizados, podemos obtener errores estndares menores de 0.2
ciclos, asumiendo una eficiencia de amplificacin del 100%, lo que implica que el error
relativo mnimo para la cuantificacin est entre el 10 y el 20%.
El rango dinmico de esta tcnica es extraordinariamente alto, con ms de seis rdenes de
magnitud .
Para calcular la concentracin inicial de nuestro templado se grafica el logaritmo decimal
de las concentraciones de los estndares versus el Ct. El resultado es una recta cuya
pendiente deber ser tericamente igual a 3.32 si tenemos una eficiencia de
amplificacin del 100% (Ecuacin 5). En la prctica, un ensayo es aceptable hasta con un
92% de eficiencia.
25
PCR en tiempo real
El clculo del rango dinmico se puede realizar en amplificaciones monoplex (un solo
blanco biolgico) o en modelos multiplex (para dos o ms blancos biolgicos
amplificados simultneamente).
Curvas de desnaturalizacin
Estas curvas representan la relacin que existe entre la fluorescencia y la temperatura
(Fig.3.18.a). Se realizan para corroborar la identidad del amplicn luego del ensayo de
PCR, puesto que debe tener una temperatura de desnaturalizacin (Tm) especfica. La
deteccin se puede realizar con intercalantes del ADN como el SYBR Green o con sondas
especficas como los Molecular Beacons. Otras como los Scorpions no pueden utilizarse
pues forman parte del producto de PCR, como tampoco se utilizan las sondas TaqMan,
dado que su seal depende de la hidrlosis de la sonda. Para la caracterizacin de los
productos de la reaccin de PCR se utilizan ms los agentes intercalantes del ADN,
mientras que las sondas especficas se usan para otros estudios como los de
genotipificacin. En estas curvas la seal decrece gradualmente como resultado de la
disminucin de la fluorescencia dependiente de la temperatura y posteriormente
disminuye de forma abrupta debido a la separacin de las dos hebras de ADN. La
temperatura de desnaturalizacin o Tm se identifica como el punto ms alto de la derivada
negativa de la curva de desnaturalizacin (Fig. 3.18.b). En esta representacin adems, el
rea bajo el pico es proporcional a la cantidad de producto, por lo que las curvas de
desnaturalizacin tambin permiten cuantificar la cantidad de producto que tenemos si
contamos con estndares de concentracin conocida (Wilhelm et al, 2003).
3.4.1 Ensayos de cuantificacin absoluta
El objetivo es determinar el nmero exacto de molculas de ADN o ARN presentes en
una muestra. El resultado estar expresado en las mismas unidades que los estndares de
la curva de calibracin (nmero de copias, ng/mL,). Este tipo de cuantificaciones se
emplean para la deteccin y cuantificacin de cargas virales, agentes patgenos o en la
terapia gnica.
3.4.2 Ensayos de cuantificacin relativa
Este tipo de cuantificaciones permite determinar cuantas veces (ms o menos) cido
nucleico se tiene de un templado o una muestra biolgica determinada con respecto a un
tejido o muestra de referencia. Los resultados son expresados de manera relativa por lo
que no se necesita una curva de calibracin con un estndar de concentracin conocida.
26
PCR en tiempo real
Fig.3.18. Resultado de una curva de desnaturalizacin de un producto de PCR y un control

negativo. El producto de PCR tiene una Tm aparente de 87.5C, mientras que el control negativo
contiene dmeros de primers con una Tm aparente de 83C. a)Curva de disociacin. B)
Representacin del pico de desnaturalizacin
La aplicacin ms utilizada de este mtodo es la comparacin de los niveles de expresin

gnica (mRNA) entre diferentes tejidos o en el tiempo, o la respuesta de un tejido a
diferentes tratamientos.
Primeramente debemos realizar una normalizacin de la cantidad relativa de cada muestra
respecto a un gen normalizador, preferentemente de expresin constitutiva en la clula
(control endgeno). Estos genes mantienen un nivel de expresin constante an en
diferentes estados fisiolgicos de la clula y no deben afectarse en respuesta a los
tratamientos que estamos evaluando, en caso de que as sea. Para que este mtodo sea
exitoso el rango dinmico de la muestra y del control endgeno debe ser similar. Un
mtodo sensible para evaluar si esta regla se cumple es calcular el Ct para diferentes
diluciones de la muestra y del gen normalizador.
Ct = Ct (muestra)-Ct (normalizador), donde Ct (muestra) y Ct (normalizador) es el ciclo
al cual la muestra y el normalizador respectivamente alcanzan el nivel umbral de
fluorescencia en el ensayo de PCR en tiempo real. El clculo de Ct se realiza para
diferentes diluciones del templado y de la referencia, y se grafica la dilucin analizada vs
el resultado del Ct para cada una. Esta evaluacin tiene como propsito determinar la
eficiencia de amplificacin entre diferentes concentraciones de ARNm tanto para la
muestra como para el control endgeno, y demostrar que para una misma muestra, la
proporcin obtenida entre el mARN templado y la referencia sea siempre la misma. Si la
27
PCR en tiempo real
eficiencia de amplificacin de la muestra y de la referencia son similares, el resultado de

esta grfica debe ser una lnea recta de pendiente prcticamente 0 menor de 0.1, como se
muestra en la Fig. 3.19.
Fig. 3.19. Ejemplo de una curva de calibracin.
Aqu como vemos el valor de la pendiente de la grfica es de 0,0471. Es de esperar que el

valor de Ct sea mayor en la muestra que en el normalizador, teniendo en cuenta que el
nivel de expresin del mensajero sea mayor en el normalizador, por lo que Ct debe ser
un valor positivo, aunque puede ser negativo tambin.
Luego procedemos al clculo del Ct (Livak y Schmittgen, 2001):
Ct =Ct (muestra)- Ct (calibrador),
donde la muestra puede ser el nivel de expresin mRNA en rin, pulmn, etc de un gen
X y el calibrador puede ser el nivel de expresin de ese mismo gen en cerebro (tejido de
referencia).
Entonces el Ct se calcula para diferentes tejidos as como la expresin relativa de
mRNA, que est dada por la ecuacin:
Expresin relativa = 2 -Ct
Si el tejido de referencia a comparar es el de menor expresin de mensajero, su valor de
Ct ser el mayor y el nivel de expresin de las muestras siempre aumentar respecto a la
referencia, pero de igual forma puede disminuir.
28
PCR en tiempo real
Para ejemplificar este modelo, mostramos la evaluacin de la expresin del gen c-myc en
cuatro tejidos diferentes: hgado, rin, pulmn y cerebro. Se emplea como control
endgeno o normalizador, la expresin de la enzima gliceraldehdo 3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) en estos tejidos. La normalizacin de los tejidos se lleva a cabo
calculando:
Ct pulmn = Ct (c-myc)pulmn- Ct (GAPDH)pulmn
Ct hgado = Ct (c-myc) hgado Ct (GAPDH) hgado
y as sucesivamente con los otros dos tejidos.
Luego calculamos Ct y la expresin relativa de c-myc en pulmn, hgado y rin
tomando como referencia el valor de Ct en cerebro:
Ct pulmn = Ct pulmn - Ct cerebro
Ct hgado = Ct hgado - Ct cerebro
Ct rin = Ct rin - Ct cerebro
y graficamos la expresin relativa de c-
myc tomando como referencia los niveles en
cerebro como se muestra a continuacin:
Otros ensayos de cuantificacin relativa se han realizado utilizando como controles

