FTIR

Estructura de Macromolculas
Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM
II.3. Espectroscopia biolgica de absorcin.

II.3.1. Espectroscopia de infrarrojos (IR).
Los espectros en la regin infrarroja de inters biolgico estn asociados a las
transiciones entre niveles de energa vibracional; estos niveles corresponden a vibraciones
(tensin-contraccin) y flexiones de los enlaces y otros movimientos complejos de las
molculas.
II.3.1.1. Regiones del espectro infrarrojo.
El intervalo que abarca la espectroscopia infrarroja puede dividirse en tres regiones:

infrarrojo lejano, medio y cercano, tabla II.3.1.
Tabla II.3.1. Regiones del espectro infrarrojo.
Al Infrarrojo cercano (NIR) corresponden los espectros de vibracin de alta energa.

Se usa tpicamente para medidas cuantitativas de grupos funcionales orgnicos, especialmente
O-H, N-H y C=O. Recientemente se han desarrollado nuevas aplicaciones en la industria
farmacutica, en agricultura, etc ( consultar la pgina web ://www.nirpublications.com/)
Al Infrarrojo lejano corresponden los espectros de rotacin pura de molculas en
estado gaseoso. No es posible aplicar esta regin a los biopolmeros en disolucin.
El Infrarrojo medio es la regin mas adecuada para los estudios de biopolmeros en
disolucin; los espectros correspondientes consisten en mltiples bandas debidas a
vibraciones del esqueleto molecular. En general todas las aplicaciones analticas caen entre
4000 y 670 cm-1. La regin til para macromoleculas biolgicas en el intervalo entre 4000 y
1400 cm-1. Las bandas de estos espectros son anchas y centradas en frecuencias de grupos
caractersticos tales como -C=O, -C=N, -N-H, amidas en protenas, ster fosfato en cidos
nucleicos, etc.
172
II.3.1.2. Fundamentos de la espectroscopia infrarroja.

Como hemos dicho al principio los espectros infrarrojos estn asociados a transiciones
entre niveles de energa de vibraciones (tensin-contraccin) y flexiones de los enlaces y otros
movimientos complejos de las molculas. En la figura III.2.1 se muestra un esquema de
diferentes tipos de vibraciones moleculares.
Vibraciones de tensin
Asimtrica
Simtrica
Vibraciones de flexin
Balanceo en el plano
Tijereteo en el plano
Aleteo fuera del plano
Torsin fuera del plano
Figura II.3.1. Tipos de vibraciones moleculares. Los signos + y corresponden a

movimientos desde el plano del papel hacia el lector y en direccin contraria,
respectivamente.
As la molcula de CO2 tiene cuatro modos de vibracin normales, dos de tensin de
enlaces (stretching), y dos de flexin de ngulos de enlace (bending), figura II.3.1. El
movimiento vibracional total es una combinacin de estos modos normales.
173
Figura II.3.2 Modos normales de vibracin del CO2.

Los modos de vibracin de cada grupo son sensibles a cambios en la estructura qumica,
cambios en las conformaciones y a interacciones con el medio; as por ejemplo el grupo C=0
tiene una banda centrada en 1.700 cm-1 y cuando se forma un puente hidrgeno, C=0 H ,
la banda se desplaza a 1652 cm-1.
Para familiarizarnos con las caractersticas que presentan los espectros infrarrojos en la
figura II.3.3 se muestra el espectro correspondiente a una delgada pelcula de poliestireno.
Figura II.3.3. Espectro de absorcin infrarrojo de una delgada pelcula de poliestireno

obtenido en un moderno espectrmetro FTIR. La escala del nmero de onda cambia a partir
de 2000 cm-1.
El caso ms simple de vibracin molecular que podemos abordar tericamente es el de
una molcula diatmica representada por un oscilador armnico simple. Este modelo simple
puede describirse mediante la Fsica Clsica o la Mecnica Cuntica; los resultados obtenidos
con uno y otro enfoque tienen aspectos comunes pero diferencias muy notables, siendo la
descripcin cuntica la ms correcta y completa. No vamos a describir con detalle los dos
tratamientos, pero si merece la pena destacar las diferencias principales de los resultados
obtenidos por cada uno.
174
II.3.1.2.1. Descripcin clsica de la vibracin de una molcula diatmica.

En esta descripcin se concibe a la molcula diatmica A-B, de masas mA y mB,
respectivamente como un oscilador armnico simple, donde la fuerza restauradora cuando los
tomos se desplazan de su posicin de equilibrio cumple la ley de Hooke, es decir, es
proporcional al desplazamiento, x:
d 2x
F = 2 = k x
[II.3.1-1]
dt
donde k, la constante de proporcionalidad, es llamada constante de fuerza del enlace entre
ambos tomos y es masa reducida dada por:
1
1
1
=
+
m A mB
La analoga con un sistema de dos masas unidas a un muelle es completa, donde la constante
K sera la constante de recuperacin del muelle, figura II.3.4.
F = k x
mA
mB
-x
+x
Figura
II.3.4. Analoga de una molcula diatmica que se comportara como un

oscilador armnico simple.
La solucin a la ecuacin diferencial II.3.1-1 es: x = A sen 2 0t , donde A es la

amplitud de la oscilacin (mxima elongacin) y 0 la frecuencia de vibracin dada por:
1 k
[II.3.1-2]
2
La molcula oscila peridicamente desde x=-A hasta x=+A, con una frecuencia
determinada por la constante de fuerza y la masa reducida.
La energa potencial en funcin de la posicin se obtiene integrando la ecuacin II.3.11, resultando:
1
1
[II.3.1.3]
W = k .x 2 = k A 2 sen 2 (2 0 t )
2
2
Esta energa potencial ser mxima en x = A y mnima en x = 0 .
0 =
1
La energa cintica es: T =
2
Y la energa total ser:
1
dx
2
2
= k A cos (2 0 t ) .
dt
2

E =W +T =
1
k A2
2
[II.3.1.4]
es decir, la energa total (en ausencia de procesos disipativos) es una constante determinada
por la constante de fuerza del enlace y la amplitud de la oscilacin.
175
Una expresin ms til para la energa potencial se obtiene cambiando x en la

ecuacin [II.3.1.3] por R-Re, donde R es la distancia internuclear y Re la distancia internuclear
de equilibrio (la longitud de enlace):
1
2
W ( R) = k .(R Re )
2
[II.3.1.5]
La figura II.3.5 muestra la curva, en color azul, de la energa potencial del estado fundamental de la molcula H2 segn el modelo de oscilador armnico. Re para H2 es 07412 .
Este modelo no es aceptable para distancias internucleares alejadas del valor Re.
Cuando R<<Re la fuerza repulsiva se superpone a la de recuperacin y la curva de energa
potencial debe aumentar de forma mas pronunciada con la distancia de lo que predice el
oscilador armnico. Para R>>Re la ley de Hooke no se cumple, la fuerza recuperadora se
debilita y a cierto valor umbral de energa se produce la disociacin de la molcula, que tiene
lugar a 4748 eV ( 1eV = 806548 eV) para la molcula H2. La curva de color rojo en la figura
II.3.5 corresponde a un modelo no armnico ms realista como es la energa potencial de
Morse que vamos a revisar mas adelante.
Obviamente los modelos mecanoclsicos del oscilador no predicen el carcter discreto
de los niveles de energa vibracionales que solo el enfoque mecanocuntico explica.
Figura II.3.5. Curva de energa potencial del oscilador armnico (azul) y curva de
energa potencial de Morse para la molcula H2
II.3.1.2.2. Descripcin cuntica de la vibracin de una molcula diatmica.
Una descripcin mecanocuntica detallada del oscilador armnico unidimensional
podemos encontrarla en el capitulo 4 del libro Qumica Cuntica de Ira N. Levine; Ed.
Prentice Hall, 5 edicin. Aqu solo vamos a destacar el resultado final de este tratamiento y
su comparacin con el tratamiento mecanoclsico.
176
La ecuacin aplicada al oscilador armnico unidimensional es:

