Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

Facultad de Ciencias Biologicas

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

BIOLOGIA MOLECULAR
Blga. Olga Libia Cjuno Huanca
Unidad Acadmica N 4: TECNICAS MOLECULARES Y SUS APLICACIONES

SECUENCIAMIENTO DE ADN
Sabemos..
La estructura de un determinado ADN est definida por la
ordenacin o "secuencia" de las bases nitrogenadas en la
cadena de polinucletidos, residiendo precisamente en
esta secuencia de bases la informacin gentica del ADN.
La estructura en doble hlice del ADN, con el apareamiento
de bases limitado (GC; A=T), implica que el orden o
secuencia de bases de una de las cadenas determina
automticamente el orden de la otra, por ello se dice que
las cadenas son complementarias.
.

SECUENCIAMIENTO DEL ADN

Secuenciar el ADN es analizar la
composicin de un fragmento de ADN para
saber qu genes tiene y qu producen esos
genes.
Los primeros intentos de secuenciar el
material gentico datan de mediados del
siglo XX. Las primeras tcnicas eran lentas
e ineficaces y se basaban en realizar la
lectura de copias de ARN.

 A finales de los aos 70 se desarrollaron los mtodos

que
permitieron
de
manera
simple
y
rpida, determinar la secuencia nucleotdica de
cualquier fragmento de ADN.
Estos primeros intentos de secuenciar cidos nucleicos
siguieron los pasos empleados en la secuenciacin de
protenas: romper las molculas en pequeos
fragmentos, determinar su composicin de bases y
deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes.
Este mtodo resulta relativamente sencillo para
protenas donde estas resultan de la combinacin de
hasta 20 aminocidos distintos, pero constituye un
problema en el caso de los cidos nucleicos donde la
secuencia resulta de la combinacin de nicamente
cuatro nucletidos diferentes.

METODOS CLASICOS DE
SECUENCIACION:
Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo qumico
y enzimtico) comparten etapas comunes.
Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar
radiactiva o fluorescentemente.
Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas
sencillas de ADN marcadas cuyos tamaos se diferencian
en una nica base. Estas cadenas de distintas longitudes
pueden separarse por electroforesis en geles
desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde
aparecen como una escalera de bandas cuya longitud vara
en un nico nucletido.
Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:
qumicos y enzimatcos

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en
1977.
Esta tcnica consiste en romper cadenas de ADN de
cadena sencilla marcadas radiactivamente con
reacciones qumicas especficas para cada una de
las cuatro bases. Los productos de estas cuatro
reacciones se resuelven, por electroforsis, en
funcin de su tamao en geles de poliacrilamida
donde la secuencia puede leerse en base al patrn
de bandas radiactivas obtenidas.

C only: Hydrazine in 1.5 M

NaCl, piperidine

C+T: Hydrazine, piperidine

G only: DMS, piperidine
A + G: DMS, formic
acid, piperidine

Rompe el ADN mediante 4 reacciones qumicas especficas

Mtodo enzimtico de Sanger

Este mtodo de secuenciacin de ADN fue diseado
por Sanger, Nicklen y Coulson tambin en 1977 y se
conoce como mtodo de los terminadores de cadena o
dideoxi.
Para este mtodo resulta esencial disponer de
un ADN de cadena simple (molde) y un
iniciador, cebador o "primer" complementario de
una regin del ADN molde anterior a donde va a
iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como
sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a
extender la cadena copiando de forma
complementaria el molde de ADN.

Frederick Sanger (1918)

AdR6G
(570 nm)

GdROX
(620 nm)

TdTAMRA (600 nm)

CdR110 (540 nm)

4 ddNTPs fluorescentes distintos

SECUENCIACION DEL ADN METODO DE SANGER

El mtodo de Sanger

1. PREPARACION DE 4 TUBOS

1.- Preparacin de los 4 tubos

2. POLIMERIZACION Y TERMINACION DE LA CADENA ddT

2.- Polimerizacin y terminacin de la cadena (ddT)

3. ELECTROFORESIS Y RECONSTRUCCION DE LA SECUENCIA DE LA CADENA

3.- Electroforesis y reconstruccin de la secuencia

El Premio Nobel de Qumica (1980)

METODOS AUTOMATICOS
SECUENCIACIN AUTOMTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMTICO
Es una alternativa al mtodo de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o
los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reaccin de
secuencia. Los productos de la reaccin se detectan directamente durante la
electroforsis al pasar por delante de un lser que al excitar los fluorforos
permite detectar la fluorescencia emitida.
Secuenciacin empleando cebadores fluorescentes
Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales
se aade el oligonucletido o cebador marcado con una sonda fluorescente
distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro
reacciones se mezclan en un nico tubo.
Secuenciacin empleando terminadores fluorescentes
Se realiza una nica reaccin de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs,
cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.

SECUENCIADORES AUTOMTICOS
Secuenciadores automticos capilares: Existen instrumentos de
electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al
sistema basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde este
soporte ha sido sustituido por un polmero que se inyecta de forma
automtica en un capilar antes de cargar la muestra de
secuenciacin; las muestras se van analizando una a una. Este tipo
de secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos
450pb.
Secuenciacin automtica en geles desnaturalizantes de
acrilamida/bisacrilamida: La secuenciacin automtica mediante
geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de
acrilamida/bisacrilamida
entre
dos
cristales
montados
adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los
mismos y que posteriormente se acoplar en el secuenciador
automtico para proceder a la carga de la muestras.

