Validacion 1

DAIMER JOSE TORRES GALE
ESPECIALISTA TECNOLGICO EN CONTROL DE

CALIDAD
DAI MER JOSE TORRES GALE
INTRODUCCION
La estandarizacin de un mtodo analtico es un proceso riguroso que
dependiendo de la tcnica analtica a la que pertenezca el mtodo, la
matriz, el analito, la cantidad de parmetros de estandarizacin y de la
logstica empleada para su desarrollo, puede requerir de un tiempo mas o
menos considerable (en algunos casos puede superar los seis meses).
En el presente documento se presenta un procedimiento de

estandarizacin que se puede considerar como abreviado pero que incluye
los parmetros fundamentales para que un mtodo analtico una vez
implementado pueda empezar a reportar datos con adecuado y
comprobable grado de confianza. El mtodo as estandarizado debe ser
sometido a un seguimiento sistemtico por medio de Cartas o grficos de
control de calidad y con ensayos particularmente diseados con el
propsito de ajustar los puntos dbiles o los que no han quedado cubiertos
en esta estandarizacin. Con el procedimiento propuesto la precisin se da
en trminos de repetitividad y una vez logrado este objetivo, se puede
desarrollar lo concerniente a la reproducibilidad entre analistas y luego
entre laboratorios.
VALIDACION DE METODOS ANALITICOS

I. GENERALIDADES
OBJETIVOS DEL CURSO

1. INTENTAMOS CONTESTAR LAS SIGUIENTES
PREGUNTAS
QU ES VALIDAR?
POR QU VALIDO?
PARA QU VALIDO?
CUNDO VALIDO?
CMO VALIDO?
2. CONOCER LA DIFERENCIA ENTRE VALIDACIN Y
VERIFICACIN
3. CONOCER LOS REQUISITOS DE LAS NORMAS
INTERNACIONALES SOBRE LA VALIDACIN DE MTODOS
VALIDACIN?
Cul es el
propsito de la
validacin
analtica?
Por qu es
necesario un
monitoreo
analtico?
VALIDACION DE METODOS
Porque es necesaria la validacin analtica?
Cul es el propsito de la validacin analtica?
Generar Confianza
Mtodos reproducibles y confiables

QU
E S VA L I DA C I N D E
MTODOS ANALTICOS ?
VALIDACIN :
Confirmacin,
Mediante
El
Examen Y La Aportacin de Pruebas Objetivas,
de que se cumplen todos
los requisitos
particulares del uso especifico al que se
pretende destinar el mtodo.
VALIDACIN DE UN PROCEDIMIENTO ANALTICO:
Procedimiento
Para
Establecer
Pruebas
Documentales Que Demuestren Cientficamente
Que
Un
Mtodo
Analtico
Tiene
Las
Caractersticas
De
Desempeo
Que
Son
Adecuadas Para Cumplir Los Requerimientos
De Las Aplicaciones Analticas Pretendidas
Qu es validacin de mtodos analticos?

Es realizar un conjunto de pruebas de manera de:
a) Comprobar varios aspectos del comportamiento del
mtodo.
b) Establecer que sirve para el fin previsto.
c) Ha de proporcionar datos analticos tiles en una
determinada situacin.
La validacin implica la demostracin de la determinacin de
las fuentes de variabilidad y del error sistemtico y al azar de
un procedimiento, no slo dentro de la calibracin sino en el
anlisis de muestras reales.
Q U E S V E R I F I C AC I N
D E M TO D O S ?
VERIFICACIN:
CONFIRMACIN
MEDIANTE
LA
APO RTACI N DE EVI DENCI A O BJ ET I VA DE Q U E SE H AN
CUMPLIDO LOS REQUISITOS ESPECIFICADOS.
INDICAR
EL
PROCESO
QUE
LLEVA
A
CABO
EL
L A B O R ATO R I O
CON
EL
FIN
DE
DEMOSTRAR
SU
CA PACI DAD
PARA
EJ ECU TAR
CORRECTAM ENT E
UN
MTODO
NORMALIZADO
CUANDO
LO
REALIZA
EX ACTAM ENT E CO M O EST DESCRI TO EN L A NO RM A .
PA R A Q U VA L ID O U N
M TOD O A N A L TICO?
PARA CUMPLIR CON REQUISITOS DE LAS
NORMAS INTERNACIONALES:
A) BPM (INDUSTRIA FARMACUTICA)
B ) N O R M A I S O 17 0 2 5 ( AC R E D I TAC I N D E L A B O R ATO R I O S
DE ENS AYO Y DE C ALI BR AC I N )
C) NORMA ISO 15189 (ACREDITACIN DE

LAB. CLNICOS)
D) ORGANISMOS INTERNACIONALES COMO FAO, USP
Y OTRAS FARMACOPEAS, OMS, ICH (CONFERENCIA
INTERNACIONAL TRIPARTITA SOBRE
ARMONIZACIN)
10
PA R A Q U VA L I D O U N
M TO D O A N A L T I C O ?
PA R A E M I TI R R E S ULTAD OS E X AC TO S Y
PRECISOS, QUE SEAN REPRODUCIBLES

PARA GENERAR LA CONFIANZA EN
NUESTROS CLIENTES.
11
CULES SON LOS TIPOS DE

M TO D O S ?
1.MTODOS NORMALIZADOS:
MTODO ANALTICO DESARROLLADO
POR UN ORGANISMO DE
NORMALIZACIN U OTRO ORGANISMO

RECONOCIDO CUYOS MTODOS SON
GENERALMENTE ACEPTADOS POR EL
SECTOR TCNICO CORRESPONDIENTE.
( R E F. I L AC - G 1 8 ) .
NOTA: EL DESARROLLO DEL MTODO