2 d 2 1
[II.3.1.6]
+ k x 2 = E
2
2 dx
2
donde es la funcin de onda vibracional, es el nmero cuntico vibracional, que puede
tomar valores enteros positivos 0,1,2,3, etc (no confundir con la frecuencia ). Las otras
variables y parmetros son los mismos que ya se han especificado en la descripcin clsica
anterior.
La solucin de la ecuacin de Schrdinger anterior nos da como resultado unos
valores propios del operardor Hamiltoniano que responden a la expresin general
1 h
E = +
2 2
= + h 0
2

k
[II.3.1.7]
En esta expresin 0 coincide con la frecuencia vibracional del modelo

mecanoclsico. Estos niveles de energa, representados en la figura II.3.6 por las lneas
horizontales continuas (de color azul), estn igualmente espaciados con una diferencia de
energa entre dos niveles consecutivos E = h 0 . En esta figura se incluyen los niveles de
energa vibracional observadas experimentalmente mediante lneas horizontales de puntos
(rojos) y podemos observar que el oscilador armnico resulta un buen modelo para los ms
bajos niveles de energa, pero falla a mas altas energas.
Figura II.3.6. Curva de energa potencial del oscilador armnico y niveles de energa
vibracional (lneas horizontales de trazo continuo) que se obtienen cuando el concepto de
oscilador armnico se usa en la mecnica cuntica para deducir las funciones de onda de la
molcula diatmica. Las lneas de puntos representan los niveles de energa vibracional
observadas experimentalmente.
177
II.3.1.2.3. Anarmonicidad de las vibraciones moleculares.

La imposibilidad de predecir la disociacin de la molcula biatmica, y la no
coincidencia de los niveles superiores de energa de vibracin previstos por el oscilador
armnico con los reales, es consecuencia del carcter no armnico de la oscilacin de los
enlaces. Un potencial con el que se obtienen resultados mucho mejores es el llamado
potencial Morse:
V ( R ) = De (1 e ( R Re ) )
[II.3.1.8]
donde De representa el valor mnimo de la energa potencial, y tanto R como Re tienen el

2
.
mismo significado que en la ecuacin [II.3.1.5]. El parmetro es: 0 = 0
De
En la figura II.3.7 se representa la curva de este potencial que como vemos predice la
disociacin de la molcula. Los niveles de energa se han calculado aadiendo a la ecuacin
II.3.1.7 trminos que representan la anarmonicidad de la oscilacin:
2
1
1
1
E == + h 0 X e + h 0 + Ye + +
2
2
2
[II.3.1.9]
Donde Xe y Ye son la primera y segunda constante de anarmonicidad, respectivamente.
Figura II.3.7. Curva de energa potencial de Morse con un mnimo de energa de valor De.
Niveles de energa vibracional calculados con la ecuacin 2.4.9 usando solo el primer
trmino de anarmonicidad. D0 representa la energa de disociacin de la molcula.
178
II.3.1.2.4. Diferencias fundamentales entre la descripcin mecanoclsica y la mecanocuntica.

Diferencias introducidas por la anarmonicidad de la vibracin.
Dos son las diferencias fundamentales de los resultados a los que nos conduce el
tratamiento mecanoclsico y el mecanocuntico de las vibraciones de una molcula
diatmica:
1. Mientras que para la mecnica clsica el oscilador armnico puede tomar cualquier
valor de energa, la mecnica cuntica predice que estos valores estn cuantificados.
2. Para la mecnica clsica la molcula puede tener una energa vibracional nula,
mientras que la mecnica cuntica predice una energa residual o energa en el punto cero
1
dada por: E = h 0 y que es consecuencia del principio de incertidumbre.
2
Otro resultado del tratamiento mecanocuntico, que puede considerarse como una
regla de seleccin, concluye que las molculas diatmicas homonucleares (N2, H2, O2, etc.
) sin momento dipolar y aquellas molculas simtricas, que teniendo un momento dipolar
no nulo, presentan modos de vibracin cuyos cambios de momento dipolar se compensan con
la vibracin, son inactivas en infrarrojos, es decir no dan espectros de vibracin. Esto es
consecuencia de que la probabilidad de transicin es proporcional al momento dipolar de
transicin (concepto mecanocuntico que podramos asemejar al concepto de momento
dipolar del electromagntismo clsico), y para que ste no resulte nulo el operador cuntico
momento dipolar, ~ , debe cambiar con la vibracin.
Por otro lado cuando se usa en mecnica cuntica el oscilador armnico la regla de
seleccin para las transiciones entre niveles es = 1 . Sin embargo, como hemos visto
anteriormente al considerar la anarmonicidad los niveles de energa no estn igualmente
espaciados, hacindose mas prximos cuando nos acercamos a la energa de disociacin. La
regla de seleccin anterior deja de cumplirse y se observan transiciones con = 2 y
= 3 . Estas transiciones son las responsables de la aparicin de las llamadas lneas de
sobretono o armnicos a frecuencias unas dos o tres veces mayores que la frecuencia de la
lnea fundamental ( = 1 ); frecuentemente la intensidad de estas lneas de absorcin son
pequeas y los picos no llegan a observarse.
Los espectros vibraciones se complican tambin por el hecho de que dos vibraciones
distintas de una misma molcula pueden interaccionar mutuamente para dar picos de
absorcin con unas frecuencias que aproximadamente son la suma o la diferencia de sus
frecuencias fundamentales. De nuevo en este caso, las intensidades de estos los picos son por
lo general pequeos.
II.3.1.3. Espectrmetros Infrarrojos
Dos son los tipos principales de espectrmetros de infrarrojo, los Dispersivos y los
Multiplex o de Transformada de Fourier. Los primeros son espectrofotmetros de doble haz
que utilizan redes de reflexin para la dispersin cuyo diseo y construccin son parecidos a
los espectrofotmetros ultravioleta/visible. Los de Transformada de Fourier, comnmente
llamados FTIR (Fourier Transform Infrared) son espectrmetros basados en el fenmeno de la
interferencia, que funcionan con seales en el dominio del tiempo y que presentan grandes
ventajas sobre los dispersivos. Para aplicaciones de ndole general en las que se necesita una
elevada sensibilidad y rapidez, los espectrmetros de infrarrojo mas utilizados actualmente
son los FTIR.
179
Aqu solo vamos a describir el espectrmetro FTIR, y puesto que stos se basan en el
interfermetro de Michelson, vamos a describir este dispositivo a continuacin.
II.3.1.3.1 El interfermetro de Michelson.
El interfermetro de Michelson es un dispositivo que divide un haz de radiacin en
dos haces de casi igual potencia y, a continuacin, los recombina de tal forma que las
variaciones de intensidad del haz recombinado pueden medirse en funcin de las diferencias
de longitud de las trayectorias de las dos mitades. La Figura II.3.8 representa un esquema de
dicho dispositivo cuando se usa para la espectroscopia ptica de transformada de Fourier.
Como se indica en la figura, el haz de radiacin de la fuente se colima e incide en un
espejo semitransparente divisor de haz, el cual transmite alrededor de la mitad de la radiacin
y refleja la otra mitad. Los haces gemelos resultantes se reflejan en espejos, uno de los cuales
es fijo y el otro mvil. A continuacin, los haces se vuelven a encontrar en el divisor, con una
mitad de cada uno dirigindose hacia la muestra y el detector, y las otras dos mitades
regresando hacia la fuente. Para fines analticos slo se emplean las dos mitades que
atraviesan la muestra hacia el detector, aunque las otras dos mitades tambin contienen la
misma informacin acerca de la fuente.
El movimiento horizontal del espejo mvil har fluctuar de manera predecible la
potencia de la radiacin que llega al detector. Cuando los dos espejos equidistan del divisor
(posicin O de la Figura II.3.8), las dos partes del haz recombinado estarn totalmente en fase
y la potencia ser mxima.
I ( )
Figura II.3.8. Esquema de un interfermetro de Michelson y la seal o interferograma

