Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
LONDRINA
2008
Londrina
2008
Dissertao de mestrado
COMISSO EXAMINADORA
___________________________________________________
Prof Dr. Ral Jorge Hernan Castro-Gmez (Orientador)
____________________________________________________
(Membro)
_____________________________________________________
(Membro)
Londrina,
de Fevereiro de 2009
Dedicatria
AGRADECIMENTOS
ANGELO, Elisangela Andrade. Otimizao de meio de cultivo para a produo de toxinas por
Bacillus thuringiensis subsp. israelensis empregando resduos agroindustriais. Dissertao de
Mestrado (Mestrado em Cincia de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina. 2009.
RESUMO
O controle de insetos realizado, em sua maioria, por produtos qumicos, os quais ocasionam
grandes prejuzos ambientais e sade humana, destacando-se ainda a rpida seleo de
insetos resistentes. O controle biolgico por entomopatgenos uma alternativa eficiente,
principalmente devido a sua alta especificidade, menor freqncia de resistncia nos insetos
alvos e baixo efeito residual no ambiente. Bacillus thuringiensis uma bactria Gram-positiva
esporulante, produtora de cristais proticos com atividade inseticida. Apesar do amplo uso B.
thuringiensis no controle biolgico, h poucos trabalhos publicados quanto a sua produo,
visto que muitas informaes so segredos industriais. Portando, o presente trabalho teve por
objetivo otimizar um meio de cultura, empregando resduos agroindstrias, para produo de
toxinas por B. thuringiensis israelensis, utilizando a metodologia de superfcie de resposta.
Foi estudada tambm a cintica de crescimento e produo de toxina pela bactria, bem como
a toxicidade da cultura ps-fermentao, por um perodo de 28 dias. Como fontes de
nitrognio orgnico foram estudadas: farinha de soja, farinha de crislida, peptona
bacteriolgica e uria agroindustrial. Como fontes de carbono foram utilizadas sacarose,
glicose e fcula de mandioca. Como fonte de nitrognio inorgnico foi estudada sulfato de
amnia. O parmetro analisado para a otimizao foi toxicidade, por meio de bioensaio contra
Aedes aegypti. Foram estudadas tambm o percentual de esporulao e o crescimento (por
meio da contagem de Unidades Formadoras de Colnia). A farinha de crislida e a glicose
foram as fontes mais adequada de nitrognio orgnico e carbono, respectivamente, para a
produo de toxinas. A superfcie de resposta mostrou-se um mtodo eficaz para a otimizao,
resultando em um meio com as seguintes faixas de concentraes das fontes de carbono e
nitrognio: glicose 0,3 a 0,55g/L; farinha de crislida 55 a 58g/L e sulfato de amnia 0,6 a
1,1g/L. O meio otimizado resultou em uma toxicidade de 0,703 ppm (v/v), a qual superior a
de meios comumente utilizados para B. thuringiensis israelensis. A toxicidade da cultura
aumentou com o tempo de cultivo, sendo mxima com 96 horas. A cultura manteve-se txica
durante os 28 dias de anlise, sendo que o armazenamento sem refrigerao mostrou-se mais
eficaz (?)(Notexto no fica claro isto)). Esses resultados contribuem para o desenvolvimento
de uma tecnologia local e para o aproveitamento de resduos agroindustriais.
NDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Cultura lisada de B. thuringiensis subsp. israelensis, evidenciando os esporos
elipsides e os cristais proticos arredondados.......................................................................15
Figura 1.2. Modos de ao das toxinas Cry.............................................................................18
Figura 1.3. Estrutura tridimensional das protenas Cry, produzidas por B. thuringiensis......20
Figura 5.1. Cultura de B. thuringiensis israelensis em diferentes momentos de cultivo..........64
NDICE DE TABELAS
Tabela 1.1 Principais ingredientes utilizados em meios de cultivo de bactrias
entomopatognicas e suas concentraes................................................................................26
Tabela 4.1 Nveis das fontes de nutrientes estudadas na etapa de seleo das fontes.............36
Tabela 4.2 Planejamento experimental utilizado na etapa de seleo das fontes de nutrientes
...................................................................................................................................................36
Tabela 4.3 Planejamento fatorial fracionado 23-1.....................................................................37
Tabela 4.4 Nveis das variveis no primeiro planejamento fatorial incompleto da etapa de
otimizao das fontes de nutrientes..........................................................................................38
Tabela 4.5 Nveis das variveis no segundo planejamento fatorial incompleto da etapa de
otimizao das fontes de nutrientes..........................................................................................38
Tabela 4.6 Nveis das variveis no planejamento fatorial completo (23) com repetio no
ponto central e pontos estrelas.................................................................................................39
Tabela 4.7 Planejamento fatorial completo 23 com repetio no ponto central e pontos
estrelas 39
Tabela 5.1 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (etapa de seleo das fontes)...........45
Tabela 5.2 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (primeiro planejamento fatorial
incompleto otimizao das fontes).........................................................................................47
Tabela 5.3 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (segundo planejamento fatorial
incompleto otimizao das fontes).........................................................................................51
Tabela 5.4 Ensaios para confirmao do ponto central (g/L): 0,5 de glicose, 1,0 de sulfato de
amnia e 50 de farinha de crislida. Valor das variveis e bioensaio.....................................53
Tabela 5.5 Respostas do Delineamento Composto Central Rotacional (planejamento fatorial
completo, com repetio no ponto central e pontos estrelas)...................................................55
Tabela 5.6 Anlise de varincia (p<0,05) para a resposta bioensaio do delineamento
composto central rotacional.....................................................................................................55
Tabela 5.7 Efeito das fontes de nutrientes sobre o bioensaio (delineamento composto central
rotacional).................................................................................................................................58
Tabela 5.8 Valores previstos para o bionsaio em diferentes concentraes das fontes de
nutrientes...................................................................................................................................59
Tabela 5.9 Custos dos meios de cultivo: Arcas adaptado e Farinha de crislida otimizado.. .61
10
NDICE DE GRFICOS
Grfico 5.1 Superfcie de resposta para variveis glicose e farinha de crislida, tendo como
resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto)..........................................48
Grfico 5.2 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e farinha de crislida,
tendo como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto)......................48
Grfico 5.3 Superfcie de resposta (3 dimenses) para variveis sulfato de amnia e glicose,
tendo como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto)......................49
Grfico 5.4 Superfcie de resposta (plana) para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo
como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto)................................50
Grfico 5.5 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto)..........................................52
Grfico 5.6 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e farinha de crislida,
tendo como resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto)......................52
Grfico 5.7 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto)..........................................53
Grfico 5.8 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional)..........................................56
Grfico 5.9 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional)..........................................57
Grfico 5.10 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e sulfato de amnia,
tendo como resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional).......................57
Grfico 5.11 Valores observados e previstos para o bioensaio (% de morte)..........................59
Grfico 5.12 Correlao entre a biomassa (mg/mL) mensuradas pelas metodologias de
gravimetria e turbidimetria.......................................................................................................62
Grfico 5.13 Crescimento microbiano (biomassa) e toxicidade (bioensaio) ao longo do
cultivo (96 horas)......................................................................................................................63
Grfico 5.14 Potencial hidrogeninico (pH) ao longo do (96 horas)......................................65
Grfico 5.15 Toxicidade da cultura durante o armazenamento...............................................67
11
SUMRIO
1. INTRODUO....................................................................................................................12
2. REVISO BIBLIOGRFICA.............................................................................................14
2.1 Caractersticas gerais de Bacillus thuringiensis..............................................................14
2.2 Bacillus thuringiensis subsp. israelensis.........................................................................16
