UNIVERSIDAD DE COLIMA

MAESTRA EN CIENCIAS: REA BlOTECNOLOGiA

CARACTERlZACIN

ENZIMTICA

DE AISLADOS DE BEAUVERIA bassiana

(DEUTEROMYCOTINA: HYPHOMYCETES), Y SU VIRULENCIA SOBRE

Epilachna varivestis (COLEOPTERA: COCCINELLIDAE)

TESIS

Que para obtener el grado de

Maestro en Ciencias: Ama Biotecnologia

Presenta
MARTHA PATRICIA ESPAA LUNA

ASESORES:
DR. ROBERTO LEZAMA GUTIRREZ
DR. SERGIO HUGO SANCHEZ RODRGUEZ

Tecomn, Col. Mx.

octubre de 2000

/
I

Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias

C. MARTHA PATRICIA ESPAA LUNA
ALUMNO DEL POSGRADO DE LA FCBA
PRESENTE.
En base a los dictmenes emitidos por los miembros de Cuerpo de revisin asignado por el
Consejo Acadmico de la Facultad, as como los asesores, sobre su tesis titulada:
Caracterizacin enzimtica de aislados de Beauveria bassiana (Deuteromycotina:
Hyphomycetes) y su virulencia sobre Epilachna varivestis (Coleoptera: Coccinelidae, me
permito informar a Ud., que habiendo cumplido con los requisitos acadmicos, as como de
forma y fondo, se autoriza la impresin del mismo para ser presentada ante un jurado, con
el fin de obtener el grado de Maestro en Ciencias, rea Biotecnologa.
Dicho trabajo fue realizado bajo la direccin de los Doctores Roberto Lezama Gutirrez y
Sergio Hugo Snchez Rodrguez de la Universidad de Colima y Universidad Autnoma de
Zacatecas, respectivamente.
Esta tesis fue revisada y autorizada por los Doctores Alfonso Pescador Rubio y Oscar
Rebolledo Domnguez y la Maestro en Ciencias Edelmira Galindo Velasco, todos de la
Universidad de Colima.
ATENTAMENTE

c.c.p.
c.c.p.
c.c.p.
c.c.p.
c.c.p.
c.c.p.
c.c.p.

Dr. Francisco 1. Le
ord. Gral. de Docencia.
Dra. Sara Griselda
ovarrubias. Dir. Gral. de Posgrado.
Dr. Carlos E. 1
Espinal. Del. Reg. No. 2
a.
Coord. Posgrado en Biotecnologa
Dr. Jaime Mo11
CPT. Evelia Facio Vieyra. Srio. Admvo. FCBA.
Archivo.
Interesado.

Por el saber compartido. Ao 2000, sesenta aniversario de la Universidad de Colima

Carretera Jiquilpan-Manzanib,

km 260 I Tecomn, Colima, 28100, A.P. 36 I Telefax 01 (332) 4 42 37,4 46 42

E-mail: dfcba@tecoman.ucol.mx

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de Colima, y particularmente a la Facultad de Ciencias Biolgicas y

Agropecuarias, por permitirme realizar estudios de posgrado.
A la Universidad Autnoma de Zacatecas, por considerarme dentro de sus
programas de formacin de recursos humanos.
Al Rector de la UAZ, Ing. Rogelio Crdenas Hernndez, quien deposit su confianza
y me brind todo su apoyo para iniciar y poder concluir satisfactoriamente este paso
en mi formacin acadmica.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa por el apoyo financiero durante mis
estudios de maestra.
Al Centro Nacional de Referencia de Control Biolgico de la Direccin General de
Sanidad Vegetal, por facilitar parte del material biolgico para la ejecucin de la
investigacin.
A los Doctores Roberto Lezama Gutirrez y Sergio Hugo Snchez Rodrguez, por la
colaboracin y asesora durante la investigacin y elaboracin de sta tesis.
A los profesores del posgrado, en especial a los revisores de ste documento por
sus atinadas observaciones y sugerencias; M.C. Edelmira Galindo Velasco, Dr.
Oscar Rebolledo Domnguez, Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Javier Faras Larios,
y Dr. Jaime Molina Ochoa.
Un agradecimiento muy especial al M.C. Julio Lozano Gutirrez por su apoyo
durante mis estudios de maestra. Al Ing. Jos Hernndez Martnez por sus
observaciones hechas a este documento. Al Ing. Jos Inocencio Jahuey Neria + por
su ayuda en el trabajo de investigacin.

DEDICATORIA

A mis padres Mara Guadalupe y Manuel de Jess por su apoyo y cario

incondicional.

A mis hemanos; Lupe, Hilda, Manuel y Norma, por su comprensin y apoyo.

A mis sobrinos; Gerardo, Erika y Abraham, porque con ellos comparto este momento
importante de mi vida.

NDICE
VI

NDICE DE CUADROS ...............................................................................................

NDICE DE FIGURAS.. ..............................................................................................

VII

RESUMEN

..............................................................................................................

VIll

Abstract

.......................................................................................................................................................................................

IX

I.I INTRODUCCIN..
II.ANTECEDENTES..

.....................................................................................................

.1

..................................................................................................

.6

2.1 El escarabajo mexicano del frijol Epilachna vativestis Mulsant .........................6

2.1

-1 Caracterstias morfolgicas de E. varivestis ...................... ....................

2.1 -2

Ciclo de vida y hbitos de E. varivestis .................................................

2.1 -3 Con~ol de E.
2.2

.7

varivestis

.8

...........................................................................

.
10

Control biolgico ...............................................................................................

2.3 El hongo entornopatgeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin................. 4

2.3.1

Cara&ersticas morfolgicas de Be bassiana.. ........................................

2.3.2

Cultivo de B. bassiana

17

............................................................................

19

2.3.3 Antecedentes de control de 8. bassiana en colepteros ....................... .20

2.3.4 Antecedentes de control de B. bassiana en otros insectos....................2 3
2.3.5

Factores

que afectan a Be bassiana ......................................................

2.5.6 Identificacin y caracterizacin de B. bassiana .....................................

2.3.7 Modo de infeccin ...................................................................................

.26

.31
34

2.3.7.1 Funcin de las enzimas durante la infeccin .................................. .37

.42
2.4 Mecanismos de defensa de los insectos ........................................................
.45
III. MATERIALES Y MTODOS ................................................................................
3.1 Localizacin del experimento .........................................................................

.45

3.2

.45

Origen

de 10s aislados en estudio ..................................................................

3.3 Produccin del inculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.4 Cra de E. varivestis

bajo condiciones de laboratorio......................................47

3.5 Evaluacin de la virulencia de aislados de B. bassiana sobre

larvas y adultos de E. varivestis.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ., . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

.48

3.6 Evaluacin de la actividad enzimtica de las lipasas de aislados de B.

bassiana.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
.
3.7 Caracterizacin de aislados de B. bassiana con base en los
perfiles de isoesterasas..................................................................................50
3.7-l Enfoque isoelectrico . ......................................................................................51
3.7.2 PAGE _ gradiente.......................................................................................52

3.7.3 Tincin de los geles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.7.4 Secado de los geles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....................................................... 53

IV.

3.7.5 Anlisis de los geles . . . . . . . . . . . . . . ................................................................

RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . ...-..................................................................................

53
54

4.1 Evaluacin de la virulencia de aislados de B. bassiana

. .... .
sobre Ee varivestis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..._...............................

54

4.2 Tiempo letal medio de los aislados de B. bassiana sobre

..
E. varivestis . . , . . . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..55
4.3 Evaluacin de la actividad enzimtica de las lipasas de aislados
.....
de B. bassiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
4.4 Correlacin de la actividad de las lipasas de los aislados de
8. bassiana con la virulencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . *5g
4.5 Caracterizacin de los aislados de B. bassiana con base en jos
perfiles de isoesterasas . . . . . . . ................................................................................60
V. DlSCUSlN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
VI. CONCLUSin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
.....
VI{. LITERATURA CITADA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

INDICE DE CUADROS

Pag.

Cuadro
1.

Aislados de Beauveria bassiana y N. nleyi utilizados en este

estudio.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.

Anlisis de varianza de los factores de virulencia de los aislados de 5.

bassiana (A), y susceptibilidad de los estados biolgicos de E.
a
r
i
v
e
s
t
i
s (B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
54

3.

Comparacin de medias de los factores de virulencia de los aislados

de 5. bassiana (Factor A), y susceptibilidad de los estadios biolgicos
de E . varivestis (Factor B)... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.

55

Porcentajes de mortalidad de los estadios larvales y adultos de E.

varivestis

por los aislados de .5. bassana al da 20 despus de la

inoculacin.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.

TL50s de aislados de B. bassiana sobre estadios larvales de E.

varivestis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

56

6.

Anlisis de varianza de actividad de las lipasas de los aislados de 5.

bassiana.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58

7.

Actividad lipasa (mm) y datos de virulencia de los aislados de 5.

bassiana sobre E. varivestis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

8.

59

lndice de Jaccard entre aislados de 5. bassiana y N. rileyi en geles de

PAGE-gradiente

y enfoque isoelctrico

................................... . .............

64

NDICE

DE

FIGURAS

Figura
1.
2.

Pag.
Estrategia de los hongos entornopatgenos para la penetracin a
travs de Ia cutcula de los insectos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tendencia de la mortalidad de larvas de primer estadio de E.
vativestis, dada por el tiempo letal medio obtenido con el aislado
BbCo1 de Be bassiana (5.79 das) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.

6.
7.

57

Actividad enzimtica de lipasas (en mm de dimetro de halo) de los

aislados BbCOl, BbZl, BbD2 y BbCR de B. bassiana............................

5.

57

Tendencia de la mortalidad de larvas de segundo estadio de E.

varivestis, dada por el tiempo letal medio obtenido con el aislado
BbCOl de B bassiana (lo.59 das) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.

41

59

Correlacin entre actividad lipasa y virulencia de los aislados BbCOl,

BbZl, BbD2 y BbCR de 8. bassiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

60

Gradiente de poliacrilamida, teido con azul de comassie (A) y con sal

azul base RR (B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

61

Gradiente de pH por enfoque isoelctrico, teido con azul de comassie

(A) y con sal azul RR (B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..........................

63

CARACTERIZACIN ENZIMTICA DE AISLADOS DE Beauveria,

bassiana

(DEUTEROMYCOTINA: HYPHOMYCETES), Y SU VIRULENCIA SOBRE Epilachna

vativesfis

(COLEOPTERA: COCCINELLIDAE).

RESUMEN
El control del escarabajo mexicano del frijol Epilachna

varivestis Mulsant ha

dependido principalmente de los qumicos; sin embargo, sus efectos nocivos a la

salud pblica y al ambiente obligan a la bsqueda de alternativas al uso de estos
productos, Beauvetia bassiana (Balsamo) Vuillemin es un hongo que se reporta
como un buen agente de control biolgico para coleopteros; por lo tanto, su uso
podra ayudar en el control de esta plaga; sin embargo, su virulencia, sobre este
insecto, no ha sido consistentemente probada; por lo cual el objetivo del estudio fue
determinar la actividad lipasa, la virulencia y el perfil de isoesterasas de los aislados
BbD2, BbCR, BbCO1 y BbZl. Se realizaron bioensayos de patogenicidad B bassiana
E. varivestis; la actividad lipasa fue determinada por un halo alrededor de la colonia,
y las tcnicas PAGE - gradiente y Enfoque isoelctrico

fueron utilizadas para

identificar polimorfismo en isoesterasas. Los valores de TL50 fueron de 5 a ms de 14

das. El aislado ms patognico (BbCOl) produjo mayor actividad lipasa. Los perfiles
de isoesterasas fueron diferentes para cada aislado, se detect un total de ll
bandas. Los resultados soportan la hiptesis que B bassiana puede ser un agente de
control biolgico, para el primer instar larval. Se recomienda continuar con la
evaluacin y caracterizacin de aislados para el control de E. vativestis.
Palabras clave: Epilachna varivestis; Beauvria bassiana; Patogenicidad; Actividad
lipasa; Isoesterasa. I

ENZIMATIC CHARACTERIZATION OF Beauveria bassiana (DEUTEROMYCOTINA:

HYPHOMYCETES) ISOLATES ANO THEIR VIRULENCE TOWARD THE MEXICAN
BEAN BEETLE Epilachna varivestis (COLEOPTERA: COCCINELLIDAE).

ABSTRACT
The control of the mexican bean beetle Epilachna varivesfis Mulsant mainly relies
on applicatons of chemical

insectides; however, their detrimental effects on the

environment and human health force to the search for altematives to these
chemicals. Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin is being developed as a
inundative control agent of beetles, it has potential as a biocontrol agent of this pest,
however its virulence on this pest has not been consistently proved.

The aim of this

study was to determine lipase activity, the virulence, and the isoesterases profiles

of

the isolates BbD2, BbCR, BbCO1 and BbZl. Bioassays were performed to assess
the virulence against E. varivestis; lipasa activity was determined by the formation of
a halo around the colony; and the gradient - PAGE, and the Isoelectrofocusing
techniques were used to identify polymorphism of isoesterases among the isolates.
LT50 values ranged from 5 days to > 14 days. The most pathogenic isolate (BbCOl)
produced

more lipase actvity than nonpathogenic isolates. The isoesterases profiles

were different, a total of 11 bands was detected. More isolates should be examined
for their virulence against E. varivestis. The results soport the hypothess of B
bassiana can be a biological control agent to the first larval instar. More isolates
should be examined for these characteristics and their virulence against E. varivests.

Key Words: Epilachna varivestis; Beauvetia bassiana; lipase activity; pathogenicity;

isoesterase.
*

1. INTRODUCCIN

En los ecosistemas naturales como en los agrcolas, los Insectos herbvoros y los
agentes patgenos tienen un impacto significativo sobre la productividad vegetal
(Matson et al., 1997). Un total de 65,000 especies de plagas en plantas cultivadas en
campo y productos almacenados, ocasionan prdidas de aproximadamente el 40%
de la cosecha anual en el mundo (Perrin, 1997).
El control de plagas se efecta principalmente a travs del uso de plaguicidas
qumicos; se estima que 5 millones de toneladas de productos qumicos son
aplicados anualmente en el mundo (Matson et al., 1997); sin embargo, se reporta
que afectan a organismos benficos y presentan efectos adversos en los mamferos
incluyendo al hombre (Cook et al., 1996). Del mismo modo, su uso trae
consecuencias locales como la disminucin de la fertilidad del suelo, reduccin de la
biodiversidad, y los insectos crean resistencia a los plaguicidas; contaminan aguas
subterrneas, ros y lagos, con consecuencias globales negativas, sobre la atmsfera
y el clima (Matson et al., 1997; Stuart et al., 1997), as como en la salud humana
(Hajek y St Leger, 1994; Pedigo, 1996).
En Amrica latina y Africa, algunas especies de insectos conocidos como
escarabajos, chicharritas y larvas, causan dao a las plantas de frijol Phaseolus spp.
(Leguminosae) (Graham y Ranall, 1997). La defoliacin ocasionada por estos
insectos reduce el potencial fotosinttico y por lo tanto, el rendimiento; en la soya se
reporta una reduccin en la cosecha de hasta el 38% (Haile ef al., 1998).
La especie conocidacomo conchuela del frijol o escarabajo mexicano del frijol,
Epilachna varivestis

Mulsant (Coleoptera:Coccinellidae),

es capaz de reducir hasta el

70% del rea foliar de las plantas (Peterson et al., 1998) y ocasionar dao econmico
en los primeros meses del ciclo agrcola; se reporta que el mayor dao ocurre
durante las etapas fenolgicas de floracin y llenado de la vaina (McPherson et al.,

1996). Algunos autores mencionan a E. varivestis como la plaga ms importante

en los cultivos de frijol y soya (Gannon y Bach, 1996; Underwood, 1998).
El uso de los plaguicidas qumicos disminuye las poblaciones de E varivestis en
los cultivos de frijol y soya, sin embargo; debido a las consecuencias que stos
productos ocasionan en el ambiente y el hombre, las estrategias de control han
cambiado y pocos insecticidas son recomendados para su uso en programas de
manejo integrado de este insecto (Kogan y Tumipseed, 1987).
El Manejo Integrado de Plagas (MIP) es una combinacin armoniosa de las
medidas disponibles de control de plagas, que minimiza el uso de insecticidas
qumicos (Kaaya, 1994; Kirliy, 1996), integra el uso de plantas resistentes, control
cultural, control biolgico y deja el uso de los plaguicidas como ultima alternativa
(Matson et a/., 1997).
Los efectos ambientales por la contaminacin de los plaguicidas qumicos
sintticos, obligan a buscar alternativas seguras, como el desarrollo de agentes de
control biolgico (Hajek y St. Leger, 1994; Pedigo, 1996). Se reporta que los
insectos plaga pueden ser controlados a travs del uso de enemigos naturales;
stos son vertebrados e invertebrados y entornopatgenos como nematodos,
virus, bacterias, protozoarios y hongos (Cook et al., 1996; Mills y Getz, 1996).
En el control biolgico de E. varivestis, se reportan varios depredadores, entre los
que destacan los hempteros (Legaspi y ONeil, 1993), y el parasitoide Pediobius
foveolafus

Crawford; no obstante, los depredadores no consumen lo suficiente

para reducir la poblacin de la plaga; adems de que no se ha logrado el

establecimiento del parasitoides en zonas donde han sido introducido (Hooker y
Barrows, 1992).
Los hongos entornopatgenos son agentes de control biolgico que tienen la
capacidad de infectar activamente una gran diversidad de insectos; estn
ampliamente distribuidos en diferentes ecosistemas por lo que se pueden utilizar
7

para el control de plagas insectiles, son inocuos para animales de sangre caliente,
plantas y dems componentes del ecosistema y tienen la capacidad de desarrollar
epizootias en

las poblaciones de insectos plaga (Jackson, 1997). Son

particularmente importantes para el control de colepteros, debido a que las

enfermedades virales y bacterianas son raras entre los escarabajos (Hajek y St.
Leger, 1994).
Para seleccionar un hongo entornopatgeno, con el fin de utilizarse como
bioinsecticida dentro de un programa de MIP en el control de E. varivestis, es
importante identificar las caractersticas de virulencia contra el insecto plaga (Varela
y Morales, 1996); adems de conocer la variabilidad bioqumica y la biofsica, para
seleccionar el aislado con las mejores caractersticas de uso (Sosa et al., 1994;
Hajek y St. Leger, 1994).
El hongo Beauveria

bassiana (Balsamo) Vuillemin (Deuteromycotina: Hyphomycetes)

es un patgeno que infecta ms de 700 especies de insectos (Barbercheck y Kaya,

1990), entre los ms importantes incluye especies del orden Coleoptera (Feng et al.,
1994). Se tiene conocimiento que los diferentes aislados de esta especie presentan
diferencias en su virulencia sobre un insecto plaga (Bing y Lewis, 1991), as como
en sus caractersticas fisiolgicas y produccin de enzimas (Bidochka y
Khachatourians, 1990; Feng y Johnson, 1990; Havukkala et a/., 1993; Sosa et al.,
1994). Adems, los aislados generalmente tienden a ser ms virulentos a su
hospedero original, o especies cercanamente relacionadas (Feng et al., 1994).
Est demostrado que la actividad entornopatgena de los hongos depende de su
equipamiento enzimtico;

ya que para la penetracin de la cutcula del insecto plaga,

requiere de la accin de enzimas hidrolticas, como: proteasas, lipasas y quitinasas

que degradan los componentes cuticulares importantes y proporcionan nutrientes
para el hongo (Feng et al., 1994; Hegedus y Khachatourians, 1995).

