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ELISANGELA ANDRADE ANGELO

OTIMIZAO DE MEIO DE CUTIVO PARA A PRODUO


DE TOXINAS POR Bacillus thuringiensis SUBSP. israelensis
EMPREGANDO RESDUOS AGROINDUSTRIAIS

LONDRINA
2008

ELISANGELA ANDRADE ANGELO

OTIMIZAO DE MEIO DE CULTIVO PARA A PRODUO DE TOXINAS POR


Bacillus thuringiensis SUBSP. israelensis EMPREGANDO RESDUOS
AGROINDUSTRIAIS

Dissertao apresentado ao programa de Psgraduao em Cincia de Alimentos da Universidade


Estadual de Londrina, como requisito parcial para
obteno do ttulo de mestre em Cincia de
Alimentos.
Orientador: Prof Dr. Ral Jorge Hernan CastroGmez
Co-Orientadora: Dr. Gislayne Fernandes Lemes
Trindade Vilas-Bas

Londrina
2008

ELISANGELA ANDRADE ANGELO

OTIMIZAO DE MEIO DE CULTIVO PARA A PRODUO DE TOXINAS POR


Bacillus thuringiensis SUBSP. israelensis EMPREGANDO RESDUOS
AGROINDUSTRIAIS

Dissertao de mestrado

COMISSO EXAMINADORA

___________________________________________________
Prof Dr. Ral Jorge Hernan Castro-Gmez (Orientador)

____________________________________________________
(Membro)

_____________________________________________________
(Membro)

Londrina,

de Fevereiro de 2009

Dedicatria

AGRADECIMENTOS

ANGELO, Elisangela Andrade. Otimizao de meio de cultivo para a produo de toxinas por
Bacillus thuringiensis subsp. israelensis empregando resduos agroindustriais. Dissertao de
Mestrado (Mestrado em Cincia de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina. 2009.
RESUMO
O controle de insetos realizado, em sua maioria, por produtos qumicos, os quais ocasionam
grandes prejuzos ambientais e sade humana, destacando-se ainda a rpida seleo de
insetos resistentes. O controle biolgico por entomopatgenos uma alternativa eficiente,
principalmente devido a sua alta especificidade, menor freqncia de resistncia nos insetos
alvos e baixo efeito residual no ambiente. Bacillus thuringiensis uma bactria Gram-positiva
esporulante, produtora de cristais proticos com atividade inseticida. Apesar do amplo uso B.
thuringiensis no controle biolgico, h poucos trabalhos publicados quanto a sua produo,
visto que muitas informaes so segredos industriais. Portando, o presente trabalho teve por
objetivo otimizar um meio de cultura, empregando resduos agroindstrias, para produo de
toxinas por B. thuringiensis israelensis, utilizando a metodologia de superfcie de resposta.
Foi estudada tambm a cintica de crescimento e produo de toxina pela bactria, bem como
a toxicidade da cultura ps-fermentao, por um perodo de 28 dias. Como fontes de
nitrognio orgnico foram estudadas: farinha de soja, farinha de crislida, peptona
bacteriolgica e uria agroindustrial. Como fontes de carbono foram utilizadas sacarose,
glicose e fcula de mandioca. Como fonte de nitrognio inorgnico foi estudada sulfato de
amnia. O parmetro analisado para a otimizao foi toxicidade, por meio de bioensaio contra
Aedes aegypti. Foram estudadas tambm o percentual de esporulao e o crescimento (por
meio da contagem de Unidades Formadoras de Colnia). A farinha de crislida e a glicose
foram as fontes mais adequada de nitrognio orgnico e carbono, respectivamente, para a
produo de toxinas. A superfcie de resposta mostrou-se um mtodo eficaz para a otimizao,
resultando em um meio com as seguintes faixas de concentraes das fontes de carbono e
nitrognio: glicose 0,3 a 0,55g/L; farinha de crislida 55 a 58g/L e sulfato de amnia 0,6 a
1,1g/L. O meio otimizado resultou em uma toxicidade de 0,703 ppm (v/v), a qual superior a
de meios comumente utilizados para B. thuringiensis israelensis. A toxicidade da cultura
aumentou com o tempo de cultivo, sendo mxima com 96 horas. A cultura manteve-se txica
durante os 28 dias de anlise, sendo que o armazenamento sem refrigerao mostrou-se mais
eficaz (?)(Notexto no fica claro isto)). Esses resultados contribuem para o desenvolvimento
de uma tecnologia local e para o aproveitamento de resduos agroindustriais.

Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, controle biolgico, Aedes aegypti, superfcie de


resposta, toxinas, produo, resduos agroindustriais.

ANGELO, Elisangela Andrade. Medium optimization for toxins productions by Bacillus


thuringiensis subsp. israelensis using agricultural byproducts. Dissertation (Marters degree
dissertation Food Science) State University of Londrina. 2009.
ABSTRACT
Synthetic insecticides have been used in control of insects, but the use of these chemical
insecticides has become problematic due to a lot of factors including physiological resistance
in the vectors and environmental pollution. Hence, there has been an increased interest in
recent years in the use of biological agents. This biological control is more specific, have
lower frequency of resistance in insect targets and low residual effect on the environment.
Bacillus thuringiensis is a Gram-positive spore-forming bacterium that produces a parasporal
crystal protein which is toxic for many insects. This bacteria is the most widely used
worldwide as a biological agent in controlling insects, but there is not very much information
about its production. This fact is because many information are industrial secrecy. Therefore,
the objective of this study was to optimize the production medium using agrindustrial
byproducts, for toxins production by B. thuringiensi subsp. israelensis. This optimization was
done with Response Surface Analyses (RSA) methodology. Also it was studied the kinetics of
growth and production of the toxin by the bacteria, and it post-fermentation toxicity after 28
days store period. The organic nitrogen sources studied were soybean meal, Bombix mori
pupae meal (BMP), bacterial peptone and agricultural urea. The carbon sources studied were
glucose, sucrose and cassava starch. The inorganic nitrogen source studied was ammonium
sulfate. The culture medium toxicity was evaluated by bioassays against Aedes aegypti and
this parameter was the criteria used for the medium optimization. It was also studied the
percentage of the bacteria sporulation and growth (Colony Forming Units, CFU,). The BMP
and glucose were the most appropriate sources of nitrogen and carbon, respectively, for toxins
production. The RSA, proved to be an effective method for medium optimization, resulting in
a medium composition for maximal response with the following ranges of carbon and
nitrogen concentrations: glucose 0,3 to 0,55gL-1; BMP 55 to 58gL-1 and ammonium sulfate 0,6
to 1,1gL-1. The optimized medium resulted in a toxicity of 0,703 ppm (v / v), which is above
the mediums toxicity commonly obtained used B. thuringiensis israelensis. The culture
medium toxicity increased with cultivation time until 96 hours. The culture medium toxicity
remains stable under refrigeration temperatures during 28 days and when it was kept without
refrigeration, the response was more effective. These results contribute to the development of
a local technology and to promote the use of agroindustrial byproducts produced in the region.

Key-words: Bacillus thuringiensis, biological control, Aedes aegypti, response surface


methodology, toxins, production, agricultural byproduct.

NDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Cultura lisada de B. thuringiensis subsp. israelensis, evidenciando os esporos
elipsides e os cristais proticos arredondados.......................................................................15
Figura 1.2. Modos de ao das toxinas Cry.............................................................................18
Figura 1.3. Estrutura tridimensional das protenas Cry, produzidas por B. thuringiensis......20
Figura 5.1. Cultura de B. thuringiensis israelensis em diferentes momentos de cultivo..........64

NDICE DE TABELAS
Tabela 1.1 Principais ingredientes utilizados em meios de cultivo de bactrias
entomopatognicas e suas concentraes................................................................................26
Tabela 4.1 Nveis das fontes de nutrientes estudadas na etapa de seleo das fontes.............36
Tabela 4.2 Planejamento experimental utilizado na etapa de seleo das fontes de nutrientes
...................................................................................................................................................36
Tabela 4.3 Planejamento fatorial fracionado 23-1.....................................................................37
Tabela 4.4 Nveis das variveis no primeiro planejamento fatorial incompleto da etapa de
otimizao das fontes de nutrientes..........................................................................................38
Tabela 4.5 Nveis das variveis no segundo planejamento fatorial incompleto da etapa de
otimizao das fontes de nutrientes..........................................................................................38
Tabela 4.6 Nveis das variveis no planejamento fatorial completo (23) com repetio no
ponto central e pontos estrelas.................................................................................................39
Tabela 4.7 Planejamento fatorial completo 23 com repetio no ponto central e pontos
estrelas 39
Tabela 5.1 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (etapa de seleo das fontes)...........45
Tabela 5.2 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (primeiro planejamento fatorial
incompleto otimizao das fontes).........................................................................................47
Tabela 5.3 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (segundo planejamento fatorial
incompleto otimizao das fontes).........................................................................................51
Tabela 5.4 Ensaios para confirmao do ponto central (g/L): 0,5 de glicose, 1,0 de sulfato de
amnia e 50 de farinha de crislida. Valor das variveis e bioensaio.....................................53
Tabela 5.5 Respostas do Delineamento Composto Central Rotacional (planejamento fatorial
completo, com repetio no ponto central e pontos estrelas)...................................................55
Tabela 5.6 Anlise de varincia (p<0,05) para a resposta bioensaio do delineamento
composto central rotacional.....................................................................................................55
Tabela 5.7 Efeito das fontes de nutrientes sobre o bioensaio (delineamento composto central
rotacional).................................................................................................................................58
Tabela 5.8 Valores previstos para o bionsaio em diferentes concentraes das fontes de
nutrientes...................................................................................................................................59
Tabela 5.9 Custos dos meios de cultivo: Arcas adaptado e Farinha de crislida otimizado.. .61

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NDICE DE GRFICOS
Grfico 5.1 Superfcie de resposta para variveis glicose e farinha de crislida, tendo como
resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto)..........................................48
Grfico 5.2 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e farinha de crislida,
tendo como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto)......................48
Grfico 5.3 Superfcie de resposta (3 dimenses) para variveis sulfato de amnia e glicose,
tendo como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto)......................49
Grfico 5.4 Superfcie de resposta (plana) para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo
como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto)................................50
Grfico 5.5 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto)..........................................52
Grfico 5.6 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e farinha de crislida,
tendo como resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto)......................52
Grfico 5.7 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto)..........................................53
Grfico 5.8 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional)..........................................56
Grfico 5.9 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional)..........................................57
Grfico 5.10 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e sulfato de amnia,
tendo como resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional).......................57
Grfico 5.11 Valores observados e previstos para o bioensaio (% de morte)..........................59
Grfico 5.12 Correlao entre a biomassa (mg/mL) mensuradas pelas metodologias de
gravimetria e turbidimetria.......................................................................................................62
Grfico 5.13 Crescimento microbiano (biomassa) e toxicidade (bioensaio) ao longo do
cultivo (96 horas)......................................................................................................................63
Grfico 5.14 Potencial hidrogeninico (pH) ao longo do (96 horas)......................................65
Grfico 5.15 Toxicidade da cultura durante o armazenamento...............................................67

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SUMRIO

1. INTRODUO....................................................................................................................12
2. REVISO BIBLIOGRFICA.............................................................................................14
2.1 Caractersticas gerais de Bacillus thuringiensis..............................................................14
2.2 Bacillus thuringiensis subsp. israelensis.........................................................................16
2.3 Protenas Cry...................................................................................................................17
2.4 Outras toxinas produzidas por B. thuringiensis..............................................................21
2.5 Produo de B. thuringiensis..........................................................................................22
2.6 Meios de cultura..............................................................................................................24
2.7 Bioensaio.........................................................................................................................28
2.8 Planejamento de experimentos e uso do mtodo de superfcie de resposta....................29
3. OBJETIVOS.........................................................................................................................32
3.1 Objetivo Geral.................................................................................................................32
3.2 Objetivos Especficos......................................................................................................32
4. MATERIAIS E MTODOS.................................................................................................33
4.1 Microrganismo................................................................................................................33
4.2 Recuperao e manuteno da cultura............................................................................33
4.3 Preparo do pr-inculo....................................................................................................33
4.4 Condies de cultivo.......................................................................................................34
4.5 Seleo das fontes de nutrientes.....................................................................................34
4.6 Otimizao das concentraes das fontes de nutrientes selecionadas............................37
4.7 Estudo da cintica de crescimento e produo de toxinas..............................................40
4.8 Toxicidade da cultura de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis duratne
armazenamento.....................................................................................................................40
4.9 Mtodos analticos..........................................................................................................41
4.9.1 Bioensaio..................................................................................................................41
4.9.2 Unidades formadoras de colnia (UFC)..................................................................41
4.9.3 Quantificao de esporos.........................................................................................42
4.9.4 Biomassa seca (gravimetria)....................................................................................43
4.9.5 Turbidimetria............................................................................................................43
4.9.6 Lminas para anlise microscpica.........................................................................44
4.10 Anlise estatstica..........................................................................................................44
5. RESULTADOS E DISCUSSO...........................................................................................45
5.1 Seleo das fontes de nutrientes.....................................................................................45
5.1 Otimizao das concentraes das fontes de nutrientes selecionadas............................47
5.1.1 Planejamentos fatoriais incompletos........................................................................47
5.1.2 Planejamento fatorial completo...............................................................................54
5.3 Cintica de crescimento e produo de toxinas..............................................................62
5.4 Toxicidade da cultura de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis durante
armazenamento.....................................................................................................................67
6. CONSIDERAES FINAIS................................................................................................69
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................................70

12

ANEXO 1:Processo de produo de farinha de crislida pela indstria de fiao de seda


Bratac s.a...................................................................................................................................75
ANEXO 2: Anlise da constituio qumica de farinha de crislida........................................76

13

1. INTRODUO

Estima-se que existam cerca de 2,5 milhes de espcies de insetos, das quais 10% so
consideradas pragas, isto , causam danos ao ser humano ou perdas econmicas na pecuria
ou na agricultura. Muitas doenas de interesse da sade pblica, como malria, dengue, febre
amarela, filariose e doena de chagas so transmitidas por insetos vetores. Em geral, os pases
mais atingidos por estas doenas so os tropicais e subtropicais, devido principalmente s suas
caractersticas climticas favorveis proliferao de insetos. O crescente aquecimento global
demanda preocupao especial, estendendo as reas propcias a esta proliferao tambm a
regies atualmente com clima temperado.
O controle atual da populao de insetos realizado, principalmente, por inseticidas
qumicos, cujo uso indiscriminado e massivo causa danos ambientais e sade humana.
Produtos qumicos com alta toxicidade, porm com baixa especificidade e alto efeito residual,
prejudicam o meio ambiente, alm de contriburem para a existncia de considervel nmero
de espcies de insetos com populaes resistentes, inviabilizando a aplicao de tais produtos.
Uma alternativa aos inseticidas qumicos o controle biolgico, o qual pode ser feito
com o uso racional de entomopatgenos, que constituem os componentes ativos dos
bioinseticidas ou inseticidas biolgico.
Entre as vantagens dos bioinseticidas destacam-se: alta especificidade, menor risco
ambiental e sade humana, menor freqncia de resistncia nos insetos alvo e a
possibilidade do entomopatgeno se multiplicar no ambiente e, com isso aumentar sua
permanncia.
Como desvantagens dos bioinseticidas, destacam-se espectro de ao restrito e maior
suscetibilidade s condies ambientais. Estas desvantagens podem ser atenuadas com o uso
de boas formulaes e estudos para aplicao do produto, a fim de torn-lo mais resistentes s
condies ambientais e com maior tempo de prateleira.
A comercializao de bioinseticidas corresponde a cerca de 5% do mercado de
pesticidas. Porm, o uso destes produtos vem crescendo dez vezes mais do que o uso de
inseticidas qumicos. As bactrias destacam-se como promissoras no controle biolgico. Entre
estes microrganismos, Bacillus thuringiensis (Bt) o mais utilizado como bioinseticida.
Estima-se que os produtos a base dessa bactria correspondam a cerca de 97% do mercado
mundial de bioinseticidas.