obtenido para una fuente de radiacin infrarroja monocromtica.
180
Para una fuente monocromtica, el movimiento en cualquier direccin del espejo

mvil, en una distancia exactamente igual a un cuarto de longitud de onda (posicin B o C de
la figura) cambiar la longitud de la trayectoria del correspondiente haz reflejado en una
mitad de la longitud de onda (un cuarto de longitud de onda en cada direccin). En estas
circunstancias, la interferencia destructiva reducir a cero la potencia radiante de los haces
recombinados. Un movimiento posterior hasta A o D pondr en fase las dos mitades, de
manera que vuelva a producirse una interferencia constructiva.
La diferencia 2(M F) de los caminos de los dos haces de la figura, se denomina
retardo . Una grfica de la Intensidad de la radiacin medida por el detector frente ase
denomina un interferograma; para la radiacin monocromtica, el interferograma toma la
forma de una curva coseno como la de la grfica inferior izquierda de la Figura II.3.8 (coseno
en vez de seno porque la potencia siempre es mxima cuando es cero y los dos caminos son
idnticos).
La radiacin que llega al detector despus de pasar por un interfermetro Michelson,
suele ser de frecuencia mucho menor que la de la fuente. La relacin entre las dos frecuencias
se deduce con facilidad analizando la grfica de I() frente a . Cuando el espejo se mueve
una distancia correspondiente a la mitad de la longitud de onda (/2), se produce un ciclo de
la seal. Si el espejo se mueve a una velocidad constante VM y se define como el tiempo
necesario para que el espejo se mueva /2 cm, se puede escribir:
VM =
2
La frecuencia f de la seal en el detector es simplemente la inversa de :
1 V
2V
f = = M = M = 2VM v
2
Teniendo en cuenta que = C la relacin entre la frecuencia ptica de la radiacin y la

frecuencia del interferograma puede escribirse como:
2V
[II.3.1.10]
f = M
C
Como la velocidad de la luz es C = 3x1010 cm.s-1 y VM es del orden de pocos cm.s-1, sea por
ejemplo 15 cm.s-1, f = 10 10 .
II.3.1.3.2 Relacin entre el Interferograma y el espectro.
Considerando una fuente monocromtica la intensidad total registrada por el detector
ser:
[II.3.1.11]
I T ( ) = I ( )1 + cos 2

2
Obsrvese que cuando el retardo es un mltiplo de la longitud de onda, = n , no habr

1
interferencia destructiva y I ( ) = I ( ) . Cuando = n + se cumplir que I ( ) = 0 y

2
habr interferencia destructiva total.

Esta intensidad tiene dos componentes, una de ellas es constante y la otra vara
peridicamente:
I T ( ) =
1
I ( ) +
2
181
I ( ) cos 2
[II.3.1.12]
Y es precisamente la parte peridica la que nos interesa y en lo sucesivo llamaremos

Interferograma:
1
1
[II.3.1.13]
I ( ) = I ( ) cos 2 = I ( ) cos (2 )
2
2
En la prctica hay varios factores que afectan a la magnitud de I ( ) , a saber:

- No idealidad del espejo semitransparente.
- Respuesta no lineal de los detectores infrarrojos, es decir la respuesta no uniforme
con la frecuencia.
- Respuesta en frecuencia del amplificador.
- Filtros electrnicos.
Todos estos factores se engloban en una funcin de correccin H ( ) que es
independiente de la muestra y que modifica la ecuacin II.3.1.13 quedando:
1
I ( ) = H ( )I ( ) cos (2 )
2
Esta ecuacin se simplifica englobando todo lo que multiplica a la funcin coseno en
un factor B( ) que representa la intensidad de radiacin modificada por las caractersticas
instrumentales:
I ( ) = B( ) cos (2 )
[II.3.1.14]
esta ecuacin nos dice que podemos obtener el espectro a partir del interferograma sin mas
que dividir por cos(2 ) .
Si en lugar de una fuente monocromtica consideramos que tenemos una fuente que
genera dos radiaciones infrarrojas, 1 y 2, iguales en amplitud pero que difieren en una
fraccin 011, el interferograma tendra la forma de una oscilacin peridica modulada en
amplitud como se muestra en la figura II.3.9. y en los casos A y B de la figura II.3.10.
Figura II.3.9. Interferograma que se obtiene con una fuente

que emite dos radiaciones infrarrojas, 1 y 2, iguales en amplitud
pero que difieren en una fraccin 011,
182
Cuando la fuente de IR emite una radiacin policromtica el interferograma

correspondiente es la resultante de los interferogramas correspondiente a cada nmero de
onda:
n
I ( ) = B( i ) cos (2 i )
1
[II.3.1.15]
donde la sumatoria se extiende a las n frecuencias diferentes. (Ver el caso de dos).

