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TEMAS MICROBIOLOGA

Scott Sutton
LA EXACTITUD DEL CONTEO DE PLACAS
"Los temas de microbiologa " trata sobre diversos temas en microbiologa de uso
prctico en la validacin y el cumplimiento. Tenemos la intencin de esta columna sea
un til recursos para las aplicaciones diarias de trabajo.
Comentarios de los lectores, preguntas y sugerencias son necesarios para ayudarnos a
cumplir nuestro objetivo para esta columna. Por favor enve sus comentarios y
sugerencias al coordinador de la columna de Scott Sutton al scott .
PUNTOS IMPORTANTES
Se discuten los siguientes puntos clave:
Los datos microbiolgicos son inherentemente variable.
Los "recuento en placa " es en el mejor de una interpretacin de una aproximacin del
nmero de clulas presentes.
El rango lineal para los recuentos bacterianos comunes en placas de tamao estndar
se establece.
Situaciones de recuento en placa inusual producirse y debe ser objeto de un
procedimiento operativo estndar (SOP).
Redondeo y reglas promedio pueden jugar un papel en el recuento de bacterias
deducido. Estas reglas deberan estar de acuerdo con la Farmacopea de Estados
Unidos y descrito en el SOP.
Conteo de placa puede tener un impacto significativo en el cumplimiento de las
especificaciones de producto y proceso controles.
CULES SON DATOS MICROBIOLGICOS?
La mayora de los microbilogos afirmaran que la registrada nmero de unidades
formadoras de colonias (CFU ) eran de datos.
Sin embargo, esa cifra es de alguien (tcnico especializado) interpretacin del nmero
de colonias en la plato. La experiencia ha demostrado que los diferentes tcnicos
(cada una especializada) puede y con frecuencia no observar diferentes cuenta con la
misma muestra. Los datos registrados en la cuaderno de laboratorio son una
interpretacin del nmero de colonias en la placa. Sin embargo, se trata de los mejores
datos disponibles para nosotros. Tambin hay que recordar que la
CFU es slo una estimacin del nmero de clulas presentes.
Se trata de una estimacin sesgada en el mejor de como las nicas clulas capaces de
formar colonias son aquellas que pueden crecer bajo las condiciones de la prueba (por
ejemplo, medios de incubacin, temperatura, tiempo, condiciones de oxgeno). Incluso
esos no representan una sola clula, sino ms bien los que pas a ser bien separados

en la placa por lo que puede distinguirse despus del crecimiento. Podra surgir Una
colonia de una clula o varios miles.
Microbiologa tiene una reputacin bien merecida por ser altamente variable. Nuestra
laxa atencin a la precisin y la precisin en nuestras mediciones ayuda an ms esta
percepcin. Hemos permitido que las especificaciones para el medio ambiente
vigilancia, carga biolgica de materia prima, en proceso biocarga, y biocarga producto
terminado ser impuesta por la regulacin sin tener en cuenta la capacidad de los
mtodos para apoyar a esas especificaciones.
Una segunda razn para preocuparse por la placa exactitud recuento es la introduccin
de mtodos microbiolgicos en el laboratorio. Ser obsesivo por el entrenamiento,
estamos tratando establecer medidas arbitrarias de precisin y precisin en este
ejercicio que los mtodos tradicionales no puede acercarse a juego. Un buen ejemplo
de esta es la Farmacopea Europea requisito de "precisin" para un mtodo alternativo
(cuantificacin) para tener una desviacin estndar relativa (RSD) en el rango de
10-15% (1). Si bien este requisito podra ser afortunadamente logrado con diluciones
que tienen recuentos de placas en el rango de 150 a 250 UFC / placa, en los recuentos
de placas inferiores el valor objetivo impuesto por la regulacin har virtualmente
garantizar un largo y difcil, y muy posiblemente sin xito ejercicio de validacin.
GAMA CONTABLE EN UNA PLACA
Los rangos generales de aceptacin comn para numerable nmero de colonias en
una placa son 30-300 y 25-250. Los origen de esos rangos es el examen vale la pena.
Literatura
Raza y Dotterrer public un artculo seminal sobre este tema en 1916. Se propuso
determinar el "lmite en el nmero de colonias que pueden autorizarse para crecer en
un plato sin introducir errores graves en relacin con la revisiones propuestas de los
mtodos estndar de anlisis de la leche (2). Sealan que "el tipo de bacterias en el
material bajo examen tendr una influencia en el tamao de las colonias, y en
consecuencia, en el nmero que puede se desarrollan en un plato. "Raza y Dotterrer
tambin sealan que suministro de alimentos puede ser un problema, colonias dosis
entre s en la placa puede fusionar, y las colonias vecinas puede inhibir o por el
contrario el crecimiento estimulan el crecimiento. "Debido a estos y otras dificultades,
algunas placas en cualquier serie de hechos una muestra dada son ms satisfactorios
para el uso de la informtica un total de son otros. La cuestin de la seleccin de platos
para ser utilizado en el clculo de un recuento convierte, por tanto, una cuestin que
requiere considerable juicio "(2). Raza y Dotterrer elegir sus platos contables de los
recubrimientos por triplicado de cada dilucin, lo que requiere placas aceptables para
estar dentro de 20% de la media. En este anlisis, placas con ms de 400 CRJ eran
insatisfactorios, como lo fueron los de menos de 30 CPU, con mejores resultados en el
rango de 50-200 CPU / placa.
Tomasiewicz et al. proporciona una excelente revisin de la continua evolucin del
nmero apropiado de la CPU por plato de la leche (3). Los autores tomaron datos de
colonia cargos de la leche cruda de tres experimentos diferentes