14

Entre as razes para o sucesso dos produtos base de B. thuringiensis esto sua alta
toxicidade aos insetos alvos, capacidade de esporulao e o carter monognico de sua
principal toxina, o que facilita a manipulao gentica da mesma.
A subespcie israelensis de B. thuringiensis mostrou-se eficaz no combate a dpteros,
ordem onde se encontram muitos gneros com espcies vetores de doenas, como Aedes,
Culex e Anoplheles. Muitos produtos feitos a partir dessa subespcie vm sendo utilizados h
mais de trinta anos em pases africanos sob a recomendao da Organizao Mundial da
Sade (OMS).
Os maiores produtores de inseticidas a base de B. thuringiensis so Estados Unidos e
Canad. O desenvolvimento de produo local, com linhagens mais adaptadas s condies
brasileiras e com meios de cultivo alternativos, poderia tornar o produto base de B.
thuringiensis mais competitivo no Brasil.
Embora a produo de B. thuringiensis seja bem estudada, muitas informaes
necessrias ao desenvolvimento de uma produo local no esto disponveis na literatura.
Isto ocorre porque muitas informaes so propriedades de indstrias que comercializam
produtos a base de B. thuringiensis.
Considerando a necessidade do Brasil em controlar os insetos vetores de doenas ou
pragas agrcolas, tendo em vista as vantagens do controle biolgico e a dificuldade em se
obter informaes sobre a produo de B. thuringiensis torna-se necessrio o estudo e
desenvolvimento de tecnologia local para produo de bioinseticidas.

15

2. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 Caractersticas gerais de Bacillus thuringiensis

Bacillus. thuringiensis foi descrito em 1915 na Alemanha, isolado a partir de traa de


farinha (Anagasta kuehniella). Anteriormente, em 1902, no Japo, o pesquisador Ishiwata j
havia isolado uma bactria a partir de Bombyx mori, que posteriormente se soube ser tambm
uma subspcie de B. thuringiensis. No entanto, a comercializao de produtos a base desta
bactria s se iniciou em 1938 na Frana, com o bioinseticida comercializado sob o nome de
Sporeine. (BRAR et al., 2006; CAPALBO et al., 2004; VIDAURRE, 1996).
Pertencente famlia Bacillaceae, a qual engloba a maioria das espcies formadoras
de esporos, B. thuringiensis um bastonete gram positivo, com clula vegetativa de 1,0 a
1,2 m de largura por 3,0 a 5,0 m de comprimento, geralmente mveis. O esporo dessa
bactria possui formato elipsoidal e localiza-se na regio central ou paracentral quando no
interior da clula me. A espcie aerbia no estrita com faixa de temperatura de
crescimento entre 10 e 45C. B. thuringiensis apresenta um amplo complexo enzimtico, o
que lhe permite utilizar uma variedade de substratos. A principal caracterstica que distingue a
espcie das outras do mesmo gnero a presena intracelular de um cristal protico (GLARE
& OCALLAGHAN, 2000; HABIB & ANDRADE, 1998; MORAES et al., 2001; VILASBAS et al., 2007).
Devido suas caractersticas fisiolgicas de esporulante e aerbia no estrita, B.
thuringiensis apresenta resistncia a condies adversas, o que contribui para seu alto
potencial no controle biolgico (MORAES et al., 1998).
O cristal protico tpico de B. thuringiensis , em geral, produzido durante a
esporulao e constitui o principal ingrediente ativo dos bioinseticidas a base dessa bactria.
Este cristal txico para vrias espcies de insetos, destacando-se no controle de:
Lepidptera, Dptera e Coleptera. Porm, h subespcies de B. thuringiensis que apresentam
cristais txicos contra insetos dos gneros Himenptera, Hemptera, Orthoptera, Phthraphera e
tambm para alguns nematides, protozorios e caros (BRAR et al., 2006; GLARE &
OCALLAGHAN, 2000; SCHNEPF et al., 1998).

16

Os cristais de B. thuringiensis so formados principalmente por protenas


denominadas Cristal (Cry) e Citolticas (Cyt), as quais so tambm conhecidas como endotoxinas (BRAVO et al., 2007). Ao final da esporulao, o cristal protico corresponde a
cerca de 20% a 30% do peso seco da clula, sendo liberado no momento da lise celular
(ARANTES et al., 2002; GLARE & OCALLAGHAN, 2000). A figura 1.1 apresenta esporos
e cristais de B. thuringiensis liberados com a lise celular, vistos em microscpio ptico com
aumento de 1000 vezes.

9 m
Figura 1.1 Cultura lisada de B. thuringiensis subsp. israelensis, evidenciando os esporos
elipsides (seta vermelha) e os cristais proticos arredondados (seta azul). Aumento de 1000
vezes. Colorao: Amido-Black e Fucsina.
Fonte: Cedido por Dr. Gislayne Fernandes Lemes Trindade Vilas-Bas; Laboratrio de
Bioinseticida / Departamento de Biologia Geral/ Universidade Estadual de Londrina.
Bacillus thuringiensis j foi isolado de diversos ambientes, destacando-se solos,
insetos vivos ou mortos, gros estocados, amostras de gua entre outros. Embora muitos
sorotipos tenham sido isolados de amostras de solo, sabe-se que o esporo pode persistir por
muito tempo neste ambiente, porm essa bactria no capaz de se multiplicar naturalmente
no solo ou na gua. Pesquisas recentes apontam o inseto como o nicho de B. thuringiensis,
pois principalmente neste ambiente que ocorre sua multiplicao e interaes genticas
(RAYMOND et al., 2008; VILAS-BAS et al., 2000).

17

2.2 Bacillus thuringiensis subsp. israelensis

A ordem de insetos Dptera possui muitos vetores de patgenos, destacando-se os


gneros Aedes (Meigen, 1818), Culex (Linnaeus, 1758) e Anopheles (Meigen, 1818). Entre os
patgenos transmitidos por estes insetos destacam-se os causadores da dengue, malria,
filariose, encefalites e febre amarela. Muitos destes vetores j apresentam resistncia a
inseticidas qumicos. Durante muito tempo procurou-se uma subespcie de B. thuringiensis
capaz de controlar com eficincia as populaes de Dptera. Em 1976/77, Goldberg e Margalit
isolaram e descreveram a variedade israelensis (Bti) a partir da gua de uma lagoa de alta
salinidade. Esta subespcie apresentou-se com alto potencial no controle de larvas de algumas
espcies de Dptera. Desde ento, Bti vem sendo bastante estudada e aplicada no controle
biolgico (BECKER & MARGALIT, 1993; CAPALBO et al., 2004, GOLDEBERG &
MARGALIT, 1977; VIDAURRE, 1996).
Devido ao seu modo de ao complexo, difcil encontrar mosquitos resistentes s
toxinas de B. thuringiensis israelensis. Esta subespcie tem sido utilizada em vrios pases da
frica, na China, na Alemanha e na Austrlia (BECKER & MARGALIT, 1993; SKAN et
al., 2003; RUSSEL & KAY, 2008).
A segurana ambiental de B. thuringiensis israelensis tendo sido estudada e numerosos
testes com animais no-alvo tem sido realizados. Em alguns estudos com mamferos, por
exemplo, fez-se a administrao de doses altas de Bti (10 8 bactrias/animal) via subcutnea,
oral, intraperitonial, ocular e por inalao; estes testes revelaram que esta subespcie incua
para mamferos. Alm desses estudos, o fato de no haver registro de malefcios a outros
animais em locais onde Bti utilizada, comprovam sua segurana ambiental. Seu uso
permitido nos Estados Unidos desde 1981 (BECKER & MARGALIT, 1993).
O cristal protico de Bti possui, em geral, a forma arredondada, como apresentado na
figura 1, sendo formado principalmente por 4 protenas Cry: Cry4A (125KDa), Cry4B
(134KDa), Cry11A (67KDa) e Cry1Aa(27KDa).

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2.3 Protenas Cry

As protenas Cry e Cyt so as principais constituintes dos cristais que caracterizam B.


thuringiensis. Estas protenas so codificadas por genes que geralmente se localizam em
plasmdeos, e com menor freqncia localizam-se no cromossomo bacteriano. O cristal
protico foi descoberto em 1953 por Hannay (BRAVO et al., 2007; HABIB & ANDRADE,
1986; LERECLUS, et al., 1993).
Atualmente esto descritas 436 protenas Cry, sendo que a cada ano novas protenas
so descobertas, s no ano de 2008 foram descritas 42 novas protenas. De acordo com a
definio mais aceita, uma protena considera Cry quando forma uma incluso paraesporal
(cristal) em B. thuringiensis, exibe algum grau de toxicidade a insetos alvos, ou alguma
protena que tenha seqncia de aminocidos similar a uma protena Cry j descrita (BRAVO
et al., 2007; CRICKMORE et al., 2008, SCHNEPF, et al, 1998).
Uma mesma subespcie de B. thuringiensis pode conter vrias cpias de um mesmo
gene cry ou de genes cry diferentes, sendo que as protenas produzidas por estes genes
formaro um mesmo cristal. Dependendo das protenas que constituem o cristal, este possui
um formato diferente, portanto h uma correlao entre a estrutura e composio protica do
cristal. Como determinadas protenas Cry so txicas para insetos especficos, o formato do
cristal pode fornecer indcios de qual inseto a subespcie em questo possui ao efetiva.
(LERECLUS et al., 1993; GLARE & OCALLAGHAN, 2000).
As protenas Cry so sintetizadas na forma de protoxinas, portanto, para poder agir
necessria sua ativao, a qual ocorre no interior do inseto. Atualmente, h dois modelos
baseados em dados experimentais que explicam o modo de ao das toxinas Cry. As primeiras
etapas desses dois modelos so iguais: aps a ingesto dos cristais, esses so solubilizados no
intestino do inseto, local com pH alcalino, liberando as protoxinas. Essas so clivadas por
proteases do prprio inseto, resultando em toxinas ativas, com cerca de 60kDa. A toxina ativa
capaz de ligar-se a receptores especficos presentes nas clulas das microvilosidades
intestinais do inseto (BRAVO et al., 2007; SCHNEPF, et al., 1998).
O modelo de ao denominado formao de poros o mais antigo e parece ser o
mais comum entre os diferentes gneros de insetos (dpteros, lepidpteros e colepteros).
Segundo esse modelo, a ligao da toxina com receptores especficos levaria a formao de
oligmeros de toxinas, os quais se ligariam a receptores secundrios, que se encontram
firmemente ancorados na membrana da clula intestinal. Como resultado dessa ligao,

19

ocorreria a insero da toxina oligomrica na membrana da clula intestinal,


resultando em poros nesse epitlio (BRAVO et al., 2007; BRAVO & SOBERN, 2008;
HABIB & ANDRADE, 1986).
O modelo mais atual que explica a ao de toxinas Cry denominado sinal de
transduo e foi estudado em apenas poucos insetos-alvos. De acordo com esse modelo, a
ligao da protena Cry com receptores especficos, induziria uma srie de reaes
intracelulares, que envolvem a protena G e a adenilato ciclase, resultando no aumento da
AMP cclico intracelular e ativao da protena quinase A. Todas essas conseqncias levam a
um desequilbrio da presso interna celular, danificando-a (BRAVO & SOBERN, 2008).
A figura 1.2 apresenta um esquema que resume os modelos de ao por formao de
poros e por sinal de transduo.

Figura 1.2. Modos de ao das toxinas Cry. Os passos 1 a 3 so iguais nos dois modelos. O
modelo formao de poros est representado na poro superior pelas nmeros 4 a 6. A
etapa 4 refere-se oligomerizao das toxinas, a 5 a ligao ao segundo receptor e a etapa 6 a
insero da toxina na membrana. O modelo sinal de transduo est representado na poro
inferior pelo nmeros 4a e 5a. A etapa 4a refere-se ligao da toxina ao receptor e
estimulao da protena G, que estimularia a adenilato cilcase (etapa 5a) e aps uma srie de
reaes em cascata, comprometeriam o equilbrio interno celular.
Fonte: BRAVO & SOBERN, 2008.

20

A ao das toxinas, seja por qualquer um dos modelos, resulta na paralisia do aparelho
digestrio, ocasionando morte por inanio. Em muitos insetos a causa da morte septicemia
e paralisia geral dos movimentos, nesses casos a causa principal a germinao de esporos
presentes no produto e no, necessariamente, devido ao da toxina (BRAVO et al., 2007;
BRAVO & SOBERN, 2008; HABIB & ANDRADE, 1986; VALLETE-GELY et al, 2008).
Como grande parte dos genes cry localiza-se em plasmdeos conjugativos, os sorotipos
podem apresentar uma grande combinao de genes, o que resulta na ampla variedade de
perfis de toxicidade (CAPALBO et al., 2004; LERECLUS et al., 1993).
A transcrio da maioria dos genes cry dependente do fator sigma, produzido durante
o processo de esporulao, por isso a maior parte das protenas que compem o cristal
produzida durante essa etapa. Apenas, uma pequena parcela dos genes cry regulada
independentemente da esporulao, sendo, portanto, expressos tambm durante o crescimento
vegetativo. Em ambos os casos, a protena Cry fruto do metabolismo secundrio
(ARANTES et al., 2002; LERECLUS et al., 1993).
A massa molecular das protenas Cry varia entre 40 e 140 KDa. A molcula destas
protenas globular, formada por trs domnios estruturais ligados entre si por pequenas
pontes. At o momento, seis protenas Cry tiveram suas estruturas bem determinadas por
cristalografia por raios-X (figura1.3). Estas protenas apresentaram um alto grau de
similaridade entre seus domnios, o que indica que apresentam um modo de ao semelhante.
O domnio 1 (N-terminal) formado por cadeias polipeptdicas com formato de -hlices,
sendo uma central (hidrofbica), cercada por 6 cadeias marginais. O domnio 2 composto
por trs cadeias polipeptdicas antiparalelas com formato de -folha pregueada. J o domnio
3 apresenta o formato de -sandwich (BRAVO et al., 2007).
Embora estudos atuais indiquem que vrias pores dos diferentes domnios da
protena se insiram na membrana no momento de formao dos poros, acredita-se que o
domnio 1 seja o principal responsvel pela insero (NAIR & DEAN, 2008). Os domnios 2
e 3 apresentam similaridades estruturais com cadeias polipeptdica que se ligam a
carboidratos e estariam envolvidos principalmente no reconhecimento de receptores presentes
na membrana das clulas dos insetos-alvo (BRAVO et al., 2007).
Durante muito tempo, a nomenclatura das protenas Cry foi feita de acordo com o
inseto-alvo, desta forma, eram classificadas como Cry I as protenas txicas a lepidpteras,
Cry II txicas a lepidpteras e dpteras, Cry III contra colepteras, Cry IV contra dpteras.
Devido s constantes descobertas de novas protenas Cry, tal sistema mostrou-se inconsistente
e, atualmente a classificao feita baseando-se na seqncia de aminocidos das protenas.