Si la fuente de IR emite un espectro de radiacin continuo la sumatoria de esta
ecuacin se convierte en integral y los lmites se han de extender a :
I ( ) = B( ) cos (2 ) d
[II.3.1.16]
Esta ecuacin es una de las dos ecuaciones del par Transformada de Fourier, siendo la
transformada inversa:
B( ) = I ( ) cos (2 ) d
[II.3.1.17]
Como I ( ) es una funcin par podemos escribir:
B( ) = 2 I ( ) cos (2 ) d
0
[II.3.1.18]
Lo relevante de estas ecuaciones es que podemos obtener el espectro a partir del

interferograma mediante la transformacin integral de Fourier; por ello a la espectroscopia
infrarroja que hace uso de espectrmetros basados en el interfermetro de Michelson se
conoce como FTIR (Fourier Transform InfraRed).
En la figura II.3.10 se muestran algunos casos sencillos de espectros y sus
correspondientes interferogramas interconectados por el par de Transformada de Fourier
definido por las ecuaciones II.3.1.16 y II.3.1.17. Leer el pie de la figura para mas informacin.
Segn estas ecuaciones en teora, es posible medir el espectro completo, desde 0 a +
-1
cm con una infinita resolucin. No obstante para ello deberamos mover el espejo desde 0 a
+. La resolucin entonces est limitada por el mximo retardo con el que se haya
1
implementado el instrumento: =
cm 1
max
183
INTERFEROGRAMA EN FUNCIN DEL RETARDO
FT
FT
FT
FT
Numero de onda (cm-1)
RETARDO
Figura II.3.10. Diferentes casos de fuentes de radiacin infrarroja, con los correspondientes
espectros a la izquierda y los interferogramas correspondientes. A, dos radiaciones
infrarrojas, 1 y 2, iguales en amplitud. El interferograma correspondiente (a la derecha)
consiste en una onda modulada en amplitud que se anula en aquellos valores del retardo
para el que la interferencia es completamente destructiva. B, dos radiaciones infrarrojas, 1 y
2, diferentes en amplitud. El interferograma correspondiente es anlogo al del caso anterior
pero debido a la diferencia de amplitudes no llega a anularse en los retardos de mxima
interferencia destructiva. C, Una banda Lorentziana centrada en la mitad de las lineas
espectrales de los casos A y B. Puesto que la Transformada de Fourier de una Lorentziana es
una funcin exponencial decreciente, cuyo tiempo de relajacin es proporcional al inverso de
la anchura de la Lorentziana, el interferograma es una seal oscilante atenuada
exponencialmente. D, Una banda Lorentziana centrada en el mismo nmero de onda del
caso anterior pero de anchura doble. El interferograma correspondiente es anlogo al caso
anterior pero con una atenuacin ms abrupta con un tiempo de relajacin mitad del
anterior. Las dobles flechas etiquetadas con FT representan el par de transformaciones
integrales de Fourier para pasar del dominio de la frecuencia o nmero de onda al dominio
del retardo y viceversa.
En el apndice A.2. encontramos una descripcin de un espectrmetro de infrarrojo de

Transformada de Fourier dando una breve especificacin sobre los componentes mas
importantes de estos espectrmetros.
En la figura II.3.11 se muestra un tpico interferograma y en la figura II.3.12 el
procedimiento usual para obtener un espectro de IR.
184
Figura II.3.11. Interferograma tpico de un FTIR. Se caracteriza por una

seal muy intensa a retardo nulo que se atena fuertemente para retardos
positivos o negativos.
INTERFEROGRAMA
ESPECTRO
B0 (
FONDO (Haz simple)
FONDO
B0 (
MUESTRA
MUESTRA (Haz simple)
ESPECTRO DE
DOBLE HAZ
Figura II.3.12. Generacin de un espectro en un espectrmetro FTIR. a)

Interferograma y espectro del fondo (sin muestra). b) Interferograma y
espectro con la muestra. c) Cociente de espectros.
185
Se obtiene un interferograma de la fuente de IR tal como se registra en el detector en

ausencia de muestra. Este interferograma digitalizado se somete a la transformacin de
Fourier y el espectro resultante se almacena en la memoria del ordenador. Con la muestra
presente ahora se repite la obtencin del interferograma, la transformacin de Fourier y su
almacenamiento en memoria. La razn entre el segundo y el primer espectro nos d la
Tramitancia que suele expresarse en tanto por ciento:
%T =
B( )
B0 ( )
II.3.1.3..3 Ventajas de los espectrmetros infrarrojos de tranformada de Fourier sobre los

espectrmetros dispersivos.
1. La ms significativa de las ventajas es la mejor relacin seal/ruido, al menos un
orden de magnitud, que caracteriza a los espectrmetros de transformada de Fourier. Este
hecho es consecuencia de la llamada ventaja de Fellgett, ver apndice.
2. Presentan resoluciones elevadas, (<01 cm-1) y elevada exactitud y reproducibilidad
en la determinacin de la frecuencia. La exactitud en la medida de es, al menos, de 001
cm-1, mientras que la exactitud de los espectrmetros convencionales caen en el intervalo de
2 a 8 cm-1. El secreto de la espectacular mejora de la exactitud radica en la exactitud en el
periodo de muestreo y el disparo del proceso de toma de datos, para lo que se usa un
interfermetro auxiliar (ver apndice).
3 El tiempo necesario para obtener un espectro es mucho menor que en los
espectrmetros dispersivos. As para una resolucin de 01 cm-1 barriendo desde 400 cm-1
hasta 4000 cm-1 un espectrmetro FTIR puede tardar 1 s., mientras que un espectrmetro
dispersivo tardara unos 30 minutos. Esta ventaja se hace crtica en aplicaciones de estudios
cinticos. Esta rapidez permite acumular 20 o 30 barridos en muy poco tiempo lo que redunda
en mejorar la relacin seal/ruido.
II.3.1.4. Aplicaciones de la espectroscopia FTIR a protenas.

.3.1.4.1 Principales
peptdico.
bandas
del
grupo
El grupo peptdico produce hasta 9

bandas caractersticas llamadas A,B,I,II, VII.
Las bandas Amida I y Amida II son las dos
principales bandas de los espectros IR de
protenas:
La banda Amida I es la ms intensa
de las bandas de absorcin en protenas, entre
1600 y 1700 cm-1 est asociada principalmente
con la vibracin de tensin del C=O (70-85%)
y esta directamente relacionada con la
conformacin del esqueleto polipeptdico y el
patrn de enlaces de H.
186
O
Amida I
C
N
Amida II
H
Figura II.3.13. Vibraciones fundamentales del
grupo peptdico. Bandas Amida I y II.
La banda Amida II est relacionada con la vibracin de flexin del enlace N-H (4060% de la energa potencial) y con la vibracin de tensin de los enlaces C-N (18-40%) y del
C-C (10%). Esta banda tambin es sensible a la conformacin de la cadena.
La banda Amida A, sobre 3500 cm-1 y la banda amida B, sobre 3100 cm-1, se
originan por resonancia Fermi entre el primer armnico o sobretodo de la banda Amida II y la
vibracin de tensin del enlace N-H. Este modo de vibracin no es dependiente de la
conformacin pero es muy sensible a la fuerza del enlace de H; as la banda A cae entre 3225
y 3280 cm-1 para longitudes de enlace de H entre 2.69 y 2.85 .
Amida III y IV son bandas muy complejas que tienen su origen en una mezcla de
desplazamientos de coordenadas. Las bandas amida V, VI y VIII estn asociadas a
movimientos fuera del plano peptdico. Estas bandas son de menos utilidad.
En la Figura II.3.14 se muestra un espectro con las bandas fundamentales del grupo
peptdico.
Antes de continuar es necesario considerar el problema de la interferencia del agua.
Como podemos ver en la Figura II.3.15 el agua absorbe fuertemente en la regin donde caen
importantes grupos, incluyendo las bandas Amida I y Amida II, lo que hace prcticamente
imposible estudiar los espectros de protenas en su presencia. En esa misma figura podemos
observar que el D2O es un disolvente que absorbe mucho menos en esa regin (notar que la
escala de absorbancia es logartmica) por lo que usualmente los espectros de protenas se
hacen usando D2O como disolvente.
Figura II.3.14 Espectro de Absorbancia vs nmero de onda mostrando las bandas