(cada dilucin plateado por triplicado) y se utiliza los datos para determinar a-squared
media de errores de la estimacin para todos platos. Su recomendacin al final del
estudio fue para un rango de 25 a 250 numerable CPU / placa por triplicado. Ello
Es interesante observar que aunque los autores sealan que CPU sigue una
distribucin de Poisson, no se hace mencin de cualquier transformacin de datos
utilizado para aproximarse a una normal de distribucin a priori a la utilizacin de la
normalidad estadstica analtica herramientas. Tomasiewicz et al. proporcionar la
siguiente excelente
Consejos de prudencia:
El Datil en este documento no es necesariamente aplicables a otros sistemas. Para el
equipo automatizado, el ptimo rango puede variar UEO con el instrumento. Adems,
incluso si no se utiliza la automatizacin, los nmeros de colonias que deben estar en
un plato contable puede irnica ampliamente, dependiendo de muchas otras variables.
Con hongos del suelo pieles ejemplo... (3).
Los compendios han armonizado recientemente una prueba microbiana de
enumeracin ( 4 ) . El compendio recomienda se Seleccione las placas
correspondientes a una dilucin dada y mostrando el mayor nmero de colonias de
menos de 250 por TAMC y SO para TYMC. En la determinacin de la resistencia de
indicadores biolgicos, los Estados Farmacopea Unidos (USP) recomienda un rango de
20 a 300 colonias, pero no menos de 6 " ( 5 ) . Sin embargo, la descripcin ms
completa de la gama contable se encuentra en USP captulo informativo.
<1227>
El rango aceptado para conteo de colonias en un standard placa de agar es de entre 25
y 250 de piel mayora de las bacterias y Candida albicans. Esta gama se estableci en
la comida industria de la piel contando las bacterias coliformes en la leche. El rango es
compendios de piel aceptable] arganisms , excepto los hongos de piel .
No es de piel ptima contando todo el monitoreo ambiental aislamientos. El Aspergt7lus
niger piel rango recomendado es entre 8 a 80 ufc por placa. El uso de filtracin de
membrana af recuperar arganisms desafo , o el uso af ambiental aislados como
arganisms desafo en el antimicrobiano pruebas de la eficacia, requiere la validacin af
el contable rango . " ( 6 ) .
Lmite superior
El lmite superior de los recuentos de placas depende de una serie de factores, como
se describi anteriormente. Los principales temas incluyen el tamao de la colonia y el
comportamiento (por ejemplo, enjambre), y el rea de la superficie de la placa. El
tamao viene particularmente en jugar con chapado de una membrana para la
determinacin de la CPU, como el rea de superficie de membrana que es mucho ms
pequeo que la de una placa estndar.
TNTC (demasiado numerosos para contar) pueden ser reportados a cabo varias
maneras. ASTM (7 ) recomienda informar de este como > " lmite superior ".
Por ejemplo, una dilucin 1:10 con ms de 200 CPU en una placa de difusin se
reporta como > 2000