2.3 Protenas Cry...................................................................................................................17
2.4 Outras toxinas produzidas por B. thuringiensis..............................................................21
2.5 Produo de B. thuringiensis..........................................................................................22
2.6 Meios de cultura..............................................................................................................24
2.7 Bioensaio.........................................................................................................................28
2.8 Planejamento de experimentos e uso do mtodo de superfcie de resposta....................29
3. OBJETIVOS.........................................................................................................................32
3.1 Objetivo Geral.................................................................................................................32
3.2 Objetivos Especficos......................................................................................................32
4. MATERIAIS E MTODOS.................................................................................................33
4.1 Microrganismo................................................................................................................33
4.2 Recuperao e manuteno da cultura............................................................................33
4.3 Preparo do pr-inculo....................................................................................................33
4.4 Condies de cultivo.......................................................................................................34
4.5 Seleo das fontes de nutrientes.....................................................................................34
4.6 Otimizao das concentraes das fontes de nutrientes selecionadas............................37
4.7 Estudo da cintica de crescimento e produo de toxinas..............................................40
4.8 Toxicidade da cultura de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis duratne
armazenamento.....................................................................................................................40
4.9 Mtodos analticos..........................................................................................................41
4.9.1 Bioensaio..................................................................................................................41
4.9.2 Unidades formadoras de colnia (UFC)..................................................................41
4.9.3 Quantificao de esporos.........................................................................................42
4.9.4 Biomassa seca (gravimetria)....................................................................................43
4.9.5 Turbidimetria............................................................................................................43
4.9.6 Lminas para anlise microscpica.........................................................................44
4.10 Anlise estatstica..........................................................................................................44
5. RESULTADOS E DISCUSSO...........................................................................................45
5.1 Seleo das fontes de nutrientes.....................................................................................45
5.1 Otimizao das concentraes das fontes de nutrientes selecionadas............................47
5.1.1 Planejamentos fatoriais incompletos........................................................................47
5.1.2 Planejamento fatorial completo...............................................................................54
5.3 Cintica de crescimento e produo de toxinas..............................................................62
5.4 Toxicidade da cultura de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis durante
armazenamento.....................................................................................................................67
6. CONSIDERAES FINAIS................................................................................................69
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................................70
12
13
1. INTRODUO
Estima-se que existam cerca de 2,5 milhes de espcies de insetos, das quais 10% so
consideradas pragas, isto , causam danos ao ser humano ou perdas econmicas na pecuria
ou na agricultura. Muitas doenas de interesse da sade pblica, como malria, dengue, febre
amarela, filariose e doena de chagas so transmitidas por insetos vetores. Em geral, os pases
mais atingidos por estas doenas so os tropicais e subtropicais, devido principalmente s suas
caractersticas climticas favorveis proliferao de insetos. O crescente aquecimento global
demanda preocupao especial, estendendo as reas propcias a esta proliferao tambm a
regies atualmente com clima temperado.
O controle atual da populao de insetos realizado, principalmente, por inseticidas
qumicos, cujo uso indiscriminado e massivo causa danos ambientais e sade humana.
Produtos qumicos com alta toxicidade, porm com baixa especificidade e alto efeito residual,
prejudicam o meio ambiente, alm de contriburem para a existncia de considervel nmero
de espcies de insetos com populaes resistentes, inviabilizando a aplicao de tais produtos.
Uma alternativa aos inseticidas qumicos o controle biolgico, o qual pode ser feito
com o uso racional de entomopatgenos, que constituem os componentes ativos dos
bioinseticidas ou inseticidas biolgico.
Entre as vantagens dos bioinseticidas destacam-se: alta especificidade, menor risco
ambiental e sade humana, menor freqncia de resistncia nos insetos alvo e a
possibilidade do entomopatgeno se multiplicar no ambiente e, com isso aumentar sua
permanncia.
Como desvantagens dos bioinseticidas, destacam-se espectro de ao restrito e maior
suscetibilidade s condies ambientais. Estas desvantagens podem ser atenuadas com o uso
de boas formulaes e estudos para aplicao do produto, a fim de torn-lo mais resistentes s
condies ambientais e com maior tempo de prateleira.
A comercializao de bioinseticidas corresponde a cerca de 5% do mercado de
pesticidas. Porm, o uso destes produtos vem crescendo dez vezes mais do que o uso de
inseticidas qumicos. As bactrias destacam-se como promissoras no controle biolgico. Entre
estes microrganismos, Bacillus thuringiensis (Bt) o mais utilizado como bioinseticida.
Estima-se que os produtos a base dessa bactria correspondam a cerca de 97% do mercado
mundial de bioinseticidas.
14
Entre as razes para o sucesso dos produtos base de B. thuringiensis esto sua alta
toxicidade aos insetos alvos, capacidade de esporulao e o carter monognico de sua
principal toxina, o que facilita a manipulao gentica da mesma.
A subespcie israelensis de B. thuringiensis mostrou-se eficaz no combate a dpteros,
ordem onde se encontram muitos gneros com espcies vetores de doenas, como Aedes,
Culex e Anoplheles. Muitos produtos feitos a partir dessa subespcie vm sendo utilizados h
mais de trinta anos em pases africanos sob a recomendao da Organizao Mundial da
Sade (OMS).
Os maiores produtores de inseticidas a base de B. thuringiensis so Estados Unidos e
Canad. O desenvolvimento de produo local, com linhagens mais adaptadas s condies
brasileiras e com meios de cultivo alternativos, poderia tornar o produto base de B.
thuringiensis mais competitivo no Brasil.
Embora a produo de B. thuringiensis seja bem estudada, muitas informaes
necessrias ao desenvolvimento de uma produo local no esto disponveis na literatura.
Isto ocorre porque muitas informaes so propriedades de indstrias que comercializam
produtos a base de B. thuringiensis.
Considerando a necessidade do Brasil em controlar os insetos vetores de doenas ou
pragas agrcolas, tendo em vista as vantagens do controle biolgico e a dificuldade em se
obter informaes sobre a produo de B. thuringiensis torna-se necessrio o estudo e
desenvolvimento de tecnologia local para produo de bioinseticidas.
15
2. REVISO BIBLIOGRFICA
16
9 m
Figura 1.1 Cultura lisada de B. thuringiensis subsp. israelensis, evidenciando os esporos
elipsides (seta vermelha) e os cristais proticos arredondados (seta azul). Aumento de 1000
vezes. Colorao: Amido-Black e Fucsina.
Fonte: Cedido por Dr. Gislayne Fernandes Lemes Trindade Vilas-Bas; Laboratrio de
Bioinseticida / Departamento de Biologia Geral/ Universidade Estadual de Londrina.
Bacillus thuringiensis j foi isolado de diversos ambientes, destacando-se solos,
insetos vivos ou mortos, gros estocados, amostras de gua entre outros. Embora muitos
sorotipos tenham sido isolados de amostras de solo, sabe-se que o esporo pode persistir por
muito tempo neste ambiente, porm essa bactria no capaz de se multiplicar naturalmente
no solo ou na gua. Pesquisas recentes apontam o inseto como o nicho de B. thuringiensis,
pois principalmente neste ambiente que ocorre sua multiplicao e interaes genticas
(RAYMOND et al., 2008; VILAS-BAS et al., 2000).
17
18
19
Figura 1.2. Modos de ao das toxinas Cry. Os passos 1 a 3 so iguais nos dois modelos. O
modelo formao de poros est representado na poro superior pelas nmeros 4 a 6. A
etapa 4 refere-se oligomerizao das toxinas, a 5 a ligao ao segundo receptor e a etapa 6 a
insero da toxina na membrana. O modelo sinal de transduo est representado na poro
inferior pelo nmeros 4a e 5a. A etapa 4a refere-se ligao da toxina ao receptor e
estimulao da protena G, que estimularia a adenilato cilcase (etapa 5a) e aps uma srie de
reaes em cascata, comprometeriam o equilbrio interno celular.