fundamentales del grupo peptdico.
187
Figura II.3.15 Espectro de Absorbancia de H2O y D2O y representacin de las

frecuencias de algunos grupos de inters.
Antes de extraer informacin estructural de las formas y posiciones de las bandas
Amida I y Amida II es necesario reconocer la presencia de bandas que provienen de las
cadenas laterales de aminocidos. De los 20 aminocidos proticos solo 9, Asp, Asn, Glu,
Gln, Lys, Arg, Tyr, Phe, His, muestran una absorbancia significativa en la regin de 1800 and
1400 cm-1 (regin Amida I y Amida II)(1). Ver Tabla II.3.2.
II.3.1.4.2 Estructura secundaria en peptidos modelo
Un elevado nmero de polipptidos sintticos se han usado para caracterizar,
experimental y tericamente, los espectros de infrarrojos de los diferentes elementos de
estructura secundaria de las protenas. Por ejemplo, la polilisina adopta una estructura de
hlice , de lmina o de cadena al azar dependiendo del pH y la temperatura de la
disolucin (Susi et al. 1967) y a cada conformacin le caracteriza un juego de frecuencias
diferentes (2)
Lminas
Las frecuencias de las bandas principales de absorcin para polipptidos sintticos que
adoptan la estructura secundaria lmina anti paralela han sido estudiadas por Chirgadze &
Nevskaya (3). En este trabajo se concluye que la banda Amida I est determinada
esencialmente por la conformacin del esqueleto polipeptdico y que es independiente de en la
secuencia de aminocidos, e independiente de propiedades tales como hidrofobicidad,
hidrofilicidad o carga. La banda Amida I tiene dos componentes; la frecuencia media del
principal componente es 1629 cm-1 con un mnimo de 1615 cm-1 y un mximo de 1.637 cm-1.
El segundo componente tiene un valor medio de 1696 cm-1 siendo el valor ms bajo
encontrado de 1685 cm-1. La estructura de lmina paralela no es frecuente en los
polipptidos sintticos, no obstante la banda principal se localiza alrededor de los 1.640 cm-1.
188
Tabla II.3.2. Vibraciones de las cadenas laterales de aminocidos.

Modos de vibracin: t, tensin; f, flexin; s, simtrica; as, asimtrica.
Absorbancia en el mximo: A0. Ancuhra del pico a la mitad de altura: 1/2
Hlices
Para el elemento de estructura secundaria hlices la frecuencia media de la banda
Amida I es de 1652 cm-1 y para la banda Amida II de 1.548 cm-1 (3). La anchura
caracterstica de la banda (anchura a la mitad de la altura) depende de la estabilidad de la
hlice. Para las hlices ms estables la anchura es de unos 15 cm-1, que corresponde con una
energa libre de transicin hlice-ovillo al azar de ms de 300 cal/mol. Otras hlices muestran
anchuras mitad de 38 cm-1 con una energa libre de transicin 90 cal/mol.
Giros
Las bandas de los tres tipos de giros (tipo I,II y III) aparecen fuertemente solapadas.
Una banda de absorcin de aproximadamente 1680 cm-1 se asigna a estos giros (2).
189
II.3.1.4.3 Estructura secundaria en protenas.

La forma de la banda Amida I de las protenas globulares es caracterstica de su
estructura secundaria. En 1986 Byler y Susi publicaron en Biopolymers (4) la primera
determinacin de estructuras secundarias en protenas a partir de espectros FTIR. Esta
determinacin fue posible por la disponibilidad de espectros digitalizados con una elevada
relacin Seal/ruido y por la disponibilidad de ordenadores y de software capaz de realizar las
operaciones de anlisis de estos espectros en un tiempo aceptable.
La informacin sobre la estructura secundaria en los espectros IR est mezclada por el
solapamiento de las bandas de diferentes estructuras. Para obtener informacin estructural
hemos de separar las diferentes contribuciones que se dan en la zona de la banda Amida I.
Dos mtodos han sido utilizados con este objetivo: a) mtodos de reconocimiento de patrones
y b) ajuste de bandas.
a) Los mtodos de reconocimiento de patrones se basan en la construccin de un
banco de espectros de protenas con porcentajes de estructura secundaria conocidos. Este
banco es utilizado posteriormente para estimar los porcentajes de estructura secundaria de la
protena que nos interesa, utilizando diferentes algoritmos. Estos mtodos permiten obtener
unos porcentajes de las diferentes estructuras secundarias presentes en una protena (hlices,
lminas, giros y otras estructuras) con un error absoluto del 4-10% (6-8) sin requerir ninguna
asignacin de bandas. Este mtodo supone que la Amida I (o la Amida II) slo es sensible a la
estructura secundaria de la protena, y que una estructura secundaria mostrar siempre un
espectro con la misma posicin, anchura y forma, independientemente de en qu protena se
localice. El xito de este mtodo depende de que las protenas que forman el banco de
calibracin sean lo ms semejantes posibles a la protena problema. Incluso en estas
condiciones, la informacin estructural obtenible se reduce a una estimacin de la estructura
secundaria.
b) En el mtodo de ajuste de bandas est basado en la suposicin de que los
espectros de bandas simples (cada banda estrecha caracterstica de un elemento de estructura
secundaria) experimentan un ensanchamiento en disolucin o en estado slido; como
consecuencia las bandas solapan y no pueden distinguirse en la envolvente.
En este mtodo se realiza una operacin de correccin del efecto de ensanchamiento
de las bandas; operacin llamada desconvolucin, normalmente mediante la desconvolucin
de Fourier (con frecuencia referida errneamente como autodesconvolucin por razones
histricas). El objeto es identificar el nmero y posicin aproximada de las bandas que
componen la Amida I. Con el espectro as corregido se realiza un ajuste de bandas en la
Amida I por un algoritmo iterativo que minimiza la desviacin cuadrtica media de la
envolvente resultante del ajuste y la experimental. El rea de una banda se asigna a una
estructura de acuerdo con su posicin (4, 10). Esta asignacin descansa en los intervalos de
aparicin aceptados para las diferentes estructuras secundarias. Este mtodo es el ms
extendido, y ha sido validado por comparacin con los datos de difraccin de rayos X, siendo
los errores absolutos en la estimacin de porcentajes de estructura secundaria del 2-9% (4, 10,
11).
La Figura II.3.16 muestra los resultados de descomponer la banda Amida I en bandas
simples (gausianas) para las protenas Lisozima y LDH (Lactato deshidrogenada), en estado
plegado (nativo) y en estado desplegado (desnaturalizado), respectivamente. La Figura II.3.17
muestra lo mismo para la Citratosintasa y el FAB ( fragmento fab de anticuerpo de ratn).
190
Figura II.3.16. Descomposicin de la banda Amida I en bandas simples gausianas, asociadas