INCLUYE LA ETAPA DE SU VALIDACIN.
12
CULES SON LOS TIPOS DE

M TO D O S ?
2. MTODOS NO NORMALIZADOS:
MTODO ANALTICO DESARROLLADO POR
UN TERCERO O QUE HA SIDO ADAPTADO
P O R E L L A B O R ATO R I O A PA R T I R D E U N
M TO D O N O R M A L I Z A D O . ( R E F. I L AC G 1 8 ) .
NOTA: EL DESARROLLO DEL MTODO,
AS COMO SU ADAPTACIN, INCLUYEN LA
ETAPA DE SU VALIDACIN .
13
C U L E S S O N LO S T I P O S D E
M TO D O S ?
3. MTODOS DESARROLLADOS POR
E L L A B O R ATO R I O :
MTODO ANALTICO QUE NO SE ENCUENTRA EN
NORMAS U OTRAS COLECCIONES DE MTODOS,
NI EN PUBLICACIONES DE TERCEROS,
HABIENDO SIDO DESARROLLADO POR
E L P ROP I O L A B OR ATOR I O .
N OTA: EL DESARROLLO DEL MTODO
I N CLUY E L A E TA PA D E S U VA L I DACI N .
14
Qu mtodos se validan?
1. Los Mtodos No Normalizados.
2. Los Mtodos diseados por el Laboratorio.
3. Los Mtodos Normalizados que han sido
modificados por el Laboratorio o utilizados fuera del
alcance previsto.
15
Qu mtodos se validan?
La validacin de los mtodos de ensayo debe:
Reflejar las condiciones reales de ensayo.
La extensin de la validacin necesaria depender del mtodo y su
aplicacin.
La debe realizar personal calificado para esa actividad.
En todos los casos un parmetro para la validacin de ensayos es la

descripcin del mtodo de ensayo.
16
Qu mtodos se verifican?
1.Los Mtodos Normalizados.
2. Los Mtodos Oficiales.
3. Los Mtodos de Organismos Nacionales o Internacionales

Reconocidos.
Es recomendable la utilizacin de mtodos normalizados
cuando stos estn disponibles y sean apropiados.
El laboratorio debe confirmar que puede aplicar
correctamente los mtodos normalizados antes de las
pruebas o calibraciones. Si el mtodo normalizado cambia, la confirmacin se
repetir ". USP
17
Cmo se clasifican los mtodos?

1. Categora I
2. Categora II
3. Categora III
4. Categora IV
5. Mtodos Microbiolgicos
18
Qu procedimientos analticos
se validan?
Se deben validar los siguientes procedimientos analticos
qumicos, fsicos y microbiolgicos:
Categora I: pruebas cuantitativas del contenido del
principio activo, son procedimientos qumicos o
microbiolgicos que miden el analito presente en una
muestra determinada.
19
se validan?
Categora II: Pruebas para la determinacin del
contenido de impurezas o de valores lmites
para el control de impurezas. Pueden ser pruebas
cuantitativas o una prueba cualitativa para
determinar si la impureza est presente en la
muestra por encima o por debajo de un
valor lmite especificado.
20
se validan?
Las categoras I y II miden con exactitud las caractersticas de
pureza de la muestra. Los parmetros de validacin
requeridos por una prueba cuantitativa son diferentes a los de
una prueba cualitativa de cumplimiento de lmite.
Cualitativa: Especificidad, Limite de deteccin, Precisin y
Estabilidad. Si se quiere establecer un nivel de concentracin
definido es necesario incluir tres parmetros mas:
Linealidad, Exactitud y Precisin.
Cuantitativa: Especificidad, Limite de Deteccin, Precisin,

Linealidad, Exactitud, Recuperacin, Incertidumbre de la
medicin, Estabilidad.
21
se validan?
Categora III: Son pruebas fisicoqumicas que miden
caractersticas propias del desempeo del
medicamento, por ejemplo la prueba de disolucin.
Las caractersticas de la validacin son diferentes a
las de las otras pruebas, aunque las pueden incluir.
22
se validan?
Categora IV: Pruebas de identificacin. Aquellas que se
realizan para asegurar la identidad de un analito en una
muestra. Esto normalmente se realiza por comparacin de
una propiedad de la muestra, contra la de un estndar de
referencia, por ejemplo espectros, comportamiento
cromatogrfico,
reactividad
qumica
y
pruebas
microcristalinas.
23
se validan?
Pruebas microbiolgicas: Aquellas que se realizan para
asegurar la calidad microbiana del medicamento.
24
Cmo seleccionar e implementar un

mtodo Analtico nuevo?
1. De preferencia, que sea un mtodo normalizado de
versin reciente
2. Que el mtodo sea apropiado para el tipo

de muestra a analizar.
3. Determinar si el Laboratorio cuenta con personal
capacitado para el anlisis a realizar.
4. Determinar si el Laboratorio cuenta con
las instalaciones y condiciones ambientales
requeridas para el anlisis.
25

mtodo analtico nuevo?
5. Descripcin del procedimiento incluyendo el
alcance del mtodo (aplicabilidad, tipo), tipo de
compuestos y de matriz.
6. Detalle de reactivos, estndares de referencia
que se utiliza.
7. Lista de equipos y requisitos de funcionamiento
y rendimiento.
8. Definir los parmetros del mtodo.
9. Detalle de condiciones e implementacin del
mtodo, incluyendo la preparacin de la muestra.
26

mtodo analtico nuevo?
10. Definir los procedimientos estadsticos y
clculos representativos.
11. Definir los procedimientos para el control
de calidad en la rutina.
12. Definir los grficos representativos, cromatogramas,
espectros y curvas de calibracin.
13. Definir los criterios de aceptacin / rechazo de los
datos.
14. Consideraciones de seguridad.
27
Etapas para desarrollar un mtodo

analtico
BUSQUEDA
BIBLIOGRAFICA
Oficiales
Publicaciones
DEFINIR
LAS
CONDICIONES
Equipos
Reactivos
Muestreo
ESTANDARIZAR
EL METODO
Encontrar
condiciones
optimas
Practicidad
Idoneidad
VALIDAR
28
Qu requisitos debo cubrir antes de

validar un mtodo analtico?
Instrumentos
Calificados y
Calibrados
Analistas
Calificados
Mtodos
Documentados
Integridad
de
las Muestras
Patrones
de
referencia
Confiables
Plan
Maestro de
Validacin
29
Qu son los parmetros del

desempeo del mtodo analtico
Son las propiedades, caractersticas o capacidades
cuantificables del mtodo que indican su grado de calidad;
incluyen exactitud, efecto matricial, repetitividad, precisin
intermedia, reproducibilidad, especificidad, lmite de
deteccin, lmite de cuantificacin, linealidad, rango,
sensibilidad, robustez, fortaleza y otras caractersticas
relacionadas con los resultados obtenidos por el mtodo.
30
Qu parmetros del desempeo se

determinan en cada mtodo analtico?
Parmetros de los procedimientos analticos fisicoqumicos.
CATEGORIA I
Parmetro de
Desempeo
Categora de Prueba
CATEGORIA II
CATEGORIA
III
CATEGORIA IV
Principio/
Activo
Prueba de
Limite
Cuantitativa
Prueba de
Limite
Cuantitativa
Fsico
Qumico
Desempeo
Identificacin
Exactitud/
Precisin
Si
SI
Si
SI
*
NO
*
SI
NO
NO
Especificidad
SI
SI
SI
SI
Limite de Deteccin
NO
NO
SI
NO
Limite de Cuantificacin
NO
SI
NP
NO
Linealidad
SI
SI
NO
NO
Intervalo
SI
SI
NO
* Puede Requerirse dependiendo de la naturaleza del ensayo

DAIMER
JOSE TORRES GALE
31
Qu parmetros del desempeo se

determinan en cada mtodo analtico?
Segn la USP 34:
Categora II de Valoracin
Caractersticas del
Desempeo Analtico
Categora I de
Valoracin
(Producto
Terminado,
granel
Prueba de
Limite
cuantitativa
(Impurezas
en Frmaco)
Prueba de
Limite
cualitativa
(Metales
Pesados)
Categora III de
Valoracin
(Caractersticas
de Desempeo,
disolucin)
Categora IV de
Valoracin
(Pruebas de
Identificacin)
Exactitud
SI
SI
NO
Precisin
SI
SI
NO
SI
NO
Especificidad
SI
SI
SI
SI
Limite de Deteccin
NO
NO
SI
NO
Limite de
Cuantificacin
NO
SI
NO
NO
Linealidad
SI
SI
NO
NO
Intervalo
SI
SI
NO
* Puede ser requerido dependiendo de la naturaleza de la prueba especifica

32
Extensin de la Validacin
Mtodos nuevos requieren validacin completa
Mtodos de Farmacopea o referencias oficiales,
requieren validacin parcial (o verificacin)
Cambios significativos implican revalidacin parcial
Cambios de equipo
Cambios de formula
Cambios de proveedores de reactivos crticos
33
Qu son los parmetros del desempeo

del mtodo analticO
Son las propiedades, caractersticas o capacidades
cuantificables del mtodo que indican su grado de calidad;
incluyen exactitud, efecto matricial, repetitividad, precisin
intermedia, reproducibilidad, especificidad, lmite de
deteccin, lmite de cuantificacin, linealidad, rango,
sensibilidad, robustez, fortaleza y otras caractersticas
relacionadas con los resultados obtenidos por el mtodo.
34
EXACTITUD DE LOS RESULTADOS

ANALTICOS
EXACTITUD: Proximidad de la concordancia entre el resultado de una
medicin y un valor verdadero del mensurando
35
Estimacin de la Exactitud
5 Maneras de
Determinar la
Exactitud
1. Prueba de un
Estndar de
Referencia
2. Mezcla con
excipientes
(placebo con una
cantidad agregada
conocida)
3. Adicin de
estndar (muestra
con cantidad
agregada de std
conocida)
4. Se deduce a
partir de los datos
de especificidad y
linealidad
5. Comparacin con
un mtodo
reconocido como
exacto (Mtodo de
referencia)
36
1. Agregando cantidad conocida del Estndar al
producto
a. Determinar por duplicado el contenido promedio del
analito en la muestra con el mtodo a validar.
b. Enriquecer las muestras con estndar: para preparar las
soluciones, (baja, media y alta) se mantiene constante la
cantidad de muestra tomada y se agregan cantidades
variables del estndar.
37
c. La exactitud es evaluada utilizando un mnimo de
nueve determinaciones, tres concentraciones y tres
determinaciones de cada concentracin. (por ejemplo:
concentraciones de 80%, 100% y 120% de la
concentracin normal de trabajo del mtodo; o 100%,
125% y 150% cuando no se puede reproducir la matriz
del analito).
38
Criterio de Aceptacin y Documentacin:
El porcentaje de recuperacin puede estar entre 90
y 110% del valor terico. Una recomendacin es usar
+/- 4 veces la desviacin estndar relativa.
Para Disolucin: 97% - 103%
Para Muestras biolgicas: 15% del valor verdadero
39
Para Trazas:
recuperacin
Menor
100
ppb:
60%
110%
de
Mayor a 100 ppb: 80% - 110% de recuperacin

Menos de 1 ppb: 70% - 120% de recuperacin
Para cada muestra, reportar el valor terico, el valor del
ensayo y el porcentaje de recuperacin. Calcular el
promedio, la desviacin estndar, desviacin estndar
relativa (coeficiente de variacin) y el porcentaje de
recuperacin para todas las muestras. Llevar un registro de
los resultados en una hoja de datos.
40
2. Comparando los resultados de un Estndar o Material
de Referencia Certificado
Determinar por duplicado el valor promedio del

estndar o material de referencia certificado por el
mtodo a validar. Comparar el resultado obtenido con
el valor declarado.
Tomar en cuenta la disponibilidad y estabilidad del
estndar o MRC, as como la incertidumbre que tenga
el valor verdadero.
La exactitud es evaluada utilizando un mnimo de 30
determinaciones:
5
concentraciones
y
6
determinaciones de cada concentracin
41
El porcentaje de recuperacin puede estar entre 98 y 102% del