AdR6G
(570 nm)

GdROX
(620 nm)

TdTAMRA (600 nm)

CdR110 (540 nm)

4 ddNTPs fluorescentes distintos

R-110

R6G

T
TAMRA

ROX

Cada ddNTP emite una fluorescencia de distinto color

template

Se puede hacer la reaccin en un solo tubo, no en 4

Los productos de la PCR terminan con un ddNTP fluorescente

Cada color representa a un nucletido terminal

Electroforesis y reconstruccin de la secuencia

Electroferograma

La electroforesis capilar es mucho ms rpida

La electroforesis capilar se hace a gran escala

Electroferograma

Cada electroferograma secuencia entre 400 y 900 bases

OTROS MTODOS DE SECUENCIACIN

AUTOMTICA
Secuenciacin de ADN empleando microarrays
Los microarrays constituyen la ltima lnea de
tcnicas basadas en la interaccin de cadenas
complementarias de ADN. Este tipo de tcnicas
introducen bsicamente dos nuevas innovaciones:
el empleo de soportes slidos no porosos tales
como cristal que facilitan la miniaturizacin y la
deteccin basada en fluorescencia y el desarrollo de
mtodos de sntesis in situ de oligonucletidos a
altas densidades sobre el soporte slido.

 Existen muchas variedades de microarrays o ADN-chips como

tambin se les denomina. Desde los microarrays "artesanales"
realizados en el laboratorio a los ofrecidos por compaas de
biotecnologa, el principio que rige su diseo es el mismo: la
complementariedad de las cadenas aisladas de ADN: o propiedad de
las citadas cadenas de hibridarse con otras cadenas aisladas de ADN
que posean una estructura complementaria.
Bsicamente un microarray consiste en una matriz de "pocillos"
microminiaturizados sobre un substrato de vidrio en donde se
implantan, utilizando diversas tcnicas, cadenas simples de
oligonucletidos. El poder adherir una cadena corta de oligo sobre
una superficie plana es decisivo en el diseo de los microarrays.
En la fabricacin de microarrays se emplean tcnicas fotolitogrficas
anlogas a las utilizadas en microelectrnica. Un sustrato de vidrio se
trata qumicamente con determinados grupos reactivos para permitir
la implantacin de los oligonucletidos sobre el mismo; a
continuacin se deposita sobre el substrato una pelcula
fotodegradable y mediante la utilizacin de una plantilla y un haz
luminoso, se crea la estructuura de celdas del microarray.

 Pirosecuenciacin
Se trata de un mtodo simple y consistente, til para la secuenciacin de fragmentos
de ADN de tamaos pequeos o medianos.

APLICACIONES DE LA
SECUENCIACIN DE ADN
Deteccin de mutaciones
Secuenciacin de ADNs
fsiles
Diagnstico de enfermedades
genticas
Identificacin de especies y
control de cruces entre
animales
Proyecto genoma humano

 Deteccin de mutaciones
Esta tcnica nos permite localizar mutaciones
previamente descritas. Se emplea as la
secuenciacin de ADN como un mtodo de
diagnstico: una vez que se ha caracterizado la
relacin con una enfermedad de una determinada
mutacin puntual (mutaciones en el gen de la
galactosa 1P uridiltransferasa en la galactosemia,
mutaciones en c-Ras y cncer, etc..) o de una
pequea delecin (delecin de 3 bases en el gen
CFTR en la fibrosis qustica), puede desarrollarse un
mtodo de deteccin rutinario. La secuenciacin
automtica puede emplearse como mtodo de
screenig en la localizacin de nujevas mutacioines.

 Secuenciacin de ADNs fsiles

El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar
secuencias de ADN a partir de unas pocas copias
intactas presentes en especmenes de museo y
descubrimientos arqueolgicos en los cuales la
mayora de las molculas estn daadas o
degradadas, para proceder posteriormente a su
estudio mediante secuenciacin.

 Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin

Diagnstico de enfermedades hereditarias o
determinacin del sexo del feto previamente a
su implantacin en procesos de fecundacin in
vitro.
Una o dos clulas del pre-embrin se retiran en
el estado de 8 a 16 clulas, previo a la
implantacin. Estas pueden utilizarse para
amplificar un gen o genes especficos y as
estudiar la enfermedad gentica o el sexo
(utilizando genes especficos del cromosoma Y).

 Identificacin de especies y control de cruces entre

animales
Las tcnicas para identificar especies pueden ser muy
importantes para descubrir fraudes comerciales, tales como
vender carne de una especie ms barata a los precios de otra
ms cara, o el comercio ilegal de especies en peligro. Estos
estudios pueden realizarse utilizando el ADN mitocondrial, el
cual presenta secuencias altamente variables entre especies
distintas, aunque sean cercanas entre s, y bastante
conservadas dentro de la misma especie.
Los controles de relaciones parentales en animales tiene
importancia forense para el control de comercio ilegal de
especies protegidas. Individuos jvenes de especies en peligro
son sacados de sus lugares de nacimiento y "disfrazados" por
certificados veterinarios falsos. En estos caso, el estudio
familiar es el nico medio de descubrir el origen ilegal de los
individuos.