21

Periodicamente o banco de dados on-line sobre protenas de B. thuringiensis atualiza a


classificao e nomenclatura de tais protenas (CRICKMORE et al., 1998; 2008).

Figura 1.3. Estrutura tridimensional das protenas Cry, produzidas por B. thuringiensis. Notase que a estrutura geral das protenas Cry conservada.
Fonte: BRAVO et al., 2007.

As protenas Cyt so definidas como uma incluso paraesporal de B. thuringiensis que


apresenta atividade hemoltica, ou alguma protena que apresente seqncia de aminocidos
similar a protenas Cyt j descritas. Estas protenas so formadas por apenas um domnio
composto por duas cadeias exteriores em forma de -hlice, e uma cadeia interna em forma de
-folha pregueada. Atualmente so conhecidas 27 protenas Cyt (BRAVO et al., 2007;
CRICKMORE et al., 1998; 2008).
Assim como as protenas Cry, as Cyt tambm so sintetizadas na forma de protoxinas.
No interior do inseto, as protenas Cyt sofrem quebras, liberando a toxina ativa. Ao contrrio
das protenas Cry, Cyt no se liga a receptores especficos da membrana celular, e sim,
diretamente aos lipdios da membrana. Aps sua ligao, as protenas Cyt induzem a
formao de poros ou agem desestruturando a bicamada lipdica das membranas (BRAVO et
al., 2007).
Vrios estudos tm demonstrado ocorrer um efeito sinergstico entre as protenas Cry e
entre estas e as protenas Cyt, ou seja, a maior toxicidade devida interao das protenas,
onde uma potencializa o efeito da outra. (BRAVO et al., 2007; SKAN, 2003).

22

2.4 Outras toxinas produzidas por B. thuringiensis

Alm das protenas Cry e Cyt, B. thuringiensis sintetiza outras toxinas que podem ou
no participar da ao entomopatognica.
Em 1967 Heimpel sugeriu o nome de -exotoxina para uma substncia termoestvel e
txica para alguns insetos. Devido a sua estrutura qumica o nome -exotoxina vem sendo
substitudo por thuringiensina. Estas protenas possuem baixo peso molecular, a sua
toxicidade relaciona-se a inibio da RNA polimerase, pois anloga a nucleotdeos. Embora
no possua especificidade, a ao de thuringiensina contribui para a toxidade global das
linhagens que a expressam (GLARE & OCALLAGHAN, 2000; HABIB & ANDRADE,
1998; LERECLUS et al., 1993). Alguns trabalhos citam a importncia dessa toxina no
controle de besouros e algumas espcies de caros (WU et al., 2002).
Muitos sorotipos de B. thuringiensis produzem protenas denominadas Vip (vegetative
insecticidal proteins), as quais so sintetizadas na etapa vegetativa do crescimento. Apesar de
no integrarem o cristal protico, estas protenas contribuem para a toxicidade global das
linhagens e possuem forma de intoxicao similar s das protenas Cry (CRICKMORE et al.,
2008; GLARE & OCALLAGHAN, 2000).
Em 2000, Mizuki et al. descreveram uma nova toxina de B. thuringiensis a qual
passou a ser denominada Parasporina. Estas toxinas so definidas como protenas paraesporal
de B. thuringiensis sem atividade hemoltica e que apresentam a capacidade de atacar clulas
cancergenas (OHBA et al., 2008).
Bacillus thuringiensis sintetiza fosfolipases C, estas so produzidas ao final da fase
exponencial de crescimento e so excretadas para o meio de cultura (AGAISSE et al., 1995).
Essa bactria sintetiza tambm quitinases e proteases que contribuem para romper a
membrana peritrquia presente no intestino dos insetos, contribuindo, dessa maneira, para a
toxicidade global das linhagens (GLARE & OCALLAGHAN, 2000).
Alm das toxinas, o esporo de B. thuringiensis tambm contribui parar sua toxicidade,
pois estes podem germinar no interior do inseto-alvo, ocasionando septicemia; ou
potencializarem o efeito da toxina em uma ao sinergstica (GLARE & OCALLAGHAN,
2000; RAYMOND et al., 2008).

23

2.5 Produo de B. thuringiensis

As primeiras indstrias a demonstrarem interesse no estudo e comercializao de B.


thuringiensis foram empresas de fermentao. Logo as indstrias de produtos qumicos
perceberam a importncia deste mercado de controle biolgico e se lanaram em sua pesquisa
e produo (CABALBO & MORAES, 1988).
Nas dcadas de 1970 e 1980, com o isolamento de novas linhagens e a possibilidade
da manipulao gnica, o interesse por B. thuringiensis aumentou bastante, principalmente no
setor privado (ARANTES et al., 2002; CAPALBO et al., 2004).
No Brasil, estudos realizados por diversos grupos em diferentes regies tm tentado
implantar centros biotecnolgicos onde ocorra a produo de produtos a base de B.
thuringiensis. Atualmente, tais centros esto em fase de estabelecimento dos mtodos de
produo e execuo dos testes preliminares. Como exemplos destes centros podem-se citar a
Probiom Tecnologia, situada na cidade de Campinas (So Paulo) e Bioticom, situada em
Recife (Pernambuco). A empresa Bthek Biotecnologia Ltda., com sede em Braslia, foi uma
das primeiras a formular e comercializar um produto nacional base de B. thuringiensis.
Em geral, os produtos base de B. thuringiensis so compostos por uma mistura de
cristais, esporos, clulas vegetativas e ingredientes secundrios da formulao (CAPALBO et
al., 2004). Muitos destes produtos no so acessveis aos consumidores, quer pelo preo, pela
falta de informao ou devido s condies legais estabelecidas pelo pas. O desenvolvimento
de produes locais pode ser uma soluo para tal situao. Neste caso, a produo pode ser
feita em um volume menor, escala piloto, usando-se materiais alternativos e abundantes na
regio a ser atendida (SALAMA & MARGALIT, 1993; MORRIS et al., 1997).
Em geral, a produo de B. thuringiensis, assim como de outros produtos microbianos,
envolve as seguintes etapas: seleo da linhagem, estocagem, processo fermentativo,
recuperao do princpio ativo (esporos e cristais), formulao do produto e anlise da
qualidade. Referencia!
Segundo Couch (2000) os principais critrios para seleo de uma subespcie
bacteriana para produo de bioinseticidas so: espectro de ao, potncia por unidade de
volume da cultura, requerimentos nutricionais, facilidade de produo, estabilidade gentica e
facilidade de estocagem.
A estocagem apropriada de grande importncia, pois a linhagem deve conservar seu
potencial txico e velocidade de crescimento. No caso de B. thuringiensis, as trocas de

24

plasmdeos ocorrem com certa freqncia e h relatos de perca de toxicidade aps sucessivas
fermentaes, sendo essencial a constante busca por novas linhagens e o monitoramento
durante o processo de fermentao (COUCH, 2000; BIZARRI et al, 2008).
A forma mais comum de produo de B. thuringiensis por fermentao submersa
(lquida) descontnua, tambm conhecida como processo em batelada. Nesta fermentao um
recipiente inoculado com o microrganismo e o meio de cultura lquido, no havendo
acrscimo ou retirada significativa do meio fermentado. Portanto, ocorre todo o
desenvolvimento da cultura, sendo retirado o produto apenas no final do processo. Em geral,
as protenas Cry de B. thuringiensis so formadas no fim da fermentao, quando as
condies do meio se tornam desfavorveis, sendo o processo em batelada satisfatrio para tal
produo (MORAES et al., 2001).
Alguns pesquisadores tm estudando as fermentaes slida, contnua e em batelada
alimentada, porm at o momento, o mais vivel para produo de protenas Cry, ainda o
processo em batelada (ADAMS et al., 2002; CHEN et al., 2003, MORAES et al., 2001,
VALLEJO et al., 1999).
Na fermentao industrial os passos a serem seguidos so: pr inculo, geralmente
feito em frascos pequenos, pr fermentador, ?comumente com 1/5 do volume da fermentao
e o fermentador final. Durante todas as etapas deve-se analisar a cultura quanto
contaminao, caractersticas morfolgicas e potencial entomopatognico. Em geral, os
reatores utilizados permitem o controle das principais condies de cultivo, as quais so:
temperatura, pH, aerao e agitao. O pr-inoculo, pr-fermentador e o fermentador em
volumes crescentes so feitos a fim de diminuir o tempo da fase lag, ou seja, o perodo de
adaptao do microrganismo s condies de cultivo. Em geral, pr fermentadores e
fermentador possuem os mesmos ingredientes no meio de cultivo. importante limitar o
nmero de passos no processo de produo a fim de evitar contaminaes e mudanas
indesejveis no comportamento da bactria (COUCH, 2000; MORAES et al., 2001).
Ao final da fermentao, a cultura de B. thuringiensis apresenta em mdia 6 a 8% de
slidos, dos quais 1 a 3% so cristais e esporos. H vrios mtodos que podem ser utilizados
para a recuperao destes cristais e esporos, sendo o mais comum a centrifugao e a microfiltrao. importante ressaltar que com tais processos, ocorre a recuperao principalmente
das protenas Cry e muitas outras toxinas que podem contribuir para a toxicidade final do
produto so perdidas. Atualmente novas tcnicas de recuperao e/ou concentrao do
produto esto sendo desenvolvidas para complementar as mais utilizadas, destacando-se: a
liofilizao e a flotao (BRAR et al., 2006; COUCH, 2000).

25

Aps a recuperao, os produtos so formulados. No caso dos bioinseticidas, a


formulao tem trs objetivos principais: conferir estabilidade ao produto durante a estocagem
e aplicao, facilitar a aplicao do produto e proteger o microrganismo das condies
adversas do ambiente. H dois tipos bsicos de formulao: slida e liquida. Em geral, as
formulaes slidas so mais estveis e preferveis. As formulaes so importantes, pois
podem permitir aos produtos a base de B. thuringiensis competir melhor no mercado de
produtos inseticidas (BRAR et al., 2006; COUCH, 2000).
Embora sejam segredos industriais, as formulaes geralmente contam com uma
combinao de aditivos reconhecidos pela FDA (Food and drug Administration) ou pelo
rgo competente do pas. comum o uso de dispersantes, protetores e surfactantes (GLARE
& OCALLAGHAN, 2000; BRAR et al., 2006).
Antes de ser comercializado, o produto formulado deve passar por testes de anlise de
qualidade que atestem principalmente sua potncia txica. Para B. thuringiensis, a toxicidade
geralmente analisada por meio de bioensaio com o inseto-alvo (COUCH, 2000).

2.6 Meios de cultura

A escolha do meio de cultivo adequado extremamente importante para o sucesso de


um produto. Esta escolha deve atender a dois requisitos principais; proporcionar uma boa
produo e no ser muito oneroso (COUCH, 2000).
Os meios de cultivo para B. thuringiensis geralmente possuem uma fonte de
nitrognio, outra de carbono e sais minerais. Algumas vezes se adicionam ao meio alguns
tampes e anti-espumantes a fim de facilitar o processo (COUCH, 2000).
A fonte de carbono, alm de fornecer matria prima para muitos compostos celulares,
serve como fonte de energia. O nitrognio requerido principalmente para sntese de
protenas e cidos nuclicos. Os sais minerais atuam como co-fatores, sendo tambm
importantes no controle da osmolaridade celular.
Couch (2000) cita os principais componentes e suas concentraes utilizadas no
cultivo de B. thuringiensis na Amrica do Norte (Tabela 1). Apesar das indstrias no
revelarem a composio de seus meios, sabe-se que estes geralmente so combinao dos

26

produtos listados. Muitos dos produtos utilizados so componentes indefinidos, porm no


devem apresentar muita variao de um lote para outro.
Meios alternativos vm sendo estudados a fim de baratear o produto final,
principalmente nas produes regionais em escala piloto. Poopathi et al. (2002) obtiveram
resultados expressivos em cultivos em meio base de batata. Vora e Shethna (1999)
estudaram um meio contendo extrato de soja suplementado com cistina, tendo bons resultados
para produo de -endotoxina. Prabakaran et al. (2008) desenvolveram um meio de cultivo a
base de gua de coco, obtendo resultados satisfatrios para produo de toxinas.
Vrios estudos tm sido feitos utilizando-se como meio de cultivo para B.
thuringiensis guas residuais de indstrias e de estaes de tratamento de gua. Tais trabalhos
tm apresentado bons resultados, e muitas produes em escala piloto j utilizam estes
resduos (LACHHAB et al., 2002; MONTIEL et al., 2001; VIDYARTHI et al., 2002; YEZZA
et al., 2005, 2006; CHANG et al, 2008).
A fonte de carbono para cultivo de B. thuringiensis varia muito conforme o objetivo da
fermentao, bem como qual linhagem est sendo cultivada. A maioria dos trabalhos revela
que a melhor fonte para crescimento vegetativo no corresponde a melhor fonte para
esporulao e formao dos cristais proticos. Referencia!
Os estudos de Igen et al. (2002b) indicam um efeito inibidor da glicose durante a
sntese da -endotoxina. De acordo com este trabalho, as melhores fontes de carbono para
produo dos cristais txicos e esporulao so lactose, sacarose e inulina.
Segundo de skan et al. (2003), a glicose, amido e melao inibem a produo de
toxina, em particular a protena Cry4B (134KDa). Este estudo foi feito com B. thuringiensis
subsp. israelensis e ressalta o efeito repressor da glicose, a qual agiria em etapas de
fosforilao da protena quinase Calfostina C, responsvel pela produo das protoxinas Cry.
Segundo os autores, as melhores fontes de carbono para biossntese da -endotoxina seriam
dextrina, aveia, maltose, lactose, inulina, glicerol e sacarose, sendo a dextrina a mais
promissora de todas quanto esporulao e produo de toxina.

