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DETECCIN DE HONGOS

INTRODUCCIN
Significado
Presencia y supervivencia
Patrones de crecimiento e identificacin
TCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA
Medios
Procedimiento

TCNICA PARA LEVADURAS


Medios
Procedimiento
Bibliografa

DETECCIN DE HONGOS

INTRODUCCIN
Significado
Los hongos, incluyendo levaduras y especies filamentosas o mohos,
son microorganismos heterotrficos acloroflicos de distribucin
universal que poseen ncleos organizados y, en general, paredes
rgidas. Pueden encontrarse siempre que exista materia orgnica no
viviente, aunque algunas especies son patgenas y otras
parasitarias. En el agua primaveral prxima a la fuente, el nmero de
esporas micticas suele ser mnimo. El agua corriente no
contaminada de los arroyos tiene una proporcin relativamente grande
de especies que constituyen los autnticos hongos acuticos
(especies que poseen zoosporas flageladas y gametos),
Hyphomicetos acuticos y hongos del suelo.
El agua moderadamente contaminada puede portar clulas o esporas
de los tres tipos, aunque presenta normalmente menos hongos
acuticos verdaderos e Hyphomicetos acuticos mientras que los
hongos del suelo son ms numerosos. El agua muy contaminada
lleva grandes cantidades de hongos del suelo. El grupo denominado
hongos del suelo comprende hongos de tipo levadura, de los que se
han aislado muchas especies en estas aguas contaminadas.
La asociacin entre densidad mictica y carga orgnica sugiere que
los hongos podran ser tiles indicadores de contaminacin. Por
desgracia, no se ha encontrado ninguna especie o grupo de
importancia a este respecto. Pueden haber algunos casos especiales
excepcionales; por ejemplo, la distincin principal entre las
levadurasCandida lambica y C. krusei es su capacidad para utilizar las
pentosas.
La primera de estas especies crece bien con estos azcares, por lo
que podra ser utilizada como indicador de la presencia de pulpa y
vertidos de fbricas de papel, que son muy ricos en dichos
azcares. Algunas especies de levaduras y hongos filamentosos son

caractersticas de aguas ms clidas y podran ser tiles indicadores


de contaminacin trmica.
Dado que los hongos poseen una gran capacidad enzimtica, pueden
degradar activamente muchas de las sustancias naturales complejas y
algunas de origen sinttico, incluyendo ciertos pesticidas. Casi todos
los hongos son aerobios o microaeroflicos, aunque algunas especies
muestran un metabolismo anaerobio limitado y muy pocas son
capaces de crecer en un medio totalmente anaerobio Ciertas especies
no precisan luz.

Presencia y supervivencia
Se han encontrado hongos en hbitats extremos, diferentes y remotos,
incluyendo lagos, charcas, ros, arroyos, estuarios, medios marinos,
aguas residuales, lodos, aguas de torrenteras rurales y urbanas,
pozos, desages cidos de minas, refineras de asfalto, sistemas de
combustible de aviones a reaccin y sedimentos acuticos.
a) Hongos del agua potable: Se han encontrado hongos en el agua
potable y en la superficie interna de las tuberas del sistema de
distribucin 8, en los que sobreviven al tratamiento del agua o en el
que penetran y permanecen viables una vez realizado el
tratamiento. Las macroconidias tuberculadas de Histoplasma
capsulatum pueden atravesar un filtro de arena rpido de 0,75
m. La sedimentacin simple o la floculacin con almina y reposo
eliminaron del 80 al 99 por 100 de las esporas. Si estas
macroconidias relativamente grandes (8 a 14 m), globulosas y
tuberculadas pueden resistir al tratamiento, no resulta sorprendente
que otros hongos, que caractersticamente tienen esporas ms
pequeas, aparezca en el agua tratada.
Si han sobrevivido al tratamiento o se han introducido despus, las
esporas micticas pueden permanecer viables durante largos
perodos de tiempo. Se han conservado perfectamente hongos
patgenos en agua destilada esterilizada durante intervalos