Del mismo modo, se reporta que los niveles de enzimas especficas tienen
relacin con los parmetros de virulencia (Gupta et a/., 1994; Hajek y St. Leger,
1994). Esta variacin est relacionada con la actividad enzimtica del hongo
durante los procesos de germinacin de la espora, crecimiento de la hifa y
penetracin de sta a la cutcula (Bidochka y Khachatourians, 1990; Lecuona et
al., 1997).
En el hongo 8. bassiana, la virulencia tambin esta relacionada con la actividad
enzimtica (Samsinkov et al., 1971; Bidochka y Khachatourians, 1990), aunque
se sabe que no es el nico factor que determina la virulencia (Champlin et al.,
1981). Las lipasas y proteasas actan antes que las quitina-s, por lo que, la
quitina no puede ser degradada, hasta que las protenas y lpidos externos son
removidos, razn por la cual la produccin secuencial de enzimas puede ser
interpretada como una estrategias de ataque del hongo al insecto (Bidochka et al.,
1997).
En el proceso de penetracin del hongo en el insecto, la primera barrera a la que
se enfrenta es a la superficie lpida de la epicutcula; las lipasas son importantes
en este proceso, y la incapacidad de los hongos para degradar los Ipidos modifica
la virulencia (St Leger, 1993; Bidochka y Khachatourians, 1994; Hegedus y
Khachatourians,

1995).

El estudio de la variacin de las isoesterasas se utiliza como un indicador de la

diversidad gentica de diferentes especies de hongos (Riba ef al., 1986;
Poprawski et al., 1988; Mugnai et a/., 1989; Riba et al., 1989; Tigano-Milani et al.,
1990; St. Leger et a/., 1992; Rakotonirainy et a/., 1994; Varela y Morales, 1996),
asimismo, se usa para distinguir entre aislados o especies de un mismo origen y
aislados exticos introducidos a un ecosistema nuevo (Rakotonirainy et al., 1994;
Castrillo y Brooks., 1998), as como para conocer la capacidad potencial de un
aislado en su adaptabilidad ecolgica (Riba et al., 1986).

Hasta la fecha no se conoce la virulencia de B. bassiana sobre larvas y adultos de E.

vativestis; del mismo modo, no se han caracterizado aislados con el fin de evaluarlos
en este insecto. En el presente trabajo se plante la hiptesis que el hongo
entomopatgeno

B. bassiana es virulento al escarabajo mexicano del frijol E.

vativestis y que esta virulencia esta relacionada con la actividad enzimtica de las
lipasas. Asimismo, que los perfiles de soesterasas varan entre aislados.
Para dar respuesta a esta hiptesis, se plantea el siguiente objetivo:
Objetivo general:

Evaluar la virulencia de aislados del hongo entornopatgeno Beauveria bassiana

sobre el escarabajo mexicano del frijol Epilachna variestisis, la actividad enzimtica
de las lipasas y los perfiles de isoesterasas.
Objetivos particulares:

l.- Evaluar la virulencia de diferentes aislados de B. bassiana sobre larvas y adultos

de E. varivestis, bajo condiciones controladas.
2.- Evaluar la actividad enzimtica de las lipasas entre diferentes aislados de B.
bassiana.
3.- Caracterizar los aislados de B. bassiana con base en los perfiles de isoesterasas.

II. ANTECEDENTES

2.1 El escarabajo mexicano del frijol Epilachna varivesfis Mulsant

La conchuela o escarabajo mexicano del frijol E. varivesfis es originaria de
Amrica Central (Coll y Bottreell, 1994), del sudeste de Mxico (Tumipseed y Kogan,
1976). Aunque Pedigo (1998), menciona que su origen es la regin semrida del
sudeste de Estados Unidos con un rango natural dentro y en los alrededores de
Mxico.
En menos de un siglo, ha extendido su distribucin desde Amrica Central a Canad
(Fan ef al., 1992). Sin embargo, a partir de 1993 esta plaga se detect en Nagano y
Yamanashi, Japn atacando cultivos de leguminosas, donde los adults pueden
sobrevivir el invierno (Fujiyama et al., 1998).
Este insecto es especfico de leguminosas (Underwood, 1998), es la plaga ms
importante del cultivo del frijol Phaseolus spp. (Fan ef al., 1992; Coll y Bottreell,
1994; Gannon y Bach, 1996), y la soya G. max (L.) Merril (Nagarajan et al., 1994;
Gannon y Bach, 1996; Underwood, 1998). El cultivo del haba Vicia faba L., tambin
es hospedero de E. varivestis en todo el medio oeste y este de los Estados Unidos
(Pedigo, 1996).
Las larvas y adultos se alimentan de las hojas, generalmente por el envs, dejando
tiras angostas y paralelas de hoja intacta entre ellas, dando a la planta una
apariencia caracterstica descamada como de encaje, hasta ocasionar la muerte de
la hoja, y posteriormente de la planta (Nolting y Edwards, 1989).
Este insecto daa significativamente la produccin al reducir la tasa fotosinttica en
las hojas en plantas cultivadas de soya y frijol, ocasionando hasta un 70% en la

reduccin de rea foliar, debido a que sus hbitos alimenticios son fsicamente
diferentes a los ocasionados por otros defoliadores (Peterson ef al., 1998).
En Indiana, el mayor dao es producido por la segunda generacin, que comienza en
los ltimos das del mes de julio y los primeros de agosto. La defoliacin ocasionada
por E. varivestis ocurre en todas las etapas de crecimiento del cultivo (Nolting y
Edwards, 1989). Esta plaga ocasionalmente puede causar prdidas econmicas en
epocas tempranas de la temporada, pero el potencial mayor de dao ocurre desde el
tiempo de la floracin al llenado de la vaina (McPherson et al., 1996).
Adems, E. varivesfs transmite el virus mosaico del chcharo de vaca en frijol
(Borrar et al., 1989), retiene el virus del mosaico sureo del frijol (VMSF) por 4 das
despus de 24 horas de adquisicin en hojas de frijol infectadas, y pierden su
habilidad de transmisin en 4 das Wang ef al., 1994). Transmite los virus SBMV
(Mosaico del frijol del sudeste) y BPMV (Moteado de la vaina del frijol), en el cultivo
del frijol variedad Negro Valentina (Field ef al., 1994).

2.1.1 Caractersticas morfolgicas de E. varivestis

El adulto de 15. varivestis es de color amarillo a caf cobrizo, con 8 puntos negros en
cada litro. Las larvas son amarillas, de forma oval y convexas, con espinas
bifurcadas de puntas negras en el cuerpo, cuando estn completamente
desarrolladas miden 0.8 cm de largo y 0.4 cm de ancho (Borror et al., 1989). Los
huevos miden poco ms de 1 mm de largo, son de color amarillo anaranjado y
adheridos en su extremo en grupos de 50 o ms, la pupa es lisa, de color amarillo
anaranjado y redondeada en el frente (Pedigo, 1996).

2.1.2 Ciclo de vida y hbitos de E. varivestis

Este insecto pasa el invierno en estado adulto, en el suelo entre las hojas, y otras
basuras, algunas veces en grupo, especialmente en terrenos cercanos a los campos
en que se cultiv el frijol (Pedigo, 1996).

En primavera, los adultos emergen de la hibernacin para alimentarse y ovipositar

(Nagarajan et al., 1994; Coll y Bottreell, 1994). Despus de alimentarse una o dos
semanas de plantas de frijol, los adultos depositan los huevos en el envs de las
hojas, para eclosionar en 7 das aproximadamente (Pedigo, 1996).
Existen cuatro estadios larvales, con duracin aproximada de 6 das cada uno
(dependiendo de la temperatura). Cuando se completa el desarrollo, las larvas pegan
la parte posterior de sus cuerpos al envs de las hojas no daadas del frijol o de otras
plantas, frecuentemente reunindose en grupos. La pupa se abre paso fuera de la
envoltura larvaria juntndola al final de la punta del abdomen, la cual permanece
cubierta con esta piel arrugada y espinosa. La pupacin ocurre y termina en 7 das
aproximadamente

(Pedigo,

1996).

Cuando el adulto emerge, puede poner huevos para la segunda generacin a las dos
semanas siguientes. El tiempo que tarda este insecto para pasar de huevo a adulto es
de un mes en promedio. Pueden haber de una a cuatro generaciones al ao,
dependiendo de la latitud y temperatura (Pedigo, 1996). En Mariland este insecto es
divoltino (Coll y Bottreell, 1994).

2.1.3 Control de E. varivestis

El control qumico generalmente ha logrado una disminucin efectiva y econmica de

los insectos plaga de la soya que rebasan los umbrales de dao econmico. Sin
embargo, las estrategias del control qumico han cambiado, en la actualidad, pocos

insecticidas selectivos son recomendados para su uso en programas de Manejo

Integrado de Plagas (MIP) de este cultivo, y la adopcin de estas recomendaciones
deben contribuir en la preservacin de los enemigos naturales en los ecosistemas
(Kogan y Turnpseed, 1987).
En el control gentico, los trcomas de las hojas influyen fuertemente sobre la
mortalidad de las pupas, las variedades con hojas pubescentes son menos
preferidas por la mayora de las plagas, la pubescencia de las hojas de soya
beneficia el control del escarabajo mexicano del frijol; la longitud y orentacin de los
trcomas pueden ser ms importantes que la densidad en proporcionar resistencia al
ataque de E. varivestis (Gannon y Bach, 1996).
En el control biolgico de E. varivestis, se han reportado 10 especies de dpteros
parasitoides y 14 especies de depredadores. En los primeros meses de la
temporada, los depredadores pueden reducir las poblaciones de larvas y huevecillos
(Tumipseed y Kogan, 1976).
Coll y Bottreell (1994), reportan las siguientes especies depredadoras de E.
varivesris:

L o s c o c c n l i d o s Coleomegilla

maculata

(DeGeer), Hippodamia

convergens G. y Coccinella septempunctata L.; las chinches Podsus maculiventris

(Say),

Orius insidiosus (Say), Geocoris punctipes (Say), Nabis rosepenns Reuter,

N. americoferus

y araas. Legaspi y ONeil (1993), mencionan que P. maculivenfris

es un depredador importante al consumir un promedio constante de 0.4 adultos de E.

vativesfis al da.
Algunos de estos depredadores consumen relativamente pocas larvas del
escarabajo, por lo que no afectan significativamente la densidad poblacional de la
plaga. Por ejemplo, un adulto de C. maculafa consume dos larvas del primer instar al
da, mientras que un adulto de N. roseipennis slo una larva del primer instar (Coll y
Bottreell, 1994).

La avispita Pediobius

foveolafus

Crawford de la familia Eulophidae es un

superparsito de E. vativestis (Hooker y Barrows,

ovulorum,

1992) la avispita Tefrastichus

un parasitoide de huevecillo, y la mosca Paradexodes

epilachnae originaria

de Mxico, que fue introducida a los Estados Unidos, sin embargo no logr
establecerse (Turnipseed y Kogan, 1976).
En Japn, el hongo entornopatgeno Beauvetia brongnialfii reduce las poblaciones
de E. varivestis en forma natural (Fujiyama et al., 1996). Adultos muertos colectados
en localidades de Maryland, fueron examinados para identificar al agente causal, y se
encontr a Rickettsiella-like

sp. en el intestino medio, trquea, msculo, y tejido

hipodrmico, adems de encontrar virus en msculo, trquea e hipodermis (Adams et

al., 1997).

2.2 Control biolgico

El control biolgico clsico es tpicamente definido como el proceso mediante el cual
se controla plagas no nativas con especies importadas, frecuentemente antagonistas
del lugar de origen de la plaga (Myers ef al., 1994; Simberloff y Stiling, 1996). El
trmino control biolgico neoclsico es cuando se introduce un antagonista de una
especie nativa (Simberloff y Stiling, 1996).
La mayora, si no es que todas las especies de insectos son depredadas, o sirven
como hospederos para otras formas de vida. Esta diversidad de enemigos naturales
de insectos incluye vertebrados, otros invertebrados, nematodos, microorganismos, y
quiz los ms importantes son los insectos mismos. Los enemigos naturales pueden
funcionar como parsitos, depredadores, o patgenos (Pedigo, 1996).
Los atributos deseables de los enemigos naturales incluyen: especificidad de
hospedero, sincrona con la plaga, habilidad para reproducirse rpidamente cuando la
plaga lo hace, la necesidad de matar slo pocos individuos plaga para completar el

10

ciclo de vida del enemigo, y una alta tasa de capacidad de bsqueda de presas u
hospederos (Murdoch y Briggs, 1996). Los agentes microbianos entornopatgenos
son selectivos y presentan mnimo impacto ambiental (Lacey y Goettel, 1995).

El desarrollo y disponibilidad comercial de nematodos entornopatgenos de las

familias Steinemematidae y Heterortiabditidae ampla las opciones de control de
insectos, especialmente de aquellos estados que habitan en el suelo (Lacey

Goettel, 1995).

El control microbiano debe ser utilizado como un componente en programas de MIP

con mayor nfasis en alargar la permanencia de la solucin (Lacey y Goettel, 1995).
Aunque los microorganismos introducidos no siempre proporcionarn una solucin
inmediata, contribuyen significativamente en las estrategias de manejo de plagas
cuando las condiciones son propicias para desarrollar epizootias naturales. Los
insecticidas microbianos pueden ser usados como alternativa a los qumicos, por lo
que tienen un futuro brillante (Lacey y Goettel, 1995).

El resultado de epizootias naturales de hongos y virus frecuentemente evita el

requerimiento de intervenciones adicionales de control. Avances importantes en el
conocimiento de la gentica de los Baculovirus y la subsecuente manipulacin de
genes han incrementado su virulencia y utilidad. Los hongos continuamente ofrecen
las nicas opciones de control microbiano contra insectos fitfagos succionadores,
aunque estos tienen gran potencial para su desarrollo como agentes de control microbiano, slo pocos han sido usados en escala operacional (Lacey y Goettel,
1995).

Sin embargo, estos microorganismos tambin presentan caractersticas que pueden

ser ventajas o desventajas, debido principalmente a que son organismos vivos,
pueden dispersarse, y si sobreviven a las nuevas condiciones se pueden establecer
en la regin en que fueron introducidos. Muchos programas de control biolgico
implican nuevas asociaciones de hospederos y enemigos, y frecuentemente

conllevan al uso de nuevos hospederos por especies previamente consideradas

monfagas u oligfagas (Simberloff y Stiling, 1996).
Existen otros factores que limitan el uso potencial de los entornopatgenos,
incluyendo el desarrollo de resistencia. Si los insecticidas microbianos son usados
como reemplazadores de los plaguicidas qumicos, entonces eventualmente estos
agentes estarn en la misma situacin que los qumicos, particularmente con
respecto a la resistencia (Lacey y Goettel, 1995).
Existen numerosas ventajas en el uso de los hongos como agentes de control
biolgico, la capacidad de infectar y matar al hospedero es ciertamente el ms
importante. Las esporas son capaces de germinar y penetrar la cutcula del insecto, y
no siempre se encuentran con mecanismos de defensa del hospedero. Sus
propulsores infectivos, son generalmente ms estables que los producidos por las
bacterias, y la disponibilidad de numerosas especies para el control de diversas
plagas es una de sus grandes ventajas (Jackson, 1997).
Existen ms de 700 especies de hongos entornopatgenos

(Feng et aI., 1994; Hajek y

St. Leger, 1994). Pedigo (1996) menciona que son ms de 750 especies de hongos
entornopatgenos conocidos. Adems, Parker et al. (1997), citan la necesidad de
realizar ms evaluaciones de los efectos de los hongos entornopatgenos en
diferentes

artrpodos.

En los ltimos aos, ha surgido gran inters en el uso de los hongos

entornopatgenos como agentes de control biolgico y un avance significativo en el
desarrollo y manufacturacin de estos agentes, con innovaciones biotecnolgicas a
futuro (Khachatourians, 1986).
Los Deuteromycetes comprenden un gran nmero de entornopatgenos incluyendo
gneros con amplia distribucin geogrfica (Beauveria y Mefarhizium), as como
los que estn distribuidos principalmente en regiones tropicales y subtropicales

(Gibellula e Hymenosfilbe).

Muchas especies tienen un amplio rango de hospederos

y son patognicos a diferentes rdenes de insectos como: Lepidoptera, Coleoptera o

Hemiptera. Los hongos mejor conocidos son Beauvetia bassiana y Metarhizium
anisopliae, los cuales, junto con otros Deuteromycetes, tiene gran potencial como
agentes de control biolgico de plagas (Zimmermann, 1986). Son particularmente
importantes para el control del Orden Coleoptera, debido a que las enfermedades
virales y bacterianas son raras entre los escarabajos. Estos microorganismos estn
asociados con los insectos en diferentes hbitats, incluyendo; agua, suelo, y lugares
areos (Hajek y St. Leger, 1994).
Los hongos entomopatbgenos ofrecen un potencial para el control de insectos plaga,
pero su introduccin dentro del ambiente demanda un cuidado y enfoque
responsable, particularmente si los hongos no. son endmicos al rea (Bidochka et
al., 1995).
Los hongos son potencialmente los ms verstiles entornopatgenos, algunos :
*producen toxinas, lo que los provee de un potencial para daar rpidamente, pero
generalmente son patgenos de accin lenta. Muchos tienen amplio rango de
hospederos, infectan diferentes estados, son virulentos y frecuentemente causan
epizootias naturales (Fuxa, 1987).
Recientemente varios micoinsecticidas han entrado al mercado, sin embargo, de las
700 especies de hongos entornopatgenos actualmente conocidos, slo 10 especies
han sido desarrollados para el control, y el potencial de los hongos entornopatgenos
no ha sido abordado en su totalidad (Hajek y St. Leger, 1994).
Los hongos tienen-algunas ventajas nicas entre los entornopatgenos; son capaces
de infectar a travs del integumento del hospedero, por lo que la ingestin del
microorganismo es innecesaria (Leathers y Gupta, 1993; Hajek y St. Leger, 1994).

