2.

El ADN mitocondrial en Medicina Forense

Fabiola Peir Codina, Amparo Prades Sanchs, Begoa
Martnez Jarreta
Laboratorio de Gentica Forense.
Universidad de Zaragoza (Espaa)

INDICE
1.
2.
3.

Introduccin
Tcnicas de anlisis del ADN mitocondrial
SNPs de ADN mitocondrial
Bibliografa

1
3
5
6

1. INTRODUCCIN
La mitocondria es una organela intracitoplasmtica delimitada por una doble membrana
con plegamientos en la ms interna y cuya misin primordial es producir, transformar y
almacenar energa en la clula.
En el ao 1954 Casperson demostr en la mitocondria la presencia de ADN de estructura
y propiedades diferentes al ADN nuclear. Barrell y cols. en 1979 y Young y Anderson en
1980, tambin describieron un cdigo gentico diferente en las mitocondrias (1).
La cifra media de mitocondrias en una clula vara entre 250 y 1.000, pese a que es muy
difcil de determinar por variar segn la especie, tipo celular, necesidades metablicas y
momento funcional (1 y 2).
El genoma mitocondrial es un fragmento circular de ADN compuesto por 16,5 kilobases
con tres caractersticas especialmente significativas que lo han convertido en objetivo de
estudio del estudio de muchas especialidades de la Biologa y de la Medicina, dichas
caractersticas son:
1. Herencia estrictamente materna (2 y 3).
2. Relacin con diversas enfermedades y procesos degenerativos generalizados (4 y 5).
3. Se conoce con exactitud la secuencia de todos sus nucletidos (6), lo que es de gran
utilidad para el anlisis de sus polimorfismos y posterior aplicacin en gentica
forense (7 y 8)
Los 16.569 pb que componen el ADNmt se disponen de forma circular y cerrada, en dos
cadenas complementarias y antiparalelas, que se encuentran en mltiples copias dentro de
la mitocondria, en total entre 1.000 y 10.000 molculas de ADNmt por clula (9 y 10).
Por su composicin bioqumica, las dos cadenas son diferentes, ya que en la secuencia
nucleotdica de una prevalecen las bases pricas (adenina y guanina), por lo que es ms
pesada que su complementaria donde, para respetar la complementariedad, han de
predominar las bases pirimidnicas (timina y citosina); en consecuencia, a la primera de
las cadenas se la denomina H (Heavy o pesada), y a la otra cadena L (Light o ligera) (4).

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El ADNmt se localiza en la matriz de la mitocondria, aunque ocasionalmente se

encuentra unido a la membrana mitocondrial interna. En la mitocondria se produce la
fosforilacin oxidativa, generndose casi todo el adenosin-trifosfato (ATP), molcula
bsica de intercambio de energa, que la clula necesita. Contiene su propio sistema
gentico y exhibe una herencia citoplasmtica (1).
El ADNmt no tiene nada especial que lo diferencie del ADN nuclear en su composicin
qumica, sin embargo posee un cdigo gentico propio (1). Por otro lado, su organizacin
es tremendamente econmica ya que tan slo un 10% de su totalidad es ADN no
codificante y no contiene intrones (6 y 11), por lo que posee una relativa simplicidad en
su genoma.
En los mamferos, el espermatozoide aporta poco o nada de citoplasma al zigoto, y la
mayor parte, si no todas, de las mitocondrias del embrin deben derivar de las del vulo y
no del espermatozoide. Su genoma, por tanto, es haploide debido a que su herencia es
estrictamente materna (2, 3, 12 y 13), y no se encuentra sometido a procesos de
recombinacin, al contrario que el ADN nuclear (3).
El ADNmt se autoperpeta por la replicacin de sus cadenas, proceso que se inicia con la
separacin de la cadena H de la L en el nucletido nmero 191 de la zona denominada
asa de desdoblamiento o d-loop (displacement loop), una regin de 1,1 Kb situada entre
los genes de la tARNPro y tARNPhe y de la que no se conoce funcin codificadora
alguna; tomando como molde una cadena L se forma una cadena H de unas 680 bases,
conocida como 7S ADN (14, 15 y 16), continuando despus la sntesis del resto de la
cadena pesada.
La replicacin de la cadena ligera slo se produce cuando su lugar de origen replicativo
queda expuesto como una cadena simple al elongarse la cadena pesada; para ello es
necesario que transcurra cierto tiempo, ya que el punto de origen de la cadena ligera no se
encuentra en el asa de desdoblamiento, sino incluido en el interior de una batera de
5 genes de tARN, aproximadamente a unos 5,7 Kb del origen de la cadena pesada (17).
Por otro lado, ambas hebras del ADNmt, H y L, se transcriben completamente a partir de
promotores PL y PH1, situados en la regin d-loop del genoma mitocondrial (18 y 19).
La mayor variabilidad interpersonal se acumula en la denominada asa de desdoblamiento
o d-loop (displacement loop), que es un fragmento de 1.112 pares de bases que no se
encuentra involucrado en la codificacin de ningn producto proteico, por lo que las
mutaciones se acumulan con una frecuencia de 5 a 10 veces mayor que en el resto del
genoma mitocondrial (20 y 21). A este fragmento tambin se le denomina regin control
y es la zona ms polimrfica de todo el genoma del ADNmt humano (21, 22, 23 y 24).
Esta regin se subdivide a su vez en dos subregiones de aproximadamente el mismo
tamao cada una (400 pb): la regin hipervariable I (HVI) y la regin hipervariable II
(HVII). La mayor parte de las variaciones no estn distribuidas al azar, sino que se
concentran en estos dos segmentos hipervariables (3 y 25).
Con el transcurso del tiempo, las mutaciones se van produciendo, acumulando y
perpetuando en las diversas personas, por lo que incluso individuos que proceden de una
misma lnea materna (y por lo tanto deberan tener exactamente el mismo ADNmt)
aparecern diferentes con el transcurso del tiempo, en este caso, miles de aos (26).
La regin control es la menos conservada entre las distintas especies (27), y ms del 96%
de los cambios de base son transiciones (28).