 Proyecto Genoma Humano

El Proyecto Genoma Humano fue un proyecto internacional
cuyo objetivo final es obtener una descripcin completa del
genoma humano a travs de la secuenciacin del ADN. El
genoma que se investiga es el genoma nuclear.
Desde su inicio, el proyecto ha sido justificado especialmente
por los beneficios mdicos que se espera obtener del
conocimiento de la estructura de cada gen humano.
Se pens que la informacin proporcionara una capacidad de
diagnstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen
de alguna enfermedad y se esper gran aporte a un marco de
trabajo para el desarrollo de nuevas terapias, adems de
nuevas estrategias para la terapia gnica.

SINTESIS QUIMICA DE ADN

Sntesis de oligonucletidos, es la sntesis qumica de fragmentos
relativamente cortos de cido nucleico con una secuencia estructural
qumica definida.
La tcnica es extremadamente til en la prctica actual en
laboratorios, porque provee un acceso rpido y barato
a oligonucletidos hechos a medida con una secuencia deseada.
Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN en una direccin de
5' a 3', la sntesis qumica de oligonucletidos se lleva a cabo en el
sentido opuesto, en la direccin 3' a 5'.
Actualmente, el proceso est implementado como una sntesis en
fase slida usando el mtodo de la fosforo-amidita y bloques de
construccin
de
fosforo-amidita
derivados
de
2
deoxinuclesidos (dA, dC, dG y T), ribonuclesidos (A, C, Gy U), o
nuclesidos qumicamente modificados, como los ANB.

Actualmente existen mquinas programables

para
sintetizar
rpidamente
secuencias
determinadas de ms de 100 nucletidos. Se
usan a menudo para generar sondas
moleculares en la bsqueda y caracterizacin de
determinados segmentos de ADN, y sobre todo
para producir los cebadores usados en la
reaccin en cadena de la polimerasa.

SNTESIS DE OLIGONUCLETIDOS
OBTENCIN QUMICA

FRAGMENTOS CIDO NUCLEICO

CARACTERSTICAS:
CCLICA
SNTESIS EN FASE SLIDA

OLIGONUCLETIDO SE
FORMA A PARTIR DE UN
RECEPTOR

GRANDES DIFERENCIAS CON LA SNTESIS DE LA CLULA:

NECESIDAD DE PROTECTORES
SE REALIZA EN UNA DISOLUCIN
FORMACIN : 3
5
SE REALIZA EN MAQUINAS AUTOMATIZADAS
NUCLEOTIDOS CON DISTINTA FORMA

ESTRUCTURA DETERMINADA

LOS OLIGONUCLETIDOS

SECUENCIA CORTA DE NUCLETIDOS

UNA BASE NITROGENADA
UNA AZUCAR
UNA MOLECULA DE CIDO FOSFRICO

SUBNIDADES FORMADAS

HISTORIA:
COMIENZO : SINTETIZADORES DE PEPTIDOS

VEGA BIOTECHNOLOGIES

SU QUMICA

PRIMER INTENTO HACER

OLIGONUCLETIDOS
QUIMICAMENTE

PRIMERA PUBLICACIN : Michelson y Todd (1955)

LEY BAYH-DOLE (1980)

APLICACIONES
ACTUAN COMO CEBADORES

PCR (reaccin en cadena de la polimerasa)

SECUENCIACIN DEL ADN

SILENCIADORES DE GENES

OLIGONUCLETIDOS ANTISENTIDO

OLIGONUCLEOTIDOS FLUORESCENTES

TERAPIA GNICA

CONSTRUCCION DE SONDAS DE ADN

Una sonda es un fragmento de ADN (o raramente ARN) de
pequeo tamao (normalmente entre 100 y 1000 bases)
usado en biologa molecular como herramienta para
detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia
complementaria parecida o igual.
En su uso, la sonda se une a la secuencia diana
monocatenaria (ADN1c ARN) mediante un mecanismo
de hibridacin que forma una estructura bicatenaria, una
de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia
diana.
Esta unin se establece porque tanto la sonda como la
diana tienen secuencias en parte o totalmente
complementarias,
formndose
pares
de
bases complementarias.

MARCAJE:

Para visualizar las molculas diana se utiliza una sonda

marcada,
bien
radiactivamente,
bien
mediante
marcaje inmunolgico.
Para el uso de ADN de doble cadena primeramente es
necesario desnaturalizarlo mediante calor o en condiciones
de alta alcalinidad. Esta sonda de cadena simple marcada
se une a la diana; y los lugares de unin se detectan
porque los mtodos de marcaje dejan una seal detectable
mediante fotografa.
En los mtodos ms avanzados se utilizan marcajes
mediante fluorescencia que emiten seales detectadas
mediante lser, como el utilizado en la PCR a tiempo real.
La sonda de ADN es una tcnica que permite cortar,
repegar, multiplicar y seleccionar fragmentos de ADN.