endgenos la expresin de -actina, 2-microglobulina y ARN ribosomal. La seleccin del
calibrador depende del tipo de relacin que queremos calcular. El diseo ms simple es
utilizar el control no tratado como calibrador, en el caso en que estudiemos expresin
diferencial entre muestras tratadas y no tratadas. En este caso, el Ct del calibrador es 0
y su expresin relativa 20 es igual a 1, por definicin. Un resultado similar se obtiene
29
PCR en tiempo real
cuando analizamos el aumento de la expresin de un gen a travs del tiempo y el

calibrador representa la cantidad de mensajero a tiempo cero.
3.6 Estrategias de normalizacin
El principio de cuantificacin mediante la tcnica de PCR en tiempo real parece muy
simple: mientras ms copias de templado tenemos, menor nmero de ciclos de PCR sern
necesarios para alcanzar el nivel umbral. Pero en la prctica, la relacin entre el nmero
de copias del templado y el Ct no es tan sencilla. En primera instancia, lograr
cuantificaciones reproducibles a partir de templados que se encuentran poco abundantes
(<1000 copias) en una mezcla compleja de cidos nucleicos constituye muchas veces una
tarea problemtica (efecto Monte Carlo, Karrer et al., 1995). En segundo lugar, hay que
tomar en cuenta que muchas muestras biolgicas pueden contener inhibidores de
reversotranscriptasas, polimerasas u otros reactivos utilizados en las reacciones de PCR,
por lo cual es necesario investigar la presencia de estos inhibidores cuando queremos
poner a punto un ensayo de cuantificacin especfico. Una manera fcil de lograrlo, por
ejemplo, es realizando un RT-PCR en tiempo real de referencia, en el cual adicionamos
una cantidad conocida de ARN y medimos las variaciones en los valores de Ct (Smith et
al., 2003).
En tercer lugar, es necesario aplicar una adecuada estrategia de normalizacin que permita
controlar la cantidad de material de partida, las variaciones en la eficiencia de
amplificacin y las diferencias entre muestras. A pesar de las numerosas estrategias que se
han puesto en prctica, el mximo problema de la normalizacin para el PCR en tiempo
real sigue en pie: los experimentos de RT-PCR en tiempo real para cuantificar la cantidad
de ARN a partir de muestras biolgicas complejas. Existen variaciones en la cantidad de
ARN expresado entre clulas de diferentes linajes o que se encuentran en distintos estados
de diferenciacin. Para el caso de las muestras de sangre, la citometra de flujo
(Raaijmakers et al., 2002) y los anticuerpos acoplados a perlas magnticas (Deggerdal y
Larsen, 1997) han permitido separar subpoblaciones celulares definidas. Sin embargo,
para las biopsias de tumores slidos no existe prcticamente ninguna forma de separar o
contar clulas, a lo que se une la alta heterogeneidad celular inherente a este tipo de
patologa: clulas cancerosas, epiteliales, estromales, componentes del sistema inmune y
del sistema vascular contribuyen a formar la masa tumoral. Esta variabilidad nos permite
30
PCR en tiempo real
sin embargo generar resultados cualitativos, pero debemos ser muy cuidadosos si
queremos realizar un anlisis cuantitativo. Afortunadamente, con la tcnica de captura por
microdiseccin utilizando lser se puede cuantificar la cantidad de ARN mensajero
proveniente de un corte de tejido como nmero de copias del templado por rea de
diseccin (Fink et al., 1998).
3.6.1 Cuantificacin de ARN mensajero
El PCR en tiempo real es muy utilizado para la cuantificacin de los niveles de ARN
mensajero, pero existen muchos problemas que pueden afectar la calidad de los
resultados, entre los que se encuentra la variabilidad inherente al ARN, la variabilidad de
los protocolos de extraccin y diferencias en la eficacia de la reverso transcripcin, entre
otros. Es por esto que se hace imprescindible utilizar un mtodo de normalizacin de los
resultados que nos permita una cuantificacin lo ms cercana posible a la realidad
(Huggett et al., 2005).
A) Tamao de la muestra
La primera forma de minimizar el error experimental es partiendo de masas o volmenes
de tejido similares a partir del cual aislaremos nuestro cido nucleico templado.
Desgraciadamente grupos de muestras del mismo tamao no siempre son representativos
entre s. Cuando trabajamos con cultivos celulares en monocapa, muchas veces se
dificulta la estimacin de la densidad celular, no slo por la prdida debido a la
mortalidad sino por cambios morfolgicos y fisiolgicos que pueden ocurrir en las
clulas. Se hace evidente entonces que asegurar muestras de igual tamao, densidad o
peso, minimiza los errores pero no es suficiente.
B) Cuantificacin de ARN
Una cuantificacin precisa y de calidad del ARN que queremos reverso transcribir es
esencial para lograr muestras de partida homogneas. Existen muchos mtodos para
cuantificar ARN, y entre los ms precisos est el uso del reactivo ribogreen, el cual se
intercala de manera precisa en los cidos nucleicos de doble cadena y es mucho ms
sensible que el bromuro de etidio. De esta forma, si tenemos una preparacin
relativamente pura de ARN celular y medimos la cantidad de ARN ribosomal (el cual
31
PCR en tiempo real
consta de muchas estructuras secundarias) por unin al ribogreen, podemos inferir que el
resto de nuestro ARN, sea mensajero o de transferencia, tambin conserva una buena
integridad. Se utiliza el ARN ribosomal como referencia pues representa
aproximadamente del 85 % al 95% de todo el ARN celular, mientras que el ARN
mensajero se encuentra entre el 2 y el 5%, por tanto se asume que la relacin
ARNr:ARNm no cambia entre grupos de anlisis, lo cual no siempre es vlido. Los
niveles de ARNr varan menos en condiciones que afectan a los de ARNm (Schmittgen y
Zakrajsek, 2000), por lo que su utilizacin como normalizadores se ha vuelto ms
confiable que muchos genes de referencia. Un reporte reciente donde se comparan los
niveles de expresin de ARN entre clulas nucleadas de la sangre en resposo o activadas,
revel que el ARNr 18S es el blanco de referencia ms estable.
En este tipo de anlisis podemos realizar una electroforesis, donde debemos observar dos
bandas bien definidas que corresponden al ARNr 28S y 18S, siendo la de 28S mucho ms
intensa debido a que, en condiciones normales, este ARNr se encuentra al doble de la
concentracin del ARNr 18S (Fig.3.20.a). Tambin podemos utilizar un bioanalizador
(Agilent Bioanalyser) donde, de manera similar a una cromatografa, separamos los ARNr
y se visualiza el cromatograma por tincin con ribogreen. Los tiempos de retencin de los
ARNr 28S y 18S ya son conocidos (Fig.3.20.b). No obstante, la normalizacin de una
muestra respecto al ARN total tiene la desventaja de no controlar las variaciones
inherentes a la reverso transcripcin o a las reacciones de PCR.
C) ADN genmico
La cuantificacin de ADN genmico para la normalizacin pudiera parecer una buena
estrategia, por cuanto no se necesita hacer un paso previo de reverso-transcripcin, pero la
realidad es que existen inconvenientes. Por ejemplo, cuando las clulas estn proliferando,
tenemos mucho ms ADN, lo que puede representar el doble de la informacin gentica
para clulas eucariotas. En el caso de las bacterias o las clulas tumorales, podemos tener
8 copias o ms de la informacin gentica de un cierto loci comparado con clulas que no
se replican. De esta forma aunque partamos de una cantidad de clulas similar, existe
mucha variabilidad en la cantidad de ADN genmico extrado. Otro problema es la
carencia de protocolos altamente estandarizados para una purificacin de ADN genmico
de calidad.
32
PCR en tiempo real
ARNr 28S
ARNr 18S
Fig. 3.20. Ejemplo de una cuantificacin de ARNr de buena calidad mediante (a) Gel de
agarosa y (b) Agilent Bioanalyser.
D) Genes de referencia
Se utilizan en los ensayos de cuantificacin relativa que describimos previamente. Una de
las ventajas de esta tcnica es que tanto el gen a cuantificar como el normalizador, son
detectados utilizando el RT-PCR en tiempo real. Existen numerosas publicaciones que
subrayan el hecho de que no existe ni un solo gen de referencia universal, pues todos se
regulan de alguna forma y ninguno se expresa constitutivamente en todos los tipos
celulares y bajo cualquier condicin experimental. Muchos de los genes de referencia
clsicos ampliamente utilizados como normalizadores en los RT-PCR en tiempo real
son genes regulados, hecho que se conoce desde mucho antes de que surgiera la tcnica de
PCR en tiempo real. Tal es el caso del ARNr 18S, el cual se sobreexpresa frente a una
infeccin con citomegalovirus, o del gen que codifica para la GAPDH, el cual se
transcribe de manera similar en diferentes tejidos de rata, pero esto no correlaciona con las
cantidades de ARN mensajero encontradas en dichos tejidos. A pesar de estas evidencias,
estos genes de referencia se siguen utilizando como normalizadores sin un proceso previo
de validacin. Reportes recientes han demostrado que muchos de estos genes no pueden
utilizarse como normalizadores. Una de las peores situaciones que se pueden presentar es
que el gen de referencia se vea afectado por las condiciones que queremos evaluar.
La validacin de los genes de referencia est sujeta tambin a los problemas de la
normalizacin. El grado de variabilidad aceptable para un gen de referencia depende de la
33
PCR en tiempo real
resolucin requerida. An cuando el gen de referencia seleccionado sea variable, esto no