relativamente largos. Las esporas de H. capsulatum conservadas


en agua sin tratar del ro Ohio y en agua del grifo esterilizada
conservaban su alta capacidad infectiva para el ratn al cabo de 400
das.
El sabor y el olor del agua potable se asocia con la presencia de
organismos procariticos como bacterias,
actinomicetos y cianobacterias. Sin embargo, tambin los hongos
pueden participar en ellos.
Se han cultivado propagulas de 19 gneros de hongos filamentosos en
un sistema de agua superficial dorada y un sistema de distribucin
profundo no clorado. El nmero medio de unidades formadoras de
colonias (UFC) fue 18/ 100 mL en el segundo y 34/100 ml en el
primero.
En Finlandia se encontraron hongos en ros, lagos y estanques que
suministraban a nueve comunidades con agua filtrada a travs de
arena, tres con agua profunda artificialmente recargada, de las que
dos utilizaban coagulacin qumica y agua desinfectada. Los hongos
mesoflicos fueron frecuentes en todas las muestras de agua no
tratada, aunque los termotolerantes fueron ms abundantes en el agua
de los nos que en la procedente de lagos. Se demostr que la
coagulacin qumica y la desinfeccin eran mucho ms eficaces para
eliminar los hongos que la filtracin en arena y desinfeccin. El hongo
ms comn fue Aspergillus fumigatus.
Cinco sistemas de agua profunda clorados de Estados Unidos
presentaron un recuento promedio por muestra positiva de alrededor
de 5,5 UFC/100 ml. En Francia, se recuperaron levaduras del 50 por
100 de 38 muestras, y hongos filamentosos en el 81 por 100.
Con las excepciones de Aspergillus fumigatum, A.flavus y A. niger, los
hongos aislados del agua potable no suelen ser considerados
mdicamente importantes, pero las infecciones micticas pueden ser
graves en los sujetos con depresin del sistema inmune. Casi todos
los hongos son saprofitos comunes del suelo.

b) Hongos en las aguas recreativas: Puede esperarse la presencia de


algunos hongos patgenos para el hombre en las aguas
recreativas, como piscinas y playas, y en las instalaciones de
limpieza acompaantes, como las duchas.
Trichophyton rnentagrophytes, causante de la tia de los pies y del pie
de atleta, se ha encontrado en el suelo de madera de una ducha.
Siete especies de hongos patgenos y potencialmente patgenos se
cultivaron en 361 muestras de arena de playa en Hawai, mientras que
en la de la costa bltica alemana, en Portugal y en la costa del
Adritico se ha aislado Epidermophyton.
c) Supervivencia tras la cloracin: Se ha cultivado una levadura no
identificada de otros organismos que sobrevivieron a la cloracin de
los efluentes de aguas residuales. Esta levadura sobrevivi a 1
mg/l de cloro libre durante 10 minutos mientras que E. coli no pudo
superar un contacto de 5 minutos con 0,03 mg/l de cloro libre. Se
conoce la cantidad de cloro necesaria para el control de los hongos,
al menos para C. albicans. Se ha demostrado que las clulas de
esta especie se inactivaron con 4 mg/l de cloro a los 30 minutos,
cuando el recuento inicial era de 103/ml.
En un estudio efectuado en Illinois con C. parapsilosi, una levadura
de frecuente cultivo que se sabe produce problemas sanitarios en
los trpicos, se precisaron mayores cantidades de cloro para inactivar este microorganismo que para eliminar las bacterias
coliformes. Se han sugerido mecanismos de inactivacin por cloro
en los estadios asimilativos de las levaduras y otros
microorganismos. Las clulas micticas, especialmente las
conidias, pueden sobrevivir a dosis mucho ms altas de cloro que
las bacterias coliformes. Incluyendo tina exposicin de 10 minutos a
10 mg/l de cloro cuando el recuento inicial de esporas fue
aproximadamente de 106 1/ml.