 Radiactividad
Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucletidos que
tengan alguno de sus tomos con un istopo radiactivo, normalmente ,
pero tambin es frecuente el uso de tritio.
Inmunolgico
Aunque el marcaje radiactivo es muy sensible, conlleva el peligro
asociado a la utilizacin de radiactividad. Para evitar este peligro se
desarrollaron otros mtodos de marcaje basados en anticuerpos. Las
sondas se marcan utilizando nucletidos que llevan unida una
molcula (digoxigenina), a la solucin se le aaden anticuerpos
especficos que se unen a esa molcula; y estos anticuerpos llevan
asociado un compuesto luminiscente o fluorescente (Como el CDPStar) que deja impronta fotogrfica.

TECNICAS DE HIBRIDACION
La hibridacin es la construccin artificial de cidos
nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios
usando la complementariedad de bases. Se trata, por
tanto, de un proceso de unin de dos cadenas
complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN para
formar una molcula de cido nucleico de doble cadena.
Es un mtodo muy verstil que permite estudiar el grado
de relacin gentica entre dos cidos nucleicos. Tambin
permite la deteccin de fragmentos de DNA que son
complementarios a fragmentos monocatenarios de
secuencia conocida (sondas).

 La calidad en la unin de las cadenas de cidos

nucleicos en un proceso de hibridacin viene
determinada por unos moduladores que
imponen una mayor o menor exigencia de
perfeccin o astringencia.
En
condiciones
normales,
la
complementariedad (GC; A=T), El par de
bases GC tiene tres uniones hidrgeno,
mientras que el par AT tiene solamente dos.
Como consecuencia, se necesita ms energa
para romper el par GC que el par AT.

 El hecho de que una cadena de ADN sea

complementaria a la otra permite una
reproduccin exacta del material gentico; as,
cada cadena puede servir como molde
(template) para la sntesis de otra.
Cualquier
hibridacin
en
la
que
la
complementariedad sea inferior al 70% se
considerar como no-homloga y, por tanto,
ocurre en condiciones de baja astringencia
(temperatura baja y/o concentracin alta de
sales).

CONDICIONES DE LA HIBRIDACION
Temperatura:
La temperatura elevada rompe los puentes de hidrgeno
y separa las hebras del ADN (desnaturalizacin). Esto
ocurre alrededor de los 90 (temperatura de fusin).
Cuando una solucin de DNA que ha sido calentada se
enfra lentamente se produce la rehibridacin dando
lugar a la estructura inicial. Tal reasociacin ocurre slo si
las secuencias de bases son complementarias. Por lo
tanto, la hibridacin permite la formacin de complejos
bicatenarios no naturales de DNA:DNA y ADN:ARN.

pH y productos qumicos:
El pH alto (pH>11) rompe los puentes de hidrgeno, por lo
que se produce desnaturalizacin.
Esto tambin pueden producirlo agentes qumicos como la
urea y la formamida e incluso el agua destilada, que impide
la neutralizacin de los grupos fosfato de la molcula por
sales de sodio y magnesio; al ser los grupos fosfato de
marcado carcter negativo, su repulsin causa la
separacin fsica de las hebras y, por tanto, su
desnaturalizacin.
La concentracin baja de sales en una solucin donde se
produce una hibridacin impone una condicin de alta
astringencia, permitiendo slo uniones de gran
complementariedad.

TECNICAS BASADAS EN LA HIBRIDACION

Existen diferentes tcnicas que emplean la
separacin en gel por electroforesis como
primer paso para identificar la presencia de
determinadas molculas dentro de una muestra.

1- los tipos bloting:

Southern y northern blot

Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en

1975 para la deteccin de ADN.
EL MTODO TIPO SOUTHERN O SOUTHERN BLOT: para la
deteccin de genes especficos en el ADN celular.
El ADN es digerido con una enzima de restriccin y los
fragmentos son separados por tamaos mediante una
electroforesis en un gel.
Se realiza tincin con bromuro de etidio para
comprobar la calidad de la electroforesis y del ADN.
Luego los fragmentos de ADN de doble cadena son
parcialmente hidrolizados con un cido dbil y
desnaturalizados con NaOH para permitir la
transferencia.
Posteriormente, el ADN es transferido a un filtro de
nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda
representada una rplica de la disposicin de los
fragmentos de ADN presentes en el gel.

 A continuacin el filtro se incuba durante un tiempo

con la sonda marcada (radiactivamente o con un
fluorocromo); durante la incubacin la sonda se va
hibridando a las molculas de ADN de cadena sencilla
de secuencia complementaria (o muy parecida).
La sonda unida al fragmento de ADN complementario
se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla
mediante una exposicin a una pelcula de rayos X para
el caso de sondas radiactivas o con una pelcula
sensible a la luz, para el caso de sondas con
fluorocromo.

 NORTHERN BLOT:
El northern blot fue
desarrollado en 1977 por James Alwine, David
Kemp y George Stark en la Universidad de
Stanford.
Es esencialmente idntica al mtodo de Southern
blot, salvo que las molculas de cido nucleico de
la muestra, en este caso de ARN (total,
mensajero, vrico, etc.), se separan por
electroforesis en condiciones desnaturalizantes
(en presencia de formaldehdo, que forma parte
de la composicin del gel).
Esto es debido a que, a pesar de ser una molcula
de una sola cadena, se forman complejas
estructuras secundarias que dificultan la
migracin.