valor terico o 2% de error relativo.
Para cada muestra, reportar el valor terico, el valor del ensayo
y el porcentaje de recuperacin. Calcular el promedio, la
desviacin estndar, desviacin estndar relativa (coeficiente
de variacin) y el porcentaje de recuperacin para todas las
muestras. Llevar un registro de los resultados en una hoja de
datos.
42
3. Comparando los resultados con un Mtodo oficial con
exactitud bien definida
La muestra debe ser analizada utilizando el mtodo a

validar y un segundo mtodo bien caracterizado, el cual
debe tener una exactitud bien definida y
establecida.
Se analizan 6 muestras por duplicado a la concentracin
normal de trabajo por ambos mtodos.
43
Se lleva a cabo un anlisis de varianza, del porcentaje
de recuperacin o del error relativo en porcentaje, para
determinar si hay o no diferencia significativa entre la
exactitud de los mtodos comparados.
Para cada muestra, reportar el valor terico, el valor del
ensayo y el porcentaje de recuperacin. Calcular el
promedio, la desviacin estndar, desviacin estndar
relativa (coeficiente de variacin) y el porcentaje de
recuperacin para todas las muestras. Llevar un registro
de los resultados en una hoja de datos.
44
PRECISIN DE LOS RESULTADOS

ANALTICOS
PRECISIN: Es el grado de concordancia entre los
resultados independientes de una medicin, obtenidos
en condiciones estipuladas, ya sea de repetitividad o de
reproducibilidad y depende de la distribucin de los
resultados sin estar relacionada con el valor verdadero.
45
PRECISIN DE LOS RESULTADOS

ANALITICOS
Hay 3 niveles para determinar la Precisin del Mtodo:
1.REPETIBILIDAD: Coincidencia entre los resultados de mediciones
sucesivas realizadas en las mismas condiciones de medicin.
2.REPRODUCIBILIDAD: Coincidencia entre los resultados de mediciones
realizadas en diferentes condiciones de medicin en un mismo
laboratorio o entre 2 laboratorios.
3.PRECISIN INTERMEDIA: Medida de la precisin de los resultados de

un mtodo en condiciones diferentes de analista, da, equipo y lote de
reactivos, dentro del mismo laboratorio. No es necesario determinar
precisin intermedia, cuando se ha determinado la reproducibilidad.
46
PRECISIN - REPETIBILIDAD
Para determinar la precisin entre ensayos o repetibilidad se
trabaja con submuestras de una muestra homognea, bajo las
mismas condiciones medicin: el mismo procedimiento de
medicin, el mismo observador, el mismo instrumento de
medicin, en un perodo corto de tiempo. Hay 2 formas de
determinarla:
1. Hacer un mnimo de 9 determinaciones: 3 rplicas a 3
concentraciones diferentes o 9 determinaciones al 100% de la
concentracin normal de trabajo.
2. hacer un mnimo de 6 determinaciones a una concentracin
que corresponda con la de la muestra problema.
47
PRECISIN INTERMEDIA
Se determina realizando un mnimo de seis determinaciones al
100% de la concentracin esperada. (Diferentes das, analistas
y equipo).
RSD < 2,0% para macro componentes

RSD < 10,0% para componentes menores
RSD < 3,0% para mtodos empleados en disolucin
RSD < 10% para muestras biolgicas
Registrar los resultados, as como los clculos de la media,
la desviacin estndar, la desviacin estndar relativa
(coeficiente de variacin) y el intervalo de confianza
48
PRECISIN - REPRODUCIBILIDAD
Se determina realizando un mnimo de seis determinaciones
al 100% de la concentracin esperada. (Se realiza las
determinaciones analizando en diferentes das, por diferente
analista, horas del da, equipos).
Se espera una variabilidad mayor, que para el caso de la
repetibilidad. Registrar los resultados, as como los clculos
de la media, la desviacin estndar, la desviacin estndar
relativa (coeficiente de variacin) y el intervalo de confianza.
No se realiza precisin intermedia cuando se estima la
reproducibilidad.
49
ERROR EN LOS RESULTADOS

ANALTICOS
Error: Accin considerada incorrecta o equivocada
Error Aleatorio: Componente del error total de una medicin que

varia de forma impredecible. Lo que permite que los distintos
resultados queden a ambos lados del valor promedio.
Error Sistemtico: Componente del error total de una medicin que
varia de forma constante. Esto hace que todos los resultados sean
errneos en el mismo sentido.
Error Total: Suma de errores aleatorios y sistemticos
50
Determinacin de Exactitud y de
Precisin del mtodo analtico
La norma ISO- 5725 nos describe las consideraciones
que se deben tomar en cuenta para determinar la
exactitud y la precisin de una medicin:
Contar con un mtodo establecido.
El nmero de factores que cambiarn en la
determinacin.
El alcance de medicin.
El nmero de puntos a realizar.
La disponibilidad de los materiales y quipos.
El nmero de repeticiones
Cronograma para realizar las mediciones.
51
ESPECIFICIDAD
Es la habilidad que muestra un mtodo para distinguir
entre un analito e impurezas conocidas, precursores
sintticos, metabolitos, o productos de degradacin.
Esta se muestra en su resolucin hacia estos
componentes.
Criterio de Aceptacin
Los componentes contaminantes no deben interferir
con el anlisis del analito en cuestin.
52
LINEALIDAD
Capacidad de un mtodo analtico para generar resultados
directamente proporcionales a la concentracin del analito o
valor del parmetro de la muestra, dentro de un rango.
Hay 2 formas de determinar la linealidad:
1. Preparar soluciones patrn de por lo menos cinco
diferentes concentraciones del estndar, que estn
distribuidas regularmente y que cubran del 80%-120% o 50%150%, del intervalo de trabajo esperado, con diluciones a
partir de una misma solucin madre y analizando en
duplicado para cada dilucin, o realizando por duplicado la
solucin madre y analizando 1 vez cada dilucin.
53
LINEALIDAD
2. Usar seis rplicas por concentracin. Analizar las
soluciones conforme el mtodo en cuestin.
La curva de calibracin se grafica colocando las
concentraciones de las soluciones en el eje horizontal (x) y
las respuestas del instrumento en el eje vertical (y), esta
relacin debe ser lineal con un coeficiente de
determinacin (r2) de por lo menos 0.98. (Es preferible
0.99). Los valores deben caer dentro de una zona
horizontal angosta, los que queden fuera no son aceptables
para ser incluidos en el intervalo normal de trabajo.
En donde:
54
LINEALIDAD
CV menor o igual a 2.0% (desviacin estndar relativa o
coeficiente de variacin)
r mayor o igual a 0.99 (el coeficiente de correlacin es
una medida del grado de asociacin entre las
mediciones y la concentracin del analito)
r2 mayor o igual a 0.98 (el coeficiente de
determinacin mide la exactitud con la que se ajusta la
curva de regresin a los valores experimentales de y)
b aproximadamente igual a 0 (intercepto de la lnea)
m igual a la sensibilidad del sistema (pendiente de la
lnea)
55
Absorbancia
Evaluacin de la Linealidad
Curva de Calibracion de DQO
0,450
0,400
0,350
0,300
0,250
0,200
0,150
0,100
0,050
0,000
0
500
1000
Absorbancia
Concentracion ( mg/L )
0,000
0,026
25
0,217
500
0,420
1000,0
Coef.Correlacion=
1,0000
Pendiente ( b ) =
0,00040
Intercepto ( a ) =
0,01557
1500
Concentracion ( mg /L )
56
ETAPA PRELIMINAR A
LA VALIDACION
La etapa preliminar es parte integrante y pre-requisito de la validacin; consiste en
una serie de pasos que permiten obtener informacin relevante y orientar el
proceso de la validacin.
Documentacin y Montaje de la Metodologa
a) Seleccionar el mtodo para cada analito y por cada matriz. Debe contener los
criterios de seleccin correspondientes.
b) Crear un archivo fsico (carpeta) para toda la documentacin generada en el
proceso de validacin. De esta manera se asegura la proteccin del proceso
de validacin. La carpeta debe radicarse en un archivador y estar disponible
para su consulta permanente.
c) Tener y conocer el protocolo del mtodo, disponiendo de una copia de trabajo,
debe incluir bibliografa).
d) Conocimiento del fundamento fsico y qumico del mtodo y de la tcnica a la
cual pertenece este, se debe elaborar un resumen practico que permita el
buen uso de los procedimientos.
57
ETAPA PRELIMINAR A
LA VALIDACION
e) Conocimiento exacto del funcionamiento del equipo de medicin. En lo posible se
debe tener un diagrama de flujo para el manejo del equipo o por lo menos los
pasos que se deben seguir en orden cronolgico para su adecuada operacin
desde el encendido hasta el apagado. (Instructivo)
f) Inventario de los reactivos que se necesitan para toda la validacin (Identificacin,
precauciones, calidad, cantidad, grado de pureza, conservaciones del reactivo puro
y en solucin).
g) Inventario de vidriera y otros materiales necesarios, sealando las cantidades
necesarias para cada da y requerimiento para su limpieza, siguiendo el protocolo
de lavado de material.
h) Establecer los procedimientos para la descontaminacin y limpieza del material y
para la disposicin de los desechos.
i) Diseo de un formato para la captura de los datos, solo por si los que actualmente
usa el laboratorio no son acordes a la informacin necesitada.
j) Verificar y optimizar las condiciones y los parmetros instrumentales, incluyendo
curva de calibracin.
58
ETAPA PRELIMINAR A
LA VALIDACION
k) Definicin de intervalo de aplicacin del mtodo, teniendo como criterios:
l) La informacin de la literatura (tcnica analtica)
m) El inters especfico (ambiental)
n) Los ensayos preliminares en el laboratorio
El intervalo de aplicacin va desde la mnima cantidad detectable (LDI) hasta
la concentracin que se podra leer con la mxima dilucin posible aceptada
de acuerdo con las condiciones fisicoqumicas de la muestra (en general no
debe ser mayor de 1:10)
Disear el plan y un procedimiento detallado para la preparacin y anlisis de

los reactivos, estndares, muestras y muestras adicionadas, de acuerdo con
el tiempo de vida til de cada uno y la estabilidad del analito. Este plan
deber ser presentado para su auditoria analtica previa al inicio del proceso y
tiene como objetivo establecer el LDI, LCM y dems variables bsicas del
mtodo.
59
Parte Experimental o de Mediciones