a elementos de estructura secundaria para Lisozima y LDH, en estado nativo (izquierda) y
desnaturalizado (derecha), por el mtodo de ajuste de bandas.
Los datos revelan que la banda Amida I para todas las protenas se descomponen en 6
o 7 componentes principales que se encuentran en todos los espectros. El contenido en hlice
alfa que se resulta del anlisis de la banda Amida I para la Lisozima, la Lactato
deshidrogenasa y la citratosintasa concuerda con los datos de la estructura determinada por
difraccin de rayos X. Sin embargo el contenido de hlice en el fragmento FAB es demasiado
bajo y el contenido de lmina demasiado alto. La forma de la envolvente de la banda Amida
I para esta protena en el estado nativo difiere ampliamente de la que presenta en el estado
desnaturalizado; para el estado nativo la banda es claramente asimtrica tiene un pico mximo
a 1650 cm-1 que corresponde a estructura hlice . En contraste la protena desnaturalizada
muestra un mximo entre 1620 y 1640 cm-1, indicando el predominio de lmina y de
estructura desordenada.
191
Figura II.3.17. Descomposicin de la banda Amida I en bandas simples gausianas, asociadas

a elementos de estructura secundaria para Citratosintasa y el FAB ( fragmento fab de
anticuerpo de ratn), en estado nativo (izquierda) y desnaturalizado (derecha), por el
mtodo de ajuste de bandas.
Del rea bajo cada banda simple se estima el porcentaje de los cuatro tipos de estructura
secundaria y en la tabla II.3.3. se comparan con los porcentajes obtenidos por difraccin de
rayos X.
Tabla II.3.3. Porcentajes de estructura secundaria obtenidos por cristalografa de

rayos X y por FTIR para las cuatro protenas indicadas.
Lisozima
LDH
FAB
CSC
Rayos X
FTI
R
Rayos X
FTI
R
Rayos X
FTI
R
Rayos X
FTI
R
Hlice
45
42
43
49
49
19
64
64
Lmina
19
16
19
21
14
39
12
15
Giros
23
36
30
27
28
33
23
19
Al azar
13
192
II.3.1.4.4 Aplicaciones de la espectroscopia FTIR a cidos nucleicos.
En cidos nucleicos el esqueleto azcar fosfato y varias bases presentan vibraciones

mucho ms complejas que las encontradas en protenas.
Las asignaciones de las bandas son ms difciles. como consecuencia las aplicaciones
de estn menos desarrolladas.
Las vibraciones ms estudiadas corresponden al grupo carbnico y dobles enlaces de
los anillos pricos y pirimidinicos, regin de 1500 a 1.800 cm-1. Estas vibraciones son
sensibles al apareamiento de bases debido a la formacin de los puentes de hidrgeno. As en
la figura de II.3.18 de la a trasparencia se muestran los espectros de dobles hlices de poli rArU y poli rG-rC (espectros de trazo continuo) y los espectros de las hebras separadas (espectro
de trazo discontinuo).
Es evidente que la rotura del apareamiento de bases conduce a cambios muy notables
en en los espectros IR y este efecto es mayor que el que podemos observar con la
espectroscopa ultravioleta/visible.
Por otro lado los espectros de las cuatro bases comunes de los cidos nucleicos tienen
un espectro bastante diferente o que hace posible examinar separadamente las formaciones de
los pares G-C y A-U.
Figura II.3.18. Efecto del apareamiento de las bases sobre los espectros IR. (a) Espectro de
la doble hlice de poli rA.rU (espectro de trazo continuo) y la suma de los espectros de los
homopolinucletidos poli rA y poli rU separados (espectro de trazo discontinuo). (b)
Espectro de la doble hlice de poli rG.rC (espectro de trazo continuo) y la suma de los
espectros de los homopolinucletidos poli rG y poli rC separados (espectro de trazo
discontinuo). Los espectros se han obtenido en D2O a pH 7.
193
APENDICES
A1. Ventaja Fellgett
Supongamos que medimos N veces una magnitud en presencia de un ruido aleatorio y
acumulamos el valor de la medida:
N
Acumulacin de la seal: X = xi = N xi
i
Acumulacin del ruido: R = N ri

Luego la relacin seal/ruido ser
X
N
N
R
N
En los espectrmetros dispersivos convencionales el monocromador selecciona la

longitud de onda con un colimador de un determinado ancho de rendija que determina la
resolucin. En cada posicin del monocromador se observa un intervalo muy estrecho de
frecuencias, prcticamente un solo elemento de resolucin. Por el contrario en los
espectrmetros FTIR, el interferograma se construye con todas las frecuencias presentes y el
nmero de elementos de resolucin ser:

N= 1 2
Donde 1 y 2 son los lmites de la regin del espectro que se estudia y es la resolucin.
La mejora en la relacin seal/ruido ser
N.
Veamos un ejemplo, para max = 4000 cm 1 , min = 400 cm 1 y = 2 cm 1 la ventaja de

Fellgett nos dar una mejora de la relacin seal/ruido de 42.
A.2. Descripcin de un espectrmetro de infrarrojo de Transformada de Fourier.