interesa siempre que la diferencia entre grupos sea mayor que la variacin del gen de
referencia. Si un ARN de referencia tiene un error de 1 log puede no ser ideal, pero es
suficiente para medir cambios en los templados de 2 log o ms.
Existen muchos programas sustentados en la plataforma de Excel que permiten el anlisis
de muchos genes de referencia. El programa Gnorm permite la eleccin del gen de
referencia apropiado mediante el clculo de la media geomtrica de la expresin del
ADNc candidato. En este programa se toma como factor de normalizacin la media
geomtrica entre pares de genes internos de referencia que muestran un perfil de
expresin similar, partiendo del principio de que pares de genes que presenten patrones de
expresin estables entre s, son genes de control adecuados. (Vandesompele et al., 2002).
Este
software
se
encuentra
disponible
en
el
sitio
(http://www.genomebiology.com/2002/3/7/research/0034/). No obstante, este modelo

requiere de una extensa validacin prctica para identificar la combinacin adecuada de
genes de referencia para cada experimento en particular, siendo los mejores candidatos
para esto los genes coexpresados. El programa BestKeeper tambin selecciona el gen de
referencia menos variable a partir de las medias geomtricas y se encuentra disponible en
el sitio http://www.gene-quantification.de/BestKeeper-1.zip.
Un tercer programa llamado Norm-Finder, no slo mide la variacin del normalizador
sino que establece una gradacin entre los genes de referencia potenciales en trminos de
cunto difieren entre los diferentes grupos de estudio, entendindose esto como diferentes
condiciones experimentales.
Muchos autores han sugerido utilizar diversos genes de referencia en vez de confiar en un
solo transcripto. Este es un mtodo robusto de normalizacin altamente favorable cuando
deben realizarse cuantificaciones muy precisas. Esta tcnica no obstante est limitada por
problemas de disponibilidad de la muestra o el costo de las mismas.
E) Molculas artificiales
Estas molculas de ARN artificiales pueden ser obtenidas a partir de otro organismo en
el cual sus genes hayan sido clonados o pueden generarse de forma sinttica. Dado que
conocemos su cantidad exacta, pueden ser adicionadas a la muestra en las etapas de
extraccin de ARNm y as estarn sujetas a todos los errores experimentales que afectan
34
PCR en tiempo real
al ARN de inters. Adems no se vern afectadas por las fluctuaciones propias de los
sistemas biolgicos que muchas veces afectan a los genes de referencia. Sin embargo, la
generacin de estas molculas alien no es asequible a muchos laboratorios, sobre todo
los que realizan pocos ensayos de RT-PCR en tiempo real. La adquisicin comercial de
este tipo de estndares para la normalizacin permanece todava como una idea terica
que no ha sido validada.
En trminos generales, una adecuada normalizacin es crtica para obtener resultados
biolgicos relevantes. Dado que no existe una sola estrategia que sea aplicable a todas las
condiciones experimentales, la clave para una buena normalizacin en los ensayos de
PCR en tiempo real es la demostracin de que el gen utilizado como referencia ha sido
correctamente validado (Bustin et al., 2005).
35
Aplicaciones
CAPITULO 4
APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL
La emergente tecnologa del PCR en tiempo real ha demostrado su versatilidad y utilidad