(Prevalidacion)
Antes de iniciar el proceso de validacin se debe establecer por
mediciones programadas
Lmite de Deteccin Instrumental (LDI)
Lmite de Cuantificacin del Mtodo (LCM)
Intervalo Lineal del Mtodo
Linealidad
Sensibilidad
Repetibilidad
Reproducibilidad
Coeficiente de Correlacin
Incertidumbre en el proceso
Variables instrumentales o metodolgicas de nuestro laboratorio que
puedan afectar el proceso de medicin en aquellos aspectos en que no se
pueda seguir estrictamente el protocolo.
60
PROCEDIMIENTO DE VALIDACION
Parte Experimental o de Mediciones
Antes de iniciar las mediciones, el analista debe garantizar que el mtodo esta
implementado y que el o los equipos funcionen correctamente. La parte
experimental consiste en la corrida de las muestras y el registro de los resultados
para cada grupo diario de ensayos, en total se deben correr un mnimo de 7
ensayos en das diferentes que pueden ser continuos o alternos, con una
diferencia mxima de 3 das entre ensayo.
El grupo bsico de muestras a determinar es:
BK (Blanco de reactivos y procedimientos)
E.b (Estndar de concentracin baja, que permita calcular el LDM y LCM)
E.m (Estndar de concentracin media; aproximadamente el 50 % del rango)
E.a (Estndar de concentracin alta; aproximadamente el 90 % del rango)
M1 (Muestra natural para ver efectos de matriz real, concentracin < 50 % del
rango)
61
M2 (Muestra natural para ver efectos de matriz real, concentracin >>M1)
M1Ab (M1 adicionada con un nivel bajo, mximo el 30 % del valor de M1)
M1Aa (M1 adicionada con un nivel alto, mnimo el 50 % del valor de M1)
Mc (Muestra o estndar certificado). Se sugiere utilizarlo en el ltimo o los
dos ltimos ensayos
Este grupo bsico de muestras se debe correr mnimo por duplicado para
un total de 16 datos diarios (18 si hay estndar certificado), en esta etapa
de corrida de ensayos es donde se obtienen todos los datos primarios y
requiere que en su ejecucin se cumplan ciertas condiciones mnimas:
Cada grupo de muestras se analiza en el mismo da corriendo todas las
muestras en forma paralela.
62
Es recomendable que el proceso se inicie siempre a la
misma hora y lo suficientemente temprano para que pueda
cumplir con el anlisis de todas las muestras, teniendo en
cuenta que pueden ocurrir imprevistos.
Todo material de vidrio ser lavado previamente de acuerdo
con el procedimiento establecido en el laboratorio para
cada uso y ser sometido a la revisin o control de calidad.
Los procedimientos sern efectuados por un profesional
Qumico o un Tcnico con capacidad de ejercer las
validaciones, bajo supervisin.
63
Anlisis Estadstico
de los Resultados
Rechazo de Datos: Se calcula el estadstico T para los
valores extremos de cada grupo (mximo y mnimo) de la
siguiente manera:
Ordenar los datos de menor a mayor: (xbajo, X2,
X3,..xalto)
Calcular promedio (X) y desviacin estndar (S)
Calcular T como T= (Xalto-Xpromedio) / S para un valor alto;
T= (Xpromedio-Xbajo) / S para un valor bajo. Si T calculado
es mayor que el T de tablas (para un nivel de confianza de
95% y n mediciones, el dato se rechaza, como mximo dos
datos, si la aplicacin de rechazo da positiva para ms de
dos datos hay que verificar el ensayo, repetir
64
Anlisis Estadstico
de los Resultados
Precisin: Calcular la desviacin estndar (S), el coeficiente de
variacin (CV) y el lmite de confianza de 95% para cada muestra
tomando todos los datos de los 7 ensayos.
Exactitud: Se calcular para cada estndar y para el patrn certificado,
el porcentaje de error relativo en cada determinacin. Determinar para
cada tipo de muestra, el valor promedio de error relativo.
Porcentaje de Recuperacin: Se calculara l %R para cada nivel de
concentracin adicionado. Reportar indicando la recuperacin para
estndares y para muestras reales. Se debe reportar la recuperacin
media, el rango de recuperacin y la desviacin relativa.
65
Criterios de Aceptacin
(Precisin): Los criterios de aceptacin para la precisin depende mucho del
tipo de anlisis; para las muestras ambientales, la precisin depende mucho
de la matriz de la muestra, la concentracin del analito y las tcnicas de
anlisis, para efecto de este cumplimiento se debe tener en cuenta la tabla
estimada para la precisin en funcin de la concentracin del analito (AOAC
de peer verrified methodsd).
(Exactitud): La exactitud es la capacidad de un mtodo analtico para dar
resultados lo ms prximos al posible valor verdadero. Como la exactitud se
define como el porcentaje de error, se tendr en cuenta como criterio de
aceptacin aquellos resultados cuyo porcentaje de error sea menos que el
5%.
(Coeficiente de Variacin): Para efecto de este cumplimiento se calcularan
los diferentes CV, teniendo en cuenta la proporcin del analito de acuerdo a
la norma (AOAC de peer verrified methodsd).
66
(Lmite de Cuantificacin del Mtodo): Para efecto de
este cumplimiento, el error relativo que se permite en
el proceso de validacin deber ser mximo de 5% para
aceptacin.
(Lmite de Deteccin del Mtodo): Como criterio de

cumplimiento se acepta que el LDM calculado sea
menor que el LCM.
67
(Linealidad): La linealidad es la capacidad de un
mtodo para obtener resultados linealmente
proporcionales al valor del mensurando, para efecto de
este cumplimiento se tendr en cuenta que el
coeficiente de correlacin sea > = 98% y el CV inferior
al 20%.
(Incertidumbre): Se acepta que sea menor que el error.
(%Recuperacin y %Recuperacin Sobre Muestra): Para
efecto de este cumplimiento se debe tener en cuenta la
tabla (AOAC de peer verrified methodsd)
68
Definiciones y Frmulas usadas

en la Validacin de Mtodos
RANGO O INTERVALO: Intervalo entre la
concentracin mxima y mnima de analito en
la cual se puede determinar al analito con un
nivel adecuado de precisin, exactitud y
linealidad utilizando el mtodo en cuestin.
a) Procedimiento:
Verificar que el mtodo analtico proporciona
linealidad, precisin y exactitud aceptables
cuando se aplica a muestras que contienen el
analito en los extremos y dentro del intervalo.
69
Definiciones y Frmulas usadas

en la Validacin de Mtodos
Deben considerarse los rangos especificados mnimos
que se indican a continuacin:
Valoracin de macrocomponentes 80-120% de la
concentracin de prueba
Uniformidad de contenido 70-130% o el intervalo ms
apropiado segn la Monografa.
Prueba de disolucin 20% por encima del intervalo
especificado.
Cuantificacin de impurezas LC o 50%- 120%
70
Definiciones y Frmulas usadas en

la Validacin de Mtodos
1. Desviacin Estndar de la Repetitividad
Es la medida de cmo se dispersan los valores alrededor de la
media en la distribucin de valores. Se calcula con la frmula:
Si
1
N
n
i 1
1 S.
i
En donde:
n = Es el nmero de valores
N = Es el numero de repeticiones
k = Es el factor de cobertura, se utilizara K=2
con un nivel de confianza de 95%
2 = Es el cuadrado de la desviacin estndar.
71
Definiciones y Frmulas usadas en la

