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Universidad Nacional del Santa

Facultad de Ingeniera
E. A. P. de Ingeniera Agroindustrial
Tema:
DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR
LOTES
Curso:
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
Docente:
ING. AUGUSTO CASTILLO CALDERN
Grupo:
B (Mircoles 7 -1pm)
Integrantes:

Arbildo Abanto Magaly.

Fiestas Maza Carmen.

Lavandera Alva Aldo.

Ortega Rodrguez Liesly.

Prez Villanueva Karito.

Sandoval Lpez Beatriz.

Santa Maria Modesta Nilthon.

Villegas Ramrez Carla.

Nuevo Chimbote Per

Resumen
Hemos desarrollado el cultivo celular
realizando

del Kluyveromyces marxianus,

su manipulacin desde su estado en forma de cepa

refrigerada. El cual ha seguido una serie de procedimientos secuenciales


tales como

inoculacin

en agar, dndole

todas las condiciones y

facilidades para que pueda crecer, asimismo siguiendo con la secuencia


se inoculo en un medio denominado rico, el cual tiene todos los
nutrientes que esta bacteria requiere para su ptimo desarrollo.
Luego de un evidente crecimiento en el medio rico, la totalidad de este
medio es diluido dentro de otro medio al que se denomina mnimo (200
ml) por sus limitaciones en cuanto a nutrientes, ya que este contiene
solo los componentes necesarios para que el microorganismo pueda
subsistir tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue lactosa.
Se trata entonces de observar y comparar como se va produciendo el
crecimiento celular con los nutrientes exactamente necesarios para tal
accin

y al mismo tiempo como va disminuyendo

el sustrato en este

caso principalmente la lactosa. Y esto es posible determinar haciendo


evaluaciones tales como crecimiento de biomasa mediante absorbancia
y el ensayo con reactivo DNS para el caso del sustrato.
Estos dos aspectos (crecimiento de biomasa y consumo de sustrato)
evaluados en un determinado tiempo y expresados en grficas adems
de ser comparados en una curva de calibrado para ambos casos, nos
darn informacin sobre el microorganismo tales como el rendimiento y
la productividad que tiene el mismo (Kluyveromyces marxianus).

I. INTRODUCCIN
En la actualidad muchos de los

alimentos

manejo y conocimiento del crecimiento de

son obtenidos

gracias al

microorganismos. Resulta

entonces importante el conocimiento

de las condiciones en que estos

microorganismos

sus

puedan

optimizar

productos.

Para

ello

la

preparacin de medios de cultivo para estos microorganismos es un


buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento as como
tambin el seguimiento de la cintica nos proporciona datos mucho
ms prcticos y exactos sobre la velocidad y caractersticas del
crecimiento del microorganismo tratado.
La

preparacin

de

medios

para

el

desarrollo

de

procesos

de

fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la productividad


de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los
efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol
esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos
del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar
energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.
No

obstante

que

los

microorganismos

varan

considerablemente

respecto de los nutrientes que pueden necesitar


Es as que para est prctica hemos centrado nuestra atencin en el
tratamiento

de un microorganismo (Kluyveromyces marxianus),

iniciando desde su siembra partiendo desde

su estado en cepa

liofilizada, para luego sembrarlo en medio rico

procurando su rpida

activacin, para que luego de un determinado tiempo podamos sembrar


la bacteria

pero en un medio mnimo; es decir con los mnimos

requerimientos; en el cual es ms factible determinar


crecimiento.

la cintica de

II.- OBJETIVO GENERAL

Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en


matraces empleando una cepa de Kluyveromyces marxianus
ATCC 16045.

2.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Disear el medio de cultivo ptimo para el desarrollo de la cepa.

Activacin celular y desarrollo del inculo.

Determinar de la cintica de consumo de la fuente de carbono.

Determinacin de los rendimientos del nutriente limitante en


clulas.

Determinacin del contenido de azcares reductores mediante el


mtodo del DNS.

Determinacin de la concentracin celular por densidad ptica.

III.- ASPECTOS TERICOS:


MEDIOS DE CULTIVO
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten
energa y elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes
celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los
microorganismos se pueden clasificar en auttrofos si es el CO2
atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y hetertrofos si
utilizan carbono orgnico.
La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente,
C4H7O2N lo que supone que los componentes de las clulas son:
carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxgeno
(32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (entorno al 1%) y otros
elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y
Zn.

La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos


antes citados en una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar
en forma de carbono orgnico para los hetertrofos y como CO2 para los
auttrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o de NO2 - o en forma de
aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar
en forma de PO4 3-, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO4
2-, etc.
Adems, en ciertos casos, es necesario aadir a los medios de cultivo
algunos

aminocidos

vitaminas

que

determinados

tipos

de

microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la levadura del pan


(Saccharomyces cerevisiae) la frmula elemental ms concreta es:
Diseo
El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin
de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin
de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se
debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los
requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos
del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones
sobre las materias primas. Otros aspectos que son tambin importantes
se refieren a todos los procesos y operaciones previas y posteriores a la
etapa de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos bioqumicos
que regulan la formacin de algunos productos.
CONCEPTO DE CULTIVO PURO
Se denomina cultivo puro (axnico) al que contiene slo un tipo de
microorganismos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias
aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma
composicin gentica. Los cultivos puros son esenciales para poder
estudiar las caractersticas de los microorganismos y para poder
identificarlos con seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce ms
sobre el funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe
hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas

condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiologa de los


microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que
presentan en condiciones de cultivos puros.
CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LQUIDO
Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las
clulas

que

se

producen

en

cada

divisin

continan

su

vida

independientemente formndose una suspensin de clulas libres.


En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden
diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el
crecimiento microbiano:
1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos
adaptan

su

metabolismo

las

nuevas

condiciones

ambientales

(abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de


crecimiento exponencial.
2.- Fase

exponencial

logartmica:

en

ella

la

velocidad

de

crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante


esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del
medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica
con los modelos matemticos que describiremos a continuacin.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias


(ni la masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase
estacionaria

desarrollan

un

metabolismo

diferente

al

de

la

fase

exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de


metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.
Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn
nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han
liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito
para

el

crecimiento

microbiano.

La

fase

estacionaria

tiene

gran

importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el


estado metablico real de los microorganismos en los ambientes
naturales.
4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias
viables del cultivo.
CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SLIDO
Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso
de los cultivos lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La
cintica de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la
evolucin del nmero de clulas viables por unidad de superficie o por
unidad de masa.
Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un
substrato slido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una
colonia. Por consiguiente, se denomina
Unidad formadora de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y
aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales
adecuadas da lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso de
tiempo. Si el nmero inicial de bacterias por unidad de superficie es muy
alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un csped
cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio.
En el caso de microorganismos mviles (deslizantes) o en el de los
hongos filamentosos que tienen un crecimiento trfico no se producen
colonