Introduccin

La materia orgnica encontrada en el suelo incluye una clase de compuestos

conocidos como HUMUS o SUSTANCIAS HMICAS, las cuales son molculas altamente
funcionalizadas, ricas en carbn y con una fuerte tendencia a agregarse. Esto significa
que pueden unirse a casi todo y son demasiado reactivas. La familia de las sustancias
hmicas est formada por los cidos hmicos, cidos flvicos y huminas.
Los cidos Hmicos (AHs) son polmeros naturales (extrados principalmente de varias
fuentes: suelo, carbn, turba y leonardita) altamente reactivos de los cuales, en trminos
generales, se postula que pueden retener agua en una proporcin de veinte veces su
peso, lo cual es muy importante si se considera su posible uso en el enriquecimiento
de desiertos. Por otra parte, debido a su gran polifuncionalidad, durante largo tiempo se
ha buscado su composicin y estructura, lo cual ha sido una de las tareas ms
importantes de la qumica de los suelos y de muchos cientficos que han estado
trabajando en ella. Sin embargo, hasta nuestros das es an desconocida, pero
independientemente del desconocimiento de su estructura y el gran esfuerzo por tratar
de esclarecerla, nicamente se tienen muy bien identificados sus principales y ms
abundantes grupos funcionales, los cuales son principalmente carboxlicos, fenlicos,
hidroxilos, carbonilos, aminas, amidas y cadenas alifticas, entre otros.
Sin embargo, para conocer ms detalladamente las fuentes de su capacidad
intercambiadora, as como el tipo de interacciones llevadas a cabo, se hace necesario el
estudio analtico y sistemtico de las soluciones acuosas de AHs con el fin de conocer
o al menos describir ms precisa y detalladamente sus propiedades termodinmicas y
fisicoqumicas. Por lo tanto, en este estudio se pretende fraccionar a los AHs
(provenientes de leonardita) obtenidos de una compaa mexicana (GBM Co., Mxico)
utilizando la Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) con la finalidad de
comparar los resultados con otros AHs de diferentes orgenes (suelo, turba y carbn) y
pases (Mxico, EU, etc) ya que como es bien sabido, la formacin y cantidad de AHs en
cada suelo es diferente, debido a que dependen del clima, temperatura, topografa,
pH, luz del sol, entre otros factores.
Qu es la Leonardita?
La leonardita es una forma de cidos hmicos encontrada exclusivamente en Dakota del
Norte. Es llamada as en homenaje al Dr. A.G. Leonard, el primer director del Servicio
Geolgico del Estado de Dakota del Norte y primer cientfico que estudi las propiedades
de esa sustancia. La formacin de la leonardita se remonta a la era carbonfera del
Paleozoico, cerca de 280 millones de aos atrs. La amplia y jugosa vegetacin existente
entonces en lo que es hoy Dakota del Norte fue destruida y carbonizada, pero en ese
proceso fueron exprimidos los ricos jugos orgnicos formando originalmente lagunas de
poca profundidad que tambin se carbonizaron dando origen a la leonardita. [1] La masa
fibrosa se transform en carbn en cima del cual se form la delgada capa de leonardita.
A travs de los millones de aos de su formacin, la leonardita ha estado sujeta a toda
clase de acciones fsicas y qumicas, como tambin microbiolgicas, para llegar a su
forma actual. En la figura 1 se muestra la estructura de la Leonardita.

Figura 1. Estructura tpica de la Leonardita

Efectos de los cidos hmicos derivados de la Leonardita

Condiciones Fsicas del Suelo

1. Mejora la estructura y textura del suelo. De particular importancia en el caso de suelos

arcillosos pesados. El suelo se hace ms esponjoso.
2. Mejora la capacidad de manejar el agua del suelo. Aumenta el drenaje cuando hay
exceso de agua, pero siempre retiene agua suficiente. Importante en caso de sequa.
3. Aumento el grado de aireacin. Facilita el suministro de oxgeno a los microorganismos
aerobios.
4. Facilita la absorcin de calor.
5. Propiedades tampn, concretamente la prevencin de cambios rpidos en el pH del
suelo gracias a que la sustancia hmica facilita el intercambio de iones libres de
hidrgeno en el suelo.