Validacin de Mtodos
1. Desviacin Estndar de la Reproducibilidad (total)
La desviacin estndar de los resultados de anlisis obtenidos bajo
condiciones de reproducibilidad. Se calcula con la frmula:
En donde:
N = Es el nmero de repeticiones
k = Es el factor de cobertura, se utilizara K=2 con
un nivel de confianza de 95%
2 = Es el cuadrado de la desviacin estndar.
Sz2 = Es el cuadrado de la desviacin estndar
entre las repeticiones o series.
72

Validacin de Mtodos
Exactitud:
Combinacin del sesgo y la precisin de un procedimiento analtico, que
refleja la proximidad de un valor medido a un valor verdadero. Se tendrn
como referencia los patrones preparados en el laboratorio, y por lo menos
un patrn externo certificado. La concentracin de estos patrones deber
estar localizada dentro del rango de aplicacin del mtodo validado. La
exactitud expresada como el Porcentaje de Error, se calcula por:
73

Validacin de Mtodos
Precisin:
Medida del grado de concordancia entre anlisis repetidos
de una muestra, aplicando el mismo procedimiento
experimental bajo condiciones fijadas. Usualmente se
expresa en trminos de Desviacin Estndar, otra forma de
expresar la precisin es la Desviacin Estndar Relativa o
Coeficiente de Variacin, se calcula as:
74

Validacin de Mtodos
Recuperacin:
Es la capacidad que tiene un procedimiento analtico para
determinar cuantitativamente una especie qumica que ha
sido adicionada a una muestra. Se expresa como porcentaje
(%R) y se calcula como:
Donde:
__
Cx = Concentracin promedio de las determinaciones,
CBK = Concentracin del blanco, y
CA = Concentracin Teorica.
75

Validacin de Mtodos
La recuperacin sobre muestras reales se calcula por:
Dnde:
__
CM = Concentracin promedio de la muestra no adicionada,
CMA = Medida de la concentracin en la muestra adicionada, y
CA = Concentracin conocida adicionada a la muestra.
Blanco (BK):
Es un sistema fsico que no contiene muestra real y por consiguiente no debera
contener el analito de inters, pero que debe ser sometido a todo el proceso del
mtodo de anlisis, tanto de las muestras como de los estndares. En lugar de
muestra, el volumen faltante se completara con agua grado reactivo que deber
tener la calidad recomendada por el mtodo respectivo.
76
Definiciones en la Validacin
de Mtodos
Coeficiente de Correlacin: Numero que indica el grado de relacin
reciproca de dos variables. Los coeficientes de correlacin varan entre 0
(sin correlacin) y -1 o +1(Correlacin perfecta).
Criterios de Aceptacin: Condiciones que han de cumplirse para que una

operacin, proceso o articulo, como un componente del equipo, se
considere satisfactorio o que se ha completado de forma satisfactoria.
Curva de Calibracin: Relacin existente entre la respuesta de seales del
instrumento y diversas concentraciones del analito en un disolvente o
matriz apropiado.
Estndar Patrn de Referencia: Estndar generalmente de la mejor
calidad disponible en un determinado lugar, del que se derivan las
mediciones hechas en ese lugar.
77
Definiciones en la Validacin
de Mtodos
Estndar Patrn Interno: Adicin de una cantidad fija de una sustancia
conocida que no se encuentra presente como constitutiva del espcimen.
A fin de identificar o cuantificar otros componentes. Las caractersticas
fisicoqumicas del estndar interno deben aproximarse lo mas posible a
las del analito.
Garanta de Calidad: Todas las actividades planificadas y sistemticas que
se llevan a cabo en el marco de un sistema de garanta de la calidad a fin
de garantizar adecuadamente que un laboratorio cumplir los requisitos
de calidad.
Incertidumbre: Parmetro asociado con el resultado de una medicin que
caracteriza la dispersin de los valores que puede atribuirse
razonablemente al analito.
.
78

Validacin de Mtodos
Limite de Deteccin del Instrumento: Concentracin de analito que
produce una seal superior a cinco veces la relacin seal/ruido del
instrumento; se ha establecido en 1.645 veces el valor de la desviacin
estndar de los anlisis de blanco. Resulta muy til valorar la seal que
permita calcular un LDM estimado.
LDI = 1,645 x s
Donde: s = Desviacin estndar del blanco
Limite de Deteccin del Mtodo: El menor contenido mensurable del que
se puede deducir la presencia del analito, con un grado razonable de
certeza estadstica. La menor concentracin de un analito que el mtodo
de anlisis puede diferenciar con fiabilidad del ruido de fondo.
LDM = Valor promedio estndar bajo + (tN-1 x s)
79

Validacin de Mtodos
Limite de Cuantificacin: El menor contenido mensurable que permite
cuantificar el analito con un grado razonable de exactitud y precisin. En
algunos laboratorios, el limite inferior de cuantificacin se considera
equivalente a la concentracin del rango de trabajo, ya que el contenido
de analito de una muestra puede definirse cuantitativamente con
precisin y exactitud, se calcula:
LCM = Valor promedio estndar bajo + (10 x s)
Precisin Intermedia: Precisin medida en condiciones intermedias a las
de repetibilidad y reproducibilidad: Por ejemplo, precisin medida por
diferentes analistas, a lo largo de un plazo prolongado, dentro de un solo
laboratorio. Expresa la variacin dentro de un laboratorio, diferentes das,
analistas y equipos.
80

