INTERNATIONAL STANDARD

ISO 14698-1
Cuartos limpios y ambientes
controlados asociados
Control de la Biocontamination
Parte 1: Principios Generales y Mtodos
Ing. Evelyn Artavia
2015

La norma busca promover prcticas de

higiene apropiadas

Los mtodos de control de

biocontaminacin o higiene
para hacer productos seguros y
estables.
Factores: diseo,
especificacin, operacin y
control de cuartos y ambientes
controlados asociados.
Procedimientos estndar de
ensayos =Adaptacin

Alcance

Especifica los mtodos

requeridos para monitorear
consistentemente zonas de
riesgo y aplicar controles
apropiados al grado de riesgo.

En zonas de riesgo bajo se

puede utilizar como fuente de
informacin.

3. Trminos y definiciones

Sistema Formal
Sistema de control de
biocontaminacin con
procedimientos establecidos y
documentados

Biocontaminacin
Contaminacin de materiales,
dispositivos, individuos,
superficies, lquidos, gases o
aire con partculas viables.

Cuarto limpio Cuarto donde la

concentracin de partculas
areas estn controladas y su
construccin minimiza la
introduccin, generacin y
retencin de partculas dentro
del cuarto, adems los otros
parmetros relevantes como
temperatura, humedad y
presin estn controlados

Trminos 2

Partculas viables

Partculas que son o soportan uno o

ms microorganismo vivos.

Unidad viable (VU)

Unas o ms partculas que se

cuentan como una sola unidad (una
CFU puede consistir en una o ms
VU).

Bioaerosol

Agentes biolgicos dispersados en un

ambiente gaseoso.

Ambiente controlado

Zona definida donde las fuentes de

contaminacin son controladas con
medios especficos.

Punto de control (control point)

Lugar en un ambiente controlado donde

se realiza control y un riesgo se puede
prevenir, eliminar o reducir a niveles
aceptables.

Zona de riego (risk zone)

Espacio definido y delimitado donde los

individuos, productos o materiales son
particularmente vulnerables a
contaminacin.

Trminos 3

Dispositivo de contacto (contact

device)

Soporte especialmente diseado que

posee un medio de cultivo estril y
una superficie accesible utilizado para
realizar muestreo de superficie.

Placa de contacto (contact plate)

Dispositivo de contacto donde el

contenedor es un disco rgido

Plato fijo (settle plate)

Contenedor de tamao apropiado que

contiene medio de cultivo estril que
se abre por un periodo definido para
colectar partculas viables del aire.

Muestreador de impacto (impact

sampler)

Dispositivo diseado para muestrear

partculas en el aire u otro gas por
medio de colisiones en una superficie
slida.

Muestreador de inyeccin
(impingement sampler)

Dispositivo diseado para muestrear

partculas en el aire u otro gas por
colisin con una superficie lquida y su
subsecuente entrada en el lquido.

Placa de contacto

Muestreador de impacto

Dispositivo de contacto

Placa fija

Muestreador de choque
(lq.)

Trminos 4

Nivel de accin (action level)

Nivel establecido por el usuario

que cuando se excede requiere la
intervencin inmediata, incluye
investigacin de la causa y una
accin correctiva.

Nivel meta (target level)

Nivel definido asignado por el
usuario como meta en
operaciones rutinarias, para uso
propio.

Nivel de alerta (alert level)

Nivel establecido por el usuario

para brindar una prevencin
temprana de una fluctuacin de
las condiciones normales que
cuando exceden requieren una
mayor atencin al proceso.

Trminos 5
Verificacin

Validacin

Confirmacin, mediante
evidencia objetiva, que se han
llenado los requerimientos para
un uso especfico o aplicacin.

Confirmacin, con evidencia

objetiva, que se han llenado los
requerimientos especficos.

Nota: Se pueden utilizar

mtodos de monitoreo y
auditaje, procedimientos y
ensayos, incluyendo muestreo
al azar y anlisis.

Occupancy states

Instalacin completa
con todos los serv.
conectados y
funcionando, pero sin
equipo de produccin,
materiales o personal
presentes

As-built

At-rest
Instalacin completa
con equipo instalado
y operando, pero no
con personal
presente

La instalacin
funciona de manera
especfica, con un
nmero especfico de
personal presente

Operacional

4. Principios de la biocontaminacin

Un Sistema Formal de Control

de biocontaminacin puede
establecerse, implementarse, y
mantenerse con cuartos limpios
y ambientes asociados.
Asegura y controla factores que
pueden afectar la calidad
microbiolgica de los procesos
y producto.
HACCP, FTA, FMEA

Zonas de
riesgo

capacitacin

Riesgo
potencial

Lmites
de
control

Acciones
correctivas

Documentacin

Monitoreo
y horario

Verificacin

5. Establecimiento del Sistema Formal

5.1 Requerimientos Generales

Desarrollar, iniciar, implementar y documentar un Sistema Formal

para control de biocontaminacin=deteccin de cond. adversas a
tiempo.