27

Tabela 1.1 Principais ingredientes utilizados em meios de cultivo de bactrias


entomopatognicas e suas concentraes.
Ingrediente
Farinha de soja
Farinha da semente do algodo
Protena de batata
Licor de milho ou slidos derivados de
milho
Glicose
Peptona
Xarope de milho
Melao
Glicerol
Amido de milho
Extrato de levedura
KH2PO4
K2HPO4
FeSO4
FeSO4.7H2O
MgSO4. 7H2O
MnSO4. H2O
ZnSO4.7H2O
(NH4)2SO4
CuSO4.5H2O
CaCO3
PPG2000
Anti-espumante Hodag FD62
Anti-espumante SAG 5693
Anti-espumante Dow Corning
Fonte: Couch, 2000

Concentrao (g/L)
20-40
14-30
15-40
15-30
10-30
2-5
20-45
1.0-18.6
2.0-10
10-15
2.0
1.0
1.0
0.02
0.0005-0.02
0.3
0.02
0.02
2
0.005
1.0-1.5
2.0-5.0
3.0
0.5-1.25
0.1

Resultados diferentes dos pesquisadores skan et al. (2003) esto presentes nos
trabalhos de Vora e Shethna (1999) e Prabagaran et al. (2004), os quais indicam o melao-decana como uma boa fonte de carbono para produo de toxina. Estes estudos comprovam que
necessrio otimizar um meio para cada sorotipo, pois os resultados do estudo com um
determinado sorotipo muitas vezes no podem ser extrapolados para outros.
As fontes de nitrognio podem ser tanto orgnicas quanto inorgnicas, sendo comum o
uso das duas fontes juntas. Os estudos de Arcas et al. (1984), Igen et al. (2002b), skan et
al. (2003) e Zouari e Jaoua (1999) indicam que o uso de apenas nitrognio inorgnico no
aconselhvel para o cultivo de B. thuringiensis, pois h diminuio de crescimento,
esporulao e biossntese. Dentre as mais promissoras fontes de nitrognio inorgnico

28

apontadas por estes autores, destacam-se os fosfatos [NH 4H2PO4 e (NH4)2HPO4] e sulfatos por
otimizarem esporulao e muitas vezes a produo de toxinas. Entre as fontes orgnicas, o
extrato de levedura bastante usado no cultivo de B. thuringiensis, porm peptona e soja
apresentam resultados promissores.
Como fontes alternativas de nitrognio orgnico vm se destacando: farinhas
derivadas de protena animal (farinha de peixe e de crislida), soja e alguns cereais (cevada e
trigo) (ALVES et al., 1997; DEVI, 2005; GHRIBI et al., 2005; MORRIS et al., 1997,
PRABAKARAN & BALAMARAN, 2006; ZOUARI & JAOUA, 1999).
A concentrao de sais no meio de cultivo influencia diretamente a osmolaridade do
mesmo. No h consenso sob qual porcentagem de sais melhor, bem como quais os sais que
devem ser adicionados. Referencia!
Arcas et al. (1987) obtiveram uma boa produo de toxina com um meio contendo
osmolaridade de 808 miliosmol, sendo este um experimento clssico que resultou em um
meio bastante adotado para crescimento e produo de B. thuringiensis. importante ressaltar
que embora os sais ajam como um todo na osmolaridade, cada on fornecido pelos sais pode
ter um efeito diferente. Muitas vezes, produo e crescimento no se relacionam, sendo que
alguns ons melhoram um parmetro e prejudicam ou so neutros para outro. Os principais
ons fornecidos pelos sais so: magnsio, clcio, mangans, cobre e zinco.
Os estudos de skan et al. (2003) e Igen et al. (2002a) revelaram que o mangans
crtico para a diferenciao celular, sendo requerido para esporulao e formao do cristal de
toxina. Provavelmente este on atue em processos de co-regulao da sntese da toxina. Os
melhores resultados aparecem quando a concentrao de mangans varia entre 10-6 e 10-4M,
valores maiores que estes se tornam txicos para todos os processos celulares.
Assim como mangans, o magnsio influencia o metabolismo secundrio, portanto,
com efeito na produo das protenas Cry. Sua concentrao ideal em torno de 10-3 M. O
clcio bastante importante no processo de esporulao, promovendo a estabilidade do cristal
protico. A concentrao de 10-3 M de clcio estimula a esporulao, porm inibidora para o
crescimento vegetativo e sntese protica. Ao que parece, o clcio no essencial para a
sntese de toxina. Recomenda-se o uso de concentraes menores que 10 -3 M de clcio, a fim
de no prejudicar a formao das protenas Cry (IGEN et al., 2002a; SKAN et al., 2003).
Metais como zinco, cobre e ferro apresentam resultados negativos para o crescimento,
esporulao e produo de toxina mesmo em concentraes pequenas como 10 -7 M (IGEN
et al., 2002a; SKAN et al., 2003).

29

2.7 Bioensaio

Um dos parmetros mais importantes no estudo com B. thuringiensis o seu potencial


txico ante o inseto-alvo. Embora muitos estudos utilizem a quantificao de protenas Cry
para aferir a toxicidade de uma produo, sabe-se que o bioensaio um mtodo mais sensvel,
pois fornece indcios no s quantitativos, mas tambm da eficcia da toxicidade da produo.
Liu e Tzeng (1998) indicam em seu trabalho a utilizao do bioensaio na otimizao de
produes, pois apenas contagem de esporos ou quantificao de protenas no foram
suficientes.
O bioensaio pode ser entendido como um teste onde seres vivos so expostos a uma
determinada substncia, sob condies controladas. No caso de B. thuringiensis, o bioensaio
feito com larvas de insetos alvos segundo protocolos da Organizao Mundial da Sade
(OMS). (MORAES, et al., 2001; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005).
Para B. thuringiensis israelensis, o bioensaio feito com larvas de terceiro ou quarto
instar de dpteras dos gneros Aedes, Culex, Anopheles, entre outros. Nesse ensaio, larvas
entre terceiro ou quarto instar so colocadas em diferentes recipientes, nos quais so aplicadas
diferentes concentraes do produto. As larvas so mantidas a 25-28C por um perodo de 24
horas, quando ento so mensuradas as quantidades de larvas mortas em cada uma das
concentraes. Faz-se ento um clculo da concentrao letal para 50% (CL 50) e 90% (CL90)
das larvas por meio de uma regresso linear log-probit, a qual pode ser feita com o uso de
programas de computador adequados. O bioensaio feito em triplicata e h um controle
negativo, no qual no aplicado o produto. Em alguns casos, como por exemplo, no estudo de
novas linhagens, padroniza-se uma concentrao para as diferentes e linhagens e aplica-se a
cultura, s posteriormente realiza-se o bioensaio completo. Esse bioensaio tem como objetivo
fazer uma triagem inicial de novas linhagens (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005).
O bioensaio pode ser expresso tambm em termos Unidades Internacionais (ITU),
nesse caso, a CL50 do produto em teste comparada com o bioensaio de uma cepa de padro
internacional a qual foi atribuda um valor arbitrrio de potncia. Para B. thuringiensis
israelensis, a cepa padro a IPS82, a qual tem um valor de potncia contra A. aegypti de
15000 ITU/mg (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005).

30

Muitos fatores podem influenciar em um bioensaio, destacando-se a espcie de inseto,


o instar, a densidade de larvas, qualidade da gua e a temperatura, sendo crucial a
padronizao do teste. Estudos revelam que A. aegypti uma das espcies mais sensveis B.
thuringiensis israelensis, isto ocorre devido a fatores intrnsecos dessa espcie, tais como sua
alta velocidade de filtrao (JARIC-PERKUSIC et al, 2008; OTIENO-AYAYO et al., 2008).

2.8 Planejamento de experimentos e uso do mtodo de superfcie de resposta

Os processos fermentativos so influenciados por muitas variveis, que podem


interagir entre si. O estudo da influncia das variveis bem como da suas interaes sob um
determinado resultado muito difcil de ser realizado sem um planejamento experimental
adequado. Desta maneira, o planejamento experimental tem por objetivo principal projetar
um experimento de forma que ele seja capaz de fornecer exatamente o tipo de informao que
procuramos (BARROS NETO et al., 1995).
O planejamento adequado permite executar o experimento de maneira mais organizada
e com um nmero de ensaios reduzidos ao mnimo necessrio para se alcanar os objetivos de
interesse. Alm disso, com o planejamento experimental possvel calcular o erro
experimental e at mesmo otimizar mais de uma resposta ao mesmo tampo (RODRIGUES &
IEMMA, 2005).
At o incio da dcada de 1970, os estudos sobre meios de cultivo para
microrganismos eram feitos variando-se uma varivel a cada ensaio. Embora tenha sido
bastante comum, este mtodo no permite o estudo das interaes entre as variveis, alm de
muitas vezes exigir uma grande quantidade de ensaios, tornando-se dispendioso. No incio
dos anos de 1970, os trabalhos dos pesquisadores Fisher e Box sobre desenho experimental se
popularizaram. De acordo com a proposta destes trabalhos, mais de uma varivel muda
durante um ensaio, possibilitando estudar as interaes entre uma varivel e outra, alm de
facilitar a modelagem matemtica do processo (KENNEDY & KROUSE, 1999;
RODRIGUES & IEMMA, 2005).
Entre os mtodos mais comuns de planejamento experimental destacam-se o
planejamento fatorial. Nessa metodologia, h combinao entre os valores de duas ou mais

31

variveis. Esses valores so definidos a priori segundo os interesses do pesquisador, com base
em dados da literatura ou anlises empricas.
O planejamento fatorial pode ser completo ou incompleto, ele dito completo quando
todas as combinaes entre as variveis nos seus diferentes valores so executadas em
ensaios. J no planejamento fatorial incompleto, tambm chamado de fracionado, apenas um
nmero limitado das possveis combinaes das variveis realizado em ensaios (KENNEDY
& KROUSE, 1999; RODRIGUES & IEMMA, 2005).
Geralmente, o planejamento fracionado utilizado quando a quantidade de variveis e
valores muito grande e a execuo de todas as combinaes se torna invivel, neste caso o
planejamento fracionado serve para fazer uma triagem de quais variveis so importantes para
o processo e devem continuar no estudo. O planejamento fatorial completo geralmente feito
em uma segunda etapa, quando as variveis importantes j foram selecionadas e,
posteriormente se deseja estudar seus valores e interaes com mais detalhes (KENNEDY &
KROUSE, 1999).
Denomina-se nvel os valores que cada varivel ser estudada, no caso de se estudar 5
variveis em 2 nveis cada, resultaro em 32 ensaios em um planejamento experimental
completo. Neste exemplo, o planejamento dito 25, sendo o expoente a quantidade de
variveis e o nmero elevado quantidade de nveis de cada varivel. Caso em uma etapa do
experimento realize-se apenas 16 ensaios dos 32 possveis, o desenho passa a ser um fatorial
incompleto 25-1.
Tendo-se feito um planejamento experimental adequado, podem-se aplicar tcnicas
que permitam o estudo da otimizao do processo. Entre as tcnicas estatsticas de otimizao
mais utilizadas destaca-se a superfcie de resposta. A metodologia do planejamento fatorial,
associada anlise de superfcie de respostas, uma ferramenta fundamental na teoria
estatstica, que fornece informaes seguras sobre o processo, minimizando o empirismo que
envolve tcnicas de tentativa e erro (BOX et al, 1978 apud RODRIGUES & IEMMA, 2005).
Esta tcnica foi desenvolvida por Box e Wilson no incio da dcada de 1950 e consiste em
duas etapas principais que devem ser repetidas quantas vezes forem necessrias a fim de se
alcanar um timo. A primeira etapa a de modelagem e geralmente feita ajustando-se os
modelos matemticos aos dados experimentais obtidos por meio de um planejamento fatorial
adequado. A segunda etapa consiste em um deslocamento geralmente no sentido de mxima
inclinao do modelo matemtico (BARROS NETO et al., 1995). Em geral, nesta tcnica a
resposta representada em grficos de superfcies que permitem visualizar melhor os
resultados contribuindo para sua interpretao (KENNEDY & KROUSE, 1999).

32

Alguns trabalhos j foram realizados com B. thuringiensis utilizando-se a metodologia


de superfcie de resposta. Entre estes trabalhos destaca-se Prabagaran et al. (2004) os quais
estudaram o melhoramento de um meio a base de ingredientes alternativos para a produo de
toxina por uma subespcie de B. thuringiensis. Tokcaer et al. (2006) utilizaram a metodologia
de superfcie de resposta para otimizar as condies de cultivo para produo de protenas Cry
por B. thuringiensis. Ambos os trabalhos conseguiram melhorar a produo de toxinas pelas
subespcies estudadas.

33

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Otimizar um meio de cultivo para a produo de toxinas de Bacillus thuringiensis


subsp. israelensis HD537 por fermentao submersa descontnua, utilizando resduos
agroindustriais, com o intuito de controlar populaes de Aedes aegypti.

3.2 Objetivos Especficos

Determinar a melhor fonte de nitrognio entre: farinha de soja, farinha de crislida,


peptona bacteriolgica, uria agroindustrial e sulfato de amnia para a produo de toxinas
por Bacillus thuringiensis subsp. israelensis HD537. Como? ASR?
Determinar a melhor fonte de carbono entre: sacarose, glicose e fcula de mandioca
para a produo de toxinas por Bacillus thuringiensis subsp. israelensis HD537. Como? ASR?
Determinar as melhores concentraes de fontes de nutrientes selecionadas para
produo de toxinas por Bacillus thuringiensis subsp. israelensis HD537 utilizando a
metodologia de Analise de Superfcie de Resposta.
Estudar a cintica de crescimento e produo de toxinas por Bacillus thuringiensis
subsp. israelensis HD537.
Verificar a estabilidade da toxicidade da cultura de Bacillus thuringiensis subsp.
israelensis HD537 por um perodo de 28 dias aps sua fermentao.

34

4. MATERIAIS E MTODOS

4.1 Microrganismo.

O microrganismo utilizado neste estudo foi B. thuringiensis subsp. israelensis,


HD537, o qual foi gentilmente cedido pelo Laboratrio de Bioinseticida do Departamento de
Biologia Geral da Universidade Estadual de Londrina.
Essa linhagem de B. thuringiensis foi isolada no Estado do Esprito Santo (Brasil) por
?????? (AUTOR, ANO) e caracterizado pelo Collaboration Centre for Entomopathogenic
Bacillus (Paris, Frana).

4.2 Recuperao e manuteno da cultura

A linhagem de B. thuringiensis israelensis HD537 foi inicialmente recuperada a partir


de cultura estoque em gua e fitas de papel filtro. Aps a recuperao, as culturas foram
mantidas sob refrigerao, em placas contendo agar nutriente, o qual continha (g/L): 5,0 de
peptona, 3,0 de extrato de carne e 15 de agar (BRASIL, 2004). Esta cultura foi replicada a
cada 15 dias.