en diversos campos de la investigacin biomdica y el diagnstico biomolecular, siendo la
limitante la imaginacin de investigadores y fabricantes de nuevos equipos, productos y
servicios asociados a estas ramas del conocimiento.
Entre los campos de accin que ms recurren a esta tecnologa se cuentan la virologa, la
microbiologa clnica y la investigacin biomdica, aunque existen otras como las
industrias alimenticias y farmacuticas que han hecho o harn uso de esta tecnologa.
En el presente captulo se revisarn algunas de las aplicaciones actuales y las perspectivas
futuras de la tecnologa del RT PCR.
4.1 Virologa
El PCR en tiempo real ha sido extremadamente til para el estudio de agentes virales
asociados a enfermedades infecciosas y ha ayudado a clarificar en alguna medida los
procesos infectivos de dichas enfermedades. La mayor parte de los ensayos que se
encuentran en la literatura muestran un aumento en la frecuencia de deteccin de virus
comparndolos con las tcnicas tradicionales, lo cual ha hecho ms atractivo el uso del RT
PCR en muchas reas de la virologa.
El RT PCR se ha hecho valioso en estudios generales de virologa, desde la simple
confirmacin de la presencia o ausencia de virus de diferentes enfermedades, o del
monitoreo de la actividad de genes especficos como resultado del crecimiento bajo
condiciones manipuladas. Tambin se puede seguir la entrada alterada o replicacin de un
virus causada por la modificacin tejido-especfica y permite comparar entre replicacin
viral y expresin de genes celulares. (Mackay et al., 2002).
EL RT PCR ha mejorado la velocidad y el alcance de la medicin de cepas virales y las
diferencias entre ttulos de pacientes que muestran diferentes sndromes debidos a
36
Aplicaciones
variaciones del mismo virus. (Furuta et al., 2001). Tambin, los estudios epidemiolgicos
han avanzado ya que con la tcnica de RT PCR se puede medir con precisin la cantidad
de dos cidos nucleicos blanco en una sola reaccin. El uso de nuevas estrategias
qumicas ha permitido una mejor discriminacin de mltiples genotipos virales en un solo
recipiente y ha provisto una alternativa a los mtodos de deteccin de virus basados en
ensayos de morbilidad y mortalidad.
El uso del RT PCR ha suministrado datos ms profundos sobre el papel de algunos
compuestos que tienen inhibicin en la reaccin de PCR como tambin ha dado luz sobre
la eficiencia de diferentes mtodos de extraccin de cidos nucleicos de un diverso tipo de
muestras. Esta capacidad de utilizar templados de diversos tipos de muestras, llena un
requerimiento importantsimo para un sistema ideal de deteccin, que es capaz de aplicar
una tecnologa sencilla en muchos campos. Esta flexibilidad se destaca por la deteccin de
cidos nucleicos virales, derivados en diferentes formas de plantas, animales, lodos
urbanos, fluido cerebroespinal, cultivo de tejidos, clulas sanguneas mononucleares,
plasma, suero, saliva y orina.
Tambin, condiciones crticas como sarcoma, carcinoma, neoplastia cervical intraepitelial
y desrdenes linfoproliferativos pueden ser fcilmente estudiados para investigar
relaciones directas o indirectas con infecciones virales. Tambin, el seguimiento de la
carga viral por tcnicas de RT PCR ha sido beneficioso para realizar seguimiento de
pacientes a quienes se les han trasplantado rganos.
Esta tecnologa se est convirtiendo en una herramienta esencial en el aseguramiento de
vectores de terapia gnica viral antes de su uso en pruebas clnicas. Adicionalmente, el
estudio de virus emergentes ha sido complementado con la tcnica de RT PCR como
herramienta para demostrar relaciones existentes entre secuencias virales nicas, seales
clnicas y sntomas de cada paciente.
La velocidad y flexibilidad del RT PCR tambin ha sido de utilidad para los intereses
comerciales y ha sido usada para la deteccin de contaminacin microbiana en
preparaciones de reactivos producidos a gran escala en sistemas de expresin eucariticos.
4.2 Microbiologa clnica (Costa, J. 2004)
Las aplicaciones del RT PCR en el campo de la microbiologa clnica no difieren mucho
de las que utilizan comnmente las reacciones de PCR convencional. Entre ellas se
37
Aplicaciones
cuentan el diagnstico etiolgico, el control del tratamiento con antimicrobianos y la
caracterizacin gentica de agentes infecciosos. No obstante, es previsible que gracias a
sus indudables ventajas y a la sencillez de su empleo, la RT PCR haya ido reemplazando a
la PCR convencional y que su aplicacin se extienda a un nmero cada vez mayor de
agentes infecciosos, implementndose progresivamente en la rutina asistencial. Algunas
empresas de diagnstico (Roche Diagnostics, Artus, Abbott, Celera) han hecho ya una
apuesta decidida por la nueva tecnologa y tienen disponibles, o los tendrn en breve, kits
para el diagnstico de los agentes infecciosos de mayor inters comercial mediante
sistemas de PCR a tiempo real (VIH, VHB, VHC, citomegalovirus). Sin embargo, hay
muchas enfermedades infecciosas, con menor inters comercial, en las que el uso de
mtodos moleculares de diagnstico aporta indudables ventajas. La PCR a tiempo real,
combinada con los nuevos sistemas automticos para la preparacin de las muestras,
ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas
moleculares para la identificacin o cuantificacin de esos agentes infecciosos. Es el caso
de muchos virus, (familia de los Herpesvirus, virus respiratorios, enterovirus, virus JC,
virus BK, etc.) o de bacterias que no crecen en medios de cultivo como Tropheryma
wippeli, o que crecen mal como Bordetella pertussis o Bartonella o muy lentamente como
Mycobacterium tuberculosis. Tambin, de micosis invasivas, especialmente por
Aspergillus ssp. o de infecciones parasitarias como las ocasionadas por Toxoplasma
gondii en lquido amnitico o en lquido cefalorraqudeo (LCR).
Otro campo potencial de aplicacin del RT PCR es en la identificacin de organismos
fcilmente cultivables, cuya deteccin rpida sea beneficiosa por algn motivo. Por
ejemplo, la identificacin de Streptococcus del grupo B (S. agalactiae) en frotis vaginales.
La colonizacin del tracto genital de mujeres parturientas por este agente se relaciona con
un mayor riesgo de infeccin neonatal grave. El tiempo necesario para el aislamiento de
esta bacteria mediante cultivo es de 1-2 das, mientras que por PCR a tiempo real su
identificacin se puede llevar a cabo en 30 min. La reduccin del tiempo de diagnstico
puede mejorar la prevencin de esas infecciones en recin nacidos. En otros casos, como
la sepsis, la supervivencia del enfermo puede depender de un diagnstico precoz del
agente causal que permita establecer el tratamiento antibitico especfico en etapas
tempranas del proceso. Probablemente en pocos aos se habrn optimizado protocolos de
38
Aplicaciones
PCR mltiple a tiempo real para la identificacin de los 10 o 20 agentes ms frecuentes de
la sepsis en unas pocas horas.
Lgicamente, la PCR a tiempo real no va a reemplazar al hemocultivo, porque la sepsis
puede estar ocasionada por una variedad de microorganismos mucho ms amplia, pero la
demora en el tratamiento se podr reducir en un nmero considerable de casos, lo que sin
duda puede mejorar el pronstico de este grave proceso.
El xito de un tratamiento no slo se basa en un diagnstico etiolgico precoz, sino que en
muchas ocasiones la determinacin rpida de la sensibilidad del agente causal a los
frmacos antimicrobianos puede ser determinante. La PCR a tiempo real proporciona
mtodos giles y sencillos para la identificacin de mutaciones puntuales asociadas con
resistencias a frmacos antimicrobianos. Por ejemplo, en apenas una hora se puede
determinar la presencia en heces de enterococos resistentes a vancomicina, facilitando el
control de la transmisin de este patgeno en los centros sanitarios. En los ltimos aos se
han desarrollado mtodos sencillos para la deteccin rpida de mutaciones asociadas con
resistencias a meticilina en Staphylococcus aureus y a rifampicina y a isoniacida en
Mycobacterium tuberculosis. Tambin se han descrito procedimientos para la
identificacin de mutaciones asociadas con resistencia a agentes antivricos, como la
lamivudina en VHB. Hoy da ya estn disponibles kits comerciales para algunas
aplicaciones comentadas en este apartado y en el futuro irn apareciendo muchos otros.
Incluso para las enfermedades infecciosas menos frecuentes estn, o estarn disponibles,
protocolos bien optimizados, sencillos y rpidos para que puedan ser implementados en la
rutina asistencial.
No obstante, hay que hacer hincapi en que esta potente metodologa slo ser til si los
laboratorios de microbiologa clnica participan en programas de control de calidad bien
definidos por entes gubernamentales.
4.3 Investigacin biomdica
Gran parte de los desarrollos alcanzados en la tecnologa de RT PCR tuvieron sus inicios
en investigaciones puntuales que llegaron a trminos comerciales. Este estudio primario
de diferentes fenmenos asociados a las disciplinas de biomedicina, bioqumica y
biotecnologa es necesario tanto en empresas de diagnstico como en empresas cuyos
departamentos de Investigacin y Desarrollo son cruciales para sus futuros desarrollos.
39
Aplicaciones
El RT PCR ha llegado a ser absolutamente comn en la investigacin bsica dentro de las
ciencias biomdicas. Cuando se requieren datos de expresin gentica para un proyecto
de investigacin, est tecnologa puede ser utilizada. Sin embargo, hay usos adicionales
que son particularmente tiles a la investigacin bsica. El RT PCR se puede utilizar para
genotipificar modelos de tipo knockout, knockin o de ratones transgnicos o para
determinar la eficacia de los mtodos en sistemas de clulas animales o en cultivos
celulares. Con el uso del RT PCR para la discriminacin de alelos, la deteccin de
polimorfismos en un solo nucletido (SNP), que pueden predisponer a individuos a
enfermedades particulares, puede determinarse en poblaciones, facilitando as los estudios
epidemiolgicos.
4.3.1 Validacin de los resultados de microarreglos de DNA
Debido a la confiabilidad del PCR en tiempo real, muchos investigadores utilizan el
mtodo de cuantificacin relativa o absoluta de la expresin de genes para validar y
corroborar los resultados de los microarreglos de DNA o arreglos de oligonucleotidos
(Por ej: Affymetrix GeneChip). Los microarreglos son usados porque permiten que un
investigador observe de una manera imparcial cmo la manipulacin experimental
puede afectar algunos de los miles de genes presentes en el microarreglo. Algunos
microarreglos pretenden contener el genoma entero de un organismo modelo y pueden
ser as tericamente probados para determinar cambios en la expresin dentro del
transcriptoma entero. El problema es que puede haber artificios, y es difcil conseguir
datos cuantitativos confiables o con poder estadstico adecuado con la actual tecnologa de
arreglos. As muchos investigadores escogen el RT PCR como tcnica de soporte para
validar y para cuantificar mejor los genes de inters de sus microarreglos.
4.3.2 Identificacin de mutaciones
El RT PCR se ha usado idealmente para el anlisis de mutaciones, incluyendo los
polimorfismos de un slo nucleotido (SNP), substituyendo a menudo otras tcnicas tales
como la secuenciacin, anlisis del polimorfismo conformacional de una sola hebra, y
anlisis de polimorfismos de fragmentos de restriccin. Para detectar mutaciones en la
secuencia, el anlisis de la curva de fusin se hace automticamente en el producto
40
Aplicaciones
amplificado (amplicon) inmediatamente despus del termociclado y de la medicin de la
fluorescencia.
Aunque cualquiera de las qumicas fluorescentes descritas en el numeral 3.3 de este
documento se puede utilizar para la deteccin de mutaciones, las sondas de hibridacin
son de uso frecuente. Despus de que se completa la reaccin de PCR, las sondas de
hibridacin se unen al amplicn en tndem, permitiendo que la energa fluorescente se
transfiera del donante al aceptor, el cual emite una seal. Como la temperatura de reaccin
del recipiente aumenta durante el anlisis de la curva de fusin, la sonda donadora se
disociar, dando como resultado una disminucin en la fluorescencia. Si hay alguna
mutacin en el amplicn (en la regin de hibridacin), la sonda donadora se unir menos
fuertemente y disociar a una temperatura ms baja. As las mutaciones pueden ser
detectadas fcilmente observando un cambio en el punto de fusin del producto de PCR.
Este tipo de anlisis puede tambin ser utilizado para genotipificar
organismos
individuales o experimentales (Por ej: discriminacin allica).