La mayora de los instrumentos de infrarrojo con transformada de Fourier disponibles
comercialmente se basan en el interfermetro de Michelson, aunque tambin se encuentran
otros tipos de instrumentos. Se considerar solamente el diseo de Michelson.
Los componentes ms importantes de los espectrmetros FTIR son: Mecanismo de
traccin, Divisores del haz, Fuentes y Detectores.
Mecanismo de traccin.
Para la obtencin de interferogramas satisfactorios, es necesario que la velocidad del
espejo mvil sea constante y que su posicin se conozca exactamente en cualquier instante.
Tambin debe permanecer constante la verticalidad del espejo respecto a la trayectoria del haz
a lo largo de todo el recorrido de 10 o ms cm. Para las regiones del infrarrojo medio y
cercano se requieren mecanismos de desplazamiento muy precisos y complejos. El soporte de
los espejos est suspendido sobre cojinetes de aire sujetos a unos tubos de acero inoxidable
(vase la Figura A2.1). Este montaje se acciona por medio de una bobina electromagntica
semejante a la de un altavoz y el espejo se mueve a una velocidad constante por medio de una
194
corriente creciente en la bobina. Al alcanzar un extremo, el espejo regresa rpidamente al

punto de partida mediante una rpida inversin de la corriente, e inicia un nuevo barrido. La
longitud del recorrido vara de 1 a unos 20 cm y las velocidades de barrido oscilan de 0,01 a
10 cm/s.
FIGURA A2.1. Interfermetros en un espectrmetro infrarrojo con transformada de

Fourier. Los subndices 1 indican la trayectoria de la radiacin en el interfermetro de
infrarrojo y los subndices 2 y 3 se refieren a los interfermetros de lser y de luz blanca
respectivamente. (Cortesa de Nicolet Analytical lnstruments, Madison, WI.)
Para que el sistema opere satisfactoriamente se requieren dos caractersticas
adicionales. La primera es que el sistema permita muestrear el interferograma a intervalos de
desfase definidos. La segunda es que se pueda determinar exactamente el punto de desfase
cero para hacer posible el promediado de las seales. Si no se conoce con exactitud este
punto, las seales de los barridos repetidos no estarn totalmente en fase y el promediado
tiende a degradar la seal en lugar de mejorarla.
El problema del muestreo preciso de la seal, y de su promediado puede superarse
mediante el uso de tres interfermetros en vez de uno y con un solo montaje que contiene a
los tres espejos mviles. En la Figura A2.1 se muestra un esquema de este dispositivo. Los
componentes y las trayectorias de la radiacin para cada uno de los tres sistemas
interferomtricos se indican respectivamente, con los subndices 1, 2 y 3. El sistema 1 es el
sistema de infrarrojo que proporciona finalmente un interferograma semejante al que se
muestra en la curva A de la Figura A2.2. El sistema 2, tambin denominado sistema de
referencia de franjas lser, proporciona la informacin para el intervalo de muestreo. Dicho
sistema consiste en un lser de helio y nen S2, un sistema interferomtrico con dos espejos
MM2 y M2, un divisor del haz B2 y un transductor T2. La seal de salida de este sistema es
sinusoidal (onda coseno), como se indica en la parte C de la Figura A2.2. Esta seal se
convierte electrnicamente en la onda de forma cuadrada que se muestra en D; el muestreo
comienza y termina en cda interseccin sucesiva en el cero. El sistema de referencia de
195
franjas lser proporciona intervalos de muestreo muy reproducibles y regularmente

espaciados. En la mayora de los instrumentos, la seal lser se utiliza tambin para mantener
constante la velocidad del sistema que acciona los espejos.
El tercer sistema interferomtrico, llamado a veces de luz blanca, emplea una fuente
de tungsteno S3 y un transductor T3 sensible a la radiacin visible. Su sistema de espejo se
fija de modo que se produzca un desfase cero desplazado hacia la izquierda con respecto al de
la seal anal tica (vase el interferograma B, Figura A2.2). Debido a que la fuente es
policromtica, su potencia a desfase cero es mucho mayor que cualquier seal anterior y
posterior a este punto. De esta forma, se puede utilizar este mximo para desencadenar el
inicio del muestreo de datos para cada barrido de modo altamente reproducible.
FIGURA A2.2. Seales de dominio de tiempo para los tres interfermetros

contenidos en un instrumento de infrarrojo basado en la transformada de Fourier.
Curva A: seal de infrarrojo; curva B: seal de luz blanca; curva C seal de
referencia de franja de lser; curva D seal elctrica de onda cuadrada obtenida
a partir de la seal de lser.
El triple sistema interferomtrico que se ha descrito permite una considerable precisin
en la determinacin de las frecuencias y bastante mayor que la que se consigue con los
instrumentos de red convencionales. Esta elevada reproducibilidad es importante cuando se
han de promediar muchos espectros. En la actualidad existen instrumentos que son capaces de
dar la misma precisin en las frecuencias solamente con un interfermetro. En este caso el haz
lser es paralelo o colineal con el haz infrarrojo, de tal forma que ambos haces atraviesan un
nico interfermetro. Adems, no se emplea fuente de luz blanca, y el interferograma de
infrarrojo se utiliza para establecer el punto de desfase cero.
196
El mximo en el interferograma de infrarrojo es una referencia excelente debido a que

este es el nico punto donde todas las longitudes de onda interfieren constructivamente.
El sistema que se muestra en la Figura A2.1 es capaz de proporcionar espectros con
una resolucin comprendida entre 0,1 y 1 cm-1. Para obtener resoluciones de 0,01 cm-1 se
necesita un sistema ms complejo capaz de mantener la alineacin del espejo mvil. Uno de
los sistemas de alineamiento del espejo utiliza tres sistemas de referencia con franja lser en
lugar de uno solo, los cuales se dirigen a puntos distintos sobre el espejo mvil. Debido a que
los tres puntos definen un plano, el uso de los tres lseres aumenta de manera significativa la
exactitud con la que se conoce a cada instante la posicin y la orientacin del espejo mvil.
Divisores del haz.

Los divisores de haz estn construidos de materiales transparentes con ndices de
refraccin tales que aproximadamente el 50% de la radiacin se refleja, y el 50% se transmite.
Un material que se utiliza mucho en la regin del infrarrojo lejano, es una delgada pelcula de
Mylar que se coloca entre dos placas de un slido de bajo ndice de refraccin. Para la regin
del infrarrojo medio se obtienen buenos resultados con pelculas delgadas de germanio o
silicio, depositados sobre bromuro o ioduro de cesio, cloruro de sodio o bromuro de potasio.
Para trabajar en el infrarrojo cercano se utiliza una pelcula de xido de hierro(III) que se
deposita sobre fluoruro de calcio.
Fuentes.
Las fuentes de infrarrojo consisten en un slido inerte que se calienta elctricamente a
una temperatura comprendida entre 1500 y 2200 K. Como resultado se obtiene una radiacin
continua que se aproxima a la del cuerpo negro. A estas temperaturas la mxima intensidad
radiante se produce entre 5000 y 5900 cm-1 (de 2 a 17 m). A longitudes de onda mayores, la
intensidad decrece suavemente hasta llegar a ser el 1% del mximo a 670 cm-1 (15 m). A
menores longitudes de onda, la disminucin es mucho ms rpida, y una reduccin de
intensidad anloga se produce a los 10000 cm-1 (1 m).
Algunas de las fuentes de IR ms usadas son:
El emisor de Nernst. Est constituido por xidos de tierras raras, y tiene forma
cilndrica con un dimetro de 1 a 2 mm y una longitud de unos 20 mm. Los extremos
del cilindro estn unidos a unos conductores de platino que permiten el paso de la
electricidad lo que permite alcanzar temperaturas comprendidas entre 1200 y 2200 K.
La lmpara de Nernst tiene un coeficiente de resistencia elctrica respecto a la
temperatura muy negativo, y debe calentarse externamente hasta el rojo oscuro para
que la corriente sea suficiente como para mantener la temperatura deseada. Debido a
que la resistencia disminuye con el aumento de temperatura, el circuito de la fuente se
ha de disear para limitar la corriente; si no fuera as, la lmpara se calentara tanto
que se destruira.
La fuenteGlobar. Un Globar es una varilla de carburo de silicio, que por lo
general tiene unos 50 mm de longitud y 5 mm de dimetro. Se calienta tambin
elctricamente (1300 a 1500 K) y tiene la ventaja de poseer un coeficiente de
resistencia positivo. Por otra parte, es necesario enfriar los contactos elctricos con
agua para evitar la formacin de un arco. Las energas espectrales del Globar y del
197
emisor de Nernst son semejantes, excepto en la regin inferior a 5 m, donde el