Los hongos en el suelo estn sujetos al parasitismo y depredacin por diversos

elementos de la micro- y mesofauna, incluyendo otros hongos (micoparsitos), virus
(micovirus), bacterias, actinomycetos, protozoarios, caros, nematodos, colembolos,
escarabajos, anlidos, y otros (Rosenheim, 1998). Adems pueden perder su
virulencia durante la reproduccin en medios- -de cultivo; uno de los mtodos ms
comnmente usados para recuperar la virulencia perdida es pasar el hongo
entornopatgeno a travs de insectos hospederos vivos (Hayden ef al., 1992;
Steinkraus ef al., 1991).
Es necesario encontrar mtodos confiables para detectar la persistencia y
propagacin del hongo introducido. Las deficiencias en las tcnicas de deteccin
microbiano tradicionales, han ocasionado la iniciativa de investigar

dentro de

mtodos moleculares con la selectividad y sensibilidad requeridos para distinguir

cepas no nativas de poblaciones nativas (Bidochka et al., 1995).
Steenberg et al. (1995), mencionan la necesidad de realizar estudios para evaluar Ia
importancia d e los hongos entornopatgenos en el desarrollo de poblaciones de
escarabajos depredadores, incluyendo infecciones fngicas de insectos durante la
temporada y la frecuencia de las epizootias. Asimismo, se debera dar atencin
especial a las infecciones fngicas de larvas y pupas. Tambin, se deben considerar
el impacto de la movilidad de los depredadores en la dispersin del inculo de los
sitios de hibernacin a los campo de cultivo.

2.3 El hongo entornopatgeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin

El hongo hyphomycete, Beauveria basiiana (Balsamo) Vuillemin es un patgeno que
infecta naturalmente numerosos insectos (Barbercheck y Kaya, 1990; Harrison et al.,
1993; Sosa et al., 1994). Es considerado como una de las especies ms promisorias
por su potencial como agente de biocontrol de insectos (Leathers y Gupta, 1993;
Feng et al., 1994).

Ms de 700 especies de insectos pertenecientes a nueve ordenes, principalmente

Lepidoptera y Coleoptera han sido reportados como hospederos de 5. bassiana
(Barbercheck y Kaya, 1990; Feng et al., 1994). Sin embargo, este hongo tambin se
ha encontrado en los fidos de los cereales -(Feng. -et. al., 1990; Feng y Johnson,
1990), chicharritas (Dorschner ef al., 1991) y chapulines (Khachatourians, 1992).
5. bassiana es el hongo ms extensamente estudiado desde que fue reportado por
primera vez como un patgeno del gusano de seda Bombyx mori L., por Agostno
Bassi en 1834 (Feng et al., 1994). Ha sido usado para el control de muchas plagas
importantes en varios cultivos de todo el mundo y ha sido probada su virulencia
sobre diferentes insectos (Hajek et al., 1987; Anderson ef al., 1988; Feng y Johnson,
1990; Leathers y Gupta, 1993).
5. bassiana es un hongo de suelo, en donde encuentra las condiciones ambientales
favorables para las conidias (Gaugler et a/., 1989; Bing y Lewis, 1991). Puede
presentarse en residuos de plantas, y en el tejido vegetal de la planta de maz (Bing y
Lewis, 1991; 1992).
En el cultivo de la soya en Argentina y Brasil, este hongo regula poblaciones de
diferentes colepteros de los gneros Diabrofica, Colapis, y Maecolapis. En Brasil se
presenta en altos niveles sobre poblaciones de Aracanfhus, una plaga importante del
cultivo del frijol (Sosa ef aI., 1994).
La coleccin de hongos entornopatgenos de la USDA-ARS contiene cerca de 100
aislados diferentes de 5. bassiana, algunos de los cuales han sido obtenidos de
Lepfinofaarsa

decemlineata

(Say), de escarabajos de la familia Coccinellidae, entre

otros insectos (Todorova et al., 1994).

En los ltimos aos 5. bassiana ha sido extensamente estudiado y usado en el
control de muchos insectos plaga en diversos cultivos en el mundo (Feng y Johnson,

1990). Recientemente, este hongo ha recibido especial atencin para su uso en

campo como un micoinsecticida contra plagas importantes de la agricultura como la
catarinita de la papa L. decemlineata

(Hajek ef al., 1987; Anderson et al., 1989).

--

Este patgeno infecta huevos, larvas-(Lezama et al., 1996), ninfas,. ppas o adultos,
la infeccin puede ocurrir despus de la germinacin de la espora dentro de los
intestinos del hospedero o en la superficie de la cutcula. La susceptibilidad de la larva
disminuye con el aumento en los estadios larvales, aunque los primeros estadios
larvales pueden ser capaces de superar la infeccin mediante la eliminacin del
integumento, antes de que la hifa penetre al hemocele (Hare y Andreadis, 1983).

En caso de no ocasionar la muerte por la enfermedad, el hongo B. bassiana puede

tener efectos secundarios en sus hospederos. Por ejemplo, las dosis de B. bassiana
cercana a la DLs -(Dosis Letal media) reduce el potencial reproductivo de Sitona
lineafus (L.); la fertilidad y fecundidad de Chilo suppressalis (Walker) al sobrevivir a la
infeccin; as como el desarrollo de los huevecillos de las chicharritas en plantas de i
arroz (Feng et al., 1994).

Los problemas que actualmente limitan el xito de la implementacin de B. bassiana

en el control de la catarinita de la papa son relacionados a su produccin, formulacin
y sensitividad a las condiciones ambientales extremas (Anderson et a/. 1988).

8. bassiana es ccmpatible

con la mayora de los insecticidas, siempre y cuando stos

no contengan solventes a base de xyleno (Anderson y Roberts, 1983). Los

insecticidas abamectin, triflumuron, y thuringiensin son compatibles con B. bassiana
(Andersen et al., 1989).

Este hongo afecta el desarrollo de los nematodos entornopatgenos Steinernema

feltiae y Heterorhabdtis

helothidis

cuando se aplica 48 horas antes de los

nematodos. Las poblaciones naturales de nematodos y B. bassiana se adaptan a los

climas de origen, y sus preferencias a temperaturas diferentes pueden ser los

mecanismos por los cuales 6. bassiana y los nematodos evitan infectar un mismo
hospedero (Barbercheck y Kaya, 1990).
Se pueden obtener mejores resultados en el control del gusano Spodoptera exigua
(Hbner), al realizar liberaciones inundativas de nematodos entornopatgenos donde
est presente 6. bassiana, que, realizar las aplicaciones de nematodos solos
(Barbercheck y Kaya, 1991).
Es necesario realizar ms investigaciones para obtener xito en el uso de B.
bassiana en regiones ridas. Las aplicaciones deberan ser cronolgicas para una
mejor aproximacin a las condiciones del laboratorio. Tambin se debe investigar el
uso posible de diferentes formulaciones con retenedores de humedad, los cuales
aumentan la capacidad de infeccin, as como la seleccin de cepas mejor
adaptadas a altas temperaturas y bajas condiciones de humedad (Dorschner et al.,
1991).
Para B. bassiana la competencia y depredacin influyen en la persistencia del hongo
en el suelo. Es necesario un trabajo adicional para a los enemigos naturales de
mayor importancia ecolgica para los hongos entornopatgenos (Rosenheim, 1998).

2.3.1 Caractersticas morfolgicas de B. bassiana

El hongo B. bassiana puede producir tres tipos de espora: conidia area, conidia
sumergida y blastosporas. Las principales caractersticas de la espora son:
hidrofobia, encapsulacin, y aglutinacin por lecitinas especficas presentes en la
superficie de las conidias. La hidrofobicidad de las conidias areas y sumergidas es
similar, las blastosporas son menos hidrfobas que las anteriores. La hidrofobicidad
es importante en la adhesin de las esporas al cuerpo del hospedero. La aglutinacin
es muy similar en las esporas areas y sumergidas, pero difiere en las blastosporas.

La viabilidad de las esporas areas y sumergidas permanece por ms tiempo que en

las blastosporas (Hegedus et al., 1992).
Debido al modo de formacin, las blastosporas de B. bassiana se consideran
funcionalmente idnticas
adecuadamente

a las clulas hifales y debido a esto son llamadas

cuerpos . hifales

(Rombach, 1989).

Las caractersticas

macroscpicas de las colonias muestran amplia variacin, por lo que no pueden ser
consideradas rasgos importantes de seleccin (Varela y Morales, 1996).
Bidochka et al. (1987), mencionan seis estados de desarrollo: (1) la deshinchazn de
la conidia, (ll) la hinchazn de la conidia, (III) la emergencia del tubo germinativo, (IV)
elongacin del tubo germinativo y formacin de la primer septa, (V) elongacin polar y
bipolar (crecimiento) del micelio resultante e iniciacin de las. blastosporas y, (VI)
divisin de las blastosporas.
El color de las colonias de aislados diferentes de 6. bassiana muestra una variacin
amplia entre blanco y amarillo. El aspecto de las colonias es tambin una
caracterstica variable (Varela y Morales, 1996). Existen diferencias en el color de las
colonias del hongo vistas a travs del agar, vara de crema a morado plido y rojo
prpura. La coloracin de rojo se cree que est relacionada con la produccin de
oosporeina (Feng y Johnson, 1990).
Es probable que este pigmento no est directamente relacionado con la virulencia, ya
que un aislado virulento no lo produce (Varela y Morales, 1996). Aislados con
coloracin intensa son ms patognicos al pulgn ruso D. noxia que a la broca del
caf Hipofhenemus

hampei (Coleoptera: Scolytidae)( Feng y Johnson, 1990).

La capacidad de producir pigmentaciones de color rojo, amarillo y verde ha sido

usada como caracterstica taxonmica en la clasificacin de aislados de Beauveria
spp. (Hegedus y Khachatourians, 1995).

Las conidias de diferentes aislados de 6. bassiana, presentan tres rangos de medida

y dos tipos de forma: 5 2.5 uum (globosa), 2.6-3.75 um (globosa), y 4.9-5.0 x 2.5-3.0
um (elipsoidal) (Varela y Morales, 1996). La longitud es de 0.95 a 3.41 um (Sosa et
al., 1994). Son lisas y miden de 2 - 3 um de dimetro (Feng ef aI., 1994). El
polimorfismo coidial

en algunos aislados se debe a su variabilidad gentica (Varela

y Morales, 1996).

2.3.2 Cultivo de B. bassiana

B bassiana se cultiva fcilmente en medios lquido y slido, por ejemplo,

Saubouraud, POA (papa dextrosa agar). Las conidias areas se producen en medios
slidos y su morfologa e infectividad son similares de aquellos que emergen en la
superficie de los insectos muertos (Bidochka ef al., 1987). Las blastosporas se
pueden producir a partir de una clula madre depositada en levadura (Bidochka et
al., 1987; Rombach, 1989).

Las conidas son resistentes y el intento por producirlas en gran escala ha atrado la
atencin de los investigadores. La produccicn
fermentacin difsica, produccin micelial

masiva de conidias areas por

vegetativo, por ejemplo, en gran cantidad

de cultivo lquido seguido por la conidiacin superficial del micelio en un nutriente o

cargador inerte, es considerada una labor intensa e inadecuada por los procesos
convencionales de material fngico en los fermentadores (Rombach, 1989).

El modo ms reciente de conidiacin sumergida incluye la produccin de

blastosporas durante las primeras 48 horas de cultivo en caldo y la subsiguiente
formacin de conidias seguida por la germinacin de las blastosporas hasta la
conidiacin (Feng et al., 1994).

La conidiacin sumergida tambin se puede llevar a cabo por el cernimiento de las

conidias formadas en el caldo (Hegedus et al,. 1992). Este micro-ciclo en la

germinacin no fue observado por Rombach (1989),

quien estudi un aislado

diferente, y as se postula la probabilidad que la conidiacin sumergida depende de la

naturaleza del aislado y de las condiciones fisiolgicas usadas.

2.3.3 Antecedentes de control de B. bassiana en colepteros

Los insectos del rden Coleoptera son los ms comnmente infectados por B.

bassiana (Feng y Johnson, 1990). As, 16 gneros de coccinlidos depredadores han

sido reportados como hospederos de ste hongo entornopatgeno (Magalhies ef al.,
1988).

Dos cepas de B. bassiana produjeron diferentes grados de toxicidad en larvas de

Coleomegilla

maculata,

las larvas del coccinlido son susceptibles a todas las

concentraciones del hongo. Una de las cepas caus una mortalidad insignificante,
mientras que la ms virulenta ocasion hasta un 77.8% de mortalidad por contacto
(Todorova et al., 1994)
Este hongo es virulento a la catarina Hippodamia

convergens Gurin-Mneville y

posiblemente tambin a otros coccinlidos. Sin embargo, es necesario realizar

investigaciones ms avanzadas que determinen los efectos en laboratorio y en
campo, donde interactan varias especies (James y Lighthart, 1994).
Este hongo reduce signiticativamente las poblaciones de larvas y adultos de la
catarina de la papa L. decemlineata

(Anderson et al., 1988). En un experimento

realizado con aplicaciones en diferentes dosis (104, 3 x 104, y lo5 conidias/cm*

de

rea foliar) de B. bassiana, todas las larvas de ste escarabajo, mueren antes de
pupar (Fargues et al., 1994).
Las larvas de L. decemlineata, difieren en susceptibilidad a la infeccin natural por B.

bassiana (Todorova et al., 1994), ste hongo es un agente de control promisorio para

L. decemlineata

dadas las experiencias en Francia, Polonia, Checoslovaquia y Rusia

(Hajek et al., 1987).

La aplicacin de B. bassiana en el suelo reducen la emergencia de adultos de

Diabrotica undecimpunctata,

y el dao a la raz es menos severo en suelo tratado

con el hongo que en los suelos infestados con la plaga, sin tratamiento conidial

(Krueger y Roberts, 1997).

El crisomlido

Cerotoma

arcuata es susceptible a B. bassiana (Magalhaes et al.,

1988). El escarabajo Ceratosanthes

hilariana Cogniaux (Coleoptera: Chrysomelidae),

es infectado por los hongos B. bassiana y M. anisophae (Daoust y Pereira, 1986).

Asimismo, f3. bassiana infecta a Cosmopolifes

sordidus (Coleoptera: Curculionidae),

y M. h. sericeus en Florida, por lo que este hongo es un factor importante en la

mortalidad de los adultos de C. sordidus y M. h. sericeus en el sudeste de Florida.
Este hongo tambin infecta a C. sordidus y M. hemipterus en Puerto Rico, Cuba y
Brasil donde se considera un agente de control que ocurre en forma natural. La
mayora de los picudos muertos infectados con B bassiana se encuentran adheridos
en la parte baja o cados de la planta del pltano (Pea et a/., 1995).

B bassiana es patognico al tercer estadio larval del picudo del pltano c. sordius,
causando mortalidades de 63-97% en los 35 das posteriores a la exposcn de fas
esporas. Con la finalidad de infectar a la hembra durante la oviposicin y a las larvas
al eclosionar los huevecillos, se pueden realizar aplicaciones de B bassiana durante
las oviposturas de la hembra de C. sordidus (Kaaya et al., 1993). El adulto de

Chalcodermus

bimaculatus

Fiedles (Coleoptera: Curculionidae), se considera menos

susceptible a B. bassiana que la larva (Quintela et al., 1990).

Las larvas y adultos del picudo del nogal pecanero Curculio

caryae (Horn), son

infectados por B. bassiana, sin tomar en cuenta el lugar, tipo de suelo, o prcticas de
manejo de plagas (Harrison y Gardner, 1991). La virulencia de los hongos

entornopatgenos contra este picudo depende del modo de aplicacin y el aislado del

hongo (Harrison et al., 1993).

B. bassiana ataca especies del curculinido Sitona en Inglaterra (Poprawski et al.,
1988). Los aislados de 6. bassiana muestran diferentes grados de virulencia sobre las
larvas del picudo Curculio

caryae (Horn) (Champlin et al., 1981).

En experimento realizado, los aislados de B bassiana fueron virulentos al picudo del

maiz almacenado, Sitophilus zeamais Motsch., en laboratorio, por lo que B. bassiana
es un agente potencial para el control microbiano de esta plaga (Adane et al., 1996).,
El adulto del escarabajo Alphitobius diaperinus (Panzer) (Coleoptera: Tenebrionidae)
es menos susceptible a la infeccin con B. bassiana que la larva. Algunas larvas
infectadas logran pupar y la esporulacin

ocurre en la pupa. Los adultos

generalmente repelen la infeccin, y la mortalidad no excede el 27% (Steinkraus et

al., 1991).
En muestreo realizado de escarabajos de las familias Carabidae y Staphylinidae, se
presentaron niveles de infeccin bajos (Carabidae: 7.6%, Staphylinidae: 7.0%), el
hongo 0. bassiana infect hasta un 67% de la poblacin del stafilnido Anotylus
rugosus y 37% del stafilnido Gyrohypnus angustatus.

Este hongo predomin, ya que

fue colectado de las dos familias en todos los sitios de estudio (Steenberg et al.,
1995).
La mayora de los aislados probados producen un bajo porcentaje de mortalidad
(menos de 25%) en un periodo de 10 das en la broca del caf H. hampei
(Coleoptera: Scolytidae), lo anterior podra indicar una prdida de la virulencia y la
necesidad de aumentarla a traves de la infeccin con hospederos de la misma
especie o una especie alternante (Varela y Morales, 1996).