 Al igual que en el Southern blot, el ARN se

transfiere a la membrana de filtro y se hibridan
con sondas de ADN marcada.
Durante la electroforesis se pueden observan
grandes cantidades de ARNm correspondiente a
ribosomal (unidades 28S y 18S).
Tanto la tcnica de Southern como de Northern
blot se usan poco hoy en da al haber sido
sustituidas por tcnicas derivadas de la PCR.

2. CGH (hibridacin genmica comparada):

La hibridacin genmica comparada es una tcnica
citogentica para detectar regiones cromosmicas que
estn amplificadas o delecionadas en una muestra,
especialmente en tumores.
En la CGH, dos muestras de DNA genmico (una
tumoral y una normal) se marcan con diferentes
fluorocromos y se hibridan simultneamente sobre una
extensin de cromosomas metafsicos.
La relacin de intensidad entre las dos seales
fluorescentes proporciona una medida de la relacin
entre el nmero de copias de las dos muestras de DNA
genmico.

TECNICA CGH Y CGH-Array

3. Microarrays de ADN
Es el tipo de microarray al que suele referirse cuando
se habla de forma general y sirven para analizar el nivel
de expresin de miles (o todos) los genes de una
muestra.
Los hay de dos tipos principales:
Aquellos que utilizan como sondas fragmentos de
cDNA y los que usan fragmentos ms pequeos de
ADN (oligonucletidos).
A estas sondas, colocadas sobre el soporte, se les
lanzar el ARN de la muestra que ha sido previamente
transformado en cDNA, de tal manera que aquellos
genes muy expresados (con gran cantidad de ARN en la
muestra original) darn una mayor seal al unirse
(hibridacin) a su sonda correspondiente, lo cual se
detecta por medio de fluorescencia con un lector de
luminosidad .

 El resultado del experimento es una

fotografa del estado de expresin del ARN
de los genes de la muestra (tumoral o
normal). Se trata por tanto de un mtodo de
screening masivo para detectar aquellos genes
que se sobre- o infraexpresan en una muestra.

Utilidad en Patologa Molecular:

Deteccin de mecanismos o vas estimulados o
reprimidos en el metabolismo celular (neoplasias
o no neoplasias
Deteccin de marcadores tumorales tiles para el
diagnstico y clasificacin de las neoplasia
Deteccin de marcadores tumorales tiles para el
pronstico y prediccin de respuesta teraputica
de las neoplasia.
Deteccin de dianas teraputicas.

4. Hibridacin in situ.
Es una tcnica de hibridacin que se realiza directamente sobre
tejido, clulas o cromosomas localizados sobre un soporte slido,
habitualmente un portaobjetos. La visualizacin puede realizarse
por medios isotpicos , enzimticos o con fluorescencia , siendo
evaluada en un microscopio. Su gran virtud es que permite
identificar las clulas donde se produce la hibridacin que detecta
la alteracin genmica o transcripcional.
La visualizacin de resultados puede realizarse por marcaje con
fluorescencia de la sonda (FISH) o cromognico (CISH, SISH). Este
ltimo tiene la ventaja de poder realizarse en microscopio de
campo claro y poder almacenarse casi indefinidamente las
preparaciones.
Los usos ms frecuentes en Patologa molecular son la deteccin de
amplificaciones (Ej. Her2 en cncer de mama c-myc en linfoma de
Burkitt), traslocaciones ( linfoma folicular, linfoma del manto,
sarcomas) y presencia de virus (Epstein-Barr, HPV)

Representacin
Esquemtica del anlisis
de expresin mediante
microarrays de cDNA.
Tras la extraccin de
ARN, este se transforma
en cDNA y se co-hibrida
sobre el microarray con
sondas de ADN. Los
diferentes colores tras la
hibridacin indican el
nivel de expresin (rojo:
sobreexpresin.

USO DE SONDAS DE ADN PARA EL

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES
Las pruebas de hibridacin a menudo disminuyen el
tiempo necesario para identificar organismos
fastidiosos. Adems, permiten que los laboratorios
puedan aumentar el nmero de patgenos que
pueden ser identificados. En el estudio de costos,
debe considerarse que aunque los exmenes que
usan sondas son ms caros que los mtodos
tradicionales, el hecho de tener un resultado en un
mnimo de tiempo puede significar un ahorro para
el paciente y el hospital.

 Las sondas pueden ser usadas para detectar

microorganismo directamente de una muestra clnica
(expectoracin, orina, etctera) o para confirmar la
identificacin de un cultivo que por otros mtodos
tarda varios das (Legionella pneumophila, Chlamydia
trachomatis, etctera).
Adems, las sondas pueden ser usadas para
hibridacin in situ para evaluar la respuesta del
husped a un agente infecciosos en particular y
tambin para determinar la extensin de la infeccin
mediante el estudio de muestras de tejidos de varios
rganos.

CONSTRUCCION DE LIBRERIAS
GENOMICAS
GENOTECAS: o librerias genmicas es til para
cuando se quiere caracterizar una secuencia
genmica determinada, establecer el mapa
fsico de un genoma o secuenciar, total o
parcialmente, un genoma.
La genoteca de ADN genmico es un conjunto
de vectores recombinantes que contienen un
fragmento de genoma de la especie estudiada.
La construccin de una genoteca de ADN
genmico consta de las siguientes etapas:

- Aislamiento de ADN genmico de la especie

en inters.
- Digestin del ADN con una enzima de
restriccin que permita obtener fragmentos
de un tamao compatible con el vector.
- Clonacin de los fragmentos en un vector.
- Integracin de los vectores recombinantes en
un microorganismo para su multiplicacin.