4.4 Organismos genticamente modificados (GMO) (Bustin, 2005)
La aprobacin mundial de una gran cantidad de organismos genticamente modificados
(GMOs), y los requisitos de etiquetado asociados, han dado lugar al desarrollo de mtodos
basados en RT PCR para la deteccin de la presencia de GMOs en alimentos o en aditivos
para los mismos. La deteccin de organismos genticamente modificados por RT PCR se
basa en la amplificacin paralela del transgen y de un gen endgeno de referencia que
proporciona un control tanto para la prdida de inhibicin como para la capacidad de
amplificar el DNA blanco en la muestra. Adems, para los anlisis cuantitativos, la
amplificacin del gen de referencia proporciona una estimacin de la cantidad total de
DNA blanco presente en la muestra. Ubicar el DNA blanco es particularmente apropiado,
debido a la alta estabilidad de esta molcula bajo las condiciones extremas usadas durante
el procesamiento de algunos productos alimenticios.
4.5 Aplicaciones futuras y perspectivas (Valasek et al., 2005)
Cualquier necesidad de medir rpida y exactamente pequeas de cantidades de cidos
nucleicos representa un nicho potencial a futuro para las innovaciones basadas en RT
PCR. Ya que las mquinas se vuelven ms rpidas, baratas, pequeas, y ms fciles de
41
Aplicaciones
usar, el desarrollo de ensayos estandarizados, y los avances en microfluidos, la ptica, y
los termocicladores, se podrn cubrir ms campos de aplicacin. En el sector alimenticio y
la agricultura, la tcnica de RT PCR puede probablemente ampliar el uso para deteccin e
identificacin de microorganismos, parsitos u organismos genticamente modificados.
Las ciencias forenses se pueden beneficiar de la sensibilidad, especificidad, y velocidad
de las tcnicas de RT PCR, especialmente porque el tiempo es crucial para muchas
investigaciones criminales y el tamao de la muestra puede ser limitado. La reduccin en
el costo y la disminucin en los tamaos de los equipos abren una puerta para el
diagnostico de enfermedades en reas alejadas junto con los estudios epidemiolgicos in
situ y pueden facilitar la transferencia de tecnologas cientficas a los pases en vas de
desarrollo. Ya que la demanda para medir la expresin gentica es poco probable que
disminuya, nuevas generaciones de mquinas para RT PCR deben ser desarrolladas.
Como las computadoras, las primeras generaciones de mquinas debern ser
relativamente ms baratas y por lo tanto se incrementar el acceso global y el aumento de
la tecnologa. La enseanza del RT PCR podr ser usada como una plataforma para
introducir conceptos claves en biologa molecular, as como tambin una oportunidad para
dar a los estudiantes habilidades cientficas relevantes. El RT PCR generar un foco de
atencin hacia el transcriptoma, permitiendo a los investigadores entender mejor los
programas transcripcionales que son la base de la fisiologa, la patofisiologa, y
desarrollo.
La evolucin de la ciencia y de la tecnologa de la biologa molecular puede ser vista
cronolgicamente por pocas que estn marcadas por la maduracin del estudio de
biomolculas particulares. Bsicamente, el anlisis del DNA (genmica) fue primero
realizado en el proyecto del genoma humano. Ahora, el anlisis de los perfiles de
expresin del RNA (transcriptmica) est alcanzando madurez. El futuro inminente
promete grandes saltos en anlisis de las protenas (protemica), y en lpidos biolgicos o
intermediarios metablicos (lipmica o metabolmica, respectivamente). Se espera que
los pedazos del rompecabezas biomolecular puedan ser juntados, conduciendo a una
comprensin ms holstica de la biologa. Para formar una figura coherente, sin embargo,
sern necesarios avances paralelos en la adquisicin, la compilacin, y el anlisis de
datos.
42
Trampas del RT-PCR en tiempo real
CAPITULO 5
TRAMPAS DEL RT-PCR EN TIEMPO REAL
La cuantificacin de ADN genera datos robustos que son informativos y reproducibles,