4.3 Preparo do pr-inculo

Antes do preparo do pr-inculo, B. thuringiensis israelensis HD537 foi cultivado em


meio Arcas adaptado (ANDRADE, 2005), a fim de melhorar o crescimento do microrganismo
em meio lquido. Nessa etapa, a cultura foi mantida a 30C e 120 rpm (agitador rotativo)
durante 16 horas em frascos tipo Erlenmeyer de 500 mL de capacidade, contendo 50 ml de

35

meio, o qual continha (g/L): MgSO4 (1,0); KH2PO4, (1,0); K2HPO4 (1,0); MnSO4.H2O (0,3);
CaCl2 (0,4); (NH4)2SO4 (1,0), extrato de levedura (8,0) e glicose (4,5).
Aps esse cultivo, o pr-inculo foi feito transferindo-se 1,25 mL da cultura em meio
Arcas adaptado para um Erlenmeyer de 500 mL de capacidade, contendo 50 mL do meio a ser
testado. O pr-inculo foi mantido a 30C, 120 rpm (agitador rotativo) por um perodo de 16
horas.

4.4 Condies de cultivo

O inoculo foi feito transferindo 1,25 mL do pr-inculo para frascos Erlenmeyer de


500 ml de capacidade contendo 50 mL do meio estril a ser estudado.
As culturas foram mantidas por um perodo de 72 ou 96 horas, a 30C e 120 rpm em
agitador rotativo. O tempo de cultivo foi baseado em testes preliminares e tambm em dados
da literatura (ANDRADE, 2005; COUCH, 2000).

4.5 Seleo das fontes de nutrientes

As fontes de nutriente estudadas bem como seus nveis iniciais foram escolhidos de
acordo com testes preliminares e dados da literatura. Como fontes de nitrognio orgnico
foram estudadas:

Farinha de soja: escolhida por ser utilizada na produo do Laboratrio de


Bioinseticida do Centro de Cincias Biolgicas da Universidade Estadual de
Londrina;

Farinha de crislida: esse ingrediente foi gentilmente cedido pela indstria de


fiao de seda Bratac s.a.. O processo de obteno dessa farinha pela indstria
citada encontra-se no anexo 1. Esse ingrediente foi escolhido para o estudo com
base em testes preliminares e dados da literatura (ALVES et al., 1997);

36

Peptona bacteriolgica: escolhido por ser ingrediente comum no cultivo industrial


de bactrias entomopatognicas (COUCH, 2000);

Uria agroindustrial: escolhido por ser comumente utilizada na agricultura como


fonte de nitrognio e por apresentar um baixo custo.

Como fonte de nitrognio inorgnico foi utilizado o sulfato de amnia ((NH 4)2SO4), o
qual compe o meio Arcas, comumente utilizado na fermentao de B. thuringiensis
(ARCAS, 1987).
As fontes de carbono estudadas foram:

Glicose: escolhida por ser comumente empregada no cultivo de B. thuringiensis


(ARCAS, 1987).

Sacarose: escolhida com base em estudos de Igen et al. (2002b) e skan et al.
(2003).

Fcula de mandioca: escolhida por apresentar um baixo custo e como uma


alternativa ao uso de amido de milho, o qual empregado em vrias produes de
bactrias entomopatognicas (COUCH, 2000).

A seleo das fontes foi feita por meio de um planejamento fatorial fracionado 2 8-4, no
qual cada varivel foi estudada em dois nveis (-1 e +1) com variaes extremas. Esses
experimentos foram feitos em dois blocos aleatrios O objetivo desta etapa foi criar um
contraste entre os nveis e, com isto realizar uma seleo qualitativa. Os nveis das diferentes
fontes de nutrientes bem como o planejamento fatorial encontra-se na tabela 4.1 e 4.2
respectivamente.
Alm das fontes de nutrientes em estudo, o meio de cultivo continha uma mistura de
sais baseada no meio Arcas adaptado (ANDRADE, 2005), a qual no sofreu alterao e no
foi foco de estudo durante a pesquisa. Os sais presentes nessa mistura foram (g/L): MgSO 4
(1,0); KH2PO4, (1,0); K2HPO4 (1,0); MnSO4.H2O (0,3) e CaCl2 (0,4).
As condies dos experimentos dessa etapa foram as mesmas descritas no item 4.3 por
um perodo de 72 horas.
A resposta analisada para a seleo das fontes foi bioensaio, conforme descrito no item
4.9.1. Alm dessa resposta, foi analisado o efeito das fontes de nutrientes em estudo sobre o
crescimento e esporulao; para isso, foram feitas contagem de Unidades Formadoras de
Colnia e Contagem de esporos, como descritos no itens 4.9.2 e 4.9.3 respectivamente.

37

Tabela 4.1 Nveis das fontes de nutrientes estudadas na etapa de seleo das fontes

Fontes de nutrientes (Variveis)


Farinha de soja (g/L)

Nvel -1
5,0

Nvel +1
50

Farinha de crislida (g/L)


Peptona de carne (g/L)
Uria (g/L)
Sulfato de amnia (g/L)
Glicose (g/L)
Sacarose (g/L)
Fcula de mandioca (g/L)

2,0
0,5
0,2
0,2
1,0
1,0
1,5

20
5
2,0
2,0
10
10
15

Tabela 4.2 Planejamento experimental utilizado na etapa de seleo das fontes de nutrientes

Farinha Pepton
Sulfato
Fcula de Farinha
de
a de
de
Experimento Sacarose Glicose mandioca de soja crislida carne Uria amnia
1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
2
1
-1
-1
-1
-1
1
1
1
3
-1
1
-1
-1
1
-1
1
1
4
1
1
-1
-1
1
1
-1
-1
5
-1
-1
1
-1
1
1
1
-1
6
1
-1
1
-1
1
-1
-1
1
7
-1
1
1
-1
-1
1
-1
1
8
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
9
-1
-1
-1
1
1
1
-1
1
10
1
-1
-1
1
1
-1
1
-1
11
-1
1
-1
1
-1
1
1
-1
12
1
1
-1
1
-1
-1
-1
1
13
-1
-1
1
1
-1
-1
1
1
14
1
-1
1
1
-1
1
-1
-1
15
-1
1
1
1
1
-1
-1
-1
16
1
1
1
1
1
1
1
1
4.6 Otimizao das concentraes das fontes de nutrientes selecionadas

Essa etapa teve por objetivo otimizar a concentrao das fontes de nutrientes
selecionadas como descrito no item 4.5. Inicialmente foram feitos dois planejamentos fatoriais

38

incompletos 23-1, onde os nveis das variveis foram selecionados segundo dados da literatura.
Esses planejamentos fatoriais foram feitos em apenas um bloco com 9 experimentos, como
descrito na tabela 4.3..

Tabela 4.3 Planejamento fatorial fracionado 23-1

Sulfato Farinha
de
de
Experimentos Glicose amnia crislida
1
-1
-1
-1
2
-1
0
1
3
-1
1
0
4
0
-1
1
5
0
0
0
6
0
1
-1
7
1
-1
0
8
1
0
-1
9
1
1
1
Os nveis das variveis no primeiro e no segundo planejamento fatorial incompleto
encontram-se descritos nas tabelas 4.4 e 4.5, respectivamente. Esses nveis foram codificados
de acordo com a equao abaixo:
X codificado = Xi X0
X / 2
Onde:
X codificado: nvel codificado da varivel
Xi = valor real
X0 = valor no ponto central
X = valor real mximo valor real mnimo

39

Tabela 4.4 Nveis das variveis no primeiro planejamento fatorial incompleto da etapa de
otimizao das fontes de nutrientes

Variveis
Glicose (g/L)
Sulfato de
amnia (g/L)
Farinha de
Crislida (g/L)

Nvel (-1)
2,00

Nvel (0)
6

Nvel (+1)
10,00

2,00

6,00

10,00

30

50,00

Tabela 4.5 Nveis das variveis no segundo planejamento fatorial incompleto da etapa de
otimizao das fontes de nutrientes

Variveis
Glicose (g/L)
Sulfato de
amnia (g/L)
Farinha de
Crislida (g/L)

Nvel (-1)
0,5

Nvel (0)
1,25

Nvel (+1)
2,0

1,0

3,0

5,0

50,0

90,0

130,0

Aps o segundo planejamento fatorial incompleto, foram feitos 4 experimentos com


valores para as variveis prximos ao do experimento com melhor bioensaio obtido at ento.
Com isto, determinou-se o ponto central para o prximo planejamento. Com base nesses
resultados, foi feito um fatorial completo central rotacional (23), com uma repetio no ponto
central mais os pontos axiais (pontos estrelas). Os nveis das variveis utilizados nesse
planejamento fatorial completo encontram-se na tabela 4.6. Os 16 experimentos desse
planejamento fatorial completo central rotacional foram feitos em dois blocos, como descrito
na tabela 4.7.
As condies de cultivo dessa etapa de otimizao foram as mesmas descritas no item
4.3 em todos os experimentos o cultivo durou 72 horas.
A resposta analisada para a otimizao da concentrao das fontes de carbono,
nitrognio orgnico e inorgnico foi o bioensaio, como descrito no item 4.9.1. Alm dessa

40

resposta, estudou-se tambm o crescimento (UFC) e esporulao, como descrito nos itens
4.9.2 e 4.9.3 respectivamente.

Tabela 4.6 Nveis das variveis no planejamento fatorial completo (23) com repetio no
ponto central e pontos estrelas

Variveis
Glicose (g/L)
Sulfato de
amnia (g/L)
Farinha de
Crislida (g/L)

Nvel
(-1,79)

Nvel
(+1,79)

0,005

Nvel (-1)
0,25

Nvel (0)
0,5

Nvel (+1)
0,75

0,10

0,5

1,0

1,5

1,90

32,11

40

50

60

67,89

0,95

Tabela 4.7 Planejamento fatorial completo 23 com repetio no ponto central (experimentos 9
e 10) e pontos estrelas (experimentos 11 a 16)

Blocos
Experimentos
1
2
3
4
5
6
7
8
9 (C)
10 (C)
11
12
13
14
15
16

Glicose
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2

-1,00000
-1,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000

Sulfato de
Amnia
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
0,00000
0,00000

Farinha
de.
crislida
-1,00000
1,00000
-1,00000
1,00000
-1,00000
1,00000
-1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885

41

4.7 Estudo da cintica de crescimento e produo de toxinas

Aps a otimizao das fontes nutrientes, foi feito um estudo a fim de se verificar a
curva de crescimento de B. thuringiensis israelensis HD537 no meio desenvolvido, bem como
em qual das etapas de crescimento ocorre a maior produo de toxinas: Para isso, foram
inoculadas culturas com o meio de cultivo com as fontes otimizadas e mantidas como descrito
no item 4.3. Essas culturas foram mantidas por um perodo de 96 horas.
Em intervalos predeterminados, foram retiradas alquotas das culturas a fim de se
analisar seu crescimento, produo de toxinas e pH. Nessa etapa, o crescimento foi avaliado
por meio de gravimetria e turbidimetria, como descrito nos itens 4.9.4 e 4.9.5
respectivamente. A produo de toxinas foi avaliada por meio de bioensaio, como descrito no
item 4.9.1. O pH foi medido por meio de um aparelho potencimetro modelo Foram feitas
ainda, lminas para anlise microscpica, como descrito no item 4.9.6.
Esse experimento foi repetido por 3 vezes, sendo que todos os mtodos de anlise de
crescimento e medio de pH foram feitos em duplicata e o bioensaio foi feito em triplicata.

4.8 Toxicidade da cultura de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis durante


armazenamento

A toxicidade da cultura de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis HD537 foi


estudada por um perodo de 28 dias. Para isso, foram feitas quatro culturas com o meio
otimizado, as quais foram fermentadas sob as condies do item 4.3 por um perodo de 72
horas.
Aps o cultivo, duas culturas foram mantidas sob refrigerao em cmara fria a 5C
(+/-2C) e duas foram mantidas sob as condies ambientes, porm ao abrigo da luz. A cada 7
dias foram feitos bioensaio com clculo da CL50 para essas culturas.

42

4.9 Mtodos analticos

4.9.1 Bioensaio
Os bioensaios foram realizados no Laboratrio de Entomologia Mdica, do professor
Dr. Jos Lopes, do Centro de Cincias Biolgicas da Universidade Estadual de Londrina.
Estes testes foram feitos com base na metodologia da WHO 2005, com larvas entre terceiro e
quarto instar de A. aegypti (Linnaeus, 1762), as quais foram colocadas em recipientes
contendo 100 mL de gua destilada. Aps aplicao do produto, as larvas foram mantidas a
25C por um perodo de 24 horas, quando ento, procedeu-se a leitura do bioensaio quanto
mortalidade das mesmas. Em cada recipiente utilizado no bioensaio foram colocadas 20
larvas.
Na etapa de seleo das fontes de nutrientes, as culturas dos diferentes experimentos
foram diludas em gua destilada. Procedeu-se, ento, o bioensaio aplicando-se as culturas
diludas, de maneira que a concentrao final nos recipiente do bioensaio fosse de 10 ppm
(v/v). Essa concentrao foi escolhida, aps testes preliminares com diferentes concentraes.
Nas etapas de otimizao das fontes e estudo da cintica, o bioensaio foi feito como
descrito para a etapa de seleo de fontes, porm a concentrao final no recipiente do
bioensaio foi de 1 ppm (v/v).
Esses bioensaios foram expressos como porcentagem de morte das larvas e foram
feitos em triplicata.
Os bioensaios com o meio otimizado, bem como de pontos do estudo da cintica e da
etapa de verificao da toxicidade das culturas durante armazenamento foram expressos em
termos de CL50. Para isso, as culturas foram diludas; e 5 ou 6 concentraes diferentes foram
aplicadas em recipientes dos bioensaios. Ao final do teste, foi feita a quantificao de larvas
mortas em cada uma das concentraes. A CL 50 foi calculada por meio de anlise de regresso
linear do log-Probit, utilizando-se o programa de computador microprobit (FINNEY, 1971).
Esse bioensaio foi feito em triplicata.

4.9.2 Unidades formadoras de colnia (UFC)

43

A quantificao das unidades formadoras de colnia foi feita diluindo-se 1 mL da


cultura em frascos contendo 9 mL de soluo salina estril de cloreto de sdio (NaCl) a
0.85%. Aps diluies em srie em frascos contendo salina, 0,5 mL das amostras diludas
foram inoculadas por espalhamento superficial em placas contendo agar nutriente.
As placas foram mantidas a 30C por um perodo de 24 horas, quando ento se fez a
contagem das unidades formadoras de colnia. Foram desconsideradas as placas com mais de
300 UFC ou menos de 30 UFC. Considerando-se as diluies procedidas, fez-se o clculo das
unidades formadoras de colnia na cultura inicial. Essa anlise foi feita em triplicata e
expressa como logaritmo de UFC por mililitro de cultura.