 Los vectores de tipo fago, son muy usado para la

clonacin de secuencias genmicas particulares,
mientras que los cosmidos y los YAC y BAC se utilizan
en caracterizacin de genomas enteros.
La genoteca obtenida por este proceso contiene
millones de clones recombinantes.
Dado que el ADN genmico es esencialmente igual en
todas las clulas de un organismo, se puede usar
cualquier tejido para obtener ADN a clonar. En las
plantas por ej. Un ADN genmico construido a partir de
ADN de races sera, en principio identica a otra
construida de hojas.

 Una genoteca de ADNcomplementario, es

representativa de la poblacin de ARNm,
presentes en un tejido concreto en un
momento determinado del desarrollo. A
diferencia de la genoteca de ADN genmico,
una genoteca de ADNc es especfica de tejdo.
Una genoteca ADNc podra considerarse como
una fotografa instantnea de las poblaciones
de ARNm, presentes en un rgano.

CONSTRUCCION DE UNA GENOTECA

DE ADNcomplementario
La construccin de una genoteca ADNc se realiza en distintas etapas:
1. Extraccin de ARN a partir del rgano de inters y, en algunos
casos, purificacin de los ARNm poliadenilados (x cromatografa
de afinidad, en columna de poliT).
2. Copiado de los ARNm en ADNc por accin de la transcriptasa
inversa.
3. Eliminacin especfica del ARNm del hbrido ADN/ARN con sosa o
por accin de ARNasa H.
4. Sntesis de la segunda cadena de ADNc con una ADN polimerasa.
5. Ligacin de oligonucletidos(adaptadores) para crear dianas de
restriccin.
6. Ligacin en un vector de clonacin (plsmido o fago).
7. Integracin de los vectores recombinantes en bacterias.

Los vectores de clonacin utilizados para las

genotecas de ADNc, son los plsmidos o los fagos.
Las etapas de la sntesis de la segunda cadena de
ADNc y ligacin de adptadores se realizan, cada vez
ms por PCR.
La sntesis de la primera cadena de ADNc se realizan
generalmente a partir de un cebador de poliT, que
se fija en el extremo poliA del ARNm. Tambin se
puede empezar la reaccin a partir de mezcla de
hexanucletidos de secuencia aleatoria que acta
como cebadores que se fijan al azar sobre el ARNm.

TECNICAS DE AMPLIFICACION

Las tcnicas de hibridacin pueden tener una baja sensibilidad

debido a que en algunos casos existe una sola copia de la secuencia
en blanco. Por esta razn las tcnicas de amplificacin, que pueden
producir millones de copias de un determinado segmento de ADN o
ARN, han tenido un impacto extraordinario en muchas reas del
diagnstico clnico.
Existen varias tcnicas de amplificacin las cuales varan
ligeramente en su mtodo de amplificacin. Unas de las tcnicas de
amplificacin ms usadas en la actualidad, tanto elaboradas en el
propio laboratorio como comercialmente, es la reaccin de la
polimerasa en cadena o PCR.
Otra tcnica que ha sido evaluada para el diagnstico es la reaccin
de la ligasa en cadena o LCR, en la cual pequeos segmentos
amplificados son posteriormente ligados.
Ambas tcnicas se encuentran disponibles comercialmente y
pueden ser adquiridas en varios formatos de automatizacin.

 Otras tcnicas de amplificacin, la mayora sin nombre

traducido al espaol, son:
Strand displacement amplificatin (SDA), isothermal
RNA self sustaining sequence replication. reaction,
nucleic acid sequence-based amplification (TMA) y la
amplificacin por QB replicasa.
A continuacin slo se analizarn los fundamentos de
las tcnicas de PCR en el diagnstico de enfermedades
infecciosas, que el anlisis de las otras escapa al
objetivo de esta revisin.

PCR. REACCION EN CADENA DE LAS

POLIMERASAS
Tcnica que revolucion en los aos 80.
Permite tener mucha cantidad de un fragmento de ADN de
inters: esta tcnica de PCR, reaccin en cadena de la
polimerasa Es una tcnica muy rpida, que por otra parte
puede funcionar partiendo de trazas de ADN.
Por ello se utiliza mucho en el rea forense y de identificacin
humana, as como en gentica de poblaciones, en casos en los
que se tiene muy poquito ADN.
Esta tcnica aprovecha las caractersticas de la replicacin del
ADN, es decir que a partir de un pequeo cebador la polimerasa
puede proseguir unacadena.

 El requisito como se ve en la figura es poder disear

dos cebadores adecuados.
Por la posicin de estos cebadores, al cabo de una serie
de rondas de replicacin, (hablamos de una reaccin
en cadena), tenemos grandes cantidades de un solo
trozo, el tramo que va desde uno de los cebadores al
otro.
Esta tcnica, en la que el ADN tiene que ser
desnaturalizado por calor para inciar cada nuevo ciclo
se torn muy fcil cuando hizo uso de una polimerasa
que resiste el calor (aislada de una bacteria de aguas
termales). Esta tcnica se utiliza ya rutinariamente

Elementos necesarios para la PCR

Desoxinucleosidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.