Cuando B. bassianaes aislado de escarabajos del gnero Phyllophaga

spp.,

(Coleoptera: Scarabaeidae) ocasiona un alto porcentaje de mortalidad en larvas del

mismo insecto. Este hongo es ligeramente infeccioso cuando se administra en el
alimento de las larvas; sin embargo, el hongo parece estar asociado ms
especficamente cn el segundo y tercer estadio larval (Poprawski y Yule, 1991).

2.3.4 Antecedentes de control de B. bassiana en otros insectos

Los hongos B. bassiana y B. brogniartii

son virulentos a Osttinia

nubilalis y

Melolontha melolontha respectivamente (Lecuona et al., 1997). El hongo B. bassiana

puede persistir en la planta de maz para proporcionar un control efectivo de 0.
nubilalis (Bing y Lewis, 1991; Lewis y Bing, 1991; Lewis et al., 1998).
f3. bassiana muestra diferentes capacidades de virulencia sobre el gusano del elote

Heliothis zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctudae) (Sandhu et a/. , 1993), y el gusano

cogollero Spodoptera exigua (Hung et al., 1993). En bioensayos realizados, los
aislamientos de B. bassiana presentan virulencia variable sobre S. frugiperda,

con un

parasitismo entre 3 y 90% en huevos y 54 a 100% en larvas; el aislamiento ms

sobresaliente present un TL50 de 3.1 y 2.8 das en huevos y larvas,
respectivamente, y una CL50 de 2.4 x 1 O3 conidias/ml (Lezama et al., 1996).
En el control de S. exigua,

las liberaciones nundativas de los nematodos

entornopatognicos Steinernema carpocapsae y Heterorhabditis

bacteriophora junto

con B. bassiana, se pueden obtener mejores resultados en el control de este gusano

que realizar las aplicaciones de nematodos solos (Barbercheck y Kaya, 1991).
El fango de hospederos de B. bassiana incluye a los lepidpteros; palomilla de la
cera Galletia mellonella,

el cortador de la col Tiichoplusia ni (Gupta et al, 1994);

Pieris rapae (L.), P/ufe//a xylosfella (L.), Trichoplusia ni (Hbner) (Ignoffo et al., 1979),

y P/ute//a xylostella (Vandenberg et al., 1998a).

B. bassiana es efectivo contra el lepidptero Malacosoma

americanum,

ya que

ocasiona la muerte de larvas en 4 das. En algunos casos, las larvas muestran signos
de enfermedad (inactividad y melanizacin de la cutcula) a las 6 horas de la
exposicin a las esporas. Los niveles altos de susceptibilidad de M. americanum

ciertas cepas de B. bassiana sugieren que este hongo es ideal para el biocontrol de
la plaga (Leathers y Gupta, 1993).

Los chapulines tambin son infectados por B. bassiana (Bidochka y Khachatourians,

1990; Johnson y Goettel, 1993; Goettel et al., 1995; Inglis et al., 1997b), ya que este
hongo reduce las poblaciones de diferentes especies de chapulines en forma natural
(Shah et al., 1994).
El chapuln Melanoplus sanguinipes es susceptible a varios hongos imperfectos,
incluyendo a B. bassiana (Khachatourians, 1992; Inglis et al., 1997c).

Las ninfas de

este acrdido son altamente susceptibles a la infeccin por B. bassiana formuiado en

cebo, y la eficacia de la formulacin depende del grado en que las ninfas contaminen
su superficie cuticular durante y en la ingestin del cebo (Inglis et al., 1993; Inglis et
al., 1996).
La mortalidad de M. sanguinipes est relacionada con la dosis ingerida de esporas
(54.3-60.0 mg por chapuln), las primeras muertes atribuidas a B. bassiana ocurren en
los das 6 y 7 en dosis de 1 .1x 10 y 5.4 x 1 O6 esporas por mililitro, mientras que las
dosis bajas de 1 .l x lo4 y 1.2 x 10 ocasionan la muerte hasta los das 13 y 14
respectivamente (Jeffs et ai., 1997).

En bioensayos realizados sobre M. sanguinipes, las cepas de B. bassiana GK2016,

tipo nativo (virulento), y GK2051,

presentaron un TL50 de 5.8 y 7.8 das

respectivamente, aunqua son slo dos das de diferencia en el valor de TL50 la cepa
GK2051 consistentemente requiere 17 das para matar el 90% de la poblacin y

nunca produce 100% de mortalidad, mientras que la cepa tipo nativo GK2016,
caus el 100% de muerte en 8-10 das (Kosir ef al., 1991).

El xito de 5. bassiana contra chapulines en campo depende del desarrollo de las

estrategias bioracionales que superan la luz y la temperatura como limitantes del
hongo (Ingls et aI., 1997a). Sin embargo, por la elevacin de la temperatura de su
cuerpo, los chapulines pueden inhibir y/o prevenir las enfermedades causadas por 5.
bassiana y M. flavoviride, los efectos de la termoregulacin son considerados ms
inhibitorios para 5. bassiana que para M. flavoviride (Inglis et al., 1997c).

En ambiente controlado, la mezcla de conidias

de 5. bassiana con arena como

substrato para oviposicin caus una mortalidad extensiva por infeccin durante la
oviposicin de las hembras de M. sanguinipes, en machos asociados y
subsecuentemente en la emergencia de las ninfas (Inglis et al., 1995b).
El hongo 5. bassiana es potencial para el control biolgico de fidos, en un
bioensayo realizado, con dosis de lo4 a l0 8 conidias/ml, el hongo exhibi un alto
nivel de virulencia sobre el pulgn Phorodon humuli (Schrank); as, se obtuvo una
CL50 de 1.37 x 10 conidias/ml, y el TL50 se redujo en la medida del incremento de la
dosis conidial

(Dorschner et a/., 1991). Asimismo, puede infectar al pulgn ruso

Diuraphis noxia (Homoptera: Aphididae), sin embargo, la virulencia de los aislados

vara mucho (Feng y Johnson, 1990).
En la mayora de los casos 5. bassiana es ms virulento que V. Lecanii cuando se
aplica sobre diferentes especies de fidos (Homoptera:Aphididae) (Feng et al., 1990).
Asimismo, ste hongo produce un 7 7 % de mortalidad sobre ninfas de Empoasca

kraemeri (Homoptera: Cicadelldae) (Magalhaes et al., 1988).

5. bassiana es un agente potencial de control biolgico de la hormiga de fuego,

Solenopsis invicta Buren (Himenoptera: Formicidae) (Siebenecher et al., 1992). Este

hongo tiene la capacidad de crecer, dispersarse, y esporular en nidos y suelos de la

hormiga de fuego (Pereira et al.,

1993). Bajo condiciones de laboratorio, el

hongo 5. bassiana infecta poblaciones de S. invicta. La presencia o ausencia de

suelo no influye en la susceptibilidad de las hormigas al patgeno (Pereira y Stimac,
1992).

El hongo 5. bassiana tambin es un agente de control promisorio para la mosca

casera Musca domestica L en establos asperjados con conidias se detect al hongo
en el 43 a 47% de adultos colectados (Watson et a/., 1996).
Este hongo puede ser aplicado en suelos forestales para el control de trips

Taeniothrips inconsequens (Uzel), plaga importante de los rboles, sin ocasionar

efectos negativos en la poblacin natural de invertebrados de reas forestales (Parker

et al., 1997). En un experimento realizado, se obtuvo un 24% de mortalidad en larvas

de trips del meln Thrips palmi tratadas con 5. bassiana (Castineiras et al., 1996).

2.3.5 Factores que afectan a B bassiana

Una variedad de factores abiticos y biticos afectan la estabilidad y persistencia de

5. bassiana en el suelo (Lingg y Donaldson, 1981; Gaugler et al., 1989, Studdert et

al., 1990).
En los factores abiticos, la dispersin de los propgulos infectivos a un nuevo
hospedero representa una de las partes ms peligrosas del ciclo de vida del hongo,
los procesos de produccin, liberacin, dispersin, germinacin y sobrevivencia de
esporas, frecuentemente dependen de las condiciones ambientales (Hajek y St.
Leger, 1994). La radiacin solar, temperatura, y la baja virulencia del patgeno hacia
el hospedero que se quiere controlar limitan la eficacia de 5. bassiana en el campo
(Inglis et al., 1997a; Inglis et al., 1997b).

Las conidias de B. bassiana son hialinas y el parmetro ms importante que limita la

sobrevivencia de la conidia en los habitantes epigeales es la luz solar (Daoust y
Pereira, 1986; Inglis et al., 1995a;

Inglis et a/., 1993). Las conidias mueren

rpidamente por la exposicin a la luz solar y en particular por los rayos ultravioleta
que causan principalmente mutacin en el cido nucleico y/o fotoreaccin, que los
lleva a la muerte celular (Inglis ef al., 1995a).

La sobrevivencia de las conidias en la superficie de las hojas, declina

logartmicamente por la exposicin al ambiente; este mismo fenmeno ocurre con la
poblacin conidial sobre el integumento de los chapulines (Inglis et al., 1997a).

La sobrevivencia de las conidias en la parte ms alta de la superficie de las hojas de

alfalfa y pastos es relativamente baja, en 4 das la poblacin conidial disminuye en
ms del 75%, en la parte media de la planta la persistencia de la conidia es de ms
tiempo; en hojas de pasto la poblacin conidial se reduce en ms del 99% a los 16
das de exposicin y de 28 a 85% en hojas de alfalfa (Inglis et al., 1993). En 28 das
se obtiene un 90% de viabilidad conidial perdida en hojas de alfalfa, sin embargo an
se observa un gran nmero de conidias vivas (James y Lighthart, 1994).
La vida media de B. bassiana sobre el follaje de la soya es de menos de 24 horas
(Ignoffo et al., 1979), puede llegar a ocasionar hasta un 83% de mortalidad en larvas
de Spodopfera frugiperda

y Heliofis zea el da de la aplicacin, 44% al quinto da y 0

al dcimo da (Gardner et al., 1977).

El rojo congo, la arcilla, y todos los abrillantadores probados proporcionan un grado
de proteccin de la radiacin ultravioleta artificial a B. bassiana. La arcilla y el
abrillantador stilbene, Tinopal

LPW, incrementan consistentemente la persistencia de

las conidias de B. bassiana en hojas de gramneas (Inglis et al., 1995a).

La temperatura es uno de los factores principales que afectan el desarrollo de B.

bassiana. Este hongo presenta variacin en las temperaturas ptimas, siendo de 25

y 28C, exhibiendo crecimiento ptimo a temperaturas tan bajas de 20C o tan altas
de 30C. Sin embargo,

el umbral mximo de temperatura es de 30 a 37C, y la

temperatura mnima de 8C (Fargues ef al., 1997).

La mayor mortalidad de Plutella xylosfella ocasionada por B bassiana se presenta a

una temperatura de 25C, y disminuye a temperaturas ms altas o ms bajas, es
decir la temperatura ptima para este hongo es a 25C, donde ocasiona la mayor
mortalidad en este lepidptero (Vandenberg el al., 1998b).

En un ensayo realizado con ninfas del chapuln Melanoplus sanguinipes expuestas a

35C, y tratadas con 5. bassiana, se observ una mayor mortalidad a 35 que a 40C
(Inglis et al., 1997c).

Sin embargo, las cepas mutantes de B. bassiana por su

sensibilidad al calor matan chapulines M. sanguinipes a temperatura de 20C pero no

a 30C o ms (Hegedus y Khachatourians, 1996c).

Se menciona con frecuencia que la humedad relativa (HR) es el factor abitico clave
en el potencial de los hongos. Usualmente, la germinacin de la conidia ocurre en un
rango de HR de 90-100%.

Sin embargo, se ha demostrado que las infecciones de

varios insectos hospederos son posibles a diversos niveles de HR. Las infecciones de

B bassiana sobre larvas del escarabajo negro del olmo Sco/ytus sco/ytus fueron
posibles a humedades relativas bajas (51%). Estos datos revelan que es necesario
distinguir entre HR atmosfrica, HR macroambental, y HR microambiental prxima
inmediata a la cutcula del insecto o la superficie de las hojas (Zimmermann, 1986).

Las condiciones de humedad o HR son de menor importancia, o incluso no la tienen

cuando el uso de. los hongos entomopatbgenos es contra insectos de suelos
cultivados. Excepto para los niveles superficiales, el micelio normalmente permanece
en el suelo en una atmsfera de cerca del 99% de HR (Zmmermann, 1986).

Por otro lado, en el ambiente del suelo, al decremento en la sobrevivencia puede ser
causado por efectos fungistticos (Hajek y St. Leger, 1994). Al parecer, existen

ciertos factores en el estircol que durante la descomposicin reducen la

sobrevivencia de B. bassiana (Rosin et al., 1996).

Los mejoradores del suelo benefician

la sobrevivencia de las conidias

en suelo

estril, mientras que en el suelo no estril son dettimentales debido a la estimulacin

de la microflora (Lingg y Donaldson, 1981). Por otro lado, las prcticas culturales
influyen en la densidad de propgulos de hongos entornopatgenos en los
agroecosistemas, y la no-labranza favorece la prevalencia de los hongos en el suelo
(Sosa y Moscardi, 1994).
Para B. bassiana la competencia y la depredacin parecen tener influencia en su
persistencia en el suelo. Son necesarios estudios adicionales para evaluar la
importancia de los depredadores en la ecologa de los hongos entornopatgenos
(Rosenheim, 1998).

Los hongos entornopatgenos que se aplican contra insectos plaga; en la agricultura,

tambin pueden ser afectados por los agroqumicos, como los fungicidas,
insecticidas, o herbicidas (Zimmermann, 1986). B. bassiana puede ser usado en
mezcla con la mayora de los insecticidas, siempre y cuando stos no contengan
solventes a base de xyleno (Anderson y Roberts, 1983).

La susceptibilidad de los hongos a los fungicidas es variable, dado que el

ditiocarbamato derivado del zineb + oxicloruro de cobre, y mancozeb, inhiben
completamente la germinacin de B. bassiana. Los fungicidas triadimefon, oxicloruro
de cobre, metalaxil, azufre, azufre + nitrothalisopropil y himexazol afectan a los
hongos. El impacto de los fungicidas en los hongos entornopatgenos es
aparentemente delicado, es necesario realizar estudios a gran escala, debido a que
los fungicidas podran ser ms dainos a los hongos entornopatgenos cuando son
aplicados varias veces en un ao (Majchrowicz y Poprawski, 1993).

Entre los factores biticos, las plantas hospederas pueden interferir con los patgenos
fngicos directa o indirectamente por su influencia en los insectos hospederos.

LOS

insectos herbvoros tienen una relacin compleja con sus plantas hospederas. La
variacin entre plantas hospederas tambin puede afectar la relacin entre herbivoros
y sus enemigos naturales. Las larvas de L. decemlineata desarrolladas en diferentes
especies de plantas hospederas en campo, difirieron en susceptibilidad a la infeccin
natural por B bassiana. As, se observ como las larvas desarrolladas en
Lycopersicom esculentum fueron ms susceptibles a la infeccin por B bassiana que
las desarrolladas en sus especies hospederas adecuadas (Hare y Andreadis, 1983).

El desarrollo de los patgenos fngicos dentro de los hospederos, puede ser afectado
no slo por las reacciones de inmunidad de los hospederos, sino tambin,
indirectamente por el alimento del hospedero (Hajek y St. Leger, 1994).
Los pocos estudios desarrollados in vitro,

han demostrado que la adicin de

glicoalcaloides a una diversidad de extractos de plantas inhiben el crecimiento de B.

bassiana. Adultos de la chinche Blissus

leucopterus,

inoculados con B. bassiana,

mostraron mayor mortalidad cuando se alimentaron de trigo, cebada, o dieta artificial

comparado con maz o sorgo. Pocos cadveres de las chinches alimentadas de maz
o sorgo produjeron conidias.

Lo anterior podra deberse al resultado de qumicos

fungistticos secundarios de las plantas (Hajek y St. Leger, 1994).

El antibitico polyene nistatina reduce la formacin de colonias, crecimiento y

desarrollo de conidiforas de

B.bassiana, en concentraciones ms bajas que los

alcaloides. La tomatina inhibe el crecimiento y formacin de colonias en mayor grado

que la solanina, la cual presenta relativamente poco efecto sobre el hongo. Lo

anterior sugiere que la germinacin de la conidia y el crecimiento hifal se inhibe

cuando un insecto consume follaje, conteniendo 0.100 mg/g (peso fresco) de este
compuesto (Costa y Gaugler, 1989).

2.3.6 identificacin y caracterizacin de B. bassiana

Histricamente

la identificacin de los hongos ha sido basada en las caractersticas

morfolgicas, bioqumicas y propiedades inmunolgicas (Hegedus y Khachatourians,

1996b).

Debido a la importancia del gnero Beauvetia en los programas de control de plagas

en el mundo, se ha usado un nmero de tcnicas para la identificacin de ste
hongo. Los estudios ms frecuentes han usado isoenzimas (Poprawski et al., 1988;
St. Leger et al., 1992; Castrillo y Brooks, 1998), secuencias de rRNA (Rakotonrainy
et al., 1991), y anlisis con PCR (Pfeifer y Khachatourians, 1989; Kosir ef al., 1991;
St. Leger et al., 1992; Pfeifer y Khachatourians, 1993; Neuvglise et al., 1994;
Hegedus y Khachatourians, 1993, 1996a, 1996b; Couteaudier et al., 1996; Viaud et
aI., 1996; Maurer et a/., 1997; Cravanzola et al., 1997; Castrillo y Brooks, 1998; Glare
y Inwood, 1998; Ben-eta et a/. , 1998; Travis y Inwood, 1998; Viaud et al , 1998).
El uso de los mtodos de gentica molecular como PCR, pueden complementar y
evaluar el impacto ambiental. Tambin se pueden evaluar los efectos de las
liberaciones intencionales de micoinsecticidas sobre la biodiversidad y en el
reestablecimiento de poblaciones nativas de flora microbiana (Hegedus y
Khachatourians, 1996a).

Adems, estos mtodos han proporcionado marcadores

para el anlisis de poblaciones; otros estudios moleculares aplicados recientemente

incluyen el anlisis de secuencias de ARN para distinguir entre los gneros

Tolypocladium y Beauveria (Rakotonirainy et al., 1991).