Patrones de crecimiento e identificacin

En el agua existen dos patrones bsicos de crecimiento mictico. Los


hongos acuticos verdaderos producen zoosporas o gametos que se
mueven por medio de flagelos, de los tipos ltigo o flec. Algunos,
especialmente los Tricomicetos (hongos que habitan en el intestino
posterior de ciertos gusanos, larvas de mosquito, etc.), presentan
estadios ameboides. Los hongos acuticos se recogen, tpicamente,
exponiendo cebos adecuados (alimentos slidos) en el medio que se
estudia o en una muestra de laboratorio. En los Estados Unidos ha
sido relativamente poco el trabajo realizado acerca de estos hongos
en las aguas contaminadas, mientras que han sido ampliamente
estudiados en Inglaterra, Alemania y Japn.
El segundo crecimiento mictico es inmvil en todos los estadios de su
ciclo vital. El crecimiento y la reproduccin son habitualmente
asexuados (anamrficos) Se han identificado tres procesos de
desarrollo: a) crecimiento filamentoso con esporas blsticas o esporas
producidas en estructuras especiales; b) crecimiento filamentoso con
filamentos que se dividen en forma de articulacin (fragmentacin)
para formar esporas separadas denominadas artroconidias, como
ocurre en Geotrichurn y gneros afines, y c) crecimiento de clulas
hijas nicas producidas sobre cada clula progenitora, denominado
gemacin, tpico de las levaduras.
La identificacin de los hongos, que son considerablemente ms
grandes que las bacterias, depende de la morfologa de las colonias
en un medio slido, de su morfologa de crecimiento y reproduccin y,
en cuanto a las levaduras, de su actividad fisiolgica en los cultivos de
laboratorio. Un numero creciente de hongos suele indicar una carga
creciente de material orgnico en el agua o en el suelo.
Grandes nmeros de hongos similares reflejan un exceso de carga
orgnica, mientras que una microbiota diversificada implica una
poblacin ajustada a los orgnicos del medio. Pese a su amplia
distribucin, se ha prestado escasa atencin a la presencia y
significado ecolgico de los hongos en los hbitats acuticos. La
importancia de los hongos y sus actividades en el agua se comprende
cada vez mejor gracias al progresivo
conocimiento de su capacidad patgena para el hombre, los animales
y las plantas; su papel como alimento o fuente de energa; su actividad

en los procesos naturales de purificacin, y su funcin en la formacin


de sedimentos.
Una revisin de los estudios publicados sobre los hongos que
aparecen en el agua, las aguas residuales y sustratos afines
contaminados orgnicamente identific 984 especies: 133 de ellas
fueron

consideradas

Mastigomycotina

(hongos

con

zoosporas

flageladas); 79, Zygomycotina, casi todos hongos mucorceos; 161


fueron Astomycotina, incluyendo estados perfectos (teleomrficos) de
algunos

de

los

considerados

hongos

imperfectos;

18

fueron

Basidiomycotina u hongos imperfectos.


Del total, 133 especies fueron formadoras de zoosporas, 131 eran de
tipo levadura y 718 filamentosas. La mayor parte de las zoospricas
fueron halladas en aguas levemente o nada contaminadas, mientras
que del resto, menos de la mitad se encontraron en nmero suficiente
como para ser consideradas miembros de una poblacin, ni siquiera
durante breves perodos de tiempo. El significado de los hongos de
los medios acuticos y terrestres ha sido comentado detalladamente
La enumeracin cuantitativa de los hongos no es equivalente a la de
las bacterias unicelulares, porque la colonia mictica puede
desarrollarse a partir de una sola clula (espora), un agregado celular
(grupo de esporas o espora nica multicelular) o fragmento micelar o
pseudomicelar (que contiene ms de una clula viable) Se supone
que cada colonia mictica desarrollada en un cultivo de laboratorio
nace de una sola unidad formadora de colonias (UFC) que puede o no
corresponder a una sola clula.

TCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA

Excepto en comparaciones de las membranas de distintos fabricantes,


no se han descrito pruebas crticas de los filtros de membrana que se
refieran a su eficacia en el aislamiento de hongos. Se han utilizado
los componentes de los medios, los niveles de pH y los antibiticos en
procedimientos de siembra convencionales. Aparentemente, los
procedimientos descritos resultan satisfactorios.

Medios
Utilcese agar aureomicina-rosa de Bengala-glucosa-peptona no
modificado o modificado (MARGPA) o agar estreptomicinaterramicina-extracto de malta modificado (METEMM) La
concentracin de cada antibitico se eleva de 70 mg/l hasta 200 mg/l.
Dispnsese los medios en porciones de 5 a 7 mL en placas de Petri de
cristal o plstico (60 x 15 mm); son ms aconsejables las de plstico
con cierre hermtico.