esto se debe a que la informacin contenida dentro del genoma es independiente del
contexto. De forma general, cada clula normal dentro de un organismo contiene la misma
secuencia de ADN, las mismas mutaciones y los mismos polimorfismos. El transcriptoma,
por otra parte, depende altamente del contexto celular y temporal, por lo que la
informacin que nos brinda es muy variable. Si esto lo combinamos con las limitaciones
tcnicas inherentes a cualquier ensayo de RT-PCR en tiempo real, puede ser difcil
obtener resultados que puedan ser interpretados de una manera correcta. La calidad del
templado, la variacin entre operadores y la subjetividad en el anlisis de los datos son
slo algunos de los aspectos tcnicos que convierten al RT-PCR en tiempo real en una
tcnica frgil que puede hacer difcil la correcta interpretacin de los datos. Un ejemplo de
ello es la cuantificacin de ARNm que proviene de biopsias como las derivadas de
colonoscopas, clulas aisladas o muestras obtenidas mediante la microdiseccin por lser,
donde la cantidad de templado es muy baja. Desgraciadamente bajo estas circunstancias la
cuantificacin de ARNm por RT-PCR en tiempo real puede ser utilizada de manera
inapropiada para llegar a conclusiones nada comprometidas con la realidad. Por todo esto
existen dudas de que en el futuro, los anlisis basados en el transcriptoma se vuelvan
tcnicas de rutina (Bustin y Nolan, 2004b).
5.1. Calidad del ARN
Anteriormente hemos destacado que la calidad del ARN templado es el factor ms
importante para obtener resultados de relevancia biolgica. Muchas muestras, en especial
las biopsias de tejido humano, son nicas, y por ende deben ser tratadas con extremo
cuidado, desde su coleccin, transporte y almacenamiento. Debe existir alta rigurosidad
43

en los protocolos de extraccin de ARN, el cual es extremadamente delicado. Un
templado adecuado para una reaccin de RT-PCR en tiempo real debe cumplir con los
siguientes criterios:
1-Debe estar libre de ADN, especialmente si el templado es un gen sin intrones
2-No deben copurificar inhibidores de la reversotranscripcin
3- La preparacin debe estar libre de nucleasas para un almacenamiento adecuado
Existen muchos componentes dentro de la sangre y los tejidos que inhiben los ensayos de
RT-PCR. La sangre de los mamferos en cantidades tan pequeas como al 1% v/v inhibe a
la Taq polimerasa (Panaccio y Lew, 1991). El cido hmico, polmero componente de las
muestras extradas de suelo, inhibe las reacciones de PCR (Zhou et al., 1996), as como el
calcio proveniente de los alimentos (Rossen et al., 1992). Las drogas terminadoras de
cadena como el Aciclovir son tambin inhibidores de la Taq polimerasa, lo que lleva a
obtener resultados que son falsos negativos en determinados pacientes (Yedidag et al.,
1996). Algunos componentes de los medios de cultivo y de los agentes de extraccin de
cidos nucleicos, e incluso los palillos de madera utilizados para picar colonias
bacterianas, son algunos de los inhibidores ms comunes de las reacciones de PCR (Lee et
al., 1995). Otros inhibidores son altamente especficos, como los provenientes del
msculo esqueltico, los cuales frenan a la Taq polimerasa pero no a la polimerasa aislada
de Thermus thermophilus (Belec et al., 1998).
5.2. Deteccin no especfica
En estos mtodos se utilizan agentes intercalantes del ADN de doble cadena como el
SYBR Green (Ishiguro et al., 1995), el cual se adiciona a la mezcla de reaccin y, aunque
no es especfico, es muy utilizado para cuantificar ADN si el PCR se combina con curvas
de disociacin que permitan evaluar la calidad del producto de reaccin (Ririe et al.,
1997). Los ensayos que utilizan intercalantes del ADN que fluorescen tienen dos ventajas
respecto a los que se basan en sondas especficas:
1- Pueden incorporarse a protocolos optimizados que utilizan los mismos primers y
las mismas condiciones experimentales.
2- Son mucho ms baratos.
Estas caractersticas convierten a los agentes intercalantes del ADN en herramientas tiles
para los primeros pasos en la optimizacin de las tcnicas de PCR en tiempo real, por
44