Incluir un programa de capacitacin apropiado.

Programa de monitoreo diseado e implementado minimizando la

posibilidad de que el muestreo contribuya a la contaminacin del
producto, zona de riesgo o ambas.

Clasificar las Zonas de riesgo segn lineamientos, regulaciones y Sist.

Formal escogido. Acorde a nivel de biocontaminacin area o
superficial= riesgo bajo, medio, alto o muy alto.

5.2 Niveles de alerta, accin y meta

Apropiados al campo de aplicacin, clasificacin de zonas de riesgo y

tecnologa.

Los niveles meta microbiolgicos pueden ser usados como una

alternativa de alerta microbiolgica y niveles de accin en algunos
campos especficos.

Revisar datos de niveles de biocontaminacin para establecer o

confirmar la lnea base para determinar los niveles de alerta y accin.

Los niveles de alerta y accin se pueden relacionar a los niveles meta

en cada aplicacin especfica. Deben ser revisados y ajustados

5.3 Monitoreo de biocontaminacin

Plan de muestreo: mtodos de muestreo y conteo de unidad de

viables. Anexos A,C, D y F.

Usos: lnea base en as-built, monitoreo de zonas de riesgo en asbuilt y at-rest, y monitoreo rutinario es estado operacional.

Dispositivo

Mtodo
seleccionado

Procedimiento
escrito

Muestreo

Dispositivo de muestreo
Tipo de partculas
viables

Tiempo y duracin
del muestreo

Mtodo de
muestreo, material
y propiedades del
medio

Sensibilidad del
procedimiento

Condiciones
ambientales en la
zona de riesgo

Efecto del
dispositivo de
muestreo en el
proceso o ambiente

Concentracin
esperada

Habilidad para
detectar bajos
niveles de
biocontaminacin

Precisin y
eficiencia de la
colecta

Eficiencia de fluidos
de
extraccin/lavado

Flora microbiana
nativa

Accesibilidad a las
zonas de riesgo

Incubacin y
deteccin de part.
viables y mtodo de
evaluacin

Tipo de informacin
(cuantitativa,
cualitativa)

Plan de muestreo

Desarrollado
por el Sist.
Formal
Documentado

Durante el
estado
operacional
Periodos de mayor
estrs
At-rest (diseo y
comportamiento)

a. Plan de muestreo
inicial= punto de
referencia o lnea
base
b. Plan de muestreo
rutinario= resultado
de implementacin
del Sistema Formal

Diseo de Plan de muestreo

Lugar de muestreo
y funcin de z.
riesgo

Nmero de
muestras

Frecuencia

Mtodos de
muestreo

Volumen o rea
que se cubrir

Disolventes, fluidos
de lavado,
neutralizantes

Factores
particulares que
afecten resultados
del cultivo

Impacto de
operaciones,
personal y equipo

Frecuencia del muestreo

segn Sist. Formal y se modifica cuando:
Niveles de alerta o accin se excedan consecutivamente
Prolongado paro de actividades
Deteccin de agentes infecciosos en zonas de riesgo
Trabajo de mantenimiento significativo en el sistema de ventilacin
Cambios al proceso que afecte el ambiente del cuarto limpio
Reporte de resultados inusuales
Cambios en los procedimientos de limpieza o desinfeccin
Incidentes no planeados que podran contribuir a la biocontaminacin

Muestreo

Identificacin de muestras

Sitios de muestreo

Sistema Formal y Plan de

muestreo.

Ms de una muestra de cada

lugar y diferentes nmeros de
muestras en diferentes lugares.

Puntos de control
microbiolgico definidos en
procedimientos escritos.

Sitio
colecta
Fecha
y hora

Desviacin
Etiqueta o
cdigo
Medio
de
cultivo

Persona

Actividad

5.4 Procesamiento de muestras

La colecta, transporte y
procesamiento de muestras no
afectar la viabilidad y nmero
de organismos colectados
Las muestras se colectarn en
contenedores y de forma que
no agreguen o inhiban la
biocontaminacin.

