Hiptesis.

Si la sntesis de la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa en Escherichia coli

aumenta mayormente en condiciones anaerobias que en aerobias entonces, habr una
mayor actividad enzimtica en condiciones anaerobias.
Si la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa de Escherichia coli requieren de
oligoelementos como cofactores entonces en presencia de ellos habr mayor actividad
enzimtica.
Si en presencia de nitrato la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa aumentan su
sntesis entonces habr una mayor actividad enzimtica en presencia de las mismas.
Si Escherichia coli es capaz de utilizar al nitrato como ltimo aceptor de electrones y lo
reduce en ausencia de oxgeno, realizando una fermentacin anaerobia, con la
participacin de un complejo enzimtico que involucra a la nitrato reductasa y a la formiato
deshidrogenasa, entonces una modificacin en las condiciones de cultivo altera la sntesis
y actividad de este complejo enzimtico, y es distinta la actividad en aerobiosis,
anaerobiosis, presencia de oligoelementos y presencia de nitratos (inductor).
Objetivos:

Determinar la actividad enzimtica de la Formiato

Deshidrogenasa(FoDH), Nitrato Reductasa(NR) y del complejo Formiato
Deshidrogenasa-Nitrato Reductasa(FoDH-NR) en Escherichia col.
En base a diferentes condiciones de cultivo verificar la reduccin de
nitrato a nitrito en el proceso de respiracin celular de Escherichia coli.
Observar el carcter inducible de este proceso respiratorio en
condiciones aerbicas y anaerbicas y presencia y ausencia de Nitrato.
Poner de manifiesto la importancia de Cofactores (Oligoelementos) en la
actividad enzimtica y como se afecta sta el prescindir de ellos.

Diseo Experimental:
El ensayo se llev a cabo con Escherichia coli nativa cultivada en medio
Sypher y Strauss adicionado con glucosa en cuatro condiciones diferentes, a la
primera condicin se adicionaron oligoelementos solamente y se incubo en
condiciones de anaerobiosis a 37c, a la segunda se adiciono KNO# y
oligoelementos y se incubo en anaerobiosis a 37C , a la tercera condicin se
adiciono solo KNO3 incubando en anaerobiosis a 37C, estas tres primeras
condiciones se incubaron de manera estacionaria por 6 horas, la cuarta
condicin se adiciono con KNO3 y oligoelementos y se incubo en agitacin a
37C por 6 horas, pasado el tiempo de incubacin se recuperan y re suspenden
en regulador TMK-20 adicionando sacarosa 20% y 2mg/ml de Lisozima dejando
actuar por 15 minutos(las muestras presentaron una consistencia viscosa) una

vez que las clulas estn rotas se adicionaron 10g/ml de DNasa( se

homogenizo hasta la desaparicin de la consistencia viscosa) estos fueron los
extracto enzimticos de trabajo.
Aloe cuatro extractos enzimticos se les determino actividad de FoDH, en una
celda espectrofotomtrica se colocaron 0.25ml de DCPIP; 1ml de Formiato de
sodio; 0.5ml de MSF; 3.15ml de regulador de fosfatos y 0.1ml de extracto
celular, a cada uno de los extractos se ley absorbancia a 600nm por 10 min
en intervalos de 1 min utilizando como blanco regulador de fosfatos.
Para determinar actividad de NR en frascos para suero se mezclaron0.25ml de
kno3; 0.25 ml de Bencil Viologeno0.1ml de extracto celular(1: ) y 1.8ml de
regulador de fosfatos, se hizo pasar una corriente de nitrgeno y se
preincubaron a45C por 15 min posteriormente se inyectaron0.2-0.3ml de
hidrosulfito de sodio(hasta permanecer color azul por 10 min a 45C) , se
cuantifico la cantidad de Nitritos liberados con una curva tipo de Nitritos, se
utiliz un blanco de reactivos el cual no contena extracto enzimtico.
Para determinar actividad del complejo FoDH-NR en frascos para suero se
mezclaron 0.25ml de KNO3, 1ml de extracto enzimtico(1:20) y se llev a un
volumen de 2.4ml con regulador de fosfatos se hizo pasar una corriente de
nitrgeno y se preincubo a37C por 5min, posteriormente se inyectaron 0.1ml
de formiato de sodio y se incubo a 37C por 10min, , se cuantifico la cantidad
de Nitritos liberados con una curva tipo de Nitritos, se utiliz un blanco de
reactivos el cual no contena extracto enzimtico.
Para la determinacin de Nitritos se adicionaron, despus de la incubacin
final, 0.75ml de solucin 3(ver Reactivos) incubando por10min y se lee
Absorbancia a 520nm, se elabor una curva tipo de Nitritos para llevar acabo la
determinacin.
Para determinar protenas insolubles se hizo por el mtodo de Lowry a cada
extracto, a 0.5ml de este se adicionaron 0.5ml de NaOH 1N incubando por 30
min a temperatura ambiente, posterior a esto se aadieron 5ml de reactivo C
(ver reactivos) se incubo por 10min y se agregaron 0.5ml de reactivo D (ver
reactivos) y se agitaron vigorosamente se incubaron a temperatura ambiente
por 30 min y se ley Absorbancia a 600 nm, se elabor una curva tipo de
protena de 0-500g de protena.