ejemplo, para determinar si existe alguna interaccin entre los primers mediante el
anlisis de curvas de disociacin o para explorar de forma preliminar la tcnica de
deteccin de mltiples amplicones antes de utilizar un ensayo basado en sondas
fluorescentes especficas.
Entre las desventajas de la deteccin no especfica se encuentra la unin indiscriminada
hacia cualquier estructura de doble cadena, lo que produce fluorescencia en el control sin
templado debido a su unin a los dmeros de primers. Un segundo problema es que las
curvas de disociacin para analizar la calidad del producto obtenido son absolutamente
necesarias, lo cual incrementa la complejidad de los anlisis. Un tercer problema es que
muchas de estas molculas son capaces de unirse a una sola molcula de amplicn, por lo
que la intensidad de la seal fluorescente luego de la radiacin depender del tamao del
ADN de doble cadena. Si asumimos similares eficiencias de amplificacin, el PCR en
tiempo real de un templado ms largo generar una mayor seal fluorescente.
5.3. Deteccin especfica
El anlisis especfico de los templados requiere el diseo y la sntesis de una o varias
sondas fluorescentes. Algunas sondas pueden ser utilizadas adems para realizar curvas de
disociacin, lo cual provee otro nivel de control para el producto de la reaccin. La mayor
ventaja de estas sondas es que aseguran un segundo paso de especificidad, la cual ya no
slo radica en los primers utilizados. Los artefactos de la amplificacin que pueden
ocurrir debido a un mal funcionamiento de los primers o a la formacin de dmeros entre
ellos no genera seal fluorescente, lo cual obvia la necesidad de realizar un Southern Blot,
curvas de disociacin o la secuenciacin del producto luego del ensayo de PCR para
confirmar la identidad del amplicn. Las sondas adems pueden ser marcadas con
diferentes fluorforos, lo cual permite la deteccin simultnea de varios productos de
amplificacin en una misma reaccin de PCR (multiplexing). Dentro de las desventajas
del uso de sondas especficas se encuentra paradjicamente la no deteccin de los
artefactos que ocurren, los cuales siempre disminuyen la eficiencia del ensayo. Debido a
esto se hace necesario utilizar los fluorforos intercalantes del ADN de doble cadena para
optimizar el tipo de primers a utilizar y las condiciones de la reaccin, y de esta forma,
asegurarnos de que no ocurran apareamientos anmalos. El uso de las sondas especficas
es adems costoso, cada templado requiere de su sonda particular, incrementando mucho
el costo en los ensayos de multiplexing.
45

5.4 Linearidad del paso de reversotranscripcin
La primera etapa de las reacciones de RT-PCR puede llevarse a cabo utilizando tres tipos
de primers ADNc diferentes: al azar, oligo-dT o primers especficos por el templado, los
cuales difieren significativamente entre s respecto a la cantidad de ADNc que se obtiene.
Es necesario puntualizar adems que la temperatura de desnaturalizacin de los primers al
azar y de los oligo-dT est muy por debajo de la temperatura ptima de funcionamiento de
las reversotranscriptasas termoestables, por lo que al ser utilizados deben preincubarse
previamente con el ARN a bajas temperaturas o deben ser modificados qumicamente. La
compaa Ambion demostr que la reversotranscripcin a partir de muestras biolgicas
puede ocurrir an sin la adicin exgena de primers, dado que en los tejidos existen
primers internos. Esto por supuesto conlleva a una alteracin de los resultados en el paso
de PCR posterior. El uso de primers al azar produce varios ADNc a partir de un templado
de ARN, por lo que este mtodo es, por definicin, no especfico. Sin embargo rinde la
mayor cantidad de ADNc, lo cual es decisivo en la identificacin de transcriptos que se
encuentran en bajas cantidades. Se ha demostrado que los hexmeros al azar pueden
sobreestimar la cantidad de templado hasta en 19 veces respecto a los primers secuenciaespecficos (Zhang and Byrne, 1999), adems de que la mayora del ADNc sintetizado
proviene del ARN ribosomal. La sntesis de ADNc utilizando oligo-dT es ms especfica
para el ARNm y es capaz de amplificar ARNm con estructuras secundarias significativas.
Debido a que el uso de los oligo-dT requiere de ARN de alta calidad, no se utilizan en los
casos en que el ARN se fragmenta, como el obtenido por microdiseccin con lser.
Los primers especficos por el templado de ARN constituyen la opcin ms sensible de
cuantificacin (Lekanne et al., 2002). La relacin lineal Ct vs cantidad de templado en una
reaccin de RT-PCR en tiempo real utilizando oligonucletidos especficos es ms
amplia que para los ensayos donde se utilizan primers al azar, lo cual se ilustra muy bien
en la figura 5.1.
46
Fig. 5.1.
El poder analtico del RT-PCR tambin depende de la eficiencia de conversin de ARN a

ADNc, lo cual recae sobre la enzima utilizada. Por otro lado, debe considerarse otro factor
importante conocido como el efecto Monte Carlo, una limitacin inherente a toda
tcnica de PCR donde se quiera amplificar un templado que se encuentran en pequeas
cantidades formando parte de una mezcla compleja (Karrer et al., 1995). La eficiencia de
la amplificacin entre templados individuales dentro de una poblacin de ADNc depende
de su concentracin: cada uno tiene una cierta probabilidad de ser amplificado o ignorado
una vez que sobrepasa cierto rango de dilucin. Una explicacin a este fenmeno puede
ser el considerar que la hibridacin de los primers con cada molcula de templado en cada
ciclo de PCR es un evento azaroso. Bajo condiciones de exceso de primers, la
probabilidad de hibridacin depende de la temperatura de hibridacin, el tiempo y el
nmero de templados disponibles. Si la cantidad de templado es limitante y se encuentra
dentro de una mezcla compleja, disminuir la eficiencia de su amplificacin debido a que
47

la probabilidad de hibridacin con el primer ser menor. Si estas diferencias ocurren
durante la fase exponencial de la amplificacin, el reporte de la concentracin final de ese
templado en particular ser completamente errnea.
5.5 Anlisis de los datos
El parmetro Ct se ha convertido en el ms utilizado para realizar cuantificaciones
utilizando la tcnica de RT-PCR en tiempo real. Anteriormente explicamos que el ciclo
umbral (Ct) se define como el ciclo donde la fluorescencia excede un valor umbral
escogido por encima del ruido de fondo. Aqu la palabra crtica es escogido, dado que
el ruido de fondo no es un valor absoluto y tambin se ve influenciado por las condiciones
de la reaccin. Muchas veces, los valores de Ct no son indicativos de una amplificacin
genuina, y en otros casos, una verdadera amplificacin no provee un valor de Ct
significativo. Este ltimo caso se da cuando el nmero de ciclos que determinan el ruido
de fondo se escogen de forma incorrecta, a partir de los cuales se establece la lnea
umbral de fluorescencia. Normalmente, estos ciclos son los primeros antes de que el
producto de PCR se acumule de forma significativa al inicio de la fase exponencial, y
suelen ser del 3 al 15 (AB Prism 7700) o del 5 al 9 (instrumentos de Stratagene),
dependiendo del equipo. Muchas veces, la lnea base de fluorescencia que se determina en
el experimento no es la apropiada para cada pozo de reaccin. Un ejemplo de esto se
muestra en la figura 5.2, donde se muestra una comparacin de dos curvas de
amplificacin que tienen valores de Rn similares (0.023 vs 0.02) pero slo uno de ellos
rebasa la lnea umbral y da una respuesta positiva. Esto se debe a que la fluorescencia
verde se mantiene constante desde las primeras etapas del ensayo de PCR y comienza a
incrementarse a partir del mismo nivel de la fluorescencia umbral, sin embargo, la
fluorescencia representada por la lnea roja sufre un descenso significativo de 0.015
unidades, por lo que el aumento de fluorescencia en la fase exponencial de amplificacin
no rebasa la lnea umbral. Este fenmeno puede darse por diferencias en la sensibilidad
qumica de los fluorforos a los mltiples cambios de temperatura que ocurren
normalmente en toda reaccin de PCR. Aqu no podemos decir que no ocurre
amplificacin en el ensayo representado por el fluorforo rojo, sino que es necesario
realizar un ajuste de la lnea basal donde se incluya el ciclo donde la lnea roja presenta la
menor fluorescencia (de 3 a 32 y no de 3 a 15 como estaba previamente determinada), lo
48

cual se traduce en valores de Ct similares para ambos fluorforos. Una analoga til es la
comparacin entre la altura que alcanzan dos personas al saltar: slo podemos compararlo
si ambas saltan desde el mismo nivel.
Fig. 5.2
49