CFU / ml (o gramo). BAM de la FDA recomienda conteo las colonias de la dilucin con
recuentos de placas dando ms cercana a 250, contando una porcin de la placa, la
estimacin el nmero total y luego usar ese nmero como la prevista recuento
aerbico. El Departamento de Estados Unidos Agricultura (USDA) recomienda el uso
de una rejilla para segmentar el rea de recuento, a continuacin, determinar el
promedio de CPU / sistema y multiplicando esta CPU promedio / rejilla por el nmero
de rejillas en la placa (9). No est claro que el autor lo sea de estos mtodos es muy
superior a adivinar.
La razn hay i; S un lmite superior a la CPU / placa es que las colonias empiezan a
competir por espacio y nutrientes, sesgando el conteo. En mi opinin, esto es un
chapado no vlido y necesita ser hecho correctamente en una fecha posterior. Tenga
en cuenta que yo estoy evitar enrgicamente el uso de la palabra nueva prueba. Esta
resultado invalida el forro, y por lo tanto, la prueba fue no se realiza correctamente. S
que esto es una dificultad a la personal de laboratorio, que estaban tratando de reducir
la carga de chapado inicialmente por no enchapado diluciones suficientes. Sin
embargo, cometer un error al principio no es una excusa razonable para evitar hacer
correctamente despus de que se reconoci el error. Si el laboratorio desea utilizar este
" recuento estimado, " debera, en una mnimo , tener que describe un alto precio en el
" conteo de UFC " procedimiento operativo estndar ( SOP ), con una razn de ser en
cuanto a cuando los recuentos de placas no son crticos y pueden ser estimadas de
esta manera.

Hay mtodos disponibles si debe querer determinar con precisin el lmite superior
para un chapado nico de superficie o un tipo de colonia nica. Uno se presenta en
el USP captulo informativo < 1227 > (5) que se basa en una comparacin por pares
de cuentas de una serie de dilucin.
Esto se basa en la suposicin de que en el lmite superior los nmeros observados
de CFU se caern de la esperada nmeros en algn momento (vase la Figura 1) .
Esta divergencia va llegar a ser significativo en algn punto que defmes la parte
superior lmite de CPU / placa.

Lmite inferior

Una preocupacin central en esta determinacin es la denuncia del lmite de


cuantificacin ( LOQ ) (que es lo que somos realmente interesado en la presentacin
de informes ) en contra del lmite de deteccin
(LD ) ( 1 CFU) . Esta es una distincin importante si queremos que se celebra a las
especificaciones de la gama ms baja.
Recomendaciones ASTM se centran en la LOD y urgencias el usuario para informar
que la respuesta si se recuperan sin colonias (es decir, < 10 CFU / mL para una
dilucin 1:10) (7 ) . Si colonias contables estn presentes, pero por debajo del rango
contable, contarlos de todos modos y informar de un recuento estimado.
USP no tiene una recomendacin especfica sobre cmo reportar estos nmeros
bajos, pero que tenga en cuenta " el recuento ms bajo umbrales para la mayor
dilucin en placas en serie debe justificarse " (6).
La FDA BAM recomienda un formato diferente (8 ) . En el mtodo de la FDA BAM ,
todas las cuentas se registran en los datos en bruto , pero la informacin se reporta
como <LDC . Por ejemplo, una dilucin 1: 100 que produce recuentos de 18 y 12
sera reportado como < 2,500 . Este es, en mi opinin, la prudente. El quid de la
discusin es que experimental los estudios han demostrado muy poca precisin en
la placa conteos por debajo de 25 (vase ms arriba) . Tericamente podemos
argumentar que, debido a la CFU sigue la distribucin de Poisson , el error de la
estimacin es la raz cuadrada de la media (USP
< 1227 > ) . Esto conduce a grficos tales como en la Figura 2 , la cual nos muestra
que a medida que la CPU / placa cae por debajo del contable gama , el error como
un porcentaje de la media aumenta rpidamente .
Esta confusin entre la LOD y LOQ para la placa conteos ha dado lugar a algunas
situaciones muy difciles.

SITUACIONES INUSUALES

Las siguientes situaciones y preguntas se deben tomar en consideracin.