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Figura 1:
Representacin esquemtica del ADN mitocondrial.

Regin Control
~ 1100pb
342pb
HV1
16024

268pb
HV2

16365

HV

Cadena
ligera L

73

340

HV

16.569

Cadena
pesada H

El avance de las tcnicas de anlisis molecular ha permitido conocer y asociar diversos

tipos de patologas del ser humano con las variaciones (mutaciones, delecciones o
inserciones) del ADN mitocondrial (29 y 30). Una vez superados los estudios iniciales
basados en tcnicas potentes, pero no lo suficientemente discriminativas, ni informativas
(como la deteccin de variaciones por medio de alteracin en los puntos de corte de
enzimas de restriccin), y gracias a la introduccin de sistemas de secuenciacin
automticos o semiautomticos, se ha facilitado el conocimiento exacto de la estructura
ntima de cada fragmento de ADNmt, as como las repercusiones que muchas de sus
variaciones producen en el ser humano en forma de patologa y procesos degenerativos
(31).
Se ha podido demostrar que en el ADNmt se acumula un nmero de mutaciones superior
a las que lo hacen en el ADN genmico (29 y 32). Este hecho se explica por diferentes
mecanismos que intervienen paralelamente (4, 21, 23, 33 y 34):
1. El material gentico mitocondrial est especialmente expuesto a la accin de
molculas reactivas en general (procesos de oxidorreduccin en su interior), por lo
que es muy sensible al dao oxidativo, principalmente causado por la existencia de
un mayor nmero de radicales libres.
2. El ADNmt carece del efecto protector que las histonas otorgan al ADN nuclear.
3. Los mecanismos reparadores del ADNmt son menos efectivos que los del ADN
nuclear.
La ADNmt polimerasa posee una pobre actividad proof reading si la comparamos con la
polimerasa del ADN nuclear.

2. TCNICAS DE ANLISIS DEL ADN MITOCONDRIAL

El abordaje tcnico del ADNmt en Gentica Forense suele realizarse por secuenciacin
directa tras la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), tcnica que facilita el anlisis
al amplificar la regin control del ADNmt que deseamos estudiar.
La introduccin de la tcnica de PCR supuso un avance sin precedentes en la Medicina
Forense ya que se podan analizar regiones lo bastante pequeas como para que la
degradacin del ADN genmico no tuviera tanta importancia. Como aplicacin inmediata
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se us en la identificacin de restos humanos (35) ya que hasta entonces se estudiaban los