5.6 El nivel umbral
El nivel umbral calculado por los equipos de PCR en tiempo real depende de la lnea basal
y generalmente se predetermina para corridas estandarizadas. Sin embargo, este nivel
puede cambiarse en dependencia de las condiciones del ensayo y siempre debe estar
relacionado con el Rn ms bajo y el ms alto valor de Ct asociados con el menor nmero
de copias del templado. Es muy importante puntualizar dos aspectos relacionados con la
seleccin del nivel umbral:
1- No es necesario utilizar un mismo nivel umbral para cada corrida. Una misma corrida
puede ser analizada con mltiples valores umbrales y son referidas como ventana de
valores dentro de un rango umbral (Applied Biosystems).
2- El nivel umbral siempre debe interceptar la fase exponencial del ploteo de
amplificacin. Si los valores de Ct son muy altos y los de Rn son muy bajos, claramente
no nos encontramos en una regin definida de la fase exponencial, en cuyo caso hay que
ajustar el nivel umbral.
La utilizacin de mltiples niveles umbrales para el clculo de Ct es la excepcin, pero
muchas veces resulta necesario para cuantificar muestras que difieren mucho en cuanto a
la cantidad inicial de templado (Fig.5.3). Muchas veces existe tan poco ARNm que la
disminucin del umbral conlleva a que el control de la reaccin sin templado (NTC)
tambin arroje un resultado positivo. La interpretacin de este resultado ha sido objeto de
numerosos debates. La situacin es clara cuando por ejemplo, tenemos valores de Ct para
las muestras de 18 a 25 cuando el NTC tiene un valor de Ct de 39. No obstante el hecho
de que el NTC haya arrojado un resultado positivo (haya alcanzado el nivel de
fluorescencia umbral) debe ser resaltado en cualquier publicacin. Cuando los valores de
Ct estn por debajo de 30, es muy probable que exista contaminacin en el laboratorio.
La situacin es diferente cuando los niveles de Ct para la muestra y el NTC son
comparables, lo que normalmente ocurre con bajos niveles de templado. Cuando
analizamos mltiples muestras y slo uno de los replicados tiene un valor positivo de Ct,
la muestra puede estar contaminada. Se recomienda siempre utilizar dos pozos para los
NTC: uno que debe ser sellado antes de la adicin de las muestras, los controles positivos
y los estndares y el otro debe ser sellado al final para as detectar cualquier
contaminacin si hay diferencias significativas entre los valores de Ct de ambos NTCs.
50
Fig. 5.3. A. Curva de amplificacin donde el nivel umbral seleccionado de 0.12 no detecta resultados
claramente positivos. B. La reduccin manual de la lnea umbral permite tomar en cuenta los resultados
positivos de Ct para todas las muestras, donde tambin se incluye ahora el NTC (morado).
51
Conclusiones
CONCLUSIONES
Como hemos visto a travs de todo este trabajo, la tcnica de PCR en tiempo real es
altamente poderosa y puede generar resultados reproducibles con significado biolgico.
Sin embargo, est ms que demostrado que hay que tomar muchas precauciones durante
la planeacin, la ejecucin del ensayo y el anlisis e interpretacin de los resultados. En el
futuro ser necesario introducir nuevos estndares y reportar todo el procedimiento para
establecer guas confiables que puedan validar los resultados experimentales y que sean
utilizadas por los editores para la revisin rigurosa de las publicaciones. En resumen, el
PCR en tiempo real es una tcnica que debe ser tratada con respeto.
52
Referencias bibliogrficas
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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baselines and thresholds.
(http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/data_analysis_7700.pdf).
Arlington, VA. (2003) Bioinformatics. The market for real-time PCR reagents and
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Belec, L., Authier, J., Eliezer-Vanerot, MC., Piedouillet, C., Mohamed, AS., Gherardi, RK..
(1998) Myoglobin as a polymerase chain reaction (PCR) inhibitor: a limitation for PCR from
skeletal muscle tissue avoided by the use of Thermus thermophilus polymerase. Muscle. Nerve,
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Dr. Roberto P. Stock Silberman

Rodrguez M & Rodrguez W

Rodrguez M & Rodrguez W

En los ltimos aos, la reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) ha

Rodrguez M & Rodrguez W

El concepto de producir muchas copias de una molcula especfica de ADN mediante un

cuales permitieron la comparacin de secuencias en todo el

Figura 2.1 Curva de utilizacin de la

Rodrguez M & Rodrguez W

Por qu el PCR en tiempo real?

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

determina identificando el nmero del ciclo en el cual la intensidad de la emisin del

Alineamiento del primer/ hibridizacin de sonda

Fig. 3.1 Representacin esquemtica de un ensayo de RT-PCR usando el mtodo Taqman

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

3.3.1 Qumica no especfica

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

Figura 3.4 Fluorescencia del SYBR green I con el

Una ventaja importante en la qumica no

Los polimorfismos biallicos pueden ser detectados por la combinacin de

PCR en tiempo real

El uso de anlisis de curvas de disociacin para identificar diferentes amplicones, evita la

Adems, como diferentes amplicones pueden fundir a diferentes temperaturas, el SYBR

PCR en tiempo real

deben emplear condiciones de reaccin ptimas y una seleccin cuidadosa de primers

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

Fig. 3.6 Sondas marcadas con fluorforos. a) El

La sntesis de primers marcados se ha simplificado mucho recientemente mediante el uso

Fig 3.7. Primers LUX. Un primer contiene un

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

Sondas de hibridizacin especficas

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

Fig. 3.8 Resumen de la qumica asociada a las sondas Taqman

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

Fig. 3.9 Molecular beacons

El uso de los molecular beacons proporciona un nivel adicional de especificidad, ya que

PCR en tiempo real

Fig. 3.10. Elementos de un primer Scorpions

como los realineamientos de los amplicones o el plegamiento inadecuado del templado.

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

Fig. 3.12 Sondas FRET

Fig. 3.11 Reaccin de un primer Scorpion

Fig. 3.12 Sondas FRET

Rodrguez M & Rodrguez W

PCR en tiempo real

En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un

PCR en tiempo real

rango de fluorescencia desde 500 a 660nm. La

PCR en tiempo real

de un arreglo mltiple de fibras pticas. Las emisiones de fluorescencia resultantes de la

Fig. 3.15. El Rotor-Gene

por lo que no se necesita un fluorforo de normalizacin.