Condiciones Mecnicas. Los cidos hmicos proporcionan:

1. Un medio ms favorable para el desarrollo de los sistemas radiculares.

2. Un medio que estimula y multiplica la actividad de los microorganismos beneficiosos del
suelo.

Actividad Qumica en el Suelo. Los cidos hmicos son de particular importancia

por su contribucin a:

1. La desintegracin continua de las rocas en el suelo para as liberar cantidades

adicionales de nutrientes importantes.
2. Las reacciones qumicas en el suelo que convierten un nmero importante de
compuestos qumicos disponibles para la absorcin radicular. Por ejemplo, la conversin
de fsforo en la forma disponible para el uso por la planta, y la quelacin de compuestos
de hierro en el suelo para que sean aptas para la utilizacin en el metabolismo de
clorofila.
3. La reduccin del bloqueo de fsforo en el suelo, particularmente en los suelos
arcillosos.
4. La liberacin del dixido de carbono del carbonato de calcio, aumentando as la
disponibilidad de este importante nutriente a travs de las races para la sntesis de
carbohidratos.
5. La neutralizacin de sustancias qumicas potencialmente txicas en el suelo.
6. La alta capacidad de intercambio catinico en los suelos, permitiendo la mejor retencin
y utilizacin de varios elementos, incluyendo minerales y nitrgeno del suelo, al prevenir
contra las prdidas de esos compuestos por drenaje desde la zona radicular. En la
presencia de cantidades adecuadas de cidos hmicos los nutrientes se mantienen en el
suelo y se hacen disponible a las races segn la demanda.
7. El almacenamiento de nutrientes. La gradual descomposicin de sustancias orgnicas
por la accin de los microorganismos del suelo resulta en la disponibilidad de: (a) dixido
de carbono, (b) el nitrgeno en forma de amonaco se transforma rpidamente en nitritos
y nitratos por la accin bacteriana, (c) fsforo y otros elementos esenciales para el
crecimiento de las plantas, como azufre y potasio.
8. Que los compuestos orgnicos de alto peso molecular sean reducidos, gracias a los
microorganismos y bioqumica del suelo, haciendo disponible hasta 5.000 caloras por
gramo de energa para el uso por las plantas hasta que se produzca ms biodegradacin.
9. El retardo del crecimiento de los organismos patgenos.
10. La promocin y conversin (quelacin) de un nmero de elementos en forma de
nutrientes para las plantas.

Valores Bioqumicos. Los siguientes efectos generales han sido observados por
botnicos, fisilogos de plantas y horticultores en todo el mundo:

1. Estimulante del crecimiento y de la divisin celular de las plantas, incluyendo el

crecimiento acelerado debido a la presencia de reacciones de tipo auxnico.
2. Desarrollo efectivo de los sistemas circulatorios de las plantas.
3. Funcionamiento ms favorable de los sistemas de respiracin y transpiracin de las
plantas.
4. Reduccin en el estrs y el deterioro prematuro

Resultados Pragmticos. Como resultado de los factores relacionados arriba, se

estimula el crecimiento de las plantas de las siguientes maneras:

1. Mejor germinacin de semillas.

2. Mayor crecimiento radicular.
3. Aumento en la formacin de ndulos de leguminosas (nmero y tamao).
4. Mayor resistencia a insectos y enfermedades.
5. Mayor resistencia a sequas y heladas.

En la figura 2 se muestran los cidos hmicos derivados de la Leonardita pulverizada

Figura. 2 cidos hmicos derivados de la leonardita

Efectos de los cidos flvicos derivados de la Leonardita

Efectos Fisiolgicos Estimulantes

1. Los cidos flvicos penetran las races y hojas. Luego se translocan a todas las partes
de la planta.
2. Los cidos flvicos aumentan la actividad celular al aumentar el metabolismo.
3. Hasta muy pequeas concentraciones de cidos flvicos son capaces de activar los
sistemas enzimticos en las plantas y su resultado se observa especialmente en la
respiracin de la planta.
4. El oxgeno se absorbe ms intensamente en la presencia de cidos flvicos.
5. La presencia de cidos flvicos durante el perodo inicial de crecimiento aumenta la
actividad vital de la planta y alivia la deficiencia de oxgeno.
6. La actividad cataltica de los cidos flvicos en la respiracin de las plantas mejora su
capacidad de superar condiciones ridas.
7. Los cidos flvicos actan como agentes sensibilizadores especficos de las clulas y
aumentan la permeabilidad de la membrana celular, contribuyendo a la mejor absorcin
de agua y nutrientes desde el suelo circundante.
8. Los cidos flvicos aumentan la actividad de varias enzimas, incluyendo la
transaminasa e invertasa. Tambin intensifican el metabolismo de protenas, ARN y ADN.
9. Los cidos flvicos estimulan la germinacin de semillas y promueven el desarrollo y
crecimiento de races y esquejes.
10. Todos los compuestos hmicos, y especialmente los de la fraccin flvica, son
excelentes quelatantes e intercambiadores catinicos. Esas propiedades funcionales de
los cidos flvicos son de vital importancia en la nutricin de toda clase de plantas.