Fonte: BRAVO & SOBERN, 2008.
20
A ao das toxinas, seja por qualquer um dos modelos, resulta na paralisia do aparelho
digestrio, ocasionando morte por inanio. Em muitos insetos a causa da morte septicemia
e paralisia geral dos movimentos, nesses casos a causa principal a germinao de esporos
presentes no produto e no, necessariamente, devido ao da toxina (BRAVO et al., 2007;
BRAVO & SOBERN, 2008; HABIB & ANDRADE, 1986; VALLETE-GELY et al, 2008).
Como grande parte dos genes cry localiza-se em plasmdeos conjugativos, os sorotipos
podem apresentar uma grande combinao de genes, o que resulta na ampla variedade de
perfis de toxicidade (CAPALBO et al., 2004; LERECLUS et al., 1993).
A transcrio da maioria dos genes cry dependente do fator sigma, produzido durante
o processo de esporulao, por isso a maior parte das protenas que compem o cristal
produzida durante essa etapa. Apenas, uma pequena parcela dos genes cry regulada
independentemente da esporulao, sendo, portanto, expressos tambm durante o crescimento
vegetativo. Em ambos os casos, a protena Cry fruto do metabolismo secundrio
(ARANTES et al., 2002; LERECLUS et al., 1993).
A massa molecular das protenas Cry varia entre 40 e 140 KDa. A molcula destas
protenas globular, formada por trs domnios estruturais ligados entre si por pequenas
pontes. At o momento, seis protenas Cry tiveram suas estruturas bem determinadas por
cristalografia por raios-X (figura1.3). Estas protenas apresentaram um alto grau de
similaridade entre seus domnios, o que indica que apresentam um modo de ao semelhante.
O domnio 1 (N-terminal) formado por cadeias polipeptdicas com formato de -hlices,
sendo uma central (hidrofbica), cercada por 6 cadeias marginais. O domnio 2 composto
por trs cadeias polipeptdicas antiparalelas com formato de -folha pregueada. J o domnio
3 apresenta o formato de -sandwich (BRAVO et al., 2007).
Embora estudos atuais indiquem que vrias pores dos diferentes domnios da
protena se insiram na membrana no momento de formao dos poros, acredita-se que o
domnio 1 seja o principal responsvel pela insero (NAIR & DEAN, 2008). Os domnios 2
e 3 apresentam similaridades estruturais com cadeias polipeptdica que se ligam a
carboidratos e estariam envolvidos principalmente no reconhecimento de receptores presentes
na membrana das clulas dos insetos-alvo (BRAVO et al., 2007).
Durante muito tempo, a nomenclatura das protenas Cry foi feita de acordo com o
inseto-alvo, desta forma, eram classificadas como Cry I as protenas txicas a lepidpteras,
Cry II txicas a lepidpteras e dpteras, Cry III contra colepteras, Cry IV contra dpteras.
Devido s constantes descobertas de novas protenas Cry, tal sistema mostrou-se inconsistente
e, atualmente a classificao feita baseando-se na seqncia de aminocidos das protenas.
21
Figura 1.3. Estrutura tridimensional das protenas Cry, produzidas por B. thuringiensis. Notase que a estrutura geral das protenas Cry conservada.
Fonte: BRAVO et al., 2007.
22
Alm das protenas Cry e Cyt, B. thuringiensis sintetiza outras toxinas que podem ou
no participar da ao entomopatognica.
Em 1967 Heimpel sugeriu o nome de -exotoxina para uma substncia termoestvel e
txica para alguns insetos. Devido a sua estrutura qumica o nome -exotoxina vem sendo
substitudo por thuringiensina. Estas protenas possuem baixo peso molecular, a sua
toxicidade relaciona-se a inibio da RNA polimerase, pois anloga a nucleotdeos. Embora
no possua especificidade, a ao de thuringiensina contribui para a toxidade global das
linhagens que a expressam (GLARE & OCALLAGHAN, 2000; HABIB & ANDRADE,
1998; LERECLUS et al., 1993). Alguns trabalhos citam a importncia dessa toxina no
controle de besouros e algumas espcies de caros (WU et al., 2002).
Muitos sorotipos de B. thuringiensis produzem protenas denominadas Vip (vegetative
insecticidal proteins), as quais so sintetizadas na etapa vegetativa do crescimento. Apesar de
no integrarem o cristal protico, estas protenas contribuem para a toxicidade global das
linhagens e possuem forma de intoxicao similar s das protenas Cry (CRICKMORE et al.,
2008; GLARE & OCALLAGHAN, 2000).
Em 2000, Mizuki et al. descreveram uma nova toxina de B. thuringiensis a qual
passou a ser denominada Parasporina. Estas toxinas so definidas como protenas paraesporal
de B. thuringiensis sem atividade hemoltica e que apresentam a capacidade de atacar clulas
cancergenas (OHBA et al., 2008).
Bacillus thuringiensis sintetiza fosfolipases C, estas so produzidas ao final da fase
exponencial de crescimento e so excretadas para o meio de cultura (AGAISSE et al., 1995).
Essa bactria sintetiza tambm quitinases e proteases que contribuem para romper a
membrana peritrquia presente no intestino dos insetos, contribuindo, dessa maneira, para a
toxicidade global das linhagens (GLARE & OCALLAGHAN, 2000).
Alm das toxinas, o esporo de B. thuringiensis tambm contribui parar sua toxicidade,
pois estes podem germinar no interior do inseto-alvo, ocasionando septicemia; ou
potencializarem o efeito da toxina em uma ao sinergstica (GLARE & OCALLAGHAN,
2000; RAYMOND et al., 2008).
23
24
plasmdeos ocorrem com certa freqncia e h relatos de perca de toxicidade aps sucessivas
fermentaes, sendo essencial a constante busca por novas linhagens e o monitoramento
durante o processo de fermentao (COUCH, 2000; BIZARRI et al, 2008).
A forma mais comum de produo de B. thuringiensis por fermentao submersa
(lquida) descontnua, tambm conhecida como processo em batelada. Nesta fermentao um
recipiente inoculado com o microrganismo e o meio de cultura lquido, no havendo
acrscimo ou retirada significativa do meio fermentado. Portanto, ocorre todo o
desenvolvimento da cultura, sendo retirado o produto apenas no final do processo. Em geral,
as protenas Cry de B. thuringiensis so formadas no fim da fermentao, quando as
condies do meio se tornam desfavorveis, sendo o processo em batelada satisfatrio para tal
produo (MORAES et al., 2001).
Alguns pesquisadores tm estudando as fermentaes slida, contnua e em batelada
alimentada, porm at o momento, o mais vivel para produo de protenas Cry, ainda o
processo em batelada (ADAMS et al., 2002; CHEN et al., 2003, MORAES et al., 2001,
VALLEJO et al., 1999).
Na fermentao industrial os passos a serem seguidos so: pr inculo, geralmente
feito em frascos pequenos, pr fermentador, ?comumente com 1/5 do volume da fermentao
e o fermentador final. Durante todas as etapas deve-se analisar a cultura quanto
contaminao, caractersticas morfolgicas e potencial entomopatognico. Em geral, os
reatores utilizados permitem o controle das principais condies de cultivo, as quais so:
temperatura, pH, aerao e agitao. O pr-inoculo, pr-fermentador e o fermentador em
volumes crescentes so feitos a fim de diminuir o tempo da fase lag, ou seja, o perodo de
adaptao do microrganismo s condies de cultivo. Em geral, pr fermentadores e
fermentador possuem os mesmos ingredientes no meio de cultivo. importante limitar o
nmero de passos no processo de produo a fim de evitar contaminaes e mudanas
indesejveis no comportamento da bactria (COUCH, 2000; MORAES et al., 2001).