Dos cebadores (o primers), oligonucleotidos

complementarios a una de las dos hebras del ADN.

Una solucin tampn (buffer) que mantiene el pH adecuado para el

funcionamiento de la ADN polimerasa.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente

como cloruro de magnesio (MgCl2).

Iones monovalentes, como el potasio.

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima

alrededor de 70C (la ms comn es la Taq polimerasa).

ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

81

que

son,

cada

uno,

82

TERMOCICLADOR

30 ciclos repetitivos conformados

cada uno de tres pasos.

Consisten en un bloque que

puede ser programado para
calentarse y enfriarse
rpidamente en determinados
tiempos

83

84

(Lodish y cols., 2006)

ETAPAS DE LA PCR

Desnaturalizacin
Alineamiento/Unin del cebador
Extensin/Elongacin de la cadena
Elongacin Final

85

1. Desnaturalizacin.
Mediante un calentamiento a 94C, el
ADN de doble cadena logra que sus
cadenas se separen o desnaturalicen

Se rompen puentes
de hidrogeno.
Las bases
nitrogenadas quedan
expuestas
Actividad de la enzima decrece de manera
muy rpida a partir de los 95C (vida
media a 92.5C = 2h, a 95C = 40 min. y a
97.5C = 5 min.), por lo que a estas
temperaturas o superiores es aconsejable
disminuir el tiempo de incubacin.

Sntesis de novo.

86

2. Alineamiento

Se aaden los
nucletidos en el
hidroxilo 3 terminal
del iniciador ya
apareado al sitio
blanco de la
amplificacin.
Mientras que un
cebador es
complementario al
extremo 5 de la regin
del ADN molde a
amplificar, el otro es al
extremo 3de la misma
pero en la cadena
opuesta
87

ETAPAS

Desnaturalizacin
Alineamiento/Unin del
cebador
Extensin/Elongacin
de la cadena

Elongacin Final

Union del cebador

ETAPAS
Desnaturalizacin
Temperatura entre 40 y 72 C

Enzima Taq polimerasa

Alineamiento/Unin
del cebador
Extensin/Elongacin
de la cadena
Elongacin Final

Inicio de la reaccin de la PCR. Los cebadores complementarios que

flanquean el sitio a amplificar se enlazan formando puentes de hidrgeno. De
esta manera la polimerasa puede comenzar a extenderlos para copiar
ambas hebras molde.

3. Extension y elongacin de la cadena

ETAPAS
Desnaturalizacin
Alineamiento/Uni
n del cebador
Desoxiribonucleosidos
monofosfatos

1 min. Para alargar 1000 nucletidos

Progreso de la reaccin de la PCR. A la

temperatura ptima de la ADN
Polimerasa Taq (72C), la enzima agrega
los dNTPs a partir del 5 prima hacia el
89
extremo 3 prima

Extensin/Elongaci
n de la cadena
Elongacin Final

4. Elongacin

Final.
ETAPAS
Desnaturalizacin
Alineamiento/Unin del
cebador
Extensin/Elongacin
de la cadena
Elongacin Final

Es comn que al finalizar todos

los ciclos se realice un ltimo alargamiento por 5 min.
a 72C, para asegurarse que todos los productos de
amplificacin estn completamente terminados
y tengan, por ende, exactamente la misma
90 longitud

Temperatura

100

Melting
94 oC

PCR

50

Tiempo

DNA de
cadena doble

Temperatura

100

Melting
94 oC

PCR

50

Tiempo
3

DNA de
cadena simple

Calor

Temperatura

100

Melting
94 oC

50

PCR

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

Tiempo
3

5
5

Hibridacin
de primers

5
5

Temperatura

PCR
100

Melting
94 oC

50

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

Tiempo
3

Calor
5

Calor
5
5

30 ciclos

Temperatura

PCR
100

Melting
94 oC

50

Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC

0
3

Tiempo
5

Fragmentos de
tamao definido

30ciclos

VARIANTES DEL PCR

RETRO PCR
PCR INVERSA
PCR INTERNA
PCR ASIMETRICA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLE
PCR ARBITRARIA
96

El molde utilizado es RNA pero el producto

final es ADN
Generacin de cDNA
Enzima retrotranscriptasa reversa

97

RETRO PCR
PCR INVERSA
PCR INTERNA
PCR
ASIMETRICA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLE
PCR ARBITRARIA

RETRO PCR
PCR INVERSA
PCR INTERNA
PCR
ASIMETRICA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLE
PCR ARBITRARIA

Es muy conveniente para conocer la fisiologa

de las clulas y saber cmo cambia la expresin
de genes (su traduccin a proteinas) a lo largo
de un procesos infeccioso.
98

Permite realizar una amplificacin de las regiones

flanqueantes de un fragmento de ADN que solo se conoce
su secuencia interna
secuencia conocida

secuencias desconocidas
digerir DNA

ligar extremos
ER

+ER
PCR

30 ciclos de PCR
99

RETRO PCR
PCR INVERSA
PCR INTERNA
PCR
ASIMETRICA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLE
PCR ARBITRARIA

Pequeas cantidades de DNA

Se quieren evitar las amplificaciones inespecficas que a
veces se observan con la PCR tradicional, dado que en
cada etapa se realizan un numero menor de ciclos.
Se usan iniciadores cuya secuencia est hacia dentro del
producto de la secuencia original (anidados)
Se genera un producto ms pequeo que el de la
reaccin primaria