polimorfismos de ADN con mtodos convencionales (RFLP) que no daban buenos
resultados con muestras degradadas.
Entre las primeras aportaciones al anlisis de ADN mitocondrial en Medicina Forense
destaca la de Hopgood y cols. (36).
De esta manera obtenemos la informacin deseada en trminos de variaciones
individuales en forma de mutaciones puntuales, inserciones o delecciones (37).
Antes de ser aceptados para la prctica forense el conjunto de los polimorfismos
analizables por PCR deben cumplir una serie de requisitos y pasar sucesivos controles de
validacin (38 y 39).
Esta regin de 1112 pb puede ser amplificada de varias maneras, sin embargo los
mtodos ms utilizados en la actualidad son: Nested-PCR (PCR anidada) y SeminestedPCR (PCR semianidada) para amplificar la regin hipervariable I (HVI) (25) y la PCR
simple usada en la amplificacin de la regin hipervariable II (HVII) (26 y 40), con la
utilizacin de primers que acotan las zonas de la regin que se va a amplificar.
La Nested PCR se realiza en dos fases, y es til en casos en los que se dispone de poca
cantidad de ADN problema, este mtodo favorece el mayor rendimiento y la obtencin de
mayor cantidad de producto final amplificado. Sin embargo posee la desventaja de que es
ms sensible a la contaminacin lo que puede llevar a la obtencin de resultados
falsamente positivos. El uso de PCR simples disminuye el riesgo de estar amplificando
ADN ajeno a la muestra problema, pero en contraposicin, genera menos cantidad del
producto de PCR final lo que en ocasiones nos imposibilita la obtencin de resultados
(41).
Una vez amplificado el ADN mitocondrial, hay diversas formas de poner de manifiesto
los polimorfismos que presente la secuencia en estudio.
Cuando analizamos una secuencia, lo que pretendemos es conocer la disposicin u orden
en que se encuentran los nucletidos que componen un fragmento de ADN determinado.
En los ltimos aos y gracias al avance de la tecnologa, las posibilidades en cuanto a
mtodos y procedimientos de secuenciacin se han incrementado de forma beneficiosa
para la comunidad cientfica. El uso de secuenciadores automticos (42) y de
fluorocromos ha venido a facilitar el anlisis de la secuencia del ADN, que ahora es
posible siguiendo estrategias muy distintas:
- Secuenciacin cclica (36, 43 y 44).
- Secuenciacin en fase slida (36 y 45).
Pero adems de los mtodos de secuenciacin existen otras alternativas a la hora de poner
de manifiesto las diferencias mutacionales (existencia de variaciones nucleotdicas
puntuales), que no exigen el anlisis de la secuencia completa, y que pueden ser un
primer mtodo de screening o despistaje en identificacin forense:
-La tcnica de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (46, 47 y 48) como
mtodo de screening.
-RE-SSCP (Restriction Enzyme-SSCP) (49 y 50)
-LSSP-PCR (Low Stringency Single Specific Primer) (51)
-Heteroduplex (52)
-Dot-blot con sondas ASO/SSO (Sequence Specific Oligonucleotide) (8)
-IR (Infrared Fluorescence) (53)
-Minisecuenciacin (54)
-RT-PCR (55)
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3. SNPS DE ADN MITOCONDRIAL