Ao final da fermentao, a cultura de B. thuringiensis apresenta em mdia 6 a 8% de
slidos, dos quais 1 a 3% so cristais e esporos. H vrios mtodos que podem ser utilizados
para a recuperao destes cristais e esporos, sendo o mais comum a centrifugao e a microfiltrao. importante ressaltar que com tais processos, ocorre a recuperao principalmente
das protenas Cry e muitas outras toxinas que podem contribuir para a toxicidade final do
produto so perdidas. Atualmente novas tcnicas de recuperao e/ou concentrao do
produto esto sendo desenvolvidas para complementar as mais utilizadas, destacando-se: a
liofilizao e a flotao (BRAR et al., 2006; COUCH, 2000).
25
26
27
Concentrao (g/L)
20-40
14-30
15-40
15-30
10-30
2-5
20-45
1.0-18.6
2.0-10
10-15
2.0
1.0
1.0
0.02
0.0005-0.02
0.3
0.02
0.02
2
0.005
1.0-1.5
2.0-5.0
3.0
0.5-1.25
0.1
Resultados diferentes dos pesquisadores skan et al. (2003) esto presentes nos
trabalhos de Vora e Shethna (1999) e Prabagaran et al. (2004), os quais indicam o melao-decana como uma boa fonte de carbono para produo de toxina. Estes estudos comprovam que
necessrio otimizar um meio para cada sorotipo, pois os resultados do estudo com um
determinado sorotipo muitas vezes no podem ser extrapolados para outros.
As fontes de nitrognio podem ser tanto orgnicas quanto inorgnicas, sendo comum o
uso das duas fontes juntas. Os estudos de Arcas et al. (1984), Igen et al. (2002b), skan et
al. (2003) e Zouari e Jaoua (1999) indicam que o uso de apenas nitrognio inorgnico no
aconselhvel para o cultivo de B. thuringiensis, pois h diminuio de crescimento,
esporulao e biossntese. Dentre as mais promissoras fontes de nitrognio inorgnico
28
apontadas por estes autores, destacam-se os fosfatos [NH 4H2PO4 e (NH4)2HPO4] e sulfatos por
otimizarem esporulao e muitas vezes a produo de toxinas. Entre as fontes orgnicas, o
extrato de levedura bastante usado no cultivo de B. thuringiensis, porm peptona e soja
apresentam resultados promissores.
Como fontes alternativas de nitrognio orgnico vm se destacando: farinhas
derivadas de protena animal (farinha de peixe e de crislida), soja e alguns cereais (cevada e
trigo) (ALVES et al., 1997; DEVI, 2005; GHRIBI et al., 2005; MORRIS et al., 1997,
PRABAKARAN & BALAMARAN, 2006; ZOUARI & JAOUA, 1999).
A concentrao de sais no meio de cultivo influencia diretamente a osmolaridade do
mesmo. No h consenso sob qual porcentagem de sais melhor, bem como quais os sais que
devem ser adicionados. Referencia!
Arcas et al. (1987) obtiveram uma boa produo de toxina com um meio contendo
osmolaridade de 808 miliosmol, sendo este um experimento clssico que resultou em um
meio bastante adotado para crescimento e produo de B. thuringiensis. importante ressaltar
que embora os sais ajam como um todo na osmolaridade, cada on fornecido pelos sais pode
ter um efeito diferente. Muitas vezes, produo e crescimento no se relacionam, sendo que
alguns ons melhoram um parmetro e prejudicam ou so neutros para outro. Os principais
ons fornecidos pelos sais so: magnsio, clcio, mangans, cobre e zinco.
Os estudos de skan et al. (2003) e Igen et al. (2002a) revelaram que o mangans
crtico para a diferenciao celular, sendo requerido para esporulao e formao do cristal de
toxina. Provavelmente este on atue em processos de co-regulao da sntese da toxina. Os
melhores resultados aparecem quando a concentrao de mangans varia entre 10-6 e 10-4M,
valores maiores que estes se tornam txicos para todos os processos celulares.
Assim como mangans, o magnsio influencia o metabolismo secundrio, portanto,
com efeito na produo das protenas Cry. Sua concentrao ideal em torno de 10-3 M. O
clcio bastante importante no processo de esporulao, promovendo a estabilidade do cristal
protico. A concentrao de 10-3 M de clcio estimula a esporulao, porm inibidora para o
crescimento vegetativo e sntese protica. Ao que parece, o clcio no essencial para a
sntese de toxina. Recomenda-se o uso de concentraes menores que 10 -3 M de clcio, a fim
de no prejudicar a formao das protenas Cry (IGEN et al., 2002a; SKAN et al., 2003).
Metais como zinco, cobre e ferro apresentam resultados negativos para o crescimento,
esporulao e produo de toxina mesmo em concentraes pequenas como 10 -7 M (IGEN
et al., 2002a; SKAN et al., 2003).
29
2.7 Bioensaio
30
31
variveis. Esses valores so definidos a priori segundo os interesses do pesquisador, com base
em dados da literatura ou anlises empricas.
O planejamento fatorial pode ser completo ou incompleto, ele dito completo quando
todas as combinaes entre as variveis nos seus diferentes valores so executadas em
ensaios. J no planejamento fatorial incompleto, tambm chamado de fracionado, apenas um
nmero limitado das possveis combinaes das variveis realizado em ensaios (KENNEDY
& KROUSE, 1999; RODRIGUES & IEMMA, 2005).
Geralmente, o planejamento fracionado utilizado quando a quantidade de variveis e
valores muito grande e a execuo de todas as combinaes se torna invivel, neste caso o
planejamento fracionado serve para fazer uma triagem de quais variveis so importantes para
o processo e devem continuar no estudo. O planejamento fatorial completo geralmente feito
em uma segunda etapa, quando as variveis importantes j foram selecionadas e,
posteriormente se deseja estudar seus valores e interaes com mais detalhes (KENNEDY &
KROUSE, 1999).
Denomina-se nvel os valores que cada varivel ser estudada, no caso de se estudar 5
variveis em 2 nveis cada, resultaro em 32 ensaios em um planejamento experimental
completo. Neste exemplo, o planejamento dito 25, sendo o expoente a quantidade de
variveis e o nmero elevado quantidade de nveis de cada varivel. Caso em uma etapa do
experimento realize-se apenas 16 ensaios dos 32 possveis, o desenho passa a ser um fatorial
incompleto 25-1.
Tendo-se feito um planejamento experimental adequado, podem-se aplicar tcnicas
que permitam o estudo da otimizao do processo. Entre as tcnicas estatsticas de otimizao
mais utilizadas destaca-se a superfcie de resposta. A metodologia do planejamento fatorial,
associada anlise de superfcie de respostas, uma ferramenta fundamental na teoria
estatstica, que fornece informaes seguras sobre o processo, minimizando o empirismo que
envolve tcnicas de tentativa e erro (BOX et al, 1978 apud RODRIGUES & IEMMA, 2005).
Esta tcnica foi desenvolvida por Box e Wilson no incio da dcada de 1950 e consiste em
duas etapas principais que devem ser repetidas quantas vezes forem necessrias a fim de se
alcanar um timo. A primeira etapa a de modelagem e geralmente feita ajustando-se os
modelos matemticos aos dados experimentais obtidos por meio de um planejamento fatorial
adequado. A segunda etapa consiste em um deslocamento geralmente no sentido de mxima
inclinao do modelo matemtico (BARROS NETO et al., 1995). Em geral, nesta tcnica a
resposta representada em grficos de superfcies que permitem visualizar melhor os
resultados contribuindo para sua interpretao (KENNEDY & KROUSE, 1999).