Dos diluciones con colonias contables

Lo ideal sera que usted nunca ver dos diluciones separadas con que cuenta en la
gama contable, como cubren los rangos contables una gama de 10 veces de CFU.
Sin embargo, esta es la microbiologa.
Recomendaciones ASFM instan tenerse en ambas diluciones de cuenta, la
determinacin de la CFUfmL (o gramo) por separado para cada uno y promediando
los resultados para el resultado final (7).
Raza y Dotterrer (2) tambin utiliz varias diluciones si el los nmeros se ajustan a
los requisitos de control de calidad (QC). FDA BAM tiene ninguna recomendacin en
esta situacin. Mientras puede argumentar utilizar todos los cargos, se trata de un
fuerte argumento si se utilizan placas por triplicado y los lmites de control de
calidad en su lugar para descartar placas errneas.
Un argumento fuerte tambin se puede hacer para tomar la dilucin proporcionar el
mayor nmero de CFU en el intervalo contable.
Este enfoque minimiza dos preocupaciones: errores en las estimaciones aumentar
con el aumento de diluciones en serie, y los errores en las estimaciones aumentan
con la disminucin de los recuentos de placas. Uso de la dilucin ms pequea (por
ejemplo, uno y diez vs. 1: 100) podra justificarse desde esta perspectiva.
Alternativamente, el procedimiento USDA recomienda determinar la deducida CFU
(teniendo en cuenta el factor de dilucin) para cada dilucin por separado y
promediando las dos estimaciones { 9 ) . Independientemente del mtodo utilizado
debe ser documentado y justificado en el Conteo UFC "SOP
Qu pasa si todas las placas tienen menos Colonias que el mnimo del rango
contable?
Si el promedio de las placas est por debajo del LOD , a continuacin, reportar el
resultado como inferior al lmite de deteccin . Por ejemplo, enchapado duplicados
de 1 ml de una dilucin 1:10 de la LOD es de 10 UFC / ml. Si no hay colonias
crecieron en las placas de dilucin 1:10, o si uno colonia creci en un plato
(promedio de 0,5 CPU / placa) , esto debe ser reportado como < 10 UFC / ml . La
segunda situacin es donde las placas tienen colonias pero menos que el contable
gama. La FDA BAM recomienda informar de este como < 25 x Factor de dilucin. En
otras palabras, si el mejor que tuvimos fue una dilucin 1: 1000 con un promedio de
16 CPU / placa, esto se reporta como < 25.000. USDA recomienda calcular la UFC
como normal, pero sealando esto como una estimacin. Mientras esta situacin
particular puede parecer acadmico, es uno que tiene importancia para la
determinacin de la adherencia a las especificaciones de calidad.
Lmites de control de calidad en los recuentos de placas Replicar
Peridicamente hay recomendaciones para establecer los lmites de control de
calidad en los recuentos de placas replicadas. Raza y Dotterrer requeridos
recuentos de placas vlidas de placas por triplicado para proporcionar estimaciones
de CFU / mL dentro de 20% de la media {2). En otro

Es decir, se contaron todas las placas, y el recuento de UFC de cada placa se utiliz
para estimar la CFU / mL originales. Cada estimacin se evalu, y si la estimacin
para cada plato estaba dentro del 30% de la media, se consider aceptable.
Establecimiento de lmites de control de calidad para los recuentos de placas que
funciona mejor si usted tiene por lo menos tres placas idnticas para cada dilucin y
a entender la relacin entre la precisin y el nmero de CPU / placa. Weenk
desarroll estas consideraciones en un debate comprensible en relacin con los
estudios de promocin de crecimiento media {10). Su anlisis supone un error de
dilucin de 5,5% a partir de pipeteo y estima la capacidad de experimentos
paralelos de chapado (nuevos medios vs. estndar) distinguir entre dos
poblaciones. Los resultados son muestra en la Figura 3 (recalculado a partir de las
ecuaciones de Weenk).
Este tratamiento muy caro muestra los efectos de aumento del nmero de placas
en la rplica-aumentando nuestra capacidad de distinguir entre poblaciones
similares. De una manera similar, somos capaces de distinguir las diferencias ms
pequeas (el conteo se vuelve ms exacto) como el nmero de CPU / placa
aumenta. Por lo tanto, tratando de establecer una directriz de control de calidad
para
CPU / replicacin (por ejemplo, cada rplica debe estar dentro del 30% de la media)
puede ser problemtico en los recuentos de CPU / placa inferior.
El mtodo utilizado para el recuento por placa de control de calidad, si se utiliza,
debe ser documentado y justificado en el SOP, junto con la respuesta a la bsqueda
de los recuentos de variantes.

Puedo placa 10 x 1 ml Las muestras de placa un total de un 10 ml de muestra?