PCR anidado
nested PCR

CYP2D8

CYP2D6

CYP2D7
100

RETRO PCR
PCR INVERSA
PCR INTERNA
PCR
ASIMETRICA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLE
PCR ARBITRARIA

Produce fragmentos de ADN de cadena simple al

utilizar
los
dos
cebadores
necesarios
a
concentraciones molares distintas en una relacin
entre 50/1 y 100/1.
Se produce ADN de doble cadena en cantidad
exponencial hasta que se agota el cebador minoritario
y luego slo se produce la cadena que hibrida con el
ADN que se encuentra en exceso, producindose a
partir de entonces de forma lineal.

El producto de PCR contiene 10 a 20 veces ms de

ADN monocatenario que de ADN bicatenario.
Recuperando exclusivamente el ADN monocatenario
se puede utilizar para una secuenciacin directa con la
tcnica de Sanger

101

RETRO PCR
PCR INVERSA
PCR INTERNA
PCR
ASIMETRICA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLE
PCR ARBITRARIA

Realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos.

Consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas
o clulas, donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificacin.
Se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y
luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional
con sondas de ADN/ARN.
De esta manera pueden
pequesimas de genoma.

detectarse

102

cantidades

RETRO PCR
PCR INVERSA
PCR INTERNA
PCR
ASIMETRICA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLE
PCR ARBITRARIA

PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin.

PCR MULTIPLE

Emplea dos o ms pares de cebadores en nico tubo con el fin de

amplificar simultneamente mltiples segmentos de DNA.

RETRO

PCR

PCR

INVERSA

PCR

INTERNA

PCR

ASIMETRICA
PCR

IN SITU

PCR

MULTIPLE

PCR

ARBITRARIA

103

VENTAJAS
Tcnica especfica, sino tambin muy sensible, pues
en principio para practicarla bastara una sola
molcula, por ejemplo, del genoma humano ~6
picogramos.
Puede usar como substrato para la reaccin al ADN,
sin tener que purificarlo de su fuente natural, y es
comn emplear productos biolgicos diversos.
Muchas veces basta una simple ebullicin de la
muestra para lisar, liberar y de paso desnaturalizar el
ADN, dejndolo listo para la reaccin.

104

 Se puede prescindir del uso de radioistopos, los

cuales eran indispensables antes de su invencion
(Rodrguez I, 2004)
Proporciona muchas alternativas ms rpidas y
menos costosas para muchas aplicaciones de la
clonacin, en particular para los organismos en los
que se conoce la secuencia completa del genoma .
Puede producirse enteramente in vitro, sin el uso
de clulas.
Con est tcnica se puede seleccionar una
secuencia especifica de nucletidos para replicarse
en forma selectiva y rpida en grandes cantidades
a partir de cualquier muestra que las contenga
(Alberts y cols., 2006).

DESVENTAJAS
Debido a que los cebadores tienen que
sintetizarse qumicamente, la PCR solo puede
utilizarse solo para clonar ADN con secuencias
de comienzo y de terminacin conocidas.

APLICACIONES
Pre-diagnstico de enfermedades
Diagnostico de enfermedades
Amplificacin de regiones hipervariables
Investigaciones forenses
Aplicaciones en estudios evolutivos

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES

INVESTIGACIONES

FORENSES

Mediante la PCR se pueden amplificar genes de

organismos ya extinguidos, como del mamut, o
restos antiguos humanos. Se pueden comparar
estos genes con los genes semejantes de
organismos actuales y poder reconstruir rboles
filogenticos.
El PCR tambin se ha utilizado para conseguir el
mapa del genoma humano.

 A pesar del innegable poder de las tcnicas de biologa

molecular en el diagnstico clnico, es errneo pensar que
van a reemplazar a los exmenes convencionales para
deteccin de agentes patgenos.
Sin embargo, la capacidad de estas tcnicas para
proporcionar un diagnstico definitivo en corto tiempo
tendr sin duda, un efecto en el manejo del paciente y nos
ayudarn a entender mejor la patognesis de la infeccin.
Aunque existe la posibilidad de usarlas en todos los
microorganismos, las tcnicas de diagnstico molecular
tendrn un mayor impacto en algunos patgenos.
Es as que exmenes rpidos para la identificacin de
Micobacterias y la deteccin de resistencia a las drogas de
primera lnea, dar la base para que se tomen ms
oportunamente las decisiones clnicas adecuadas.

 Tambin, la identificacin rpida de virus Herpes

simplex en el LCR de un paciente con encefaliitis dar la
oportunidad de comenzar oportunamente la terapia
adecuada, eliminando otros procedimientos ms
invasivos.
A medida que se automaticen, con un costo menor y
con regulaciones ms precisas, los laboratorios clnicos
podrn incorporar estos exmenes en el
funcionamiento de rutina y los clnicos podrn
familiarizarse an ms con la interpretacin y con las
ventajas que proporcionan las tcnicas de biologa
molecular en el diagnstico clnico.

APLICACIONES COMERCIALES DE LA INGENIERIA

GENETICA
Produccin de vacunas
Produccin de hormonas
Terapia gnica