Las variaciones en el ADN ribosomal

de los filamentos del gnero Beauveh

muestran un alto grado de polimorfismo entre cepas de B. brongniartii, y permite su

separacin dentro de siete grupos distintos, uno de estos grupos contiene
especficamente todas las cepas aisladas de gallina ciega Hoplochelus marginalis
(Neuvglise, 1994).

Las

variaciones

genticas

entre aislados de Beauveria spp. definidas por un

anlisis de electroforesis demuestra variaciones allicas

de alozima codificando

genes. 146 aislados de diversos sitios geogrficos fueron asignados a 47

distintas clases de genotipos.
especies

morfolgicas

Tolypocladium

(B.

cylindrosporum)

El anlisis de la agrupacin demostr que 4

brongniartii,

B vermiconia,

B .

caledonica y

son genticamente distintas (St. Leger et al.,

1992).
El nivel de distancia gentica entre cepas de B. bassiana indica que ste representa
un agregado de especies; a pesar del mantenimiento de la alta diversidad en B.

bassiana, se encontr que tres genotipos ampliamente distribuidos contienen a la

mayora de los aislados; esto sugiere que en muchas situaciones, B. bassiana existe
con una estructura poblacional clonal. Otros aspectos de los datos de alozima (la
magnitud de las distancias genticas entre poblaciones, diversidad gentica, y el
patrn de distribucin de clases genotpicas) indican que la recombinacin
cromosoma1 entre diferentes genotipos de B. bassiana es rara o no se presenta (St.
Leger et a/., 1992).

El anlisis genmico con RFLP de dos cepas de B. bassiana con caractersticas de

virulencia distantes, no indica diferencias detectables entre ellas, ya que muestran
similares patrones de bandas en el gel (Kosir et al., 1991).

Los hongos tienen diferentes proporciones de protenas totales (Gorinstein et al.,

1996). Se ha analizado la variacin protenica de este hongo a travs de
electroforesis por varios autores (Poprawski ef a/., 1988; Sosa ef al., 1994; Todorova
et al., 1994; Varela y Morales, 1996; Gorinstein et al., 1996).
El anlisis electrofortco de protena de cepas diferentes de B. bassiana indica
diferencias significativas entre ellas; la cepa ARSEF 2991 posee una banda de
protena predominante con bajo peso molecular, estimado a 34 kDa, mientras que la

cepa ATCC 44860 difiere en la presencia de una protena de 70 kDa ausente en la

cepa ARSEF 2991 (Todorova et al., 1994).

Varios sistemas enzimticos son polimrficos

y suficientemente bien resueltos para

la realizacin de estudios genticos confiables de B. bassiana (St. Leger et al., 1992).

Las isoenzimas han sido usadas como marcadores genticos para analizar la
variabilidad entre aislados de B. bassiana (Poprawski et a/., 1988; Mugnai et al.,
1989; St. Leger et al., 1992). La electroforesis, y especialmente la tcnica de enfoque
isoelctrico pueden ser utilizadas para detallar la variabilidad entre especies
(Poprawski et al., 1988). El enfoque isoelctrico es una tcnica que da alta resolucin
en bandas de protena, y ya ha sido ampliamente usado en estudios de variabilidad
de especies en hongos (Riba et al., 1986). La electroforesis de isoesterasa es una
herramienta de gran uso y ventaja en la caracterizacin de aislados (Varela y
Morales, 1996).

Se puede usar el anlisis de isoesterasa para identificar un aislado virulento, debido

a la variacin en los perfiles de sta enzima entre aislados de diferentes insectos
hospederos y/o diferentes regiones geogrficas (Poprawski et al., 1988).
Los aislados de B. bassiana, que atacan especies de Sitona en Inglaterra, Francia, y
Marruecos fueron analizados con enfoque isoelctrico, los perfiles de isoesterasa son
monomrficos y similares a una cepa que originalmente se aisl de Osttinia nubilalis
(Hbner) del norte de Francia (Poprawski et al., 1988).

La variabilidad en isoesterasas entre poblaciones de regiones geogrficas cercanas

es menor que la variabilidad entre poblaciones de regiones distantes (Sosa et al.,
1994). Este mismo fenmeno fue observado por Poprawski et al. (1988),

aunque

ellos consideraron slo un carcter; contrariamente Varela y Morales (1996),

encontraron que de acuerdo a los perfles electroforticos de isoesterasa, los

aislados de un hospedero en comn estan ms relacionados que los que son de un

origen geogrfico similar.

En anlisis por electroforesis de isoesterasas de seis aislados de B. badana, se

presentaron seis perfiles distintos, uno para cada aislado. El 75% de las bandas
fueron comunes entre dos o ms aislados (Varela y Morales, 1996).
Algunos aislados de B. bassiana son polimrficos en las bandas de isoesterasa,
mientras que otros presentan bandas idnticas (Sosa et al., 1994). En investigaciones
realizadas con distintos aislados del mismo hongo, derivados de picudos del gnero

Sitona, se presentaron 11 perfiles electroforticos de a-esterasa diferentes; 18

aislados de un mismo sitio geogrfico fueron monomrficos en sus perfiles de
isoesterasa (Poprawski et al., 1988)

2.3.7 Modo de infeccin

Los hongos entornopatgenos poseen un conjunto de mecanismos que les permite

penetrar y asimilar los materiales del hospedero, y a la vez superar los mecanismos
de resistencia. La mayora de los metabolitos fngicos ayudan al patgeno con
aspectos fsicos de ingreso. Las enzimas degradadoras de cutcula destruyen o
modifican la integridad estructural del hospedero, inhiben sus procesos selectivos, e
interfieren con su sistema regulatorio (Hajek y St. Leger, 1994).

Los hongos penetran a travs de la cutcula, la cual est compuesta principalmente

de protenas, quitina, lpidos y compuestos fenlicos, los cuales funcionan como una
barrera contra la invasin de microorganismos y medio ambiente (Hegedus y
Khachatourians, 1995).

Cada dao, asociado con los sntomas de la enfermedad, puede ser producido por
las enzimas del patgeno y sus metabolitos de bajo peso molecular (toxinas) (Hajek

y St. Leger, 1994). Sin embargo, la produccin de enzimas no es el nico factor que
influye en el factor de la virulencia, o en el xito del proceso de la penetracin
(Champlin et al., 1981).

La infeccin inicia con esporas asexuales (conidias)

depositadas sobre el

integumento externo de los insectos (Johnson y Goettel, 1993; Feng ef al., 1994).
Los insectos generalmente son infectados por B bassiana despus de que la conidia
est en contacto con la cutcula del hospedero, germina y penetra el integumento. En
algunos insectos como los chapulines, la ruta precisa de invasin dentro de cuerpo
se desconoce, pero generalmente se cree que el modo principal de infeccin es a
travs del integumento externo (Goettel et al., 1995).

-Los
propgulos germinativos de los hongos, estn continuamente en movimiento a
.
travs de diferentes partes durante la penetracin cuticular, stos responden a
cambios por estmulo de los procesos bioqumicos hasta originar una diferenciacin
celular y formar estructuras morfolgicas especficas (Hajek y St. Leger, 1994). Las
interacciones hidrofbicas, la produccin de mucosidad y apresorios por el hongo
influyen en la adhesin del hongo a la cutcula del insecto (Bidochka ef al., 1997),
aunque es raro que estas estructuras se produzcan en B. bassiana (Hegedus y
Khachatourians, 1995).

Los tubos germinativos constantemente detectan su medio y se adaptan para

colonizar el tejido del insecto y contrarrestar el potencial de respuestas del
hospedero, stas estructuras infecciosas probablemente evolucionaron como un
mecanismo con el cual el patgeno supera las barreras del hospedero (Hajek y St.
Leger, 1994).

Durante la infeccin, la epicutcuta es la primer barrera en cruzar (St. Leger et al.,

1988); la penetracin de la sta puede realizarse por infeccin a travs de ganchos
producidos

por apresorios (St. Leger et al., 1989a; Hajek y St. Leger, 1994), o por la

entrada directa de los tubos germinativos, las hifas y placas penetran en la

procutcula (St. Leger, 1993).

Una vez que la epicutcula es perforada, el inicio de la penetracin a travs de la

cutcula puede ser va directa por hifas o estructuras que se pueden extender
lateralmente, esta expansin lateral puede causar fracturas que favorecen el proceso
y facilitan la dispersin de las enzimas fngicas degradadoras de la cutcula (Hajek y
St. Leger, 1994).

Al invadir el hemocele, el hongo prolifera, y el micelio de los tubos germinativos libera

blastosporas (Feng et al., 1994; Hegedus y Khachatourians, 1995). Las blastosporas
se desarrollan para su dispersin a travs del hemocele (St. Leger, 1993). Estas
usualmente germinan a las 48 h despus de la infeccin, comparado con 3 o 4
semanas de las conidiosporas

(Todorova et al., 1994). El hongo prolifera dentro del

cuerpo del hospedero, frecuentemente como un estado de vida que no sobrevive

naturalmente fuera del hospedero (Hajek y St. Leger, 1994).

El insecto infectado muere debido a la reduccin drstica de su hemolinfa, nutrientes

y la toxemia causada por los metabolitos txicos del hongo (Feng ef al., 1994), o bien,
por la combinacin de stos con el dao mecnico producido por el crecimiento del
hongo (Hajek y St. Leger, 1994; Pedigo, 1998; Bidochka et al., 1997). En ocasiones el
cuerpo graso puede ser infectado inmediatamente despus de la penetracin a la
cutcula, mientras que otros tejidos y rganos permanecen intactos por ms de una
semana, o son coionizados hasta despus de la muerte (Hegedus y Khachatourians,
1995).

Bajo condiciones hmedas, uno o dos das despus de que el hospedero muere, el
hongo emerge y produce una capa de conidias

en la superficie del cadver

(Steinkraus et al., 1991; Feng et al., 1994; Goettel et al., 1995).

La importancia de estos mecanismos vara con el aislado especfico del hongo o el

hospedero (Hajek y St. Leger, 1994). La habilidad de la conidia de B. bassiana para
germinar rpida y sincronizadamente se considera un aspecto importante en el
proceso de infeccin (Inglis et al., 1997b).

2.3.7.1 Funcin de las enzimas durante la infeccin

El xito en la penetracin de la cutcula de los insectos por B. bassiana depende

principalmente de varias enzimas hidrolticas que degradan las protenas, quitinas y
lpidos en el integumento del insecto y proporcionan nutrientes para el hongo (Feng
et al., 1994; Hegedus y Khachatourians, 1995).

Los niveles de enzimas especficas que degradan la cutcula como la lipasa,

quitinasa, proteasa, quimoelastasa, y quimotripcina tienen relacin con los
parmetros de virulencia especfica (Gupta ef al., 1994). Indudablemente, muchas
enzimas patognicas son importantes al determinar la virulencia debido a que
permiten al patgeno coexistir con el proceso de cambios metablicos asociados con
el estado de la enfermedad del hospedero (Hajek y St. Leger, 1994).

La variacin en la virulencia de 8. bassana se puede relacionar con la produccin y

actividad enzimtica durante la penetracin en la cutcula del hospedero (Bidochka y
Khachatourians, 1990). Sin embargo, las enzimas no son el nico factor que influye
en el fenmeno de la virulencia, o en el xito del proceso de la infeccin (Champlin
ef al., 1981). Otros factores pueden ser el xito de la adhesin de la conidi a la
cutcula, presencia de cidos grasos en la superficie de la cutcula, crecimto
fngico antes de la penetracin, y la produccin y regulacin de otras toxinas
(Bidochka y Khachatourians, 1990).

La mezcla de quitinasa, lipasa y proteasa, en B bassiana acta como una unidad, y

aparentemente tiene una accin comn que permite al hongo penetrar, con ayuda de

la secrecin enzimtica de las hifas a travs del integumento del insecto

(Samsinkov et al., 1971). Las lipasas y proteasas actan antes que las quitinasas,
la produccin secuencial de estas enzimas se puede interpretar con respecto a la
estructura fsica de la cutcula del insecto, las fibras de quitina son rodeadas por una
capa de protena; por consiguiente, la quitina no puede ser degradada hasta que las
protenas son removidas (Fig. 1) (Bidochka et al., 1997; Leathers y Gupta, 1993).
Estas enzimas son sintetizadas en una manera coordinada con relacin a la
estructura cuticular, y son inducidas in vitro cuando son cultivadas sobre cutcula de
insecto; la significancia de alguna de las enzims depende de las caractersticas
cuticulares, y estado fisiolgico del insecto, as como de los mecanismos de invasin
por el hongo (Hegedus y Khachatourians, 1995).

Los lpidos de la epicutcula son la primer barrera en cruzar, por lo que las lipasas son
importantes en el proceso de la infeccin; la composicin de estos lpidos incluye
aproximadamente 65% de alkanos, 25% de steres cerosos secundarios, triglicridos,
alcoholes, y cidos grasos; adems de lpidos, la apicutcula contiene aminocidos, y
aminoazucares que funcionan como nutrientes para la germinacin del hongo
(Bidochka et al., 1997). Los hidrocarburos son los lpidos ms comunes y abundantes
en la cutcula de los insectos, en Schisfocerca gregaria constituyen el 76% del total de
lpidos extrados de la cutcula, los lpidos son usualmente mezclas de n-alcanos
(principalmente C 12 - C33) y alcanos ramificados metilados (St. Leger et aI., 1988).
La incapacidad para utilizar los lpidos que predominan sobre la superficie de la
cutcula puede reducir la virulencia de algunos hongos; stos lpidos son
suficientemente heterogneos y contribuyen en la especificidad de la relacin
patgeno-hospedero (St Leger, 1993; Kosir et al., 1991). La importancia de las lipasas
depende

principalmente

del

sistema de especificidad patgeno-hospedero

(Hegedus y Khachatourians, 1995). Los hongos entornopatgenos f3. bassiana

y M.

anisopliae

poseen lipasas y otras esterasas que son capaces de hidrolizar los lpidos

cuticulares de los insectos (Bidochka et al., 1997).

Los estudios preliminares indican que existen dos posibles funciones de los lpidos
cuticulares de los insectos en la actividad de los hongos entornopatgenos; algunos
de ellos podran ser usados como recursos pobremente accesibles de energa para
la germinacin de la espora. Otros.podran tener una actividad antifngica especfica
probablemente expresada en el crecimiento hifal, polaridad, insaturacin, o
ramificacin como longitud de cadenas de los lpidos cuticulares probablemente
involucrados en cada proceso. Es necesario realizar investigaciones sobre la posible
correlacin entre cepas infectivas y los lpidos cuticulares de los hospederos
(Lecuona et al., 1997).
La produccin constitutiva de niveles de lipasa es evidente cuando 6. bassiana es
propagado en un medio complejo, y la adicin de triglicridos, como el aceite de
oliva, inducen en gran cantidad a la actividad de las lipasas sin alterar las
caractersticas de crecimiento del hongo. Adems ciertos cidos grasos presentes en
la cutcula de los insectos, inhiben el crecimiento fngico y la germinacin de la
espora (Hegedus y Khachatourians, 1995).
Las lipasas han ganado atencin especial por su uso potencial en la biotecnologa
debido a su disponibilidad y estabilidad (Essamri et al., 1998). La produccin de
lipasa por un hongo entornopatgeno contribuye significativamente en la penetracin
y provisin de nutrientes. In vivo, la lipasa acta antes que la quitinasa sobre los
lpidos, y como en el caso de las protenas, pueden situarse como una capa
protectora de la quitina. Slo a travs de la accin coordinada y combinada de las
tres principales enzimas hidrolticas, (proteasa, quitinasa y lipasa) ocurre la
desintegracin completa de la cutcula (Hegedus y Khachatourians, 1995).

Una vez que la superficie Ipida de la epicutcula es degradada por las lipasas, el
hongo produce grandes cantidades de proteasas (Prl), para degradar el material

protenico de la procutcula que se encuentra adherido como una cubierta de la

quitina. Una vez liberadas las fibras de quitina, las protenas solubilizadas

son

degradadas por aminopeptidasas y exopeptidasas, para ser convertidas en

aminocidos tiles como nutrientes para el hongo (Bidochka ef al., 1997)
La degradacin de la cubierta de protena permite accesar a las enzimas quitinolticas
hacia las fibras de quitina para degradarlas, lo cual induce a la produccin

de ms

quitina (GlcNAc), y esta a su vez a la sntesis de ms quitinasa, reduciendo la

actividad de las proteasas (Hegedus y Khachatourians, 1995; Bidochka et al., 1997).

Las quitinasas extracelulares o N-acetilglocusamidasas (NAGasa) son producidas por

B. bassiana y M. Anisopliae despus que las proteasas; esta secuencia se debe a la
estructura fsica de la cutcula del insecto. Las fibras de quitina se encuentran
cubiertas por una capa de protena, la cual debe ser degrada para poder activar a las
quitinasas e hidrolizar la quitina (Bidochka et al., 1997); sin embargo, la degradacin
parcial de lpidos es suficiente para abrirle el camino a las quitinasas (Samsinkov et
al., 1971).

Las proteasas extracelulares producidas por B. bassiana solubilizan las protenas

cuticulares, las cuales ayudan en la penetracin y proporcionan nutrientes para una
mayor proliferacin del hongo dentro del insecto (Bidochka et al., 1997). Durante los
primeros estados de infeccin, la proteasa Pr1 de B. bassiana se localiza prxima a la
hifa, pero es indispensable la separacin mecnica de las protenas, en los ltimos
estados, Pr1 se distribtiye en toda la regin de invasin (Hegedus y Khachatourians,
1995). La Fig. 1 muestra la representacin de la interaccin entre las enzimas
extracelulares y la degradacin de la cutcula.

Fig. 1. Estrategia de los hongos entornopatgenos

para la penetracin a travs de la cutcula de los

insectos.

Se ha identificado una variedad amplia de proteasas extracelulares en hongos

entornopatgenos; en B bassiana, estas enzimas muestran mayor preferencia por
las protenas cidas que bsicas (Hegedus y Khachatourians, 1994).

Varias cepas de B. bassiana y algunas de B. brongniartii producen una proteasa

inmunolgicamente idntica, y la proteasa bsica de B. bassiana inmunolgicamente
difiere de las proteasas de P. fumosoroseus y M. Anisopliae; las proteasas bsicas
de B bassiana, P. fumosoroseus, y M. anisopliae contienen antgenos comunes
(Shimizu et al., 1993).