Las mutaciones pueden tener efectos deletreos y causar enfermedades y tambin, en
ocasiones, pueden ser neutras o incluso beneficiosas. Sea cual sea su efecto en trminos
de salud, lo que s inducen es el polimorfismo, es decir, la variacin allica entre
individuos de la misma especie. Un polimorfismo es considerado como tal cuando su
frecuencia en la poblacin es superior al 1%. Hay varios tipos de polimorfismos
(inserciones, delecciones, variaciones en el nmero de secuencias repetidas en tandem),
pero los ms frecuentes (el 80%) son los denominados SNPs (Single Nucleotide
Polymorphisms) (56).
Los SNPs estn distribuidos a lo largo de todo el genoma con un promedio de densidad
de 1 cada 1,9 Kb (57).
El estudio de los SNPs, fundamentalmente a travs del empleo de chips genticos (58), ha
adquirido un notable auge por su posible contribucin a la definicin de las bases
moleculares de las enfermedades complejas o multignicas, que incluyen las ms
frecuentes, como son el cncer, la artritis, la diabetes, las enfermedades autoinmunes o las
cardiovasculares (59).
Adems de su uso como marcadores genticos en Medicina Clnica tambin tienen una
gran utilidad en Medicina Forense, pues pueden constituir una eficiente herramienta de
identificacin gentica en casos criminales. As, podramos encontrar cuatro variedades
de tipado por individuo para cada SNP segn la base que estuviera mutada (A, C, G, T) y
si se estudian un nmero suficiente de SNPs para cada muestra, tendramos un buen perfil
de discriminacin e identificacin.
El estudio de los SNPs ha pasado por sucesivas fases y tcnicas:
- Sondas especficas de alelo (ASO: Allele Specific Oligonucleotide) (60) y dot-blot
alelo-especfico (61). Ms recientemente se han usado sondas marcadas
fluorescentes (TaqMan probes) en termocicladores de PCR a tiempo real que
adems permiten la cuantificacin de la muestra (62)
- SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism).
- Secuenciacin directa de los fragmentos de inters.
- Deteccin de SNPs usando microarrays de oligonucletidos (63). Se usan primers
con sitios polimrficos y con el extremo 3 covalentemente unido al soporte. Las
dianas de ADN conteniendo SNPs se generan con una PCR asimtrica. El
rendimiento de los productos elongados aumenta por repeticin de ciclos.
En el caso del ADN mitocondrial, la regin diana para la aparicin de mutaciones es la
regin hipervariable con un porcentaje entre 5-10 veces mayor que el ADN nuclear.
Usualmente varan entre el 1-2% de las secuencias de ADN mitocondrial de individuos
no relacionados en esa regin hipervariable (64).
En un contexto filogentico, el anlisis de SNPs, se usa para estandarizar haplogrupos del
mismo modo que se hace con las variaciones que se encuentran en la regin control del
ADN mitocondrial (65 y 66).

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Figura 2:
Contribucin de los SNPs a la generacin de haplotipos. Un cambio (T-C, A-G) en el primer
par de bases crea un SNP y un segundo haplotipo. Un segundo cambio (A-G, T-C) crea otro
SNP y un tercer haplotipo (59).

Los datos que se almacenan en el SWGDAM (Scientific Working Group on DNA

Analysis Methods) sirven para inferir la rareza de los perfiles del ADN mitocondrial
(haplotipos). Habra polimorfismos poblacin-especficos que daran los perfiles de los
distintos haplogrupos (67). Muchos de los polimorfismos que determinan los haplogrupos
son continente-especficos (68). Se nombran con letras maysculas. As, el 76% de los
africanos perteneceran al haplogrupo L (69), el 77% de los asiticos al D (70), los
nativos americanos tendran cuatro haplogrupos (A-D) (67), mientras que los europeos se
encuadraran en alguno de los siguientes diez haplogrupos: H, I, J, K, M, T, U, V, W X
(71). Seis de estos haplogrupos (H, I, J, K, T y W) quedan confinados a la poblacin
estrictamente europea y probablemente se originaron de los ancestros caucasoides
genticamente separados de los ancestros de las modernas Asia y Africa (72).
Dado que el estudio del ADN mitocondrial es preferencial en muestras degradadas o
escasas, el avance en la investigacin sobre SNPs tambin va a redundar en su beneficio
creando bases de datos que permitan mayores y mejores identificaciones. Esto es
especialmente til en el caso de la Gentica Forense donde no siempre las muestras se
encuentran en las mejores condiciones ni estn en la suficiente cantidad como para poder
caracterizarlas con marcadores nucleares y redundara en una mejor aportacin a las
principales aplicaciones medico-legales de los polimorfismos del ADN mitocondrial:
- investigacin biolgica de la maternidad tanto en casos rutinarios como en casos
especiales como que se cuente solamente con un nico progenitor vivo (73).
- criminalstica: el rendimiento del estudio de ADN mitocondrial frente al nuclear en
el caso de muestras difciles es manifiestamente superior debido a su mayor
cantidad y a la ms elevada posibilidad de que alguna copia est conservada.
- identificacin de restos humanos (74).
- identificacin de razas (75).
Los SNPs son detectados comparando la secuencia de la Regin Control que interesa con
la Secuencia de Referencia de Anderson (6).
Adems del inters que tiene el estudio de la Regin control del ADN mitocondrial para
la identificacin humana y la estimacin de divergencias, el resto del genoma
mitocondrial, es decir, la regin codificante, tambin puede presentar SNPs que van a dar
lugar a la aparicin de distintas patologas (76).
Del avance en su estudio y caracterizacin va a depender el xito de la terapia gnica.

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