Factores
Condiciones y duracin de
transporte/almacenaje

Uso de agentes
neutralizantes

Uso de solutos osmticos

5.5 Cultivo de muestras

Ambiente

Condiciones
Medio
Cultivo

Proceso
Incubacin

Equipo
M.O.
esperados

Medio de Cultivo

Incubacin

No selectivo.

Temperatura

Aditivos solo para minimizar

actividad microbiana residual.

Tiempo:

2-5 das Bacterias

5-7 das Hongos

Condiciones atmosfricas y
tiempos de incubacin
especficos para m.o. inters
(anaerobios, termfilos)

Observacin en intervalos

La superficie externa o sus

recipientes se mantendrn con
el nivel de limpieza apropiado a
su uso.
Pueden requerir doble o triple
cubierta y proc. control de
calidad.

5.6 Evaluacin de los datos del muestreo

5.6.1 General

La evaluacin de los datos de biocontaminacin proveer

suficiente informacin para acciones correctivas efectivas.

Ms informacin en ISO 14698-2.

NOTA: El monitoreo de contaminacin microbiana puede ser

realizada por medicin de indicadores indirectos, ej. Medicin
de ATP.

5.6.2 Conteos

Mtodos validados: Instrumentos y procedimientos pueden influenciar

los conteos.

NOTA 1: Informacin del conteo de partculas viables se da en otras

fuentes.

NOTA 2: Esta parte de la ISO 14698 no involucra o acepta ninguna

constante directa o relacin causal entre las concentraciones de
partculas viables y no viables. Niveles de control para esos
parmetros pueden establecerse separadamente segn se requiera.

5.6.3 Caracterizacin

El monitoreo microbiolgico no identifica ni cuantifica todas la

especies de microorganismos encontradas en ambientes controlados.

NOTA

Criticidad del rea / Futura investigacin

Categoras amplias (morfologa celular, propiedades de tincin y

otras).

Identificacin, a nivel de gnero, con mtodos de laboratorio

establecidos.

Evaluacin de limpieza, desinfeccin, fuente de contaminacin o

accin correctiva.

Aislamientos de reas crticas =antecedentes en reas no crticas.

6. Expresin, interpretacin y reporte

de resultados
Expresin
Unidades viables (VU) o
unidades formadoras de
colonias (CFU) en
unidades SI
ISO 14698-2

Interpretacin
Tendencias segn periodos
extensos
Resultados inusuales, y la
aceptabilidad de las
operaciones o productos
procesados, segn
revisin de
investigaciones y
resultados especficos

Reporte de resultados

Tipo de muestra

Mtodo y
estndar

Dispositivo de
colecta

Sitio de
muestreo

Actividad y
estado

Condiciones y
duracin
incubacin

Tiempo de
examinacin de
muestras

Duracin
muestreo

Fecha y hora

N personas en
el rea

Variaciones de
mtodo u otros
fact.

Resultados desp
de lectura inicial
y final

Unidades SI en
ensayos
cuantitativas

Descripcin de
aislamientos
(caracterizacin)

Nombre de
responsable de
reporte y fecha

7. Verificacin del Sistema Formal

Los resultados de monitoreo de biocontaminacin se examinarn

peridicamente en orden para confirmar que el sistema escogido
funciona de acuerdo con los procedimientos establecidos y los
requerimientos especficos se han completado.

NOTA

Se requiere el uso de mtodos de monitoreo y auditaje,

procedimientos y ensayos, incluyendo muestreo al azar y anlisis.

Podra requerirse tambin un sistema de verificacin de todos los

pasos de trabajo y equipo.

Desviaciones de los lmites establecidos o cambios en la condicin

microbiolgica del ambiente controlado=accin correctiva.

Si aplica, el Sistema Formal se modificar.

8. Capacitacin

Anexo G

9. Documentacin
Descripcin del
Sistema Formal

Reporte de aseguramiento de
riesgo

Plan de Muestreo

Procedimientos de ensayo y
muestreo

Niveles de accin,
alerta y meta
Reportes de ensayo,
verificacin y capacitacin

Anexo A
Gua en la determinacin de biocontaminacin del aire

Mtodo de colecta y
dispositivos de muestreo
apropiados, segn Plan de
muestreo.

En zonas de riesgo durante

estados as-built y at-rest, si
aplica, y rutinariamente bajo
operacin normal.