La proteasa degradadora de cutcula con una quimoelastasa especfica, es la

proteina principal en la generacin de estructuras infecciosas de M. anisopliae in situ
durante la penetracin de la cutcula del hospedero. La produccin de quimoelastasa
por las estructuras infecciosas se favorece por los niveles de nutrientes insuficientes

por las estructuras infecciosas se favorece por los niveles de nutrientes insuficientes
para reducir la represin catablica. As, el proceso patognico involucra la relacin
morfognesis - infeccin, y la produccin de enzimas ocurre slo cuando es necesario
para establecer una relacin nutricional del patgeno con el hospedero (St. Leger et

al., 1989b).
Una cepa de 5. bassiana que sobre produce proteasa tendr un valor ms bajo de
TL50 (Tiempo Letal medio); en este caso, otros factores de virulencia pueden limitar el
curso de la patognesis y por consiguiente cambiar el TL50 (Bidochka y
Khachatourians, 1990).

Se ha encontrado una relacin entre la produccin de amilasa y la virulencia, donde

niveles elevados de amilasa se asocian con una hipervirulencia en M. anisopliae, y
los aislados con deficiencia de esta enzima, no presentan virulencia (Hegedus y
Khachatourians, 1995).

Se ha identificado una amplia variedad de enzimas catablicas en hongos

en!omopatgenos; alcalino fosfatasa, esterasa C4, esterasa/lipasa C8, lipasa C14,
leucina aminopeptidasa, valina aminopeptidasa, cisteina
quimotripcina,

aminopeptidasa, tripsina,

cido fosfatasa, fosfohidrolasa, a-galactosidasa, P--galatosidasa,

fi-glucuronidasa, a-glucosidasa, B--glucosidasa,

y a-fucosidasa, y P-galactosidasa.

@-glucosaminidasa,

a-mannosidasa

No se ha desarbierto la contribucin de estas

enzimas en los procesos de infeccin (Hegedus y Khachatourians, 1995).

2.4 Mecanismos de defensa de los insectos

Los insectos manifiestan respuestas inmunes tanto humorales como celulares que
son efectivas contra varios patgenos y parsitos,

incluyendo hongos, protozoarios,

bacterias, nematodos e himenpteros parasitoides (Washburn ef al., 1996). El

mecanismo principal de defensa contra la invasin de microorganismos es la barrera

que proporciona la cutcula (Hegedus y Khachatourians, 1995), as como la membrana

peritrfica

que rodea el bolo alimenticio y protege el epitelio del intestino medio (Dunn,

1986). Poco se conoce sobre como un insecto reconoce al hongo como algo extrao, e
inicia sus respuestas de inmunidad (Hajek y St. Leger, 1994).

La epicutcula presenta mltiples capas, y cada una tiene sus propiedades; la capa
superior se caracteriza en la mayoria de los insectos por ser mecnicamente frgil,
resistente a la degradacin enzimtica e impermeable. La composicin de la epicutcula
interior consiste de quitina protegida con una capa proteica; sta composicin implica
resistencia, pero las enzimas producidas por los hongos entomopatgenos pueden
superar este obstculo (Hajek y St. Leger, 1994).
Una infeccin puede ser abortada en la epicutcula si un factor esencial de la fase de
adhesin, desarrollo microbiano, o patognesis est ausente. Especficamente, la
infeccin puede ser inhibida por la falta de humedad, inhabilidad para utilizar los
nutrientes disponibles en la superficie de la cutcula, o ausencia de los factores
necesarios para el reconocimiento de un hospedero susceptible o sitio penetrable para
la infeccin (Hajek y St. Leger, 1994).

Para algunos sistemas, los fracasos de los hongos en invadir la cutcula del insecto, se
atribuyen a la presencia de compuestos inhibidores (fenoles, quinones, y lpidos) en la
superficie cuticular (Hajek y St. Leger, 1994). En el estudio realizado por Samsinkov
ef al. (1971), encontraron que el contenido de lpidos de la cutcula de larvas de Galleria
mellonella es de 18.5% de peso seco en promedio. 24% de carbohidratos, quitina
16.6% de peso seco, el contenido de nitrgeno total fue de 2.46%, considerando el
nitrgeno contenido en la quitina; el total de nitrgeno que contiene un 15.1% de
protenas.

Los triacigliceroles, esteroides, y fosfolpidos han sido encontrados en pequeas

cantidades en la cutcula. Sin embargo, slo evidencias circunstanciales indican que

algunos de estos compuestos pueden estar involucrados en la resistencia a la

enfermedad (St. Leger et al., 1988).
El proceso de la muda puede emplazar la infeccin de los insectos hasta que el
hongo finalmente invade el organismo y causa la muerte; la infeccin se desarrolla
rpidamente en algunas larvas de L. decemlineata que mueren antes de mudar (Vey
y Fargues, 1977).

La respuesta inicial de la hemolinfa de los insectos a partculas extraas se origina

por la circulacin de los hemocitos; stos son extremadamente eficientes removiendo
las partculas extraas como bacterias, hongos, nematodos, y huevecillos de
parasitoides; tambin por fagocitosis, formacin de ndulos, o encapsulacin
(Hegedus y Khachatourians, 1995).
La reaccin principal en los mecanismos de defensa celular antifngica es la
encapsulacin

del

hongo,

el cual es rpidamente melar-izado. Durante la

encapsulacin, los granuloctos son atrados hacia el hongo y pueden cubrirlo

totalmente (fagocitosis), entonces los plasmatocitos son aislados y forman un
pseudotejido en capas concntricas que forman un ndulo en el cual el hongo puede
ser descompuesto (Hajek y St. Leger, 1994).

En el caso de cepas hipervirulentas de una especie de hongo, los hospederos son

incapaces de formar granulomas tpicos o superar la encapsulacin y el crecimiento
fngico contina (Hajek y St. Leger, 1994). B. bassiana es capaz de suprimir la
habilidad de extensin de los hemocitos en larvas de Spodoptera

exigua; las

blastosporas fagocitadas de B bassiana producen tubos germinativos que crecen

fuera de los granulocitos y las hifal circularon libremente (Hung ef al., 1993).

III. MATERIALES Y METODOS

3.1 Localizacin del experimento

El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de Biologa Celular, del Centro

Regional de Estudios Nucleares, y en el Laboratorio de Entomologa y Control
Biolgico, de la Facultad de Agronoma, de la Universidad Autnoma de Zacatecas,
durante el perodo de agosto de 1998 a julio de 1999.

3.2 Origen de los aislados en estudio

Los aislados de B bassiana utilizados fueron originalmente extrados de insectos del

orden Coleoptera, BbD2, BbCOl y BbCR,

fueron proporcionados por el Centro

Nacional de Referencia de Control Biolgico de la SAGAR,

mismos que se

encuentran en la coleccin de hongos entornopatgenos de dicho Centro, que se

ubica en el municipio de Tecomn, Colima. El aislado BbZl fue obtenido por la
autora de este trabajo en el campo agrcola de la Facultad de Agronoma de la
Universidad Autnoma de Zacatecas y un quinto aislado de la especie Nomuraea
fireyi (Farlow) Samson, fue proporcionado por el Dr. Roberto Lezama Gutirrez, de la
Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima, fue
utilizado como testigo por ser especie diferente de B. bassiana, y su inocuidad a
colepteros (Ignoffo, 1981), para la caracterizacin de los aislados, a travs de la
expresin de las isoesterasas. Estos hongos tienen su origen en diferentes sitios
geogrficos de la Repblica Mexicana (Cuadro 1).

Cuadro 1. Aislados de Beauveria bassiana y N. rileyi, utilizados en este estudio.

Aislado

Hospedero de origen

Origen

Cultivo

geogrfico
BbD2

Diabrotica

sp. (Coleoptera: Chrysomelidae)

BbCOl

Hypofhenemus

hampei (Ferrari)

Maz

Ocotln, Jal.

Caf

Oaxaca

Maz

desconocido

(Coleoptera: Scolytiadae)
BbCR

(Coleoptera:

BbZl

(Coleoptera: Curculionidae)

Frijol

Zacatecas, 1998

N. rileyi L9

Spodopfera frugiperda (J. E. Smith)

Maz

Colima, 1998

(Lepidoptera:

Chrysomelidae)

Noctuidae)

3.3 Produccin de inculo

Los aislados de B. bassiana se cultivaron en un medio estril a base d Sabouraud

dextrosa agar + 0 . 2 % de extracto de levadura, en cajas petri, e incubados por 7 das,
a 25 C. Las conidias se colectaron en 20 ml de agua destilada estril con Tween 20
al 0.05%. La suspensin conidial se pas, a travs de un filtro No.4, con una medida
de poro de 5-15 Mm (Millipore Corp.), y la concentracin se determin en una cmara
nomatmtrica

de Neubauer (Rombach, 1989). La suspensin de conidias se ajust a

1 x l07 conidias/ml, con esta concentracin se llevaron a cabo los bioensayos de

virulencia y determinacin de los valores de TL50 Varela y Morales, 1998).
Por otro lado, se lev a cabo la produccin de micelio de cada uno de los hongos
para extraer las protenas, evaluar la actividad de las lipasas y caracterizar los
aislados con base en perfiles de isoesterasas. Para lo anterior, se utiliz el medio
lquido Sabouraud dextrosa + 0.2% de extracto de levadura. A matraces de 250 ml se
les adicion 150 ml de medio, mismos que se esterilizaron a 120 libras de presin
durante 20 minutos y se inocularon con 20 u1 de la suspensin conidial, preparada

con anterioridad, se incubaron a 25C, en un agitador rotatorio a 150 rpm, durante

siete das,

Posteriormente, el micelio fue separado del caldo de cultivo, lavado y centrifugado,

con agua destilada estril, una parte de l fue secado en una liofilizadora

a -5OC y

se conserv a -2OC; mientras que la otra parte de micelio fue utilizado

inmediatamente, para evaluar la actividad de las lipasas (Sosa et al., 1994).

3.4 Cra de E. varivestis bajo condiciones de laboratorio

La cra de E. varivestis fue realizada mediante una modificacin de la tcnica de

Todorova et al. (1994). Los adultos fueron colectados en campo, de parcelas con
frijol, establecido bajo condiciones de riego en la Facultad de Agronoma de la
Universidad Autnoma de Zacatecas. Tres grupos de 20 insectos fueron colocados
en frascos de vidrio de 2,500 ml de capacidad, a los cuales diariamente se les coloc
hojas de frijol frescas como alimento para los insectos; las hojas adems de
funcionar como alimento, lo hicieron como sustrato de ovposicin.

Los huevos fueron colectados de las hojas y colocados dentro de una caja petri, con
algodn hmedo al centro, para evitar la deshidratacin. Una vez eclosionadas, las
larvas se colectaron de las cajas petri y se colocaron en frascos estriles con
alimento fresco; estas larvas se utilizaron para mantener la colonia y para los
experimentos de virulencia de los aislados. Las larvas que se utilizaron para los
bioensayos fueron de 48 horas despus de haber eclosionado para larvas de primer
estadio, o de haber mudado para larvas de segundo, tercer y cuarto estadio. El
insectario se mantuvo bajo condiciones de laboratorio a una temperatura de 23 + 1C
y 70 % de humedad relativa, con un fotoperiodo de 16:8 horas luz: oscuridad.

Del mismo modo, para disponer de hojas de frijol frescas y en cantidades suficientes
para mantener la colonia durante los experimentos, desde un mes anterior al

establecimiento del insectario se sembr frijol de la variedad Flor de Mayo por SU

mayor

disponibilidad y aceptacin por el insecto, en macetas de plstico de 2 litros de

capacidad, con suelo arcillo-arenoso.

3.5 Evaluacin de la virulencia de aislados de B. bassiana sobre larvas y

adultos de E. varivestis

Para evaluar la virulencia y cuantificar los TL50 de los cuatro aislados de B bassiana
sobre E. varivestis,

se realizaron bioensayos de virulencia en larvas de primero,

segundo, tercero y cuarto estadio, y en adultos.

Para lo anterior, se inocularon hojas de frijol frescas con una suspensin de conidias
a la concentracin de 1 X I0 7 conidias por mililitro de tween 20 al 0.05%, por
inmersin durante 30 segundos. Posteriormente, a las hojas se les elimin el exceso
de agua, dejndola durante 5 minutos en ventilacin en una campana de flujo
laminar; une vez ventiladas, se depositaron en forma individual, en frascos de vidrio
de 150 ml de capacidad, estriles. A la hoja de frijol se le coloc en la base algodn
hmedo y un papel filtro hmedo (Whatman No. 3) en el fondo del frasco, para
mantener condiciones de alta humedad. Como testigo, se utilizaron hojas frescas de
frijol, inmersas en tween 20 al 0.05% estril (Varela y Morales, 1996).

A cada uno de los frascos con la hoja de frijol inoculada, se les coloc una larva o
adulto, los frascos se taparon con tela de algodn y se incubaron a 25C, con un
fotoperiodo de l0:14 h durante 20 dias. Los frascos fueron revisados cada 24 h, para
proporcionar alimento, humedecer el papel filtro y el algodn, asi como para registrar
el nmero de larvas muertas en cada tratamiento. Para corroborar la muerte de los
insectos a causa del hongo, stos fueron colocados en cmaras hmedas para
propiciar el desarrollo y esporulacin del hongo aplicado.

Terminado el experimento el nmero de larvas muertas cada 24 h, en cada

tratamiento, fue sometido a anlisis Probit, mediante la correlacin entre el logaritmo
del tiempo de la muerte de los insectos y el Probit de la mortalidad, para determinar
el TL=50 de los aislados que causaron una mortalidad superior a 50% en cada uno de
los estadios larvales y/o adulto (Finney, 1971). Del mismo modo, con los porcentajes
de mortalidad obtenidos en cada uno de los tratamientos se realiz un anlisis de
varianza y prueba de medias de Tukey (P<O.05) en el paquete estadstico SAS
(1988),

previa transformacin angular de los porcentajes (Studdert y Kaya, 1990;

Varela y Morales, 1996), considerando dos factores de estudio, con distribucin

completamente al azar de los tratamientos con cuatro repeticiones, donde el factor
A fueron los aislados del hongo ms el testigo y el factor B los estadios larvales y
adulto del insecto.

3.6 Evaluacin de la actividad enzimtica de las lipasas de aislados de B.

bassiana
Para evaluar la actividad de las lipasas se utiliz la tcnica de Hankin y
Anagnostakis (1975). Se emple el medio de cultivo formado a base de Peptona
Difco (10 g), Cloruro de Sodio (5 g), Cloruro de calcio-2H20

(0.1 g), agar (20 g) y

Tween 20. La mezcla se ajust a pH de 6.0, utilizando HCL 0.5 M y se esteriliz

durante 20 minutos a 15 libras; una vez estril se coloc en cajas de petri estriles.
El Tween fue esterilizado por separado, durante 20 minutos a 15 libras de presin y
se adicion 1 ml , por cada 100 ml de medio de cultivo estril fro.

El micelio lavado fue tratado en buffer Tris 0.1 M, pH 6.0 (Varela y Morales, 1996),
se tomaron 10 ul de extracto y micelio y se inocul en cada caja petri, con el medio
de cultivo descrito antes, colocado en el centro de la caja. Posteriormente, cada caja
se sell con cinta testigo y se incubaron a 26 C por 6 das (Rajami y Hilda, 1987). A
partir del sexto da, cada caja se examin para medir, con un vernier, el dimetro de

la colonia, as como, el dimetro del halo caracterstico de la actividad enzimtica en

mm.

La produccin de las enzimas se expres con la proporcin del dimetro de la

colonia y el dimetro del halo (Rajami y Hilda, 1987) y para calcular la actividad
enzimtica, a los datos de dimetro de halo se les rest los de dimetro de colonia.
(Sosa ef al., 1994). Los resultados de la actividad enzimtica fueron sometidos a
anlisis de varianza y prueba de medias de Tukey (P<O.05); y la correlacin entre la
actividad enzimtica de las lipasas y la virulencia fueron desarrollados en el paquete
estadstico SAS (SAS, 1988).

3.7 Caracterizacin de aislados B. bassiana con base en los perfiles de

isoesterasas
A los aislados de B. bassiana se les extrajo la protena total pasando 1 g de micelio
en un mortero de porcelana a O C, donde se adicion 1 ml de buffer Tris-HCI 0.04 M
(pH 6.8). Una vez molidas las preparaciones miceliales, stas fueron centrifugadas a
16,000 g por 30 min a 4 C, el sobrenadante fue extrado y liofilizado para concentrar
la protena, finalmente el extracto fue puesto en tubos eppendorf de 1.5 ml y
congelado a -20 C hasta ser utilizados (Sosa et al., 1994).

Para determinar la concentracin de protena de las muestras de cada extracto, se

utiliz el ensayo de Bradford (1976). Una vez preparadas las muestras de protena
de los aislados, as como los estardares de albmina de suero de bovino con el
mtodo de Bradford, se midi la absorvancia a 595 nm en un espectrofotmetro en
cubetas de 3 ml contra un reactivo blanco. Los datos obtenidos de la protena fueron
analizados contra los datos correspondientes a la curva estndar obtenida por las
muestras de albmina calculada con regresin lineal en el programa de cmputo
Instat versin 3.5.

Para caracterizar los aislados de B. bassana con base en puntos isoelctricos y

peso molecular de esterasas, se utilizaron las tcnicas de Enfoque Isoelctrico de
OFarrel

(1975),

y PAGE - gradiente (520%) en condiciones nativas preparado de

acuerdo a Varela y Morales (1996).

Se prepararon las muestras para las corridas con 1 OO

ug de protena y 10 ul de

buffer de muestra para enfoque isoelctrico y 50 ug de protena y 10 ul de buffer de

muestra para el gel de PAGE - gradiente.

3.7.1 Enfoque isoeletrico

Las isoenzimas a y B esterasas fueron separadas por enfoque isoelctrico usando
Anfolinas pH 3.5 a 10 y 4 a 7 (Pharmacia Biotech). La corrida se realiz en una
cmara vertical grande, el contenido del gel fue de 10 ml de acrilamida al 40%, bis
5%; 10 ml de NP40 al 10%; 20 ml de agua destilada; 3 ml de anfolinas pH 4 - 7; 2 ml
de anfolnas pH 3.5 - 10; 45 ul de temed, y 70 ~1 de PSA al 10%.