Validacin de Mtodos
Regresin Lineal: Mtodo de describir la relacin entre dos o mas
variables mediante el calculo de la lnea recta o las coordenadas de ajuste
optimo.
Reproducibilidad: Grado de acuerdo entre los resultados de mediciones

sucesivas del mismo analito de un material idntico realizadas utilizando
el mismo mtodo en condiciones diferentes, por ejemplo, operadores
diferentes, laboratorios diferentes. Los resultados deben expresarse en
trminos de desviacin estndar de la reproducibilidad, coeficiente de
variacin de la reproducibilidad o intervalo de confianza del valor medio.
81
Valores crticos T para Rechazo de Datos

n
95%
95%
95%
95%
1,15
11
2,24
19
2,53
27
2,69
1,46
12
2,29
20
2,56
28
2,71
1,67
13
2,33
21
2,58
29
2,72
1,82
14
2,37
22
2,6
30
2,74
1,94
15
2,41
23
2,62
40
2,87
2,03
16
2,44
24
2,64
50
2,96
2,11
17
2,47
25
2,66
60
3,03
10
2,18
18
2,50
26
2,67
100
3,21
Valores de la distribucin t para calcular LC 95 %

gl
95%
gl
95%
gl
95%
gl
95%
12,71
11
2,20
21
2,08
50
2,01
4,30
12
2,18
22
2,07
3,18
13
2,16
23
2,07
2,78
14
2,14
24
2,06
2,57
15
2,13
25
2,06
2,45
16
2,12
26
2,06
2,36
17
2,11
27
2,05
2,31
18
2,10
28
2,05
2,26
19
2,09
29
2,05
10
2,23
20
2,09
30
2,04
1,96
82
Valores de la distribucin t (99%) para calcular

LDM
gl
99%
gl
99%
gl
99%
gl
99%
31,82
11
2,72
21
2,52
40
2,42
6,96
12
2,68
22
2,51
50
2,40
4,54
13
2,65
23
2,50
60
2,39
3,75
14
2,62
24
2,49
70
2,38
3,36
15
2,60
25
2,48
80
2,37
3,14
16
2,58
26
2,48
90
2,37
3,00
17
2,57
27
2,47
100
2,36
2,90
18
2,55
28
2,47
2,82
19
2,54
29
2,46
10
2,76
20
2,53
30
2,46
2,33
83
EJERCICIO
Calcular el promedio, la desviacin estndar, el % error, el
coeficiente de variacin, el limite de deteccin del mtodo, el
limite de cuantificacin, % de recuperacin, el limite de
deteccin del instrumento, calcular el T para rechazo de datos,
el T critico de los siguientes datos y la desviacin estndar del
blanco.
Valor Real = 25 ug/mL
Valor Experimental
Valor Blanco
0,010
0,038
26,08
27,45
0,028
0,032
26,08
23,58
0,022
0,025
23,58
26,08
23,58
24,58
0,015
0,028
23,58
26,08
0,022
0,033
26,08
23,58
0,012
0,035
26,08
23,58
0,035
0,040
84
EJERCICIO
Calcule el valor de M1, M2, M1Ab y M1Aa para el siguiente
rango de trabajo.
Estndar Bajo = 1,0 ug/mL
Estndar Medio = 5,0 ug/mL
Estndar Alto = 10,0 ug/mL
85
EJERCICIO RESUELTO
Promedio
S
% ERROR PROM
CV
LDM
LCM
%R
LDI
T Bajo
T Alto
T Critico
25,00
1,394
5,11%
5,58%
25,03
25,10
99,89
0,016
1,02
1,76
2,37
Desviacin
Estndar del
Blanco
Promedio del
Blanco
0,010
0,027
86
EJERCICIO RESUELTO
Rango de Trabajo.
Estndar Bajo = 1,0 ug/mL
Estndar Medio = 5,0 ug/mL
Estndar Alto = 10,0 ug/mL
M1= 4,0 ug/mL (40%)
M2 = 7,2 ug/mL (80%)
M1Ab = 4,0 ug/mL + 1,0 ug/mL adicionado = 5,0 ug/mL (25%)
M1Aa = 4.0 ug/mL + 3,0 ug/mL adicionado = 7,0 ug/mL (75%)
87
88

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DAIMER JOSE TORRES GALE

ESPECIALISTA TECNOLGICO EN CONTROL DE

DAI MER JOSE TORRES GALE

En el presente documento se presenta un procedimiento de

DAIMER JOSE TORRES GALE

VALIDACION DE METODOS ANALITICOS

DAI MER JOSE TORRES GALE

OBJETIVOS DEL CURSO

DAI MER JOSE TORRES GALE

Cul es el propsito de la validacin analtica?

Mtodos reproducibles y confiables

Qu es validacin de mtodos analticos?

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DAI MER JOSE TORRES GALE

C) NORMA ISO 15189 (ACREDITACIN DE

DAI MER JOSE TORRES GALE

PRECISOS, QUE SEAN REPRODUCIBLES

DAI MER JOSE TORRES GALE

CULES SON LOS TIPOS DE

NORMALIZACIN U OTRO ORGANISMO

NOTA: EL DESARROLLO DEL MTODO

DAI MER JOSE TORRES GALE

CULES SON LOS TIPOS DE

DAI MER JOSE TORRES GALE

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DAI MER JOSE TORRES GALE

En todos los casos un parmetro para la validacin de ensayos es la

DAI MER JOSE TORRES GALE

3. Los Mtodos de Organismos Nacionales o Internacionales

Cmo se clasifican los mtodos?

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DAI MER JOSE TORRES GALE

Cuantitativa: Especificidad, Limite de Deteccin, Precisin,

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Cmo seleccionar e implementar un

2. Que el mtodo sea apropiado para el tipo

DAI MER JOSE TORRES GALE

Cmo seleccionar e implementar un

DAI MER JOSE TORRES GALE

Cmo seleccionar e implementar un

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Etapas para desarrollar un mtodo

DAI MER JOSE TORRES GALE

Qu requisitos debo cubrir antes de

DAI MER JOSE TORRES GALE

Qu son los parmetros del

DAI MER JOSE TORRES GALE

Qu parmetros del desempeo se

* Puede Requerirse dependiendo de la naturaleza del ensayo

JOSE TORRES GALE

Qu parmetros del desempeo se

* Puede ser requerido dependiendo de la naturaleza de la prueba especifica

DAI MER JOSE TORRES GALE

Qu son los parmetros del desempeo

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EXACTITUD DE LOS RESULTADOS

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