32
33
3. OBJETIVOS
34
4. MATERIAIS E MTODOS
4.1 Microrganismo.
35
meio, o qual continha (g/L): MgSO4 (1,0); KH2PO4, (1,0); K2HPO4 (1,0); MnSO4.H2O (0,3);
CaCl2 (0,4); (NH4)2SO4 (1,0), extrato de levedura (8,0) e glicose (4,5).
Aps esse cultivo, o pr-inculo foi feito transferindo-se 1,25 mL da cultura em meio
Arcas adaptado para um Erlenmeyer de 500 mL de capacidade, contendo 50 mL do meio a ser
testado. O pr-inculo foi mantido a 30C, 120 rpm (agitador rotativo) por um perodo de 16
horas.
As fontes de nutriente estudadas bem como seus nveis iniciais foram escolhidos de
acordo com testes preliminares e dados da literatura. Como fontes de nitrognio orgnico
foram estudadas:
36
Como fonte de nitrognio inorgnico foi utilizado o sulfato de amnia ((NH 4)2SO4), o
qual compe o meio Arcas, comumente utilizado na fermentao de B. thuringiensis
(ARCAS, 1987).
As fontes de carbono estudadas foram:
Sacarose: escolhida com base em estudos de Igen et al. (2002b) e skan et al.
(2003).
A seleo das fontes foi feita por meio de um planejamento fatorial fracionado 2 8-4, no
qual cada varivel foi estudada em dois nveis (-1 e +1) com variaes extremas. Esses
experimentos foram feitos em dois blocos aleatrios O objetivo desta etapa foi criar um
contraste entre os nveis e, com isto realizar uma seleo qualitativa. Os nveis das diferentes
fontes de nutrientes bem como o planejamento fatorial encontra-se na tabela 4.1 e 4.2
respectivamente.
Alm das fontes de nutrientes em estudo, o meio de cultivo continha uma mistura de
sais baseada no meio Arcas adaptado (ANDRADE, 2005), a qual no sofreu alterao e no
foi foco de estudo durante a pesquisa. Os sais presentes nessa mistura foram (g/L): MgSO 4
(1,0); KH2PO4, (1,0); K2HPO4 (1,0); MnSO4.H2O (0,3) e CaCl2 (0,4).
As condies dos experimentos dessa etapa foram as mesmas descritas no item 4.3 por
um perodo de 72 horas.
A resposta analisada para a seleo das fontes foi bioensaio, conforme descrito no item
4.9.1. Alm dessa resposta, foi analisado o efeito das fontes de nutrientes em estudo sobre o
crescimento e esporulao; para isso, foram feitas contagem de Unidades Formadoras de
Colnia e Contagem de esporos, como descritos no itens 4.9.2 e 4.9.3 respectivamente.
37
Tabela 4.1 Nveis das fontes de nutrientes estudadas na etapa de seleo das fontes
Nvel -1
5,0
Nvel +1
50
2,0
0,5
0,2
0,2
1,0
1,0
1,5
20
5
2,0
2,0
10
10
15
Tabela 4.2 Planejamento experimental utilizado na etapa de seleo das fontes de nutrientes
Farinha Pepton
Sulfato
Fcula de Farinha
de
a de
de
Experimento Sacarose Glicose mandioca de soja crislida carne Uria amnia
1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
2
1
-1
-1
-1
-1
1
1
1
3
-1
1
-1
-1
1
-1
1
1
4
1
1
-1
-1
1
1
-1
-1
5
-1
-1
1
-1
1
1
1
-1
6
1
-1
1
-1
1
-1
-1
1
7
-1
1
1
-1
-1
1
-1
1
8
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
9
-1
-1
-1
1
1
1
-1
1
10
1
-1
-1
1
1
-1
1
-1
11
-1
1
-1
1
-1
1
1
-1
12
1
1
-1
1
-1
-1
-1
1
13
-1
-1
1
1
-1
-1
1
1
14
1
-1
1
1
-1
1
-1
-1
15
-1
1
1
1
1
-1
-1
-1
16
1
1
1
1
1
1
1
1
4.6 Otimizao das concentraes das fontes de nutrientes selecionadas
Essa etapa teve por objetivo otimizar a concentrao das fontes de nutrientes
selecionadas como descrito no item 4.5. Inicialmente foram feitos dois planejamentos fatoriais
38
incompletos 23-1, onde os nveis das variveis foram selecionados segundo dados da literatura.
Esses planejamentos fatoriais foram feitos em apenas um bloco com 9 experimentos, como
descrito na tabela 4.3..
Sulfato Farinha
de
de
Experimentos Glicose amnia crislida
1
-1
-1
-1
2
-1
0
1
3
-1
1
0
4
0
-1
1
5
0
0
0
6
0
1
-1
7
1
-1
0
8
1
0
-1
9
1
1
1
Os nveis das variveis no primeiro e no segundo planejamento fatorial incompleto
encontram-se descritos nas tabelas 4.4 e 4.5, respectivamente. Esses nveis foram codificados
de acordo com a equao abaixo:
X codificado = Xi X0
X / 2
Onde:
X codificado: nvel codificado da varivel
Xi = valor real
X0 = valor no ponto central
X = valor real mximo valor real mnimo
39
Tabela 4.4 Nveis das variveis no primeiro planejamento fatorial incompleto da etapa de
otimizao das fontes de nutrientes
Variveis
Glicose (g/L)
Sulfato de
amnia (g/L)
Farinha de
Crislida (g/L)
Nvel (-1)
2,00
Nvel (0)
6
Nvel (+1)
10,00
2,00
6,00
10,00
30
50,00
Tabela 4.5 Nveis das variveis no segundo planejamento fatorial incompleto da etapa de
otimizao das fontes de nutrientes
Variveis
Glicose (g/L)
Sulfato de
amnia (g/L)
Farinha de
Crislida (g/L)
Nvel (-1)
0,5
Nvel (0)
1,25
Nvel (+1)
2,0
1,0
3,0
5,0
50,0
90,0
130,0
40
resposta, estudou-se tambm o crescimento (UFC) e esporulao, como descrito nos itens
4.9.2 e 4.9.3 respectivamente.
Tabela 4.6 Nveis das variveis no planejamento fatorial completo (23) com repetio no
ponto central e pontos estrelas
Variveis
Glicose (g/L)
Sulfato de
amnia (g/L)
Farinha de
Crislida (g/L)
Nvel
(-1,79)
Nvel
(+1,79)
0,005
Nvel (-1)
0,25
Nvel (0)
0,5
Nvel (+1)
0,75
0,10
0,5
1,0
1,5
1,90
32,11
40
50
60
67,89
0,95
Tabela 4.7 Planejamento fatorial completo 23 com repetio no ponto central (experimentos 9
e 10) e pontos estrelas (experimentos 11 a 16)
Blocos
Experimentos
1
2
3
4
5
6
7
8
9 (C)
10 (C)
11
12
13
14
15
16
Glicose
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
-1,00000
-1,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
Sulfato de
Amnia
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
0,00000
0,00000
Farinha
de.
crislida
-1,00000
1,00000
-1,00000
1,00000
-1,00000
1,00000
-1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
41
Aps a otimizao das fontes nutrientes, foi feito um estudo a fim de se verificar a
curva de crescimento de B. thuringiensis israelensis HD537 no meio desenvolvido, bem como
em qual das etapas de crescimento ocorre a maior produo de toxinas: Para isso, foram
inoculadas culturas com o meio de cultivo com as fontes otimizadas e mantidas como descrito
no item 4.3. Essas culturas foram mantidas por um perodo de 96 horas.