Ha habido sugerencias de que un volumen mayor de material puede ser plateado a
travs de varias placas, y los resultados informado por el mayor volumen (por
ejemplo, placas de 10 x 1 mL muestras en 10 platos diferentes y luego reportarlo
como si una muestra de 10 ml se sembr ) . Este enfoque es errneo porque no
tiene en cuenta varias fuentes de variabilidad en chapado incluido el muestreo, el
crecimiento, y los errores de recuento ( 10 , 11) . La correcta interpretacin de esta

situacin es que usted acaba de chapado en 1 ml 10 veces, no 10 ml de una vez.


Los nmeros podran ser promedio, pero no pueden ser aadidos.
REDONDEO Y PROMEDIANDO
El nmero de cifras significativas debe considerarse en una discusin de redondeo y
un promedio. Para colonia prima recuentos, prctica comn etermines que el UFC
observ determinar la cifra significante, y que el promedio es de un decimal a la
derecha de ese nmero. Sticklers para la exactitud reportar la media geomtrica
en lugar de la media aritmtica dada la distribucin de Poisson seguido de CFU . En
la presentacin de informes, es una prctica comn a reportar como notacin
cientfica con dos cifras significativas.
Esto requiere redondeo.
USP { 12) y ASTM (7 ) tanto redonda a las cinco , si cinco es el nmero a la derecha
de la ltima cifra significativa . FDA BAM tiene un esquema ms elaborado,
redondeo si el nmero es de seis o superior y hacia abajo si cuatro o inferior. Si el
nmero es cinco, BAM se parece al siguiente nmero a la derecha y redondea si es
impar y hacia abajo si es par.
Este es uno de esos temas en los que usted desea a todos a hacer estos clculos de
la misma manera . Asegrese de incluir la direccin y su justificacin en la "Cuenta
UFC " SOP si no existe ya en un SOP separada.
ESPECIFICACIONES Y NIVELES DE CONTROL DE MONITOREO AMBIENTAL
Si usted se enfrenta con una carga biolgica producto terminado de NMT (no ms
de ) 100 UFC / gramo, y el estudio de idoneidad mtodo requiere una dilucin 1:
100 del producto para superar los efectos antimicrobianos , entonces, cmo est
usted para probarlo ? La prctica comn es realizar la dilucin 1: 100 y una placa de
verter de 1 ml por duplicado. Si dos colonias crecen en cada plato, el producto no
especificacin. Este comn la prctica es cientficamente insostenible - que
confundi el LOD con el LOQ para el mtodo de recuento en placa .
Echemos un vistazo a los niveles de alerta y de accin de monitoreo ambiental para
aspticamente producido productos. Hussong
y Madsen (13) public una revisin reflexiva de este tema en el que sostienen que
los niveles de UFC aceptable para muchas clasificaciones de las habitaciones son
por debajo de la tecnologa de concentracin de grmenes nivel de ruido (por
ejemplo, en el rango de 1-2 UFC / m3).
Adems, los datos ambientales son extremadamente variables, mucho ms que los
estudios de laboratorio controladas como los nmeros de microorganismos, el
estado fisiolgico de los aislamientos, incluso las especies son completamente fuera
del control del investigador. Adems, los nmeros no se ajustan a una distribucin
normal, ya que hay conteos espordicos con un recuento de predominando UFC
"cero". Llegan a la conclusin de que debido a que los nmeros no son fiables, la
tendencia en los datos es la nica consideracin importante, y que los recuentos de
EM no se pueden utilizar para criterios de liberacin del producto. Un tratamiento

separado de este tema fue presentado por Farrington (14), quien sostiene que la
relacin entre los datos de vigilancia del medio ambiente y la calidad del producto
terminado es una creencia muy extendida, pero no probada, agravada por los
problemas en la precisin con los recuentos bajos generados por recuento en placa
metodologa.
CONCLUSIONES
En conclusin, todos los mtodos tienen limitaciones. Una de las principales
limitaciones en el mtodo de recuento en placa es el rango relativamente estrecho
contable (generalmente considerado como 25-250 CFU bacterias en una placa de
Petri estndar). La confusin reinante actual entre el lmite de deteccin (1 UFC ) y
el lmite de cuantificacin ( 25 CFU) para el mtodo de recuento en placa crea un
mayor grado de variabilidad en los datos de microbiologa de lo necesario. Una
tendencia regulatoria lamentable en los ltimos aos es el de establecer
expectativas (por ejemplo, especificaciones, lmites, niveles) para los datos
generados por el mtodo de recuento en placa que la precisin del mtodo no
puede apoyar. Esta es una oportunidad real para modificacin de la prctica actual
para acercarse al objetivo de " reglamentos basados en la ciencia. "