4.9.3 Quantificao de esporos

Para a quantificao de esporos, os frascos de salina com cultura diluda, aps


utilizao na quantificao de UFC, foram mantidos a 80 C por 20 minutos. Aps esse
perodo, fez-se o espalhamento de 0,5 mL da cultura diluda como descrito para a
determinao de UFC. Essa anlise foi feita em triplicata e expressa como porcentagem de
esporulao, a qual foi calculada com base nos valores de UFC.

4.9.4 Biomassa seca (gravimetria)

Na etapa de estudo da cintica, a biomassa seca foi utilizada para verificar o


crescimento do microrganismo. Para isso, 4 mL da cultura foram centrifugados a 4500g, 5C
por 15 minutos. O sobrenadante foi utilizado para etapas posteriores e o precipitado foi
ressuspendido em 4mL soluo salina de cloreto de sdio (0,85%) e centrifugado novamente
em iguais condies.
O sobrenadante da segunda centrifugao foi desprezado e o precipitado
ressuspendido novamente em 4mL da soluo salina. Alquotas de 1mL foram transferidas
para cadinhos previamente tarados, os quais foram submetidos a 105 C at peso constante.

44

Essa anlise foi feita em duplicata e expressa como miligramas de biomassa por
mililitro da cultura. A fim de no se aferir como biomassa algum componente do meio de
cultura, esse foi submetido a centrifugaes, como descrito acima, e o valor de massa seca do
meio de cultura foi descontado do valor da biomassa seca dos experimentos.

4.9.5 Turbidimetria

Na etapa do estudo da cintica, o crescimento do microrganismo foi verificado


tambm por meio de teste de turbidimetria. Para isso, fez-se uma curva de calibrao de uma
cultura em meio Arcas adaptado relacionando absorbncia a 540 nm e biomassa seca
(mg/mL).
O segundo precipitado ressuspendido em salina do item 4.6.4, foi diludo em salina e
sua absorbncia lida em espectrofotmetro a 540 nm. Por meio da curva de calibrao,
calculou-se, ento, a concentrao da biomassa da cultura, expressa como miligramas de
biomassa por mililitros da cultura.
Essa anlise foi feita em duplicata. Como o meio de cultura poderia conter alguns
pigmentos que interferissem na anlise da absorbncia, foi feita uma leitura do sobrenadante
do meio de cultura (sem crescimento microbiano) centrifugado, e essa absorbncia foi
descontada do valor da absorbncia dos experimentos.

4.9.6 Lminas para anlise microscpica

A fim de acompanhar a morfologia das clulas durante o estudo da cintica, bem como
para averiguar se havia contaminao nos demais experimentos, foram feitas lminas para
anlise em microscpio ptico.
Para confeco das lminas, alquotas das culturas foram retiradas com auxlio de uma
ala de platina. Aps esfregao e fixao por calor as lminas foram coradas com amido black
(por 70 segundos), lavadas e coradas com fucsina (10 segundos). Essa colorao evidncia os
esporos e cristais de B. thuringiensis.

45

4.10 Anlise estatstica

Os planejamentos experimentais, montagem dos grficos de superfcie de resposta,


bem como os testes de anlise de varincia (ANOVA) foram feitos utilizando-se o programa
Statistic verso 6.0. Os demais grficos foram feitos com auxlio do programa Excel (verso
2003). A comparao entre as CL50 foi feita utilizando-se o teste de -Student.

46

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Seleo das fontes de nutrientes

Embora tenha sido estudado o crescimento e esporulao, a otimizao desse estudo


visou produo de toxinas, por isso, o bioensaio foi a resposta utilizada na escolha das
fontes e na etapa posterior. A tabela 5.1 apresenta os efeitos das diferentes fontes de nutrientes
testadas sobre o bioensaio.

Tabela 5.1 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (etapa de seleo das fontes). Em
vermelho, as variveis com efeito significativo (ANOVA, p<0,05).

Efeito
Variveis/Interaes
(1) Sacarose
(2) Glicose
(3) Fcula de mandioca
(4) Farinha de soja
(5) Farinha de crislida
(6)Peptona
bacteriolgica
(7) Uria agroindustrial
(8) Sulfato de amnia
Interao 1 e 5
Interao 1 e 8
Interao 2 e 5
Interao 2 e 8
Interao 5 e 8

Probabilidade Coeficiente.

0,517500
-0,070000
-0,035000
-0,440000
-0,535000
0,060000

0,000233
0,047421
0,157299
0,001289
0,000872
0,062957

0,517500
-0,035000
-0,017500
-0,220000
-0,267500
0,030000

0,045000

0,104467

0,022500

-0,455000
0,430000
-0,045000
0,035000
-0,010000
0,020000
-0,045000

0,001205
0,001349
0,104467
0,157299
0,591752
0,333333
0,104467

-0,227500
0,215000
-0,022500
0,017500
-0,005000
0,010000
-0,022500

Esse resultado apresentou um coeficiente de determinao (R) de 0,999 e um R


ajustado de 0,996. Isto indica que 99% dos resultados so explicados pelo efeito das variveis,
sendo, portanto bastante confivel.

47

Com exceo da glicose (a tabela indica um efeito negativo), as demais fontes de


carbono apresentaram um efeito negativo sobre o bioensaio. Embora a glicose no tenha
apresentado efeito positivo, seu resultado no foi significativo, sendo esta a escolhida como
fonte de carbono para as etapas posteriores.
Diferente dos trabalhos de Igen et al. (2002b) e skan et al. (2003), esses resultados
no apontam a sacarose como uma boa fonte para produo de toxinas, tendo em vista seu
efeito negativo para o bioensaio. O que ressalta a importncia de um estudo direcionado para
cada linhagem especfica, bem como para o resultado que se pretende otimizar.
Quanto ao crescimento, a anlise das Unidades Formadoras de Colnia (log UFC/mL)
demonstrou que a sacarose e a glicose no tiveram efeito significativo sobre o crescimento, j
a fcula de mandioca apresentou um efeito negativo. Isso provavelmente ocorreu, devido a
maior complexidade estrutural da fcula de mandioca frente s outras fontes, o que dificultou
a utilizao da mesma durante o crescimento microbiano. No trabalho de skan et al. (2003),
o amido, o qual possui estrutura semelhante fcula, apresentou um efeito negativo sobre o
crescimento de B. thuringiensis israelensis HD500, justificado por sua estrutura qumica
complexa. Muitos meios que utilizam materiais complexos, como guas residuais do
processamento de amido, fazem um pr-tratamento antes de utiliz-la no meio de cultivo
(YEZZA et al., 2006; CHANG et al., 2008). (Verficar a presena de enzimas amiloliticas em
Bacillus thuringiensis)
Dentre as fontes de nitrognio orgnico, apenas a uria agroindustrial apresentou
efeito significativo, porm negativo sobre o bioensaio. J a farinha de crislida e peptona no
apresentaram efeito sobre o bioensaio, sendo portanto necessrio escolher entre essas duas
fontes para as etapas de otimizao. Com o intuito de aproveitar resduos agroindustriais e
abaixar o custo da produo, foi escolhida para os testes posteriores a farinha de crislida.
O sulfato de amnia apresentou um efeito significativo e positivo sobre o bioensaio, o
que, portanto, indica sua importncia como fonte de nitrognio na produo da toxina,
resultado semelhante aos estudos de Igen et al. (2002a).
Em relao ao crescimento, dentre as fontes de nitrognio, apenas a peptona
apresentou um efeito significativo e positivo. Porm, como o objetivo principal era a
otimizao das toxinas, essa fonte no foi escolhida para as etapas posteriores.
Quanto esporulao, nenhuma das fontes de carbono ou nitrognio apresentou efeito
significativo sobre tal parmetro. A taxa de esporulao foi alta em todos os experimentos
dessa etapa, em mdia de 74,45%.

48

5.1 Otimizao das concentraes das fontes de nutrientes selecionadas

5.1.1 Planejamentos fatoriais incompletos

Aps a seleo da glicose, farinha de crislida e sulfato de amnio como fontes de


nutrientes, a concentrao dessas fontes no meio de cultivo foi otimizada visando a melhora
no bioensaio.
Inicialmente foi feito um planejamento fatorial incompleto, cujos resultados dos
efeitos encontram-se na tabela 5.2 e nos grfico 5.1 a 5.3.

Tabela 5.2 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (primeiro planejamento fatorial
incompleto otimizao das fontes). Em vermelho, as variveis com efeito significativo
(ANOVA, p<0,05). L representa o termo linear e Q o termo quadrtico.

Variveis.
Glicose (L)
Glicose (Q)
(2)Sulfato de
amnia(L)
Sulfato de
amnia(Q)
(3)Farinha de
crislida(L)
Farinha de
crislida(Q)

Efeito
Probabilidade Coeficiente.
9,55556
0,006958
9,55556
1,33333
0,566987
0,66667
-3,33333
0,188893
-1,66667
-0,66667

0,766450

-0,33333

3,66667

0,163685

1,83333

15,33333

0,015991

7,66667

-4,33333

0,125525

-2,16667

49

Grfico 5.1 Superfcie de resposta para variveis glicose e farinha de crislida, tendo como
resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto). O sulfato de amnio est
fixado no valor codificado central.

Grfico 5.2 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e farinha de crislida,
tendo como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto). A glicose est
fixado no valor codificado central.

50

Os resultados desse primeiro planejamento fatorial apresentaram um coeficiente de


determinao de 0,97, j o coeficiente ajustado foi de 0,90; sendo satisfatrio para estudos
biolgicos.
Entre as variveis testadas, a farinha de crislida apresentou o termo linear altamente
significativo e positivo, o que indica que esta fonte influenciou muito o bioensaio (na
realidade influencio a toxicidade do meio de cultura utilizado no bioensaio), porm ainda no
se encontra no seu ponto timo (termo quadrtico no significativo). Observando os grficos
5.1 e 5.2, v-se que a regio de timo, representado em vermelho, est no sentido de aumento
da concentrao da farinha de crislida. Por isso, para o segundo planejamento incompleto, os
valores para a concentrao de farinha de crislida foram calculados a partir do ponto mximo
(+1) do primeiro planejamento, ou seja, houve um aumento na concentrao dessa fonte.

Grfico 5.3 Superfcie de resposta (3 dimenses) para variveis sulfato de amnia e glicose,
tendo como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto). A farinha de
crislida est fixada no valor codificado +1.

51

Em relao glicose e ao sulfato de amnio, nenhum dos dois apresentou o termo


quadrtico ou linear significativo sobre o bioensaio. No entanto, os valores dessas variveis
no foram fixados por esse experimento, por ele ser um fatorial incompleto, ou seja, poderia
haver interaes e efeitos significativos futuros.
Observando-se os grfico 5.3 e 5.4, v-se que h dois pontos em direo ao timo para
essas duas variveis, resultando em um grfico com formato de cela. Como a produo visa
a melhora da resposta, conjuntamente com a diminuio dos custos, a otimizao dessas duas
variveis prosseguiu no sentido de menor valor, ou seja, a glicose em torno dos valor
codificados -1,37 a -1,0; j o sulfato de amnia em torno dos valores codificados -1,5 e a 0,5.

1,2
1,0
0,8

Glicose (valor codificado)

0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
-1,0
-1,2

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

24
22
20
18
16
14

Sulfato de amnia (valor codificado)

Grfico 5.4 Superfcie de resposta (plana) para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo
como resposta o bioensaio (primeiro planejamento fatorial incompleto). A farinha de crislida
est fixada no valor codificado +1.
Portanto, para o segundo experimento os valores da concentrao da farinha de
crislida foram aumentados, j os concentraes de glicose e sulfato de amnia diminuram,
como apresentado na tabela 4.5.
Os resultados com os efeitos das variveis no segundo planejamento fatorial
incompleto encontram-se na tabela 5.3.

52

Tabela 5.3 Efeito das fontes testadas sobre o bioensaio (segundo planejamento fatorial
incompleto otimizao das fontes). Em vermelho, as variveis com efeito
significativo (ANOVA, p<0,05). L representa o termo linear e Q o termo
quadrtico.

Variveis.
Glicose (L)
Glicose (Q)
Sulfato de amnia(L)
Sulfato de amnia(Q)
Farinha de
crislida(L)
Farinha de
crislida(Q)

Efeitos
19,7778
-19,3333
-13,6667
-14,6667
-6,6667

Probabilidade
Coeficiente.
0,000012
19,7778
0,012189
-9,6667
0,032552
-6,8333
0,044148
-7,3333
0,258147
-3,3333

-32,0000

0,000431

-16,0000

3,3333

0,563070

1,6667

Os resultados desse segundo planejamento fatorial apresentaram um coeficiente de


determinao de 0,81, sendo satisfatrio para estudos biolgicos.
Observando-se os efeitos das variveis percebe-se que o sulfato de amnia e a farinha
de crislida apresentaram efeito quadrtico no significativo, o que indica que essas fontes
ainda no se encontram em seu ponto timo. Essas variveis apresentaram o termo linear
significativo e negativo, o que indica que para alcanar seu nvel timo, a concentrao dessas
variveis deve diminuir.
Em relao glicose, tanto o termo linear como o quadrtico foram significativos, o
que pode indicar uma interao com outra varivel ou dois destinos de otimizao, o aumento
ou diminuio de sua concentrao, o que levaria a formao do chamado ponto de cela.
Os grficos 5.5 a 5.7 ilustram o efeito das variveis sobre o bioensaio, no segundo
planejamento fatorial incompleto.
Embora nessa etapa as variveis ainda no se encontrem no seu nvel timo, j houve
uma melhoria na resposta; pois o maior valor do bioensaio melhorou de 24% no primeiro
planejamento incompleto para 60% de morte das larvas no segundo planejamento fatorial
incompleto. Esses valores referem-se previso da resposta segundo o modelo, os valores
reais para tal resposta foram de 22 e 68% de mortes no primeiro e segundo planejamento,
respectivamente.

53

Grfico 5.5 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto). A farinha de crislida est
fixada no valor codificado -1.

Grfico

5.6

Superfcie

de

resposta
variveis
de

para
sulfato

amnia

farinha
crislida,

e
de

tendo

como resposta o
bioensaio
(segundo
planejamento fatorial incompleto). A glicose est fixada no valor codificado -1.

54

Grfico 5.7 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (segundo planejamento fatorial incompleto). O sulfato de amnia est
fixado no valor codificado -1.
Tendo em vista os efeitos das variveis sobre o bioensaio, a otimizao prosseguiu
mapeando a regio prxima ao ponto mnimo (-1) do segundo planejamento fatorial
incompleto. Nesse ponto, as variveis apresentavam os seguintes valores (g/L): 0,5 de glicose,
1,0 de sulfato de amnia e 50 de farinha de crislida.
Com o objetivo de verificar se o ponto mnimo (-1) do segundo experimento deveria
ser mesmo o ponto central em um planejamento fatorial completo, foram feitos trs ensaios
(A, B e C) com valores prximos a esse ponto mnimo. Os valores das variveis nesses trs
ensaios bem como o resultado do bioensaio encontram-se na tabela 5.4.
Tabela 5.4 Ensaios para confirmao do ponto central (g/L): 0,5 de glicose, 1,0 de sulfato de
amnia e 50 de farinha de crislida. Valor das variveis e bioensaio.
Ensaios

Glicose

Sulfato de

Farinha de

Bioensaio (% de

(g/L)
0,9

amnia (g/L)
1,8

crislida (g/L)
66

morte das larvas)


50

B
C

0,7
0,3

1,4
0,6

58
42

46
38

55

Tendo em vista que nenhum dos ensaios resultou em um bioensaio melhor do que do
ponto mnimo (-1) do segundo planejamento fatorial incompleto, esse ponto foi utilizado
como central no planejamento completo.