Em intervalos predeterminados, foram retiradas alquotas das culturas a fim de se
analisar seu crescimento, produo de toxinas e pH. Nessa etapa, o crescimento foi avaliado
por meio de gravimetria e turbidimetria, como descrito nos itens 4.9.4 e 4.9.5
respectivamente. A produo de toxinas foi avaliada por meio de bioensaio, como descrito no
item 4.9.1. O pH foi medido por meio de um aparelho potencimetro modelo Foram feitas
ainda, lminas para anlise microscpica, como descrito no item 4.9.6.
Esse experimento foi repetido por 3 vezes, sendo que todos os mtodos de anlise de
crescimento e medio de pH foram feitos em duplicata e o bioensaio foi feito em triplicata.
42
4.9.1 Bioensaio
Os bioensaios foram realizados no Laboratrio de Entomologia Mdica, do professor
Dr. Jos Lopes, do Centro de Cincias Biolgicas da Universidade Estadual de Londrina.
Estes testes foram feitos com base na metodologia da WHO 2005, com larvas entre terceiro e
quarto instar de A. aegypti (Linnaeus, 1762), as quais foram colocadas em recipientes
contendo 100 mL de gua destilada. Aps aplicao do produto, as larvas foram mantidas a
25C por um perodo de 24 horas, quando ento, procedeu-se a leitura do bioensaio quanto
mortalidade das mesmas. Em cada recipiente utilizado no bioensaio foram colocadas 20
larvas.
Na etapa de seleo das fontes de nutrientes, as culturas dos diferentes experimentos
foram diludas em gua destilada. Procedeu-se, ento, o bioensaio aplicando-se as culturas
diludas, de maneira que a concentrao final nos recipiente do bioensaio fosse de 10 ppm
(v/v). Essa concentrao foi escolhida, aps testes preliminares com diferentes concentraes.
Nas etapas de otimizao das fontes e estudo da cintica, o bioensaio foi feito como
descrito para a etapa de seleo de fontes, porm a concentrao final no recipiente do
bioensaio foi de 1 ppm (v/v).
Esses bioensaios foram expressos como porcentagem de morte das larvas e foram
feitos em triplicata.
Os bioensaios com o meio otimizado, bem como de pontos do estudo da cintica e da
etapa de verificao da toxicidade das culturas durante armazenamento foram expressos em
termos de CL50. Para isso, as culturas foram diludas; e 5 ou 6 concentraes diferentes foram
aplicadas em recipientes dos bioensaios. Ao final do teste, foi feita a quantificao de larvas
mortas em cada uma das concentraes. A CL 50 foi calculada por meio de anlise de regresso
linear do log-Probit, utilizando-se o programa de computador microprobit (FINNEY, 1971).
Esse bioensaio foi feito em triplicata.
43
44
Essa anlise foi feita em duplicata e expressa como miligramas de biomassa por
mililitro da cultura. A fim de no se aferir como biomassa algum componente do meio de
cultura, esse foi submetido a centrifugaes, como descrito acima, e o valor de massa seca do
meio de cultura foi descontado do valor da biomassa seca dos experimentos.
4.9.5 Turbidimetria
A fim de acompanhar a morfologia das clulas durante o estudo da cintica, bem como
para averiguar se havia contaminao nos demais experimentos, foram feitas lminas para
anlise em microscpio ptico.
Para confeco das lminas, alquotas das culturas foram retiradas com auxlio de uma
ala de platina. Aps esfregao e fixao por calor as lminas foram coradas com amido black
(por 70 segundos), lavadas e coradas com fucsina (10 segundos). Essa colorao evidncia os
esporos e cristais de B. thuringiensis.
45
46
5. RESULTADOS E DISCUSSO
Tabela 5.1 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (etapa de seleo das fontes). Em
vermelho, as variveis com efeito significativo (ANOVA, p<0,05).
Efeito
Variveis/Interaes
(1) Sacarose
(2) Glicose
(3) Fcula de mandioca
(4) Farinha de soja
(5) Farinha de crislida
(6)Peptona
bacteriolgica
(7) Uria agroindustrial
(8) Sulfato de amnia
Interao 1 e 5
Interao 1 e 8
Interao 2 e 5
Interao 2 e 8
Interao 5 e 8
Probabilidade Coeficiente.
0,517500
-0,070000
-0,035000
-0,440000
-0,535000
0,060000
0,000233
0,047421
0,157299
0,001289
0,000872
0,062957
0,517500
-0,035000
-0,017500
-0,220000
-0,267500
0,030000
0,045000
0,104467
0,022500
-0,455000
0,430000
-0,045000
0,035000
-0,010000
0,020000
-0,045000
0,001205
0,001349
0,104467
0,157299
0,591752
0,333333
0,104467
-0,227500
0,215000
-0,022500
0,017500
-0,005000
0,010000
-0,022500
47
48
Tabela 5.2 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (primeiro planejamento fatorial
incompleto otimizao das fontes). Em vermelho, as variveis com efeito significativo
(ANOVA, p<0,05). L representa o termo linear e Q o termo quadrtico.
Variveis.
Glicose (L)
Glicose (Q)
(2)Sulfato de
amnia(L)
Sulfato de
amnia(Q)
(3)Farinha de
crislida(L)
Farinha de
crislida(Q)
Efeito
Probabilidade Coeficiente.
9,55556
0,006958
9,55556
1,33333
0,566987
0,66667
-3,33333
0,188893
-1,66667
-0,66667
0,766450
-0,33333
3,66667
0,163685
1,83333
15,33333
0,015991
7,66667
-4,33333
0,125525
-2,16667
49
Grfico 5.1 Superfcie de resposta para variveis glicose e farinha de crislida, tendo como
resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto). O sulfato de amnio est
fixado no valor codificado central.
Grfico 5.2 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e farinha de crislida,
tendo como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto). A glicose est
fixado no valor codificado central.
50
Grfico 5.3 Superfcie de resposta (3 dimenses) para variveis sulfato de amnia e glicose,
tendo como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto). A farinha de
crislida est fixada no valor codificado +1.
51
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
-1,0
-1,2
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
24
22
20
18
16
14
Grfico 5.4 Superfcie de resposta (plana) para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo
como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto). A farinha de crislida
est fixada no valor codificado +1.
Portanto, para o segundo experimento os valores da concentrao da farinha de
crislida foram aumentados, j os concentraes de glicose e sulfato de amnia diminuram,
como apresentado na tabela 4.5.
Os resultados com os efeitos das variveis no segundo planejamento fatorial
incompleto encontram-se na tabela 5.3.
52
Tabela 5.3 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (segundo planejamento fatorial
incompleto otimizao das fontes). Em vermelho, as variveis com efeito
significativo (ANOVA, p<0,05). L representa o termo linear e Q o termo
quadrtico.
Variveis.
Glicose (L)
Glicose (Q)
Sulfato de amnia(L)
Sulfato de amnia(Q)
Farinha de
crislida(L)
Farinha de
crislida(Q)
Efeitos
19,7778
-19,3333
-13,6667
-14,6667
-6,6667
Probabilidade
Coeficiente.
0,000012
19,7778
0,012189
-9,6667
0,032552
-6,8333
0,044148
-7,3333
0,258147
-3,3333
-32,0000
0,000431
-16,0000
3,3333
0,563070
1,6667
53
Grfico 5.5 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto). A farinha de crislida est
fixada no valor codificado -1.
Grfico
5.6
Superfcie
de
resposta
variveis
de
para
sulfato
amnia
farinha
crislida,
e
de
tendo
como resposta o
bioensaio
(segundo
planejamento fatorial incompleto). A glicose est fixada no valor codificado -1.