Significado Ecolgico

Los cidos flvicos siendo ms solubles que los cidos hmicos pueden tener una
funcin especial respecto al destino de los compuestos orgnicos aplicados al suelo como
plaguicidas [2]. Asimismo, los cidos flvicos pueden ser particularmente eficaces para
disolver silicatos. Los ligandos como cidos flvicos son mezclas complejas con
propiedades polielectrolticas. Esos polmeros, o mezclas electrolticas complejas, juegan
un papel importante en los sistemas naturales (lagos, ros y soluciones del suelo) de iones
metlicos, enlazando con contaminantes orgnicos (como plaguicidas), y catalizando la
descomposicin de los contaminantes txicos
Tipos de Detectores de diodos UV
a) Detectores de longitud de onda fija.
La fuente luminosa ms corrientemente utilizada en los detectores de UV, emite la mayor
parte de la energa a una longitud de onda fija de 253,7 nm. Es posible seleccionar, por
medio de filtros adecuados, una de las longitudes de onda, retirando las de emisin ms
dbil. La mayora de los detectores que trabajan con longitud de onda fija, utilizan la lnea
de 254 nm, que presenta una gran estabilidad y de emisin y permite obtener una alta
sensibilidad, pudindose medir incluso cantidades por debajo del nanogramo en
sustancias que presenten una gran absorcin.
El espectrofotmetro de 254 nm, ha sido el detector de bajo coste ms ampliamente
utilizado en CLAE, ya que la mayora de los compuestos que absorben en UV presentan
cierta absorcin esta longitud de onda.
Muchos detectores de longitud de onda fija tambin ofrecen la posibilidad de utilizar otros
filtros, lo que permite una utilizacin limitada del detector a otras longitudes de onda para
la deteccin de aquellos compuestos que no presentan absorcin a 254 nm, pero que si
absorben en algn otro punto del espectro ultravioleta; sin embargo, la estabilidad de la
lnea de base y la intensidad de la seal que se obtiene al trabajar con estas lneas ms
dbiles, no suelen ser nunca comparables a las que se obtienen con la lnea de 254 nm.
b) Detectores de longitud de onda variable.
Los detectores de longitud de onda variable son particularmente tiles en tres casos:

En el caso de que pueda obtenerse una mejor sensibilidad a una longitud de onda
distinta de 254 nm o de otras longitudes de onda para las que existen filtros.
En el caso de que los distintos componentes de la muestra presenten gran
absorcin a diferentes longitudes de onda y, por tanto, el trabajo a una nica
longitud de onda reduzca la sensibilidad e incluso pueda resultar imposible la
deteccin de algunos de los componentes de la muestra.
En el caso de que se desee una operacin con paro del flujo combinado con un
registro del espectro completo de los picos.

En la figura 3, se presenta el esquema ptico de un detector de UV de longitud de onda

variable. Los modernos detectores de UV son capaces de trabajar a cualquier longitud de
onda comprendida entre 190 y 900 nm.

Figura 3. Detector UV/Vis de longitud de onda variable

Otro tipo de detector ultravioleta, cuya importancia en CLAE se hace cada vez mayor, ya
que permite en tiempo real conocer el espectro de UV/Vis en cualquier instante del
cromatograma, es el llamado detector de matriz de diodos. La base del funcionamiento de
los espectrofotmetros de matriz de diodos (figura 4) es simple; el haz de radiacin que
ha atravesado una cubeta de flujo continuo, a travs de la que circula la fase mvil
procedente de la columna cromatogrfica, es dispersado por medio de una red de
difraccin fija, siendo recogidas simultneamente todas las longitudes de onda
dispersadas mediante una matriz de fotodiodos.

Figura 4. Detector UV de matriz de fotodiodos

Experimentacin
Preparacin de la solucin acuosa de cido hmico: Una solucin madre de AH
se prepar disolviendo 10 mg de AH slido en 360 ml de NaOH 1 M y se afor con agua
desionizada hasta 10 ml (1000 ppm).
Columnas y condiciones para el estudio de HPLC: Para estos estudios se filtraron las
soluciones, solventes y la muestra con filtros de membrana millipore de 0.45 m, las
soluciones y solventes se desgasificaron durante 5 s con gas Helio grado cromatogrfico.
Las columnas y las condiciones estudiadas en este trabajo se resumen en la Tabla 1.