Muestreo
Pasivo

Seleccin de mtodo y
dispositivo, segn finalidad
de la muestra

Placas Petri

Muestreo
Activo

Impacto,
choque o
filtracin

Seleccin de dispositivos de muestreo

No dispositivos de choque para muestreo areo =poco volumen,

cantidad, y su tendencia a romper agregados.

No contaminar el ambiente que se muestrea o se reaspira

1.

Tamao y tipo de las partculas viables.

2.

Sensibilidad de part. viables al proc.

3.

Concentracin esperada.

4.

Habilidad para detectar altos o bajos niveles de biocontaminacin

5.

Medio de cultivo

6.

Hora y duracin del muestreo

7.

Condiciones ambientales

8.

Alteracin del flujo de aire unidireccional

Propiedades del dispositivo de muestreo

1.

Succin apropiada al flujo en niveles bajos de partculas viables en

el aire.

2.

Velocidad apropiada de impacto/flujo de aire

3.

Colecta precisa y eficiente

4.

Facilidad de manejo y operacin (bombas de vaco, agua,

electricidad)

5.

Facilidad de limpieza y desinfeccin o esterilizacin

6.

Posible adicin intrnseca de partculas viables a la biocontaminacin

Muestreo Pasivo (Sedimentacin)

Mide partculas viables que se

posan en las superficies

Uso: evaluacin cualitativa o

cuantitativa de la
contaminacin del aire

Conteo de placa por tiempo:

relacin entre el rea y el
tiempo de exposicin.

Muestreo activo (1)

Niveles bajos (Biocontaminacin normal)

Impacto y choque

Velocidad de impacto:

1.

alta, atrapar part. viables 1 m

2.

baja, sin dao mecnico o ruptura de agregados.

3.

apropiada al medio de cultivo

Volumen de muestra: grande, detectar niveles

muy bajos de contaminacin y pequea para
evitar la degradacin fsica o qumica del medio
de colecta.

Tasa de flujo: 1 m3 en un tiempo razonable, sin

secar medio.

Muestreo activo (2)

Niveles bajos (Biocontaminacin normal)
Filtracin

Condiciones de filtracin no afecten viabilidad

(ej. deshidratacin).

Eliminar electricidad esttica que interfiera con

tasa de impacto.

Mismo flujo de succin y velocidad de impacto

del aire que en m. de impacto.

Contar con dispositivo que mida la tasa de

succin.

Colocar y remover membranas de los filtros de

manera asptica.

ANEXO B
Gua de validacin de muestreadores de aire

Colecta eficiente

Eficiencia
Fsica*

Eficiencia
Biolgica

Mtodo experimental (1)

Ensayo en una cmara
Aerosol en un cuarto de 1mx1m, flujo de aire
no unidireccional, filtro HEPA
Suplir y extraer suficiente aire para presin
negativa y recircular con ventilador
Mtodo de muestreo de aire filtrado HEPA

Ensayo de cepa de m.o.

Cepas para probar la eficiencia fsica:
Bacillus subtilis var. niger , esferas de
poliestireno u otros. Ms fcil identificar m.o.
Cepas para ensayos de eficiencia biolgica:
bacterias tpicas en el aire del cuarto, ej.
Staphylococcus epidermidis. Menos eficiente
que ensayo de eficiencia fsica

Mtodo experimental (2)

Generacin de partculas que transportan
m.o.
Disco generador de aerosol de disco giratorio +
suspensin de m.o.= aerosol tamao controlado
de partcula.
Ecuaciones que determinan el tamao de
partculas hmedas y slidas

Ensayos
Dentro de cmara o rea adjunta turbulencia
similar a cuarto limpio.
El muestreador y el soporte de filtro de
membrana (0,45 m) se colocan a 1m del
generador de aerosol .Contador de part.*
Tiempo de muestreo: unos pocos minutos.
Incubacin: 2 das a 37C
Cinco soluciones con dif tamao de partcula (d=
0,8 m a 15 m).

Resultados

Usar campos del muestreador de prueba y el muestreador de filtro de

membrana del mismo volumen de aire para calcular la eficiencia.

Graficar tamao de partcula por eficiencia, para utilizar datos para

desviaciones estndar y eficiencias.

ANEXO C
Gua sobre la determinacin de biocontaminacin de
superficies

Principio

Conteo de microorganismo

1.

Un dispositivo con un medio slido de rea conocida se pone en

contacto con una superficie= imagen espejo de las unidades viables.

2.