54
Grfico 5.7 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto). O sulfato de amnia est
fixado no valor codificado -1.
Tendo em vista os efeitos das variveis sobre o bioensaio, a otimizao prosseguiu
mapeando a regio prxima ao ponto mnimo (-1) do segundo planejamento fatorial
incompleto. Nesse ponto, as variveis apresentavam os seguintes valores (g/L): 0,5 de glicose,
1,0 de sulfato de amnia e 50 de farinha de crislida.
Com o objetivo de verificar se o ponto mnimo (-1) do segundo experimento deveria
ser mesmo o ponto central em um planejamento fatorial completo, foram feitos trs ensaios
(A, B e C) com valores prximos a esse ponto mnimo. Os valores das variveis nesses trs
ensaios bem como o resultado do bioensaio encontram-se na tabela 5.4.
Tabela 5.4 Ensaios para confirmao do ponto central (g/L): 0,5 de glicose, 1,0 de sulfato de
amnia e 50 de farinha de crislida. Valor das variveis e bioensaio.
Ensaios
Glicose
Sulfato de
Farinha de
Bioensaio (% de
(g/L)
0,9
amnia (g/L)
1,8
crislida (g/L)
66
B
C
0,7
0,3
1,4
0,6
58
42
46
38
55
Tendo em vista que nenhum dos ensaios resultou em um bioensaio melhor do que do
ponto mnimo (-1) do segundo planejamento fatorial incompleto, esse ponto foi utilizado
como central no planejamento completo.
56
Bloco
Ensaio
1
2
3
4
5
6
7
8
9 (C)
10 (C)
11
12
13
14
15
16
Glicose
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
Sulfato de
Amnia
-1,00000
-1,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
0,00000
0,00000
Tabela 5.6 Anlise de varincia (p<0,05) para a resposta bioensaio do delineamento composto
central rotacional. Em vermelho, as variveis com efeito significativo (ANOVA,
p<0,05). L representa o termo linear e Q o termo quadrtico.
Blocos
Glicose (L)
Glicose (Q)
Sulfato de amnia(L)
Sulfato de amnia(Q)
Farinha de crislida(L)
Farinha de crislida(Q)
Interao glicose X sulfato
(L)
Interao glicose X far. De
crislida (L)
Interao sulfato X farinha
de crislida (L)
Erro puro
Total
Quadrado
mdio
699,213
68,056
1161,907
231,940
1334,659
664,118
1519,379
F
Probabilidade
calculado
4,058296
0,100067
0,395000
0,557271
6,743809
0,048432
1,346198
0,298329
7,746478
0,038753
3,854601
0,106834
8,818610
0,031171
555,444
555,444 3,223849
0,132522
88,844
88,844 0,515661
0,504843
355,644
355,644 2,064192
0,210292
861,462
7540,666
5
15
172,292
O erro puro no foi significativo, bem como a variao referente aos blocos, portanto
os fatores que mais influenciaram a resposta foram a concentrao das fontes de nutrientes.
57
Nessa etapa, todas as fontes apresentaram apenas o termo quadrtico significativo, o que
indica que as mesmas j alcanaram seu timo de concentrao para a resposta bioensaio.
Os grficos 5.8 a 5.10 representam a superfcie de resposta para o delineamento
composto central rotacional. Observa-se que a zona em vermelho escura, correspondente a
maior taxa de morte no bioensaio, encontra-se no centro do grfico, ou seja, todo o seu
entorno foi mapeado. Isso significa que para alcanar os melhores resultados de bioensaio
pode-se trabalhar em intervalos de concentrao das fontes que correspondem a tal rea e, no
necessariamente com um nico valor fixo de concentrao; o que facilita o controle da
fermentao. Para o sulfato de amnia, a faixa de variao da regio de timo est entre (g/L)
0,6 a 1,1; j para a glicose de 0,3 a 0,55g/L, enquanto que para a farinha de crislida tal
faixa encontra-se entre 55 a 58g/L.
Grfico 5.8 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional). A farinha de crislida est
fixada no valor ponto central.
58
Grfico 5.9 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional). O sulfato de amnia
encontra-se fixado no valor ponto central.
Grfico 5.10 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e sulfato de amnia,
tendo como resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional). A glicose
encontra-se fixada no valor ponto central.
59
Tabela 5.7 Efeito das fontes de nutrientes sobre o bioensaio (delineamento composto central
rotacional). Em vermelho, as variveis com efeito significativo (ANOVA,
p<0,05). L representa o termo linear e Q o termo quadrtico.
Principal/interaes
Blocos
Glicose (L)
Glicose (Q)
Sulfato de amnia(L)
Sulfato de amnia(Q)
Farinha de crislida(L)
Farinha de crislida(Q)
Interao glicose e sulf. de
amnia (L)
Interao glicose e far. de
crislida (L)L
Interao sulf. de amnia
e far. de crislida (L)
Efeito
Probabilidade Coeficiente
55,9605
0,002818
55,9605
-14,7490
0,100067
-7,3745
-4,3479
0,557271
-2,1740
-21,7725
0,048432
-10,8863
-8,0267
0,298329
-4,0133
-23,3350
0,038753
-11,6675
13,5822
0,106834
6,7911
-24,8975
0,031171
-12,4488
16,6650
0,132522
8,3325
6,6650
0,504843
3,3325
-13,3350
0,210292
-6,6675
60
080
070
060
Valores previstos
050
040
030
020
010
00
-010
-020
-10
10
20
30
40
50
60
70
80
Valores observados
Previso
Glicose
(bioensaio)
(codificado)
55,9605
0
55,08828
-0,4
50,73246
-0,8
56,2965
0
54,16821
0
56,8208
0
56,6851
0
55,55362
0
Glicose
(real)
0,5 g/L
0,4
0,3
0,5 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L
Sulfato
(codificado)
0
0
0
-0,2
-0,6
0
0
0
Sulfato
(real)
1 g/L
1 g/L
1 g/L
0,9
0,7
1 g/L
1 g/L
1 g/L
Farinha
Farinha
(codificado) (real)
0
50 g/L
0
50 g/L
0
50 g/L
0
50 g/L
0
50 g/L
0,2
52
0,4
54
0,6
56
61
62
suplementao mineral. Alves et al. (1997) estudou vrios ingredientes alternativos para o
crescimento de B. thuringiensis kurstaki, a farinha de crislida foi o mais promissor. Nesse
estudo, a concentrao utilizada foi de 10g/L dessa farinha alm de suplementao com sais e
fonte de carbono.
A CL50 mdia do meio otimizado foi de 0,703 ppm (v/v). Esse resultado foi comparado
com o bioensaio de cultura feita em meio Arcas adaptado (ANDRADE,
2005), cuja CL 50
mdia foi de 3,01 ppm (v/v). Esses valores diferiram estatisticamente, sendo que o meio
base de crislida apresenta uma toxicidade cerca de 4,3 vezes maior do que o meio Arcas
adaptado. (No entendi)
A tabela 5.9 apresenta os custos referentes matria-prima para produo de 1 L de
meio a base de farinha de crislida otimizado e do meio Arcas adaptado.
Tabela 5.9 Custos dos meios de cultivo: Arcas adaptado e Farinha de crislidas otimizado.
Custos/Meios
Meio Arcas
Meio farinha de
adaptado
crislida otimizado
Mistura de sais
Extrato de levedura
Glicose
Farinha de crislida
Sulfato de amnia
Custo total (1L)
Fonte: ??????????????? Cotao feita em ?????????????