El buffer del nodo fue preparado en medio litro de agua desionzada degasificada

cido fosfrico 10 mM; mientras que el buffer del ctodo se prepar con NaOH 20
mM en la misma cantidad de agua con similares caractersticas.

Se realiz una precorrida con 20 ul de buffer de overlay (urea 9M y amfolitos 2%) en

cada pozo, a 200, 300 y 400 V durante 15 minutos cada voltaje, a temperatura
ambiente para formar el gradiente. Posteriormente se retiraron los buffers de corrida
y el overlay para colocar las muestras de protena de los aislado, las muestras se
colocaron por duplicado, la corrida se llev a cabo a 400 V a 4 C durante 12 horas,
al finalizar se le dio una corrida final de 60 minutos a 800 V.

Al finalizar la corrida se verific la formacin del gradiente, para lo cual, se cort el

carril inicial y final del gel, es decir, donde no se coloc muestra, posteriormente

estos fueron cortados en pequeos trozos de 0.5 cm cada uno y colocados en 2 ml

de agua destilada en tubos de ensayo ordenados en forma descendiente, despus
de 24 horas se midi el pH del agua de cada uno.

3.7.2 PAGE - gradiente

El gel (520% de acrilamida) en condiciones nativas se prepar en un formador de

gradiente, y la corrida en una minicmara de electroforesis, ambos de Bio-Rad. El
contenido del gel fue de acrilamida-bisacrilamida,

tris-HCL 1.5 M, pH 8.8, ,agua

destilada, sacarosa, persulfato de amonio 10% y TEMED. Las concentraciones

usadas fueron las indicadas por Varela y Morales (1996).

Se prepararon dos geles en las mismas condiciones, se les colocaron las muestras
de protena de los cinco aislados de hongos entornopatgenos en cada uno, la
corrida se desarroll a 4C durante 12 horas a 120 V. Al finalizar la corrida, se
retiraron los geles para ser teidos y secados.

3.7.3 Tincin de los geles

El gel de enfoque isoelctrico se dividi en dos de la par-te media, para obtener dos
geles con las mismas caractersticas de cada uno de los aislados, uno para teir el
total de protena con azul de comassie y otra para teir las bandas de los enzimas
a y B-esterasas.Del mismo modo los geles de PAGE - gradiente, uno fue teido con
azul de comassie,

mientras que el otro fue utilizado para observar la expresin de las

a y p-esterasas.

La solucin teidora de esterasas de Shaw y Prassad (1970) fue preparada de la

manera siguiente: 100 mg de Fast blue salt RR (sal azul base RR); 10 ml de Tris-HCI
0.5 M, pH 7.1; 3 ml de substrato a y B - naftil acetato y 87 ml de agua desionizada.

La solucin teidora se filtr en papel filtro Whatman No.1, los geles fueron inmersos
en la preparacin a 37 C, por una hora para propiciar la reaccin de las enzimas en
la presencia del sustrato, posteriormente se lavaron con agua destilada y se fijaron
en cido actico al 7%.

La solucin teidora

para el total de protena se prepar con 1.25 g de azul de

comassie; 200 ml de agua desionizada; 250 ml de metanol y 50 ml de cido actico.

Los geles fueron incubados en el buffer a temperatura ambiente durante 1 hora,
luego lavados y fijados en solucin desteidora, se agitaron lentamente hasta
observar una formacin clara de bandas azules.

3.7.4 Secado de los geles

Con el fin de secar los geles, se colocaron entre una membrana de papel celofn y
papel filtro Whatman No.3, para posteriormente deshidratarlos en un secador de
geles Bio-Rad a una temperatura de 70 C durante 1.3 horas.

3.7.5 Anlisis de los geles

La similitud entre aislados por los perfiles de isoesterasas se estim con el ndice propuesto
por Jaccard, el cual consiste en la frmula siguiente:
S = A/(A + B + C)
Donde A son las bandas presentes en ambos aislados, que son comparados, B son
las bandas presentes slo en el primer aislado y C, las bandas presentes slo en el
segundo aislado (Skovgaard y Rosendahl, 1998).

IV. RESULTADOS

4.1 Evaluacin de la virulencia de aislados de 8. bassiana sobre E. varivestis.

Con la finalidad de evaluar la virulencia de los aislados BbD2, BbCR, BbCO1 y BbZ1
de B bassiana sobre los cuatro estadios larvales y adultos de E. vativestis,

se

realizaron bioensayos de patogenicidad, y los porcentajes de mortalidad acumulada

transformados al arco seno se sometieron a un anlisis de varianza (Cuadro 2).
Cuadro 2. Anlisis de varianza de los factores de virulencia de los aislados de 8.

bassiana (A), y susceptibilidad de los estados biolgicos de E. varivesfis (B).

Fuentes de Grados de

Suma de

Cuadrado

Valor de F

variacin

cuadrados

medio

calculada

libertad

P>F

Factor A

22998.5781

5749.6445

37.9475

0.0001

Factor B

11886.5312

2971.6328

19.6127

0.0001

Interaccin

16

6196.5625

387.2851

2.5561

0.004

Error

75

11363.6718

151.5156

Total

99

52445.3437

Coeficiente

de

variacin=

33.97%.

La comparacin de medias (cuadro 3) muestra que el aislado BbCOl fue

significativamente ms virulento sobre E. varivestis,

con una mortalidad superior al

76% transformado a 61, mientras que los otros tres aislados presentaron una
virulencia estadstica similar hacia este insecto plaga. La mortalidad encontrada en el
testigo no present ningn signo de infeccin por el hongo.

Con respecto a la susceptibilidad de larvas y adultos, a la infeccin por el hongo, la

comparacin de medias de Tukey indica que no existe diferencia significativa entre
los cuatro estadios larvales, no obstante que los dos primeros estadios presentan
medias de un 58 y 46% de mortalidad, transformados a 49 y 42 respectivamente,

mientras que el tercer y cuarto estadio presentan medias de 38 y 33

respectivamente.

El adulto fue significativamente menos susceptible al

microorganismo estudiado con un 8% de mortalidad convertido a 17 (cuadro 3).

Cuadro 3. Comparacin de medias de los factores de virulencia de los aislados de B.
bassiana (Factor A), y susceptibilidad de los estadios biolgicos de E.
varivestis (Factor 6).
Aislados (A)

media

estadios de

media *

E. vativestis (B)
BbCOl

61.2285 a

estadio 1

49.4195 a

BbZl

41.5780 b

estadio 2

42.9070 ab

BbD2

32.4400 b

estadio 3

38.0484 b

BbCR

31.0605 b

estadio 4

33.7310 b

Testigo

14.8920 c

adulto

17.0930 c

Medias de mortalidad de E. varivesfis

ocasionada por la virulencia de los aislados de 6. bassiana

b Medias de susceptibilidad de estadios de E. varivestis a B bassiana

Medias seguidas por la misma literal en cada columna, son estadsticamente iguales.
Tukey (0.05). a= 10.9133

4.2 Tiempo letal medio de los aislados de B. bassiana sobre E. varivestis

La determinacin de tiempo letal medio sobre larvas y adultos de E. varivestis

se

realiz con los aislados que presentaron los porcentajes de mortalidad mayores al
50% (cuadro 4).

Cuadro 4. Porcentajes de mortalidad de los estadios larvales y adultos de E.

varivestis

por los aislados de B. bassiana al da 20 despus de la

inoculacin.
Estadios

BbZl

Bb02

BbCOl

BbCR

ler-

55*

55

1 00*

32.5

2do

42.5

37.5

85

35

3er

49

27.5

65

32.5

4to

45

10

67.5

15

Adulto

12.5

Valores utilizados para determinar el TL50

El insecto de primer estadio larval present mortalidad superior al 50% con los
aislados BbZl, BbD2 y BbCOl, mientras que el segundo, tercer y cuarto estadio
larval presentaron valor superior al 50% con el aislado BbCOl. El adulto no alcanz
dicho porcentaje con ninguno de los aislados. En el cuadro 5 se presenta los TL50
obtenidos durante la investigacin.

Cuadro 5. TL50*s de aislados de B bassiana sobre estadios larvales de E. varivestis.

EEtado

Aislado

TL50

XL Calc.

Ecuacin

(das)

1 er.

BbZl

20.92

1.285

y= 1.55 x -0.15

1 er.

BbD2

20.02

0.838

y= 1.23 X +0.93

1 er.

BbCOl

5.79

12.44

y= 2.39 X -1.6

2do

BbCOl

10.59

12.10

y= 2.72 X -3.23

3er.

BbCOl

19.19

10.13

y= 3 x -4.86

4to

BbCOl

16.71

7.946

y= 2.56 X -3.26

X2del 5% = 11.7

En el cuadro anterior se destaca que los valores de TLs, para las larvas de primer y
segundo estadio, con el aislado BbCOl fueron de 5.79 y 10.59 das respectivamente;

las figuras 2 y 3 muestran las tendencias de la mortalidad de estos datos. Los TL50
obtenidos para ios dems estadios y aislamientos fueron superiores.

Timpa (das)

Fig. 2. Tendencia de la mortalidad de Iarvas

de primer estadio de E. vativesfis,

dada por el tiempo letal

medio obtenido con el aislado BbCO1 de 5. bassiana (5.79 das).

10

11

12

liempo (das)

Fig. 3. Tendencia de la mortalidad de larvas de segundo estadio de E. varivestis,

letal medio obtenido con el aislado BbCO1 de 5. bassiana

(10.59 das).

dada por el tiempo

4.3 Evaluacin de la actividad enzimtica de las lipasas de aislados. de 8.

bassiana

Con el fin de evaluar la actividad enzmtica de las lipasas de los aislados de B.

bassiana, los datos de actividad meda fueron sometidos a anlisis de varanza
(cuadro 6).

Cuadro 6. Anlisis de varianza de actividad de las lipasas de los aislados de B.

bassiana.
Fuentes de Grados de

Suma de

Cuadrado

variacin

cuadrados

medio

328.8984

109.6328

Aislamientos

libertad
3

Error

28

Total

31

27.7187

Valor de F

P>F

calculada
110.7452

0.000

0.9899

356.6171

Coeficiente de variacin= 8.2O%

La comparacin de medias muestra que e! aislado BbCO1 presenta un valor

significativamente mayor de actividad de lipasas (16.75),

mientras que BbCR

presenta un valor menor con respecto a los dems (7.75), asimismo se observa que
los aislados BbZ1 y BbD2 son similares en esta actividad (12.56 y 11.50
respectivamente) (Fig. 4).

Fig. 4. Actividad enzimtica de lipasas (en mm de dimetro de halo) de los aislados BbCOl , BbZl,
BbD2 y BbCR

de 5. bassiana. Barras con la misma letra son estadsticamente similares.

4.4 Correlacin de la actividad de las lipasas de los aislados de B. bassiana

con la virulencia

Con el fin de evaluar la correlacin existente entre las variables de actividad

enzimtica de las lipasas y la virulencia de los aislados de 5. bassiana, los datos
respectivos (cuadro 7) se sometieron a un anlisis de correlacin.

Cuadro 7. Actividad lipasa (mm) y datos de virulencia de los aislados de 5. bassiana

sobre E. varivestis.
Aislado

Actividad lipasa

Virulencia

BbCOl

16.75

61.22

BbZl

12.56

41.57

BbD2

11.5

32.44

BbCR

7.75

31.06

El coeficiente de correlacin fue de 0.92, no significativo.

En la Fig. 5 se observa como el aislado con mayor actividad lipasa presenta la mayor
virulencia (BbCOl); lo mismo ocurre con los dems aislados, hasta llegar al aislado
con menor actividad lipasa y con la menor virulencia (BbCR),

No obstante que sta

figura muestra la relacin que existe entre las dos variables, en el anlisis de
correlacin sta no es significativa.

18

70

1 6

60

BbCOl

BbZl

BbD2

BbCR

Aislados
+Activdad

lipasa +Virulencia

Fig. 5. Correlacin entre actividad lipasa y virulencia de los aislados BbCOl, BbZl , BbD2 y BbCR de
6. b a s s a n a .

4.5 Caracterizacin de los aislados de B. bassiana con base en los perfiles de

isoesterasas

La expresin de las bandas de isoesterasas, en geles de PAGE - gradiente y de

enfoque isoelctrico, se observa en las Figuras 6 y 7, respectivamente. La.
disposicin de las bandas en ambos geles muestra que los aislados son diferentes
entre ellos, y presentan bandas comunes.

Azul de comassie
A

Expresin de enzimas
B

Fig. 6. Gradiente de poliacrilamida, teido con azul de comassie (A) y con sal azul base RR (6). Los
carriles 1, 2, 3 y 4 corresponden a los aislados BbD2, BbCR, BbCOl y BbZl respectivamente,
mientras que el 5 a N. rileyi.

En el gel (Fig. 6 B) se present un total de 8 bandas, donde se observan distintos

perfiles de las enzimas

CC

y p esterasas para cada aislado; existen dos bandas que

son comunes entre los aislados de B. bassiana (E y F), y una que se presenta en
todos los aislados (F). Los aislados BbD2 y BbCR muestran bandas exclusivas (B, C,
D G y H)
Los aislados BbCOl y BbZl son similares al presentar las mismas bandas (E y F),
sin embargo, stas se localizan en los cuatro aislados estudiados. de B. bassiana.
Por otro lado, se observa una marcada intensidad en la banda F del carril 5, que

corresponde al hongo entornopatgeno N. rileyi y que se manifiesta en todos los

aislados.

En la Fig. 6 (A), que corresponde al gel teido con azul de comassie, se aprecia el
total de protenas presentes en cada extracto. Se observa gran nmero de bandas
para los aislados de B. bassiana (1, 2, 3 y 4), mientras que para N. rileyi, se observa
una banda, que coincide con la expresada por la reaccin de las isoesterasas (F) en
el mismo aislado.

Con el objetivo de hacer una mejor drferenciacn entre aislados, se desarroll la

tcnica de enfoque isoelectrico (gradiente de pH) y se caracteriz a los aislados con
base en los puntos isoelctricos (PI) de las enzimas OL y B esterasas, asimismo se
ti un gel con azul de comassie (Fig. 7 A) y uno ms para observar la expresin de
las enzimas por la reaccin en la presencia del substrato (Fig. 7 B).

El gel de enfoque isoelctrico muestra mayor resolucin de bandas, al manifestarse

mayor cantidd de stas en diferentes perfiles para cada aislado de B bassiana y N.
rileyi (Fig. 7).

b
6.34 >
6.10 >
5.99 >
6.87

4.92
4.80

>
>

Fig. 7. Gradiente de pH por enfoque isoeltrico, tenido con azul de comassie (A) y con sal azul RR
(B). Los caniles 1,2,3 y 4 corresponden a los aislados BbD2, BbCR, BbCO1 y BbZ1 respectivamente,
mientras que el 5 a N rleyi.

En la Fig. 7 (B) se observa un total de1

1bandas de isoesterasas expresadas con
base en su punto isoelctrico, se presenta una banda en comn para todos los
aislados (H). De la misma forma que en la Fig. 6 (B), el aislado BbCR presenta el
mayor nmero de bandas.
Con base en la presencia o ausencia de bandas de isoesterasas en los geles de
PAGE - gradiente y enfoque isoelctrico de las Fig. 6(B) y 7(B), se calcul el ndice

63

de Jaccard, con el fin de observar la similitud entre aislados, as como las diferencias
por la tcnica empleada (cuadro 8).

Cuadro 8. Indice de Jaccard entre aislados de B. bassiana y N. rileyi en geles de

PAGE _ gradiente y enfoque jsoelectrico4
. . . . -- -.- -- -- .
Aislados

ndice en PAGE - gradiente.

hdice en EIE

B b D 2y BbCR

0.37

0.40

BbD2 y BbCOl

0.28

0.28

BbD2 y BbZl

0.28

0.25

BbD2 yNr*

0.20

0.25

BbCR yB b C O l

0.33

0.42

BbCR y BbZl

0.33

0.25

BbCR yN r

0.16

0.11

B b C O ly BbZl

1.0

0.66

BbCOl yNr

0.5

0.25

0.5

0.5

I BbZl y Nr
Aislado de N rileyi.

En el cuadro 8 se aprecian los ndices de similitud que existen entre los aislados de
B bassiana y N. rileyi con base en los perfiles de isoesterasas expresados por las
tcnicas de PAGE - gradiente y enfoque isoelctrico. Segn los datos de similitud, los
aislados BbCOl y BbZl son similares, ya que en la primer tcnica presentan un
ndice de similitud de 1.0, y en la segunda un ndice de 0.66.

Por otro lado, se observa que los ndices de similitud entre el aislado de N. rileyi y los
aislados BbCOl y BbZI son de 0.5 en PAGE - gradiente, sin embargo, si se
observan las Fig. 6.(B) y 7 (B), presentan bandas que son comunes entre todos los
aislados. Asimismo, se aprecia que los aislados BbCR y Nr son los ms distantes en
similitud por ambas tcnicas.

V. DISCUSIN

En la presente investigacin no se observ una relacin clara entre la actividad

enzimtica de las lipasas de lo aislados
varivestis

de 8. bassiana con la virulencia sobre E.

debido a que el coeficiente de correlacin no fue significativo (0.92).

Aunque, el aislado con mayor actividad de las lipasas, mayor virulencia, as como los
TL50 favorables de control los present el aislado BbCO1. Los aislados BbZ1 y BbD2
que fueron estadsticamente parecidos en su actividad lipoltica, presentan valores de
TL50 similares (20.92 y 20.02, respectivamente) en larvas de primer estadio.

Estos resultados coinciden con los reportados por Varela y Morales (1996), al sealar
que no existi correlacin entre la virulencia y la actividad lipasa de los aislados
estudiados sobre H. hampei; no obstante que el aislado con la mayor actividad de las
lipasas fue el ms virulento; asimismo Sosa et a/. (1994),

reportan que en el

experimento realizado por ellos, no existi una relacin clara entre actividad
enzimtica y la virulencia de los aislados estudiados, aunque asumen que la alta
virulencia de un aislado fue debida a su mayor actividad Ipoltica.