Procedimiento
a) Preparacin y dilucin: Eljanse las diluciones que proporcionen
de 20 a 100 colonias por membrana.
b) Filtracin: Fltrense cantidades adecuadas de la muestra o
dilucin bien agitadas, en trilicato, a travs de filtros de membrana
con poros de un dimetro de 0,45 a 0,8 m.
c) Incubacin: Transfiranse los filtros a las placas, invirtanse stas
o no, e incbese a 15 0C durante 5 das en una atmsfera
hmeda. Tambin pueden incubarse a 20 0C durante 3 das, o
ms, en funcin de los hongos existentes.

d) Recuento y registro: Usando una lupa estereoscpica binocular


con un aumento de 10 x, cuntense todas las colonias de cada
placa elegida. Si es preciso retrasar temporalmente el recuento,
gurdense las placas a 4 0C durante no ms de 24 horas. Las
placas ideales tienen de 20 a 80 colonias por filtro.

TCNICA PARA LEVADURAS


Del nmero total de colonias micticas obtenido en aguas
contaminadas, hasta el 50 por 100 pueden corresponder a
levaduras. Los medios slidos, como los antes descritos, no permiten
el crecimiento de todas ellas; por tanto, puede ser til el empleo de
una tcnica de enriquecimiento cuantitativa adems del recuento en
placa.

Medios
Para el enriquecimiento, utilcese un medio lquido de nitrgeno baseglucosa; para cultivo, emplese el agar de extracto de levaduraextracto de malta-glucosa o el agar diamalt.
a) Medio lquido de nitrgeno base-glucosa: Disuivanse 13,4 g de
una base de nitrgeno levadura en 1L de agua destilada.
Esterilcese por filtracin. Preprense dos soluciones de 500 ml
cada una de glucosa en agua al 2 por 100 y 40 por 100 y
esterilcese por separado mediante filtracin. Para obtener el
medio definitivo, introdzcase en un erlenmeyer de 250 ml, con
tcnica asptica, 25 ml de solucin base de nitrgeno levadura y
25 ml de las soluciones acuosas de glucosa al 2 o 40 por 100 para
obtener concentraciones finales de glucosa de 1 por 100 y 20 por
100. Tpese el matraz con un tapn de algodn cubierto con una
gasa y gurdese hasta el momento de su empleo.

b) Agar de extracto de levadura-extracto de malta-glucosa


c) Agar diamalt:.

Procedimiento
a) Preparacin y dilucin de la muestra
b) Enriquecimiento: En distintos erlenmeyer de 250 ml, preprese un
medio de nitrgeno base levadura que contenga glucosa al 1 por
100 y 20 por 100. Inoclese con 1 ml de la dilucin adecuada de la
muestra e incbese a temperatura ambiente en un agitador
rotatorio con una velocidad de 120 a 150 oscilaciones/minuto
durante al menos 64 horas. Es necesario agitar los cultivos para
evitar el sobrecrecimiento de los hongos filamentosos.
c) Cultivo: Retrense los matraces del agitador y dejar reposar
durante 4 a 5 horas. Las levaduras, si existen, se depositarn en
el fondo, permaneciendo en suspensin las bacterias y hongos
filamentosos. Estos ltimos flotarn en la superficie o se adosarn
a la superficie del cristal en el menisco o por encima de ste. Con
un asa de alambre de nicromo, tmese el sedimento en la interfase
sedimento-sobrenadante de un frasco inclinado y simbrese con
estras en agar de extracto de levadura-extracto de maltaglucosa. Utilcense tres placas por matraz. Incbese a
temperatura ambiente, pero lejos de la luz solar directa, durante 23 das. No es necesario invertir las placas. Para obtener cultivos
puros, tmense muestras de colonias razonablemente aisladas y
vulvase a sembrar en el mismo medio o en placas de agar
diamalt. Deben obtenerse tantos cultivos puros como colonias
diferentes puedan identificarse.
d) Recuento: Es imposible obtener recuentos de placa significativos
tras este tipo de cultivo enriquecido. Si se supone que una sola
clula de la muestra original da lugar a una o ms colonias en las
placas tras su enriquecimiento, puede decirse que las levaduras, o
que determinados tipos de levadura, slo se encuentran en

cantidades mnimas que dependen de la ms alta dilucin positiva


obtenida. La recproca de esta dilucin es el nmero indicado de
levaduras en la muestra.

Bibliografa
Este documento tom como referencia el material acadmico
titulado:
Servicio Nacional de Aprendizaje -SENA-. Programa Tcnica
Profesional
en
Agua
Potable
y
Saneamiento
Bsico. Hipertexto "Microbiologa".