5.1.2 Planejamento fatorial completo

O planejamento fatorial completo apresenta melhor resoluo, permitindo o estudo das


interaes entre as variveis, j que todos os experimentos possveis so realizados. Nessa
etapa, esse planejamento mapeou a regio prxima ao ponto central (g/L): 0,5 de glicose,
1,0 de sulfato de amnia e 50 de farinha de crislida. Os nveis das variveis no planejamento
fatorial completo encontram-se na tabela 4.7.
Inicialmente foram feitos os experimentos do bloco 1, porm analisando-se os
resultados verificou-se que o modelo linear no explicava adequadamente essa fermentao,
por isso, fez-se um segundo bloco incluindo os pontos estrelas. Esses pontos correspondem ao
planejamento inicial, porm com uma rotao de 45 em relao ao ponto de partida. Dessa
maneira, possvel estabelecer um modelo quadrtico (equao de segundo grau) para o
processo em estudo.
Alm dos pontos estrelas, o planejamento fatorial completo apresentou uma repetio
no ponto central, a qual permite a estimativa do erro puro, ou seja, o que inerente ao
processo. Esse planejamento tambm conhecido como Delineamento Composto Central
Rotacional (RODRIGUES & IEMMA, 2005).
Os resultados (bioensaio, UFC e porcentagem de esporulao) desse planejamento
fatorial completo, incluindo os pontos estrelas, encontram-se na tabela 5.4. Os resultados da
anlise de varincia e dos efeitos para a resposta bioensaio encontram-se nas tabelas 5.5 e 5.6
respectivamente.

56

Tabela 5.5 Respostas do Delineamento Composto Central Rotacional (planejamento fatorial


completo, com repetio no ponto central e pontos estrelas).

Bloco
Ensaio
1
2
3
4
5
6
7
8
9 (C)
10 (C)
11
12
13
14
15
16

Glicose
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2

Sulfato de
Amnia

-1,00000
-1,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000

-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
-1,00000
-1,00000
1,00000
1,00000
0,00000
0,00000
0,00000
0,00000
-1,78885
1,78885
0,00000
0,00000

Farinha Bioensaio log UFC


%
de.
(% morte)
esporulao
crislida
-1,00000
33,33
12,602
92,39
1,00000
53,33
13,978
93,65
-1,00000
6,67
14,544
78,12
1,00000
20,00
14,431
81,95
-1,00000
0,00
16,17
80,52
1,00000
53,33
16,057
69,08
-1,00000
26,67
17,732
67,19
1,00000
33,33
15,903
74,78
0,00000
66,67
15,819
79,98
0,00000
60,00
15,924
83,33
0,00000
22,50
14,851
84,2
0,00000
5,00
14,505
85,35
0,00000
12,50
14,851
86,18
0,00000
10,00
16,158
81,34
-1,78885
7,50
15,556
83,504
1,78885
10,00
15,982
79,34

Tabela 5.6 Anlise de varincia (p<0,05) para a resposta bioensaio do delineamento composto
central rotacional. Em vermelho, as variveis com efeito significativo (ANOVA,
p<0,05). L representa o termo linear e Q o termo quadrtico.

Blocos
Glicose (L)
Glicose (Q)
Sulfato de amnia(L)
Sulfato de amnia(Q)
Farinha de crislida(L)
Farinha de crislida(Q)
Interao glicose X sulfato
(L)
Interao glicose X far. De
crislida (L)
Interao sulfato X farinha
de crislida (L)
Erro puro
Total

Soma dos Graus de


quadrados liberdade
699,213
1
68,056
1
1161,907
1
231,940
1
1334,659
1
664,118
1
1519,379
1

Quadrado
mdio
699,213
68,056
1161,907
231,940
1334,659
664,118
1519,379

F
Probabilidade
calculado
4,058296
0,100067
0,395000
0,557271
6,743809
0,048432
1,346198
0,298329
7,746478
0,038753
3,854601
0,106834
8,818610
0,031171

555,444

555,444 3,223849

0,132522

88,844

88,844 0,515661

0,504843

355,644

355,644 2,064192

0,210292

861,462
7540,666

5
15

172,292

O erro puro no foi significativo, bem como a variao referente aos blocos, portanto
os fatores que mais influenciaram a resposta foram a concentrao das fontes de nutrientes.

57

Nessa etapa, todas as fontes apresentaram apenas o termo quadrtico significativo, o que
indica que as mesmas j alcanaram seu timo de concentrao para a resposta bioensaio.
Os grficos 5.8 a 5.10 representam a superfcie de resposta para o delineamento
composto central rotacional. Observa-se que a zona em vermelho escura, correspondente a
maior taxa de morte no bioensaio, encontra-se no centro do grfico, ou seja, todo o seu
entorno foi mapeado. Isso significa que para alcanar os melhores resultados de bioensaio
pode-se trabalhar em intervalos de concentrao das fontes que correspondem a tal rea e, no
necessariamente com um nico valor fixo de concentrao; o que facilita o controle da
fermentao. Para o sulfato de amnia, a faixa de variao da regio de timo est entre (g/L)
0,6 a 1,1; j para a glicose de 0,3 a 0,55g/L, enquanto que para a farinha de crislida tal
faixa encontra-se entre 55 a 58g/L.

Grfico 5.8 Superfcie de resposta para variveis sulfato de amnia e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional). A farinha de crislida est
fixada no valor ponto central.

58

Grfico 5.9 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e glicose, tendo como
resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional). O sulfato de amnia
encontra-se fixado no valor ponto central.

Grfico 5.10 Superfcie de resposta para variveis farinha de crislida e sulfato de amnia,
tendo como resposta o bioensaio (delineamento composto central rotacional). A glicose
encontra-se fixada no valor ponto central.

59

Tabela 5.7 Efeito das fontes de nutrientes sobre o bioensaio (delineamento composto central
rotacional). Em vermelho, as variveis com efeito significativo (ANOVA,
p<0,05). L representa o termo linear e Q o termo quadrtico.

Principal/interaes
Blocos
Glicose (L)
Glicose (Q)
Sulfato de amnia(L)
Sulfato de amnia(Q)
Farinha de crislida(L)
Farinha de crislida(Q)
Interao glicose e sulf. de
amnia (L)
Interao glicose e far. de
crislida (L)L
Interao sulf. de amnia
e far. de crislida (L)

Efeito
Probabilidade Coeficiente
55,9605
0,002818
55,9605
-14,7490
0,100067
-7,3745
-4,3479
0,557271
-2,1740
-21,7725
0,048432
-10,8863
-8,0267
0,298329
-4,0133
-23,3350
0,038753
-11,6675
13,5822
0,106834
6,7911
-24,8975
0,031171
-12,4488
16,6650

0,132522

8,3325

6,6650

0,504843

3,3325

-13,3350

0,210292

-6,6675

A tabela 5.6 apresenta o efeito das fontes de nutrientes sobre o bioensaio.


Considerando-se apenas os efeitos significativos e o coeficiente, pode-se construir a equao
quadrtica a seguir que explique o efeito das fontes sobre o bioensaio:
Y= 55,96 10,89 A2 -11,67 B2 12,45 C2
Onde:
Y= valor do bioensaio em porcentagem de morte
A= concentrao da glicose (valor codificado)
B= concentrao do sulfato de amnia (valor codificado)
C= concentrao da farinha de crislida (valor codificado)
Com base na equao que representa o processo, foi possvel prever os valores de
bioensaio para diferentes valores das fontes de nutrientes. O grfico 5.10 relaciona os valores
previstos com os valores observados nos bioensaios; observa-se que houve uma correlao
considervel entre esses valores. O coeficiente de determinao desse delineamento (R) foi de
0,88; o que indica que 88% da variao explicada pelo modelo.

60

080
070
060

Valores previstos

050
040
030
020
010
00
-010
-020
-10

10

20

30

40

50

60

70

80

Valores observados

Grfico 5.11 Valores observados e previstos para o bioensaio (% de morte).


A tabela 5.8 apresenta algumas combinaes de valores das variveis bem como o
bioensaio previsto. Observa-se que h uma ampla faixa onde a variao do bioensaio
mnima. O valor mximo previsto pelo modelo foi de 56,82%, no entanto, o valor mximo de
morte das larvas observado nos ensaios desta etapa foi de 66,67%. Mesmo nos grficos que
representam a superfcie de resposta, a zona de maior morte no bioensaio corresponde a cerca
de 40%. Essas diferenas entre os valores mximos esperados e previstos justificam-se pelo
ajuste que o modelo matemtico deve apresentar para que a maior parte dos dados seja
explicada por ele.
Tabela 5.8 Valores previstos para o bionsaio em diferentes concentraes das fontes de
nutrientes.

Previso
Glicose
(bioensaio)
(codificado)
55,9605
0
55,08828
-0,4
50,73246
-0,8
56,2965
0
54,16821
0
56,8208
0
56,6851
0
55,55362
0

Glicose
(real)
0,5 g/L
0,4
0,3
0,5 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L

Sulfato
(codificado)
0
0
0
-0,2
-0,6
0
0
0

Sulfato
(real)
1 g/L
1 g/L
1 g/L
0,9
0,7
1 g/L
1 g/L
1 g/L

Farinha
Farinha
(codificado) (real)
0
50 g/L
0
50 g/L
0
50 g/L
0
50 g/L
0
50 g/L
0,2
52
0,4
54
0,6
56

61

Em relao ao crescimento e esporulao, as concentraes testadas no apresentaram


efeitos significativos para tais parmetros. No entanto, na regio de timo para bioensaio o
log mdio de UFC foi de 15,87 j a esporulao mdia foi de 81,65%, o que indica um bom
crescimento e esporulao.
Embora em um estudo de superfcie de resposta o timo encontre-se em uma faixa e
no em um valor fixo das variveis, para os experimentos seguintes foi adotado o valor das
variveis no ponto mximo previsto de bioensaio. Esse ponto corresponde aos seguintes
valores das variveis (g/L): 0,5 de glicose; 1,0 de sulfato de amnia e 52 de farinha de
crislida. Alm das fontes de carbono e de nitrognio orgnico e inorgnico, o meio de cultura
otimizado continha a mistura de sais, citadas no item 4.5, a qual no foi objeto de estudo.
Muitos autores relatam o efeito repressor da glicose sobre a produo de toxinas por
B. thuringiensis; porm, esse fato no se observou nesse estudo, provavelmente porque a
concentrao de glicose utilizada foi baixa (0,5g/L), quando comparada com a dos estudos
que observaram a represso (em mdia 1,0g/L) (SKAN et al.; 2003). Nas etapas iniciais da
otimizao, quando a concentrao de glicose era alta (entre 1,25 a 10g/L), os resultados do
bioensaio foram bem baixos, em torno de 12% de morte das larvas. Possivelmente, nessa
etapa a glicose estaria reprimindo a produo de toxina.
Assim como nos trabalhos de Igen et al. (2002b), o sulfato de amnia mostrou-se
uma boa fonte de nitrognio orgnico para a produo de toxinas por B. thuringiensis. A
concentrao tima dessa fonte (1,0g/L) foi metade do que geralmente se costuma utilizar na
indstria, o que leva a um barateamento da produo (COUCH, 2000).
Logo no incio da descoberta de B. thuringiensis, em 1902, ele foi isolado a partir de
larvas infectadas de Bombix mori. Desde ento, j se sabia que essa bactria era capaz de se
desenvolver em tal meio (BRAR et al., 2006; CAPALBO et al., 2004; VIDAURRE, 1996).
Os bons resultados obtidos com o meio a base de farinha de crislida confirmam esse fato.
Alm disso, o fato desse meio ter alcanado resultados promissores refora que o nicho de B.
thuringiensis o prprio inseto, onde ocorrem suas interaes genticas e seu metabolismo
estaria mais adaptado (RAYMOND et al., 2008; VILAS-BAS et al., 2000).
A farinha de crislida apresenta uma composio bastante rica, destacando
principalmente como fonte de protenas e aminocidos, portanto de nitrognio orgnico. O
anexo 2 apresenta uma tabela com a constituio dessa farinha, essas anlises foram feitas
pelo laboratrio Labtec (Campinas) e, gentilmente cedida pelo professor Amarildo Passini
(Departamento de Agronomia, UEL). Embora apresente os minerais potssio, magnsio,
zinco, ferro e cobalto; a concentrao desses baixa. Portanto, ainda h necessidade de

62

suplementao mineral. Alves et al. (1997) estudou vrios ingredientes alternativos para o
crescimento de B. thuringiensis kurstaki, a farinha de crislida foi o mais promissor. Nesse
estudo, a concentrao utilizada foi de 10g/L dessa farinha alm de suplementao com sais e
fonte de carbono.
A CL50 mdia do meio otimizado foi de 0,703 ppm (v/v). Esse resultado foi comparado
com o bioensaio de cultura feita em meio Arcas adaptado (ANDRADE,

2005), cuja CL 50

mdia foi de 3,01 ppm (v/v). Esses valores diferiram estatisticamente, sendo que o meio
base de crislida apresenta uma toxicidade cerca de 4,3 vezes maior do que o meio Arcas
adaptado. (No entendi)
A tabela 5.9 apresenta os custos referentes matria-prima para produo de 1 L de
meio a base de farinha de crislida otimizado e do meio Arcas adaptado.

Tabela 5.9 Custos dos meios de cultivo: Arcas adaptado e Farinha de crislidas otimizado.

Custos/Meios

Meio Arcas

Meio farinha de

adaptado

crislida otimizado

Mistura de sais
Extrato de levedura
Glicose
Farinha de crislida
Sulfato de amnia
Custo total (1L)
Fonte: ??????????????? Cotao feita em ?????????????
Alm do meio otimizado apresentar um menor custo, sua toxicidade maior, o que
permite que ele seja diludo cerca de 4x mais do que o meio Arcas adaptado. Dessa maneira,
com 1L do meio crislida otimizado possvel obter 4L de meio com igual toxicidade do
meio Arcas adaptado; o que resulta em um custo real do meio otimizado cerca de ???%
menor.