Hegedus y Khachatourians (1995), y Bidochka et a/. (1997), reportan que la actividad

de las lipasas de los hongos entornopatgenos est estrechamente relacionada con
la virulencia; sin embargo, enfatizan que la importancia de estas enzimas en la
virulencia depende de muchos factores; por lo que la correlacin no significativa
entre actividad lipasa y virulencia presentada en sta investigacin se debi a la
influencia de otros factores. Se reporta que varios factores intervienen en la
virulencia de los hongos entornopatgenos (Gupta ef a/., 1994; Feng et a/., 1994;
Kang et al., 1998); la produccin de otras enzimas es uno de los factores principales
que participan en la regulacin de la virulencia y en la especificidad al hospedero (St.
Leger, 1993; Gupta et al., 1994; Hajek y St. Leger, 1994); as, las proteasas,
quitinasas, amilasa, adems de las lipasas de 5. bassiana, son un grupo de enzimas
que degradan los componentes cuticulares importantes y proporcionan nutrientes al

hongo (Bidochka y Khachatourians, 1990; Feng et al., 1994; Hegedus y

Khachatourians, 1995).

La virulencia de los hongos entornopatgenos esta influenciada por la va de entrada

al hospedero, el modo de aplicacin y el aislado utilizado (Harrison et al., 1993). No
obstante que las conidias son ingeridas por el insecto, la virulencia del hongo
depender de que stas germinen y logren provocar la infeccin (Alle et al., 1990), o
que no germinen y sean desechadas a travs de las heces (St. Leger, 1993;
Bidochka et al., 1997). Lo anterior podra parcialmente explicar los bajos valores de
virulencia de los aislados sobre el insecto en los bioensayos realizados en esta
investigacin, dado que la tcnica de inoculacin utilizada a travs del alimento
podra haber ocasionado una disminucin del efecto del hongo, y los valores de TL50
obtenidos para los aislados evaluados son elevados y alcanzaron los 20 das.
Los resultados coinciden con los obtenidos por Todorova et al. (1994) al aplicar B.

bassana e n e l alimento d e Coleomegilla maculata T i m b e r l a k e ( C o l e o p t e r a :

Coccinellidae), donde dos cepas de B. bassiana no causaron mortalidad despus de
la ingestin, sino hasta que se aplic por contacto; las larvas del coccinelido fueron
susceptibles a todas las concentraciones utilizadas; una de las cepas caus
mortalidad no significativa, mientras que la ms virulenta ocasion hasta un 77.8%
de mortalidad.
La baja mortalidad en larvas y adultos de E. varivestis, ocasionada por los aislados
de B. bassiana durante la presente investigacin tambin podra deberse al poco
contacto del insecto con las conidias en las hojas de frijol. Sin embargo, se han
obtenido resultados positivos de infeccin en larvas del mayate de junio Phyllophaga
sp. (Coleoptera: Scarabaeidae) al administrar conidias de B. bassiana en el alimento
(Poprawski y Yule, 1991).

Los aislados de hongos entornopatgenos con TL50 mayores a los 14 das se

consideran no patognicos (Samuels et al., 1989), por lo que los TL50 obtenidos con

los aislados BbD2 y BbZl de B. bassiana sobre larvas de primer estadio de E.

varvests, y BbCOl sobre larvas de tercer y cuarto estadio, mayores a los 14 das,
no son patognicos a ste insecto plaga (20.92, 20.02, 19.19 y 16.71 das,
respectivamente), En contraste, el aislado BbCOl presenta valores de TL50
favorables para el primer y segundo estadio larval de E. vativesfis (5.79 y 10.59 das,
respectivamente).

Los porcentajes de mortalidad ocasionados en adultos de E. varivestis durante la

presente investigacin fueron bajos (de 0 a 12.5% al da 20 de evaluacin), por lo
que el TL50 no pudo ser calculado, al respecto, Steinkraus et al. (1991), menciona
que los adultos generalmente repelen la infeccin de hongos entomopatcigenos.
Resultados similares fueron reportados por Quintinela ef al. (1990), al aplicar
concentraciones diferentes de conidias de cinco aislados de 5. bassiana sobre larvas
y adultos del picudo Chalcodermus bimaculatus Fiedles (Coleoptera: Curculionidae),
donde observaron que el adulto es considerablemente menos susceptible que la
larva, al reportar un 30 % de mortalidad despus de los 21 das de la aplicacin.

Por otro lado, se reporta que la muda de los insectos tiene efecto sobre el desarrollo
de la infeccin ocasionada por los hongos entornopatgenos. As, la enfermedad
fngica se desarrolla ms rpidamente en larvas de L. decemlineata

que mudaron

recientemente y mueren, mientras que otras son capaces de mudar, evitar o alargar
el proceso de infeccin sin mostrar signos de dao o enfermedad, hasta que el
hongo finalmente invade el organismo y causa la muerte (Vey y Fargues, 1977).
El adulto del escarabajo Alphitobius

daperinus (Panzer) (Coleoptera: Tenebrionidae)

es menos susceptible a la infeccin con 5. bassiana que la larva. Algunas larvas

infectadas logran pupar y la esporulacin ocurre en la pupa. Los adultos
generalmente repelen la infeccin, y la mortalidad no excede el 27% (Stenkraus et

al., 1991).
La ausencia de diferencia estadstica significativa en susceptibilidad de los cuatro

estadios larvales es una muestra de que no todas las larvas de los primeros estados
son ms susceptibles a la infeccin de 8. bassiana, lo anterior concuerda con lo
mencionado por Anderson et al. (1989) al reportar que la mortalidad de larvas
ocasionada por el hongo es extremadamente variable, por lo que no se debe
generalizar que los primeros estadios son los ms susceptibles. En el caso de L.

decemlineata

la mayor mortalidad se presenta en larvas de los ltimos estadios, as

como en adulto (Anderson et a/. , 1988).

Por otro lado, este hongo se reporta como virulento sobre adultos de Hippociamia
convergens Guerin (James y Lighthart, 1994),

escarabajo benfico de la familia

Coccinellidae. Existe evidencia de que los aislados de B. bassiana generalmente

tienden a ser ms virulentos a su hospedero original, o especies cercanamente
relacionadas;

aunque,

tambin hay excepciones, en bioensayos sobre L.

decemlineata con 50 aislados de B. bassiana colectados en diferentes pases y de

diferentes insectos, se obtuvieron valores de TL50 de 2 a 10 das (Feng et al., 1994);
Varela y Morales encontraron que aislados originarios de colepteros fueron menos
virulentos sobre H. hampei, que otros aislados.
El hospedero original no es un indicador de confianza en la probable virulencia de un
aislado especfico a un hospedero (Feng y Johnson, 1990; James y Lighthait, 1994).
En la presente investigacin los aislados utilizados fueron originalmente extrados de
insectos del orden Coleoptera; pero aparentemente el origen no interfiri en los TL50
obtenidos, debido a que variaron de 5 a ms de 20 das. Si se quisiera evaluar el
efecto del origen, tendran que evaluarse aislados

de diferentes orgenes e incluirse

de la familia Coccinellidae o bien de E. varivestis.

Los perfiles de isoesterasas de B. bassiana, obtenidos durante la presente
investigacin, resultan diferentes para cada aislado en ambas tcnicas empleadas, la
misma variabilidad entre aislados de B. bassana fue reportada por Castrillo y Brooks
(1998), a travs de enfoque isoelctrico, y por Varela y Morales (1996) en geles de
PAGE - gradiente.

Este polimorfismo en perfiles de soesterasas en aislamientos geogrficos de B

bassiana se presenta como resultado del proceso evolutivo, como las mutaciones,
ciclo parasexual, procesos de seleccin natural relacionados a los factores bioticos y
abiticos, seleccin del hospedero, autolisis, y heterolisis (Poprawski et al., 1988;
Perkins, 1991),

Asimismo, ste polimorfismo es un indicador de la existencia de variabilidad gentica

(Rhiba et al., 1989; Tigano-Milani et al., 1990; St. Leger el al., 1992; Rakotonirainy et
al., 1994; Varela y Morales, 1996). Adems, la amplia distribucin de diferentes
aislados, y el rango de hospederos favorecen la existencia de variacin gentica. Sin
embargo, el anlisis molecular contribuira ms ampliamente en el conocimiento de la
diversidad gentica en aislados de hongos hyphomycetes (Riba et al., 1989).

La variacin en perfiles de isoesterasa, es usada principalmente para distinguir entre

aislados o especies de un mismo origen y aislados exticos introducidos a un
ecosistema nuevo (Rakotonirainy et al., 1994; Castrillo y Brooks, 1998), as como
para conocer la potencial capacidad de un aislado en su adaptabilidad ecolgica
(Riba et al., 1986).

En la presente investigacin el aislado ms virulento BbCOl present el menor

nmero de bandas (2), y por expresin de soesterasas es similar a BbZl en un
ndice de 0.66 por EIE, y en 1.0 por PAGE - gradiente, mientras que se diferencian
claramente por actividad lipoltica y virulencia. El aislado BbCR con la mayor cantidad
de bandas (7), presenta igual virulencia que los aislados BbD2 y BbZl, sin embargo
presenta menor actividad lipoltica que los dems aislados, y con ndices de similitud
muy bajos por EIE (0.40, 0.25, y 0.42 con los aislados BbD2, BbZl y BbCOl
respectivamente).

En el gel de PAGE - gradiente (Fig. 5B), todos los aislados presentan una banda en
comn (F), asimismo una banda exclusiva de los aislados de 8. bassiana (E). Lo

mismo ocurre en la caracterizacin de enfoque isoel&trico (gradiente de pH) (Fig.

6B), al presentarse una banda en comn para todos los aislados (H). En este tipo de
gel se observa una mejor separacin de bandas que en el anterior (Riba et al., 1986;
Castrillo y Brooks, 1998).

El uso de un slo tipo de enzima puede ocasionar una caracterizacin deficiente

debido a la similitud entre los perfiles electroforticos, por lo que este riesgo puede
ser disminuido si se utilizan varios sistemas enzimticos (Varela y Morales, 1996;
Sosa et al., 1994). Por otro lado, resulta difcil hacer comparaciones entre los
estudios debido a la naturaleza de cada investigacin y los procedimientos
empleados, as como los diferentes tipos de isoenzimas, pero una conclusin comn
entre ellos es la presencia del polimorfismo (Castrillo y Brooks, 1998).

VI. CONCLUSIN

Se demostr que B bassiana es virulento sobre E. vativestis.

El aislado BbCOl de 8. bassiana tiene potencial como agente de control biolgico de

E. varivestis, ya que present un TL50 de 5.79 y 10.59 das en larvas de primer y
segundo estadio respectivamente.

No se present una evidencia clara de que la actividad enzimtica de las lipasas de

B bassiana est relacionada con la virulencia sobre E. varivestis.

Del mismo modo, se pudo constatar que los perfiles de isoesterasas varan entre
aislados, de acuerdo a la metodologa usada.

Se recomienda continuar con la evaluacin y caracterizacin de aislados y especies

de Beauvetia, con el fin de encontrar hongos capaces de ser utilizados como agentes
de control biolgico de E. varivestis.

VII. LITERATURA CITADA

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Stuttgart. pp. 217 - 231.

DR. JAIME MOLINA OCHOA

COORD. DE POSGRADO EN BIOTECNOLOGIA
PRESENTE:

Por medio de la presente me permito informar a usted que la tesis titulada CARACTERIZACIN
DE AISLADOS DE Beauveria bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes) Y SU VIRULENCIA
SOBRE SOBRE Epilachna varivestis (Coleoptera: Coccinelhdae), realizada por la C. Martha
Patricia Espaa Luna, estudiante de la Maestra en Ciencias, rea Biotecnologa, reune los
requisitos de forma y contenido, para que se le autorice la impresin de la misma. Por lo anterior, el
Dr. Sergio Hugo Snchez Rodrguez y un servidor (ASESORES DE LA TESIS) autorizamos a la
estudiante, para que haga llegar a usted el documento, con el fin de que sea revisado por el H.
cuerpo acadmico que el Consejo Tcnico del Posgrado designe.
Sin ms por el momento, aprovecho la oportunidad para saludarlo.

ATENTAMENTE
Tecomn, Col. a ll de mayo de 2000

ccp. Archivo.

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS

CENTRO REGIONAL DE ESTUDIOS NUCLEARES
Dr. Sergio Hugo Snchez Rodrguez
Cipres Nm
Fraccto La PeAuela
Zacatecas, Zac., 98063 Mxico.
E-Mail: smdck@cantera.reduaz.mx
Tel/Fax (492) 27043

Zacatecas, Zac. A 17 de Mayo del 2000.

Dr. Jaime Molina Ochoa.

Coord. Acadmico del Posgrado en Biotecnologa
de la Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias
de la Universidad de Colima.
Dr. Molina:
La presente, es con el fn de informar a usted que la tesis titulada
Caracterizacin de aislados de Beuveria bassiana (Deuteromycotina:
Hyphomycetes) y su virulencia sobre Epilchna varivestis (Coleoptera:
Coccinellidae), realizada por la C. Martha Patricia Espaa Luna, estudiante de
la Maestra en Ciencias, rea Biotecnologa, reune los requisitos de forma y
contenido, para que se autorice la impresin de la misma. Por lo anterior, el Dr.
Roberto Lezama Gutirrez y un servidor (Asesores de la Tesis) autorizamos a
la estudiante, para que haga llegar a usted el documento, con el fin de que sea
revisado por el H. cuerpo acadmico que el Consejo Tcnico del Posgrado
designe.
Agradeciendo de antemano la atencin prestada a la presente, quedo de
usted.

Dr sergio ;;Y&~;;JY;TF
.
Asesor de la Tesis. Laboratorio de Biologa
Celular del CREN-UAZ
ccp. C.P. Gillermo Torres Garca. Dir. Gral. Educ. Sup. de la U. de Colima.
ccp. Dra. Sara Griselda Martnez Covarrubias. Dir. Gral. del Posgrado.
ccp. Dr. Carlos Izquierdo Espinal. Delegado Regional No. 2.
ccp. Ing. Rodolfo V. Morentin Delgado. Dir. de la FCBA.
ccp. Interesado.
ccp. Archivo.

Universidad de Colima
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Votos aprobatorios

Dr. Jaime Molina Ochoa

Coordinador del Posgrado de la FCBA
Presente
Por medio de este conducto informo a usted que ha sido revisada y leda por segunda
ocasin el borrador de tesis de maestra titulado CARACTERIZACIN DE AISLADOS
D E
Beauveria bassiatm (DEUTEROMYCOTINA: H Y P H O M Y C E T E S ) , Y S U
VIRULENCIA SOBRE Ii@lachtm varivestis (COLEOPTERA: COCCINELLIDAE), que
presenta la C. Martha Patricia Espaa Luna alumna del programa de Maestra en
Ciencias, Are-a: Biotecnologa.
Considero que es un trabajo valioso y bien ejecutado, por lo anterior el manuscrito final
rene los requisitos necesarios para su impresin, por lo cual doy mi voto aprobatorio para
que la alumna pueda hacer sus trmites correspondientes de la obtencin de su grado.
Sin ms por el momento, agradezco la atencin por haberme distinguido con el honor de ser
revisor de la tesis mencionada, y me reitero a sus respetables rdenes.

Atentamente

c.c.p.c.c.p.c.c.p.c.c.p.c.c.p.-

Dra. Sara G. Martnez Covarrubias- Directora General de Posgrado

Dr. Carlos izquierdo Espinal.- Delegado Regional No.2
Ing. Rodolfo Morentn Delgado.- Director de la FCBA.
Interesada.
Archivo

Dr. Jaime Molina Ochoa

Coordinador del Posgrago de la FCBA
Presente
Por medio de la presente, tengo el agrado de informar a usted, que le y revis, por segunda
ocasin, el borrador de tesis de maestra titulado Caracterizacin de aislados de Beauveria
bassiana (Deuteromycotina:
Hyphomycetes), y su virulencia sobre Epilachna varivestis
(Coleoptera: Coccinellidae) que presenta la C. Martha Patricia Espaa Luna, alumna del
programa de maestra en ciencias, rea: Biotecnologa, y detect, que todas y cada una de
las observaciones y recomendaciones que hice al primer borrador fueron consideradas
satisfactoriamente en el presente manuscrito.
Por lo anterior, considero que ste manuscrito cumple con los requisitos necesarios para
que la alumna presente su examen de grado en el programa de maestra en ciencias rea:
Biotecnologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias de la Universidad de
Colima.
Sin ms por el momento, agradezco la atencin por haberme distinguido con el honor de ser
revisor de la tesis mencionada, y me reitero a sus respetables rdenes.
Atentamente

c.c.p.c.c.p.c.c.p.c.c.p.-

Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal.- Delegado Regional No. 2.

Ing. Rodolfo V. Morentn Delgado-. Director de la FCBA.
Interesada
Archivo.

Centro Universitario de Invcst@cin y DesnrroIlo

&opccuario

(CUID4)

OF. No. 049/CUIDA/OO

C. ING. RODOLFO V. MORENTIN DELGADO

DIRECTOR DE LA F.C.B,A: --- -..
PRESENTE:

..

..

Con fundamento en las funciones como revisor de la tesis de Maestra en

Ciencias del programa de Botecnologia, que present la C. Martha Patricia
Espaa Luna, la cual lleva por ttulo, CARACTERIZACIN ENZIMTICA DE
AISLADOS DE
Beauveria
(DEUTEROMYCOTINA:
bassiana
HYPHOMYCETES), Y SU VIRULENCIA SOBRE Epilachna vativests
(COLEOPTERA: COCCINELLIDAE),
me permito informarle que he concluido
dos revisiones en cuanto a forma, estilo y contenido del documento y considero
que las modificaciones y sugerencias han sido acatadas con precisin.
Sin otro particular de momento reciba un cordial saludo.

ATENTAMENTE
ESTUDIA LUCHA *TRABAJA
MAN,
COL., A 02 DE OCTUBRE DE 2000
Ta
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DR. A&ONSO PESCADOR RUBIO

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C.C.P.- D R . J A I M E M O L I N A O C H O A . - C o o r d i n a d o r d e l Posgrado d e
Botecnologia.C.C.P.- MARTHA PATRICIA ESPAA LUNA.-interesada.C.C.P.- ARCHIVO.APR/fgv**
Por el saber compartido. Ao 2000, 60 aniversario de la Universidad de Colima.

K m 40, autopscColimcl-F.~~~1~2anillo / k~rh.?, Cd:nw? / AP 22, C P 281 CO / b!&ono @! :332) c 20 43, fau 4 66 64
. .-