Un hisopo se usa para muestrear un rea

Conteo de la tasa de deposicin de m.o en una superfcie

Una superficie con nutriente se expone un periodo conocido a la

deposicin de m.o. y se incuba

Dispositivos de muestreo

Placas de

sedimentacin

Hisopos

Dispositivo de
contacto 20 cm2

Expresin de resultados

El nmero de partculas viables en las superficies debe

expresarse: unidades viables / 1 dm2

O en el caso de placas: 1 dm2 /hora

1 dm2 =100 cm2

ANEXO D
Gua sobre la determinacin biocontaminacin de
textiles

Factores para seleccin de textiles

Tipo y forma

Tela

Generacin de
partculas y
dispersin

Limpieza,
descontaminacin o
esterilizacin

Eficiencia en
remocin de
partculas

Diseo de la
prenda

Efecto barrera
insuficiente por
filtracin

Permeabilidad

Causas de biocontaminacin excesiva en

textiles

Pobre retencin de
partculas

Uso incorrecto

Ciclos de lavado
inapropiado

Descontaminacin
insuficiente

Recontaminacin
despus del lavado

Muestreo de contaminacin

Segn Plan de muestreo

Se utilizan dispositivos de contacto

Expresin de resultados:
unidades de partculas viables por 1 dm2 de muestra de tela

ANEXO E
Gua sobre la validacin de los procesos de lavado

Mtodo de ensayo
1.

Suspensin de microorganismos conocidos se prepara en una solucin

de protena.

2.

Un volumen conocido de la suspensin se aplica a las piezas de

ensayo.

3.

Las piezas de ensayo se someten al proceso de lavado, carga normal

simulada. Se utilizan slo una vez. Tamao 10x5 cm, rea
contaminada de 5x5 cm, extremos para adjuntarlas.

4.

Conteo de m.o. piezas de prueba despus del proceso de lavado

5.

La reduccin de la poblacin de m.o. se mide y se compara con los

valores.

6.

Prendas utilizadas en la carga normal simulada deben esterilizarse

antes reuso o se destruyen

Controles
A
B
C

Conteo de unidades viables de suspensin inicial m.o.

Conteo de unidades viables sobre piezas de control sometidas

al mismo procedimiento con la excepcin del proceso de
lavado

Conteo de unidades viables sobre piezas de control sometidas

al mismo procedimiento y proceso de lavado, pero se
contaminan con la suspensin de m.o. despus del proceso de
lavado

Microorganismos

Bacterias
Enterococcus
hirae ATCC 10541
Escherichia coli
ATCC 10536
Inculo 108
clulas/mL

Hongos
Saccharomyces
cerevisiae
ATCC 9084
Aspergillus niger
ATCC 16404
Inculo 107
clulas/mL

Esporas
bacterianas
Bacillus subtilis
var. Niger
ATCC 6633
Inculo 107
clulas/mL

Suspensiones microbianas
Medio de
suspensin

Medio de
recuperacin

Solucin de
protenas

Procedimiento

Mezclar y dejar en contacto durante 5 min a temperatura ambiente 3

ml de la suspensin de microorganismos y 2 ml de la solucin de
protena C.

Aplicar 0,5 ml de la suspensin resultante a la pieza de ensayo, por

cada microorganismo probado, se contaminan tres piezas de ensayo.

Despus del proceso de lavado, las piezas de control se llevan al

laboratorio lo antes posible.

Se realiza diluciones, filtraciones e incubacin y finalmente el conteo

de VU

Interpretacin de resultados

Calcular la relacin entre el nmero N de microorganismos aplicado a

las piezas de control.

Comprobar la reduccin por un factor de al menos 105 de la cantidad

de bacterias y de 104 el nmero de levaduras y esporas de hongos.

ANEXO F
Gua para la determinacin de contaminantes en lquidos

Procedimiento

La seleccin del mtodo : naturaleza del lquido y el volumen de

muestra requerido.

Ej. placa de vertido, placa de extensin, filtracin por membrana u

otro.

Presin del lquido reducida para muestrear .

Segn nivel de biocontaminacin, la muestra se analiza directamente

o se realiza un tratamiento apropiado.

Resultados: N VU / 1 mL (1 cm3)

ANEXO G
Gua de capacitacin del personal

Elementos para programas de

capacitacin estandarizados
Documentos de
Formacin

Manual de Formacin

Procedimientos de
control de
microbiolgico y
biocontaminacin

Verificacin de la capacitacin

Herramientas
de evaluacin

Documentacin

GRACIAS