63

5.3 Cintica de crescimento e produo de toxinas

O estudo da cintica de crescimento de B. thuringiensis israelensis foi feito com o


objetivo de verificar em qual etapa a toxicidade da cultura era mxima e, com isso determinar
o tempo de fermentao. Segundo Couch (2000), as fermentaes industriais de bactrias
entomopatognicas duram de 62 a 92 horas. Nesse estudo, a cultura foi monitorada por um
perodo de 96 horas
O crescimento microbiano foi mensurado por meio de gravimetria e turbidimetria.
Esses dois mtodos apresentaram uma correlao de 0,93; como apresentado no grfico 5.12.
No entanto, a metodologia de gravimetria apresentou um desvio padro menor (2,04) em
relao turbidimetria (6,5) e, por isso, foi utilizada no estudo da cintica.

Grfico 5.12 Correlao entre a biomassa (mg/mL) mensuradas pelas metodologias de


gravimetria e turbidimetria.

O grfico 5.13 apresenta o crescimento microbiano e a toxicidade, mesurada por meio


de bioensaio, durante as 96 horas de cultivo.

64

Grfico 5.13 Crescimento microbiano (biomassa) e toxicidade (bioensaio) ao longo do


cultivo (96 horas).

A fase de adaptao s condies de cultivo (lag) durou cerca de 6 horas; ou seja


apenas 6,25% do tempo de cultivo. A fase exponencial, a qual apresenta a maior taxa de
crescimento, correspondeu a cerca de 72,92% do tempo de cultivo; ao final da qual a
biomassa correspondia a 15,13mg/mL. No possvel identificar a fase de declnio de uma
cultura microbiana por meio da metodologia de gravimetria, visto que essa mensura a
biomassa total, incluindo clulas vivas e mortas (REFERNCIA, ANO). Por isso, o tempo
restante da cultura foi considerado como fases estacionria e de declnio, a qual durou cerca
de 20,83% do tempo de cultivo.
A esporulao uma forma de a bactria sobreviver a situaes adversas, visto que os
esporos so mais resistentes. Em geral, a esporulao ocorre na fase estacionria, quando a
bactria j consumiu grande parte das fontes de nutrientes e esse fator passa a ser uma
limitante para o seu crescimento. Alm disso, durante a fermentao, o microrganismo pode
produzir metablitos que, com o acmulo, acaba por inibir seu prprio crescimento
(REFERNCIA, ANO).
A maior parte das toxinas de B. thuringiensis sintetizada durante a esporulao,
portanto, diferente de muitos cultivos, a fase estacionria bastante importante na
fermentao dessa bactria. (LERECLUS et al., 1993; GLARE & OCALLAGHAN, 2000).
Observando-se o grfico 5.13, percebe-se que a toxicidade da cultura foi aumentando

65

gradativamente, alcanando o melhor resultado por volta de 96 horas de cultivo, ou seja, j no


perodo estacionrio.
A fim de se verificar com maior preciso qual o momento de maior toxicidade, foram
feitos bioensaios com clculo de CL50 para a cultura com 72 horas e com 96 horas. O tempo
de 72 horas foi escolhido por ter sido o adotado nas etapas anteriores. A cultura com 96 horas
de cultivo apresentou uma CL50 mdia de 0,50; a qual foi significativamente menor do que a
cultura com 72 horas, a qual apresentou CL50 mdia de 0,70.
A figura 5.1 apresenta fotomicroscopia da cultura de B. thuringiensis israelensis em
diferentes momentos de cultivo.

Figura 5.1. Cultura de B. thuringiensis israelensis em diferentes momentos de cultivo.


Aumento de 1000 vezes. Colorao: Amido-Black e Fucsina. Seta verde: clulas vegetativas.
Seta azul clara: clulas em final de esporulao. Seta azul escura: cristais. Seta vermelha:
esporos.

Analisando-se as fotomicroscopia, percebe-se que inicialmente predominavam clulas


vegetativas (6 horas). J com 32 horas de cultivo, a maior parte das lminas apresentava
clulas j em esporulao inicial, com esporos e cristais no seu interior. s 56 horas foi
possvel observar uma grande quantidade de esporos e cristais de toxina j no exterior da

66

clula, porm ainda era evidente uma grande quantidade de clulas em esporulao. A cultura
com 72 horas de cultivo apresentava praticamente apenas esporos e cristais fora das clulas,
com poucas clulas em final de esporulao. s 96 horas de cultivo, foi possvel observar
uma grande quantidade de cristais e esporos fora da clula, porm havia clulas vegetativas.
Provavelmente, s 96 horas de cultivo alguns esporos produzidos durante o cultivo
germinaram, resultando novamente em algumas clulas vegetativas.
Pela anlise da toxicidade observa-se que o perodo de 96 horas seria o indicado para o
cultivo, porm, analisando-se as lminas percebe-se que nesse momento alguns esporos j
estariam germinando. A maior toxicidade do perodo de 96 horas provavelmente ocorreu
porque a grande maioria das clulas da fase de crescimento j havia liberado seus cristais, ao
passo que com 72 horas algumas clulas, ainda que poucas, apresentavam-se no final de
esporulao. Uma alternativa para essa questo seria manter fermentar a cultura por 72 horas
e, posteriormente mant-la em repouso por 24 horas, para que as clulas em final de
esporulao liberem suas toxinas. Dessa maneira, o tempo de cultivo no se estenderia muito,
no resultando em custo extra para a produo. MORAES et al.(2001) relatam essa estratgia
para alguns cultivos de B. thuringiensis.

Grfico 5.14 Potencial hidrogeninico (pH) ao longo do (96 horas).

67

O grfico 5.14 apresenta os valores do potencial hidrogeninico (pH) ao longo do cultivo


de 96 horas. Em geral, a cultura de B. thuringiensis, quando no h controle de pH, esse inicia
em torno de 7.0, diminui para cerca de 6,0, no incio da esporulao. Ao final da esporulao
e com a lise celular o pH sobe para valores neutros e at bsicos como 8.9 (ABDELHAMEED, 2001; LUNA et al., 2004).
Nesse estudo, no se observou a queda inicial que, geralmente ocorre durante o incio do
cultivo de B. thuringiensis. Provavelmente, isso ocorreu porque a concentrao de glicose no
meio era baixa (0,5g/L), o que resultou em menor produo de cidos orgnicos responsveis
pela queda inicial do pH (CHANG, et al., 2008). Alm disso, os sais dihidrogenofosfato de
potssio (KH2PO4) e fosfato de potssio dibsico anidro (K2HPO4) presentes no meio
provavelmente tamponaram essa leve diminuio inicial. Posteriormente, o pH aumentou para
cerca de 8,0 e manteve-se.
Os estudos de skan et al. (2003) sugerem o pH 7.0 com variao de 0.3 como melhor
para o crescimento e a produo de toxinas por B. thuringiensis. Isso porque, algumas
protenas Cry, principalmente Cry4Ba, mostram-se mais sensveis a variaes de pH, com
comprometimento pronunciado nos casos de alcalinizao. J os estudos de Igen et al.
(2002a) indicam uma melhor produo com pH entre 5,5 e 6,5. Outros estudos indicam que
no h uma alterao significativa na produo de toxinas quando o pH do meio varia entre
6,5 a 8,0 (HOLMBERG, R, et al. apud. IGEN et al. 2002a).
No presente estudo, a produo de toxinas foi satisfatria, embora tenha ocorrido
variao de pH entre 6,4 e 8,2. Para uma preciso maior quanto a influncia do pH na
produo de toxinas, esse deveria ter sido foco de estudo.

68

5.4 Toxicidade da cultura de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis durante


armazenamento

O grfico 5.15 apresenta a toxicidade da cultura de B. thuringiensis israelensis,


avaliada por meio de bioensaio com clculo CL50, por um perodo de 28 dias de
armazenamento.

Grfico 5.15 Toxicidade da cultura durante o armazenamento.

Inicialmente o comportamento das duas culturas armazenadas foi igual, com


diminuio da toxicidade para cerca de 1,0 ppm (v/v). No entanto, com 21 e 28 dias de
armazenamento, a cultura no refrigerada apresentou quedas na CL50, chegando a 0,43 ppm
(v/v). J a cultura refrigerada continuou a apresentar um aumento da CL 50 at 21 dias de
armazenamento e, posteriormente, manteve-se em cerca de 1,20 ppm (v/v).
Geralmente, os estudos sobre armazenamento de B. thuringiensis apresentam dados
apenas de produtos formulados (ARAJO et al., 2008), no entanto, dados sobre o
armazenamento da cultura so importantes, pois servem para se comparar com o do produto
formulado e, assim, estabelecer a eficcia da formulao.

69

Glare & OCallaghan, 2000 relatam que os principais fatores que influenciam a
toxicidade de B. thuringiensis no meio ambiente so a radiao solar e temperatura. Couch
(2000) afirma que logo aps a fermentao, interessante manter a cultura a 4C por algumas
horas, para que ocorra a completa lise celular.
Nesse estudo, a melhor condio de armazenamento foi sem refrigerao.
Provavelmente, a baixa temperatura (5C +/-2) por um perodo prolongado de tempo foi
prejudicial para as toxinas, resultando em uma menor toxicidade. J temperatura ambiente,
pode ter possibilitado a lise de praticamente todas as clulas, e posterior germinao de
esporos tardios, resultando em uma melhor toxicidade. Esse resultado refora a eficcia de se
deixar a cultura em repouso aps sua fermentao, antes de formul-la (MORAES et al.,
2001).

70

6. CONSIDERAES FINAIS (Concluses?)

Entre as fontes de nitrognio estudas (farinha de crislida, peptona bacteriolgica,


uria agroindustrial e sulfato de amnia), a farinha de crislida e o sulfato de amnia foram os
mais adequados para produo de toxinas por B. thuringiensis israelensis HD537.
Entre as fontes de carbono estudadas (sacarose, glicose e fcula de mandioca), a
glicose apresentou-se a mais adequada para produo de toxinas.
A metodologia de superfcie de resposta mostrou-se eficaz na otimizao do meio de
cultivo, resultando em um meio com as seguintes faixas de concentraes das fontes de
carbono e nitrognio: glicose 0,3 a 0,55g/L; farinha de crislida 55 a 58g/L e sulfato de
amnia 0,6 a 1,1g/L..
A otimizao do meio alternativo base de farinha de crislida resultou em um meio
com CL50 de 0,703 ppm (v/v). Esse meio apresentou um custo ??? vezes menor do que o meio
de cultivo Arcas adaptado.
As maiores toxicidades da cultura de B. thuringiensis israelensis HD537 ocorreram
nas etapas finais de cultivo, sendo mxima em 96 horas.
O armazenamento da cultura de B. thuringiensis israelensis HD537 em condies no
refrigerada foi a mais adequada para manuteno de sua toxicidade por um perodo de 28
dias.
Indicam-se estudos posteriores com utilizao da superfcie de resposta para otimizar
as condies fsicas de cultivo (pH, temperatura e aerao), visto que essas no foram objeto
de estudo.
Para uma melhoria maior da produo de B. thuringiensis israelensis HD537 indica-se
o estudo do aumento de escala e a de sua formulao.

71

7.REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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acetate on delta- endotoxin production by Bacillus thuringiensis subsp kurstaki. Journal of
industrial microbiology e biotechnology. v.23, p.497-502. 1999.
ZOUARI, N.; JAOUA, S. The effect of complex carbon, and nitrogen, salt, Tween-80 and
acetate on delta- endotoxin production by Bacillus thuringiensis subsp kurstaki. Journal of
industrial microbiology e biotechnology. v.23, p.497-502. 1999.

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ANEXO 1:Processo de produo de farinha de crislida pela indstria de fiao de seda


Bratac s.a.

A matria prima (casulos contendo as crislidas do bicho da seda), aps passarem pelo
processo industrial de fiao automtico e fiao semi-automtico, so transportados atravs
de canaletas para o setor de Sub-produtos, onde segue por meio de esteiras para a mquina
estopadeira. Essa mquina faz a separao das crislidas dos resduos de seda.
A mquina estopadeira dividida em esteira de entrada, tanque de banho com soda
custica e vapor e dois tanques de enxge com gua limpa.
Na esteira de entrada, um funcionrio responsvel pela separao dos casulos que
ainda podem ser reutilizados no setor de fiao automtico e semi-automtico, o restante do
processo todo automatizado.
As crislidas seguem para os tanques de banho com soluo de soda custica e vapor,
por meio de esteiras. Esse processo tem por objetivo retirar os resduos de seda.
Aps a passagem pela soluo de soda custica, as crislidas seguem em esteira direto
para o depsito da centrfuga, e em seguida, para a centrfuga. Aps centrifugar, seguem em
esteira para o secador de crislidas.
No secador, as crislidas permanecem por 1 hora, sendo a temperatura de 130C no
primeiro compartimento e 118C no segundo compartimento. Aps a secagem, as crislidas
so encaminhadas para o resfriador, onde sero resfriadas pelo processo de exausto.
Aps a secagem e resfriamento, as crislidas seguem para a mesa de classificao.
Nesse estgio de produo, feito o exame da umidade das crislidas. So realizadas duas
amostras de locais diferentes na peneira rotativa e duas amostras dos sacos embalados,
totalizando quatro amostras por turno, para monitorao da umidade para evitar possveis
falhas,
As crislidas secas seguem para o silo de armazenamento ou moinho.
No silo de armazenamento, as crislidas secas permanecem at o momento da
embalagem como Crislidas Integrais, ou seguem para o moinho, onde so trituradas e
embaladas como Farinha de crislida, de acordo com o pedido do cliente.

Fonte: Manual de Boas Prticas de Fabricao da empresa Fiao de seda BRATAC s.a.

77

ANEXO 2: Anlise da constituio qumica de farinha de crislida.


RELATRIO DE ANLISES
LABORATRIO CENTRAL LABTEC
FONE: (19) 227-9994 ou 729-4441
Rua das Magnlias, 2405
Jd Bandeirantes -CEP: 13050-070
Campinas -SP Fax: (19)729-4443
e-mail: labtec@guabi.com.br
Data da anlise: 15/04/2003
Anlise
Protena Bruta (%)
Extrato Etereo (%)
Clcio (%)
Fsforo total (%)
Alanina (%)
Arginina (%)
cido Aspartico (%)
Glicina (%)
Isoleucina (%)
Leucina (%)
cido Glutmico (%)
Lisina (%)
Cistina (%)
Metionina (%)
Fenilalanina (%)
Tirosina (%)
Treonina (%)
Triptofano (%)
Prolina (%)
Valina (%)
Histidina (%)
Serina (%)
Potssio (Mg/Kg)
Magnsio (Mg/Kg)
Mangans (Mg/Kg)
Zinco (Mg/Kg)
Ferro (Mg/Kg)
Cobre (Mg/Kg)
Cobalto (Mg/Kg)

Resultado
52.6600
27.1700
0.1100
0.6900
2.8214
2.7279
5.8778
2.3481
2.1805
3.7528
6.7585
3.4737
0.6224
1.6891
2.6662
2.9083
2.6158
0.6702
2.6552
2.8380
1.5121
2.6524
7643.0900
3266.7500
no detectado
162.290
89.1100
14.6500
8.5000

78