Manejo de datos.
Curva tipo de nitritos

Curva tipo de protena

tubo
1
2
3
4
5
6
7

nmol de
nitrito
0
5
10
20
30
40
50

absorbencia
a 520 nm
0
0.096
0.174
0.395
0.578
0.757
0.946

Tubo
1
2
3
4
5
6

Curva tipo de nitritos.

f(x) = 0.02x - 0
R = 1

g de
albumina
0
100
200
300
400
500

absorbenci
a a 600nm
0
0.259
0.384
0.53
0.775
0.927

curva tipo de proteinas.

f(x) = 0x + 0.03
R = 0.99

Determinacin de
extracto absorbencia a
de los
600 nm
cultivos
1
0.291/ 0.417
2
0.292 / 0.457
3
0.279 / 0.470
4
0.292 / 0.466

protena
g de protena/mL

146.0015 / 215.6841
146.5545 / 237.8055
139.3651 / 244.9950
146.5545 / 242.7828

Determinacin de actividad de formiato deshidrogenasa

tiempo
Extracto de los cultivos dil.1:20 alcuota 0.1mL
Absorbencia a 600 nm
1
2
3
4
testigo
0
0.96
0.89
0.923
0.82
0.886
1
0.946
0.862
0.917
0.793
0.88
2
0.937
0.842
0.909
0.774
0.876
3
0.921
0.799
0.902
0.754
0.874
4
0.912
0.775
0.896
0.736
0.875
5
0.901
0.745
0.888
0.718
0.874
6
0.888
0.72
0.883
0.701
0.868
7
0.876
0.697
0.875
0.684
0.865
8
0.864
0.674
0.862
0.668
0.866
9
0.849
0.654
0.862
0.654
0.864
10
0.84
0.633
0.855
0.64
0.863
Determinacin de actividad total de nitrato reductasa
extractos de
los cultivos

absorben
cia a 520
nm

nmoles
de
nitritos/

mL
1
2
3
4
testigo

0.242
0.151
0.562
0.402
0.048

12.7531
7.9637
29.5952
21.1742
2.5426

Determinacin de la actividad del complejo formiato deshidrogenasanitrato reductasa

extract
os de
los
cultivo
s
1
2
3
4
testigo

absorben
cia a 520
nm

nmoles
de
nitritos/
mL

0.216
0.226
0.126
0.504
0.094

11.3847
11.9110
6.6479
26.5426
4.9637

Contenido de
protena y
actividad
enzimtica

mg
protena/ml
extracto
Actividad
especfica de
FoDHasa
(A600nm/mi
n/mg de
protena)
Actividad
especfica de
NRasa
(nmoles de
NO2/min/mg
de protena)
Actividad
especfica del
complejo(nmo
les de
NO2/min/mg
de protena)

Extracto de clulas de E. coli nativas crecidas en

condiciones
anaerbicas
aerbicas
1
Sin NO3 +
oligoelemen
tos
18.3605

2
con NO3 +
oligoelemen
tos
19.282

3
con NO3 sin
oligoelemen
tos
19.0902

4
con NO3 +
oligoelemen
tos
19.3484

0.1305

0.1331

0.0354

0.0929

111.2224

56.2296

283.4187

192.5906

6.9943

7.2111

1.7656

22.3056

Discusin
De los datos obtenidos experimentalmente en las diferentes condiciones para
la cepa de E. coli se muestra una actividad en diferentes enzimas formiato
deshidrogenasa, nitrato reductasa y el complejo.
La actividad del formiato deshidrogenasa resulta ser mayor en una cepa donde
hay NO3 y oligoelementos esto porque en estas condiciones no necesariamente
requiere de dicho sustrato ya que el sustrato donador de e - resulta ser el

formiato, en el otro caso donde en el medio no se agregaron oligoelementos la

actividad resulta menor esto pudo ser a que aunque si hubiese de estos
(proporcionados por el medio) probablemente no fueran suficientes para la
actividad normal.
Para la actividad de nitrato reductasa se observa la mayor actividad en el
cultivo con NO3 y sin oligoelementos aunque para dicha enzima las condiciones
ptimas es en donde hay presencia de NO 3 con oligoelementos para que la
reduccin se d ptimamente.
Finalmente la actividad del complejo resulta de igual forma muy alta en la cepa
con NO3 y con oligoelementos y en condiciones anaerobias, ya que el complejo
trabaja ms ptimamente en estas condiciones, seguida de la cepa sin NO 3
pero si con oligoelementos, al momento de medir esta actividad se induce a
que el complejo por la misma ruta para el crecimiento aerobio la cantidad fue
mayor aun que debera ser menor ya que al tener la opcin de realizar la
respiracin con O2 la actividad del complejo debera verse disminuida, para el
caso del microorganismo sin oligoelementos pudiera ser que no obtuviera lo
necesario con lo cual la actividad del complejo disminuira considerablemente.

Conclusin.
El complejo de formiato deshidrogenasa-nitrato reductasa resulta de gran
importancia para el microrganismo E. coli ya que le permite vivir en medios

donde las condiciones son anaerobias llevando a cabo la reduccin de

nitratos, e inclusive funciona (de forma menos activa) en condiciones
aerobias lo que le permite desarrollarse en cualquier de las dos formas
anaerbica o aerbicamente.