Globar se distingue por tener una mayor energa.
Fuente de filamento incandescente. Una fuente de intensidad algo menor,
aunque de vida til ms prolongada en comparacin con un Globar o un emisor de
Nernst, consiste en una espiral muy apretada de alambre de nicromo, que se calienta
por el paso de una corriente elctrica. Alambres de rodio, introducidos en el interior de
cilindros de cermica, constituyen una fuente de emisin con propiedades semejantes.
El arco de mercurio. Para la regin espectral del infrarrojo lejano (> 50 m),
ninguna de las fuentes trmicas descritas hasta aqu proporcionan suficiente energa
para una deteccin adecuada. En este caso, se utiliza un arco de mercurio de alta
presin. Este dispositivo consiste en un tubo de cuarzo que contiene vapor de mercurio
a una presin mayor que una atmsfera. El paso de la electricidad a travs del vapor
origina una fuente de plasma que proporciona una radiacin continua en la regin del
infrarrojo lejano.
La lmpara de filamento de tungsteno. Una lmpara de filamento de
tungsteno ordinaria es una fuente adecuada para la regin del infrarrojo cercano de
4000 a 12 800 cm-1 (25 a 078 m).
Fuente lser de dixido de carbono. Para el control de la concentracin de
ciertos contaminantes atmosfricos y para determinar especies absorbentes en
disoluciones acuosas, se utiliza-como fuente de infrarrojo un lser sintonizable de
dixido de carbono. Un lser de dixido de carbono produce una banda de radiacin
en el intervalo de 900 a 1100 cm-1 (11 a 9 m), que est constituida por unas 100
lneas discretas y poco espaciadas. Aunque el intervalo de longitudes de onda
disponible es limitado es particularmente rico en bandas de absorcin (que provienen
de modos de tensin interactivos). Por ello, esta fuente resulta til para la
determinacin de algunas especies de gran inters como el amonaco, butadieno,
benceno, etanol, dixido de nitrgeno y tricloroetileno.
Detectores. Podemos clasificar de forma general a los detectores de infrarrojo en tres tipos:
Detectores trmicos, piroelectricos y detectores fotoconductores.
Por lo general, los detectores trmicos no se adaptan fcilmente a los instrumentos de
transformada de Fourier debido a su lenta velocidad de respuesta. Los detectores
piroelctricos de sulfato de triglicina se utilizan ampliamente para la regin del infrarrojo
medio. Los detectores fotoconductores enfriados de telururo de cadmio y mercurio o de
antimoniuro de indio, se emplean cuando se necesita mejorar la sensibilidad o disminuir los
tiempos de respuesta.
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(H2O) solutions. Biopolymers 1990;30(13-14):1243-57
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Talanta. 1996, 43, 199-219.
199

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Estructura de Macromolculas

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

II.3. Espectroscopia biolgica de absorcin.

El intervalo que abarca la espectroscopia infrarroja puede dividirse en tres regiones:

Al Infrarrojo cercano (NIR) corresponden los espectros de vibracin de alta energa.

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

II.3.1.2. Fundamentos de la espectroscopia infrarroja.

Aleteo fuera del plano

Torsin fuera del plano

Figura II.3.1. Tipos de vibraciones moleculares. Los signos + y corresponden a

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Figura II.3.2 Modos normales de vibracin del CO2.

Figura II.3.3. Espectro de absorcin infrarrojo de una delgada pelcula de poliestireno

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

II.3.1.2.1. Descripcin clsica de la vibracin de una molcula diatmica.

II.3.4. Analoga de una molcula diatmica que se comportara como un

La solucin a la ecuacin diferencial II.3.1-1 es: x = A sen 2 0t , donde A es la

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Una expresin ms til para la energa potencial se obtiene cambiando x en la

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

La ecuacin aplicada al oscilador armnico unidimensional es:

En esta expresin 0 coincide con la frecuencia vibracional del modelo

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

II.3.1.2.3. Anarmonicidad de las vibraciones moleculares.

donde De representa el valor mnimo de la energa potencial, y tanto R como Re tienen el

Donde Xe y Ye son la primera y segunda constante de anarmonicidad, respectivamente.

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

II.3.1.2.4. Diferencias fundamentales entre la descripcin mecanoclsica y la mecanocuntica.

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Figura II.3.8. Esquema de un interfermetro de Michelson y la seal o interferograma

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Para una fuente monocromtica, el movimiento en cualquier direccin del espejo

Teniendo en cuenta que = C la relacin entre la frecuencia ptica de la radiacin y la

Obsrvese que cuando el retardo es un mltiplo de la longitud de onda, = n , no habr

interferencia destructiva y I ( ) = I ( ) . Cuando = n + se cumplir que I ( ) = 0 y

habr interferencia destructiva total.

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Y es precisamente la parte peridica la que nos interesa y en lo sucesivo llamaremos

En la prctica hay varios factores que afectan a la magnitud de I ( ) , a saber:

Figura II.3.9. Interferograma que se obtiene con una fuente

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Cuando la fuente de IR emite una radiacin policromtica el interferograma

donde la sumatoria se extiende a las n frecuencias diferentes. (Ver el caso de dos).

Como I ( ) es una funcin par podemos escribir:

Lo relevante de estas ecuaciones es que podemos obtener el espectro a partir del

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

INTERFEROGRAMA EN FUNCIN DEL RETARDO

En el apndice A.2. encontramos una descripcin de un espectrmetro de infrarrojo de

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Figura II.3.11. Interferograma tpico de un FTIR. Se caracteriza por una

FONDO (Haz simple)

MUESTRA (Haz simple)

Figura II.3.12. Generacin de un espectro en un espectrmetro FTIR. a)

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Se obtiene un interferograma de la fuente de IR tal como se registra en el detector en

II.3.1.3..3 Ventajas de los espectrmetros infrarrojos de tranformada de Fourier sobre los

II.3.1.4. Aplicaciones de la espectroscopia FTIR a protenas.

El grupo peptdico produce hasta 9

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Figura II.3.14 Espectro de Absorbancia vs nmero de onda mostrando las bandas

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Figura II.3.15 Espectro de Absorbancia de H2O y D2O y representacin de las

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Tabla II.3.2. Vibraciones de las cadenas laterales de aminocidos.