Alm do meio otimizado apresentar um menor custo, sua toxicidade maior, o que
permite que ele seja diludo cerca de 4x mais do que o meio Arcas adaptado. Dessa maneira,
com 1L do meio crislida otimizado possvel obter 4L de meio com igual toxicidade do
meio Arcas adaptado; o que resulta em um custo real do meio otimizado cerca de ???%
menor.
63
64
65
66
clula, porm ainda era evidente uma grande quantidade de clulas em esporulao. A cultura
com 72 horas de cultivo apresentava praticamente apenas esporos e cristais fora das clulas,
com poucas clulas em final de esporulao. s 96 horas de cultivo, foi possvel observar
uma grande quantidade de cristais e esporos fora da clula, porm havia clulas vegetativas.
Provavelmente, s 96 horas de cultivo alguns esporos produzidos durante o cultivo
germinaram, resultando novamente em algumas clulas vegetativas.
Pela anlise da toxicidade observa-se que o perodo de 96 horas seria o indicado para o
cultivo, porm, analisando-se as lminas percebe-se que nesse momento alguns esporos j
estariam germinando. A maior toxicidade do perodo de 96 horas provavelmente ocorreu
porque a grande maioria das clulas da fase de crescimento j havia liberado seus cristais, ao
passo que com 72 horas algumas clulas, ainda que poucas, apresentavam-se no final de
esporulao. Uma alternativa para essa questo seria manter fermentar a cultura por 72 horas
e, posteriormente mant-la em repouso por 24 horas, para que as clulas em final de
esporulao liberem suas toxinas. Dessa maneira, o tempo de cultivo no se estenderia muito,
no resultando em custo extra para a produo. MORAES et al.(2001) relatam essa estratgia
para alguns cultivos de B. thuringiensis.
67
68
69
Glare & OCallaghan, 2000 relatam que os principais fatores que influenciam a
toxicidade de B. thuringiensis no meio ambiente so a radiao solar e temperatura. Couch
(2000) afirma que logo aps a fermentao, interessante manter a cultura a 4C por algumas
horas, para que ocorra a completa lise celular.
Nesse estudo, a melhor condio de armazenamento foi sem refrigerao.
Provavelmente, a baixa temperatura (5C +/-2) por um perodo prolongado de tempo foi
prejudicial para as toxinas, resultando em uma menor toxicidade. J temperatura ambiente,
pode ter possibilitado a lise de praticamente todas as clulas, e posterior germinao de
esporos tardios, resultando em uma melhor toxicidade. Esse resultado refora a eficcia de se
deixar a cultura em repouso aps sua fermentao, antes de formul-la (MORAES et al.,
2001).
70
71
7.REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
72
BRAVO, A. et al. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their
potential for insect control. Toxicon, v.49, p. 423-435, 2007.
CAPALBO, D. M. F.; MORAES, I.O. Aspectos da produo de Bacillus thuringiensis. In:
Anais do congresso brasileiro de entomologia, Campinas. Fundao Cargill, 1988. p.70-80.
CAPALBO, D. M. F. et al. Bacillus thuringiensis: formulaes e plantas transgnicas. In:
BORM, A. (ed.). Biotecnologia e meio ambiente. Viosa: Folha de Viosa, 2004. p.309-350.
CHANG, M. et al., Starch processing wastewater as a new medium for production of Bacillus
thuringiensis. World J Microbiol Biotechnol. v.24, p.441-7, 2008.
CHEN, S. et al. Fed-batch culture of Bacillus thuringiensis based on motile intensity. Journal
of industrial Microbiology and Biotechnology, v. 30, p.677-681, 2003.
COUCH Terry L. Industrial fermentation and formulation of entomopathogenic bacteria. In:
CHARLES, J. F. (org) Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field applications.
Kluwer: Academic Publishes, 2000. p. 297-316.
CRICKMORE, N. et al. "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" Disponvel:
<http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/>. Acesso em: 24 dez. 2008.
CRICKMORE, N. et al. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal
crystal proteins. Microbiology and molecular biology review, v. 62, n. 3, p. 807-813, 1998.
DEVI, P. S. V. et al. Barley-based medium for the cost-effective production of Bacillus
thuringiensis. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v. 21, p. 173-179, 2005.
FINNEY, D. J Probit Analysis, London: Cambridge Univ. Press, 1971, 3rd ed.
GHRIBI, D. et al. Improvement of bioinsecticides production through adaptation of Bacillus
thuringiensis cells to heat treatment and NaCl addition. Journal of Applied Microbiology,
v.98, p. 823-831, 2005.
GLARE, T. R.; OCALLAGHAN. Bacillus thuringiensis Biology, Ecology and Safety.
Chichester: John Wiley & Sons, 2000, 350p.
GOLDEBERG, L. J.; MARGALIT J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity
against Anopheles sergenii, Uranotaenia unguiculata, Culex uinivatus, Aedes aegypti and
Culex pipiens. Mosquito News, v. 37, p. 355-358, 1977.
HABIB, M.E.M.; ANDRADE, C.F.S. Bactrias entomopatognicas. In: ALVES, S. B. (coord)
Controle microbiano de insetos. Piracicaba: Manole, 1986.p. 130-140.
HABIB, M.E.M.; ANDRADE, C.F.S. Bactrias entomopatognicas. In: ALVES, S. B. (coord)
Controle microbiano de insetos. Piracicaba: Manole, 1998. p. 383-446.
73
Disponvel
em:
74
75
76
A matria prima (casulos contendo as crislidas do bicho da seda), aps passarem pelo
processo industrial de fiao automtico e fiao semi-automtico, so transportados atravs
de canaletas para o setor de Sub-produtos, onde segue por meio de esteiras para a mquina
estopadeira. Essa mquina faz a separao das crislidas dos resduos de seda.
A mquina estopadeira dividida em esteira de entrada, tanque de banho com soda
custica e vapor e dois tanques de enxge com gua limpa.
Na esteira de entrada, um funcionrio responsvel pela separao dos casulos que
ainda podem ser reutilizados no setor de fiao automtico e semi-automtico, o restante do
processo todo automatizado.
As crislidas seguem para os tanques de banho com soluo de soda custica e vapor,
por meio de esteiras. Esse processo tem por objetivo retirar os resduos de seda.
Aps a passagem pela soluo de soda custica, as crislidas seguem em esteira direto
para o depsito da centrfuga, e em seguida, para a centrfuga. Aps centrifugar, seguem em
esteira para o secador de crislidas.
No secador, as crislidas permanecem por 1 hora, sendo a temperatura de 130C no
primeiro compartimento e 118C no segundo compartimento. Aps a secagem, as crislidas
so encaminhadas para o resfriador, onde sero resfriadas pelo processo de exausto.
Aps a secagem e resfriamento, as crislidas seguem para a mesa de classificao.
Nesse estgio de produo, feito o exame da umidade das crislidas. So realizadas duas
amostras de locais diferentes na peneira rotativa e duas amostras dos sacos embalados,
totalizando quatro amostras por turno, para monitorao da umidade para evitar possveis
falhas,
As crislidas secas seguem para o silo de armazenamento ou moinho.
No silo de armazenamento, as crislidas secas permanecem at o momento da
embalagem como Crislidas Integrais, ou seguem para o moinho, onde so trituradas e
embaladas como Farinha de crislida, de acordo com o pedido do cliente.
Fonte: Manual de Boas Prticas de Fabricao da empresa Fiao de seda BRATAC s.a.
77
Resultado
52.6600
27.1700
0.1100
0.6900
2.8214
2.7279
5.8778
2.3481
2.1805
3.7528
6.7585
3.4737
0.6224
1.6891
2.6662
2.9083
2.6158
0.6702
2.6552
2.8380
1.5121
2.6524
7643.0900
3266.7500
no detectado
162.290
89.1100
14.6500
8.5000
78