Columna

Condiciones

Detector: UV a 234 nm, ndice de Refraccin a 230 nm y

Fluorescencia con una excitacin = 330 nm y emisin = 430
nm.
-1
Elusin: isocrtica. Flujo: 0.5 mL min Inyecciones de 20 m.
Columna SAX de 50 X 4.6 Tiempo total de corrida: 15 minutos. Fases mviles:
mm, Dimetro de partcula - Buffer (c. Brico/Tris/ EDTA) pH = 8.5,
de 8 m.
- Mezclas: Buffer al 80% pH 9.3 y al 60% pH 10.4 (NaOH),
- Mezcla: 90% Agua con 10% MeCN pH = 11 (NaOH)
- Y Agua a pH = 12 (NaOH).
Detector: UV a 200 y 210 nm. Elusin: isocrtica.
-1
Flujo: 0.5 mL min
Inyecciones de 20 m.
Columna C8 de 250 X 4.6 Tiempo total de corrida: 40 y 60 minutos. Fases mviles:
mm, Dimetro de partcula - Buffer (c. Brico/Tris/EDTA) pH = 8.5,
de 8 m.
- Mezcla: 50% Agua con 50% MeCN pH = 11 (NaOH),
- MeCN pH= 5.1 (H3PO4)
- Y Agua a pH = 4.1, 7.0 y 12 (H3PO4 Y NaOH).
Detector: UV a 200 y 210 nm. Elusin: isocrtica y en gradiente.
-1
Flujo: 0.5 mL min
Inyecciones de 20 m.
Tiempo total de corrida: 30, 40 y 50 minutos. Fases mviles:
Columna C18 de 250 X 4.6 - Agua pH= 4.0, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 y 9.0 (H3PO4 y NaOH),
mm Dimetro de partcula de - Mezcla: 50% Agua con 50% MeCN pH= 9.0 (NaOH),
8 m.
- Mezcla: Buffer al 1% y al 10% (c. Brico/Tris/EDTA) pH= 8.5,
- Mezcla: 50% Agua con 50% MeCN pH= 4.4 y 7.0 (H 3PO4 y
NaOH )
- Y Agua pH= 7.0 y Agua pH= 8.0 (NaOH) (en gradiente).

Tabla 1. Resumen de las condiciones llevadas a cabo por HPLC para el fraccionamiento
de AHs
Resultados y discusin
En primer lugar, debido a la gran reactividad de los AHs (aun con el O2 y CO2 del
aire), se prepar la solucin de AH y se mantuvo sellada en un frasco de vidrio.
Posteriormente, en el cromatgrafo de lquidos se inyectaron diferentes volmenes de AH
y se probaron tambin diversas columnas, fases mviles, flujos, detectores, longitud de
onda de deteccin, etc., con la finalidad de obtener cromatogramas con el mayor
nmero de picos resueltos lo mejor posible (mayor cantidad de fracciones de AH).
Debido a esta inestabilidad de los cidos hmicos con el aire, se hicieron pruebas para
seguir los cambios en los cromatogramas despus de varios das de preparar la
solucin de AH bajo las mismas condiciones experimentales. En las Figuras 5,6 y 7

se muestran los cromatogramas obtenidos los primeros das despus de preparar la

solucin de AH (1, 3 y 30 das respectivamente).

Figura 5. Cromatograma de separacin de HA de leonardita despus de 1 da de

preparado. Columna Fase Inversa C8, de 250 X 4.6 mm, dimetro de partcula de 8 m,
detector de arreglo de diodos, fase mvil: agua acidulada a pH
= 4.14, Flujo de 0.5 mL/min, tiempo de corrida de 40 min.

Figura 6. Cromatograma de separacin de HA de leonardita despus de 3 das de

preparado. Columna Fase Inversa C8, de 250 X 4.6 mm, dimetro de partcula de 8 m,
detector de arreglo de diodos, fase mvil: agua acidulada a pH
= 4.14, Flujo de 0.5 mL/min, tiempo de corrida de 40 min.

Figura 7. Cromatograma de separacin de HA de leonardita despus de 30 das de

preparado. Columna Fase Inversa C8, de 250 X 4.6 mm, dimetro de partcula de 8 m,
detector de arreglo de diodos, fase mvil: agua acidulada a pH
= 4.14, Flujo de 0.5 mL/min, tiempo de corrida de 40 min.
Cabe resaltar que los cromatogramas de las Figuras anteriores (5, 6 y 7) se
obtuvieron a las mismas condiciones de trabajo y lo nico que vari fueron los das
de aejamiento de la solucin de AH. En estas figuras se demuestra como las
soluciones de HA tienen cintica ya que al paso de los das los perfiles de los
cromatogramas varan (la intensidad del pico 5 conforme pasa el tiempo va
disminuyendo, mientras que los picos 1,2 y 4 van aumentando su intensidad a pesar de
que la diferencia es de pocos das), es decir, se observa el cambio en las intensidades de
los picos conforme pasa el tiempo.
Con el objeto de realizar separaciones reproducibles se decidi utilizar para el
fraccionamiento soluciones de AH preparadas con al menos 3 semanas de aejamiento.
Por otra parte, al intentar fraccionar los AHs utilizando una fase mvil con pH bsico
(Figura 8), se observ que el AH no se logr separar (unicamente 3 seales), pero debido
a que la intensidad del pico era bastante alta se propone que quiz esto es debido a la
solubilidad que presentan los AHs a valores de pH bsicos, por lo que se puede pensar
que no hay interaccin de la muestra en la columna y se eluye completamente toda la
solucin de AH al mismo tiempo sin lograr fraccionamiento.
Mientras que con una fase mvil a pH neutro o cido hay mayor interaccin de los
diferentes grupos del AH en la columna y se logra separar, pero la intensidad de los
picos es muy baja por esta razn no se puede tener una buena recoleccin de las
fracciones. Esto se debe como ya se mencion anteriormente a la solubilidad que

presentan el AH ya que a valores de pH cidos los AHs son poco solubles y a pH < 2
precipitan completamente, por lo tanto quiz gran parte del AH se reteniene en la
columna (Figura 7).

Figura 8. Columna C8 de 250 X 4.6 mm, dimetro de partcula de 8 m, detector UV 210

nm, Fujo de 0.5 mL/min, Fase mvil agua pH= 9.0 (NaOH ), Elusin isocrtica, Tiempo
total de corrida 40 min.

Figura 9. Columna C8, de 250 X 4.6 mm, dimetro de partcula de 8 m, Detector UV

210 nm, Fujo de 0.5 mL/min, Fase mvil agua pH= 7.0, Elusin isocrtica, Tiempo total de
corrida 40 min.
En conclusin, se considera que la mejor separacin es la presentada en la Figura 5,
ya que las condiciones experimentales utilizadas permiten ver el fraccionamiento de los
AHs en cinco seales principales, las cuales se panean seguir rompiendo hasta llegar a

los componentes bsicos. Por otra parte, el fraccionamiento de los AHs sigue bajo
estudio variando factores que puedan contribuir al rompimiento del AH.

Conclusiones
El cido hmico y fulvico obtenido de la leonardita es el de mayor calidad y de acuerdo a
sus propiedades fsicas, qumicas y bioqumicas le otorgan mayores propiedades para su
uso en la agricultura.
La leonardita es sin duda una fuente de cidos hmicos de la que gracias a sus
propiedades existen un sin fin de efectos con principales aplicaciones en los fertilizantes.
Esto debido a que las propiedades fsicas, qumicas y bioqumicas, estimulan el
crecimiento de las plantas de manera que provocan, mejor germinacin de semillas,
mayor crecimiento radicular, aumento en la formacin de ndulos de leguminosas
(nmero y tamao), mayor resistencia a insectos y enfermedades, mayor resistencia a
sequas y heladas. Es por eso que ah radica la importancia de su aplicacin directa en la
agricultura.
La extraccin del cido hmico se obtuvo con una solucin de hidrxido potsico.
De acuerdo a la literatura se demostr que los cidos fulvicos pueden disolver silicatos.
El detector de Diodos UV para el HPLC con mejor uso para los experimentos con AH es el
detector UV/Vis de longitud de onda variable.
En este trabajo de experimentacin se probaron tres tipos de columnas (SAX, C8 y la
C18), de las cuales slo con la C8 se ha podido fraccionar el AH de la mejor manera, en
las condiciones que ya se mencionaron anteriormente ahora lo que se pretende es
reproducir esta separacin y tambin recolectar las fracciones obtenidas y analizarlas.
Para esto se ha tratado de separar en fracciones al AH para determinar la estructura
de cada fraccin, las cuales pueden ser estudiadas independientemente.
Estudios recientes se han enfocado ms hacia las fracciones, ya que son las fracciones
ms que los AHs, en general, las que son de gran inters debido a que cada fraccin
brinda ms informacin con respecto a las propiedades de estos compuestos, y puesto
que cada fraccin tiene mayor capacidad de interaccin con metales pesados,
compuestos xenobiticos, pesticidas, entre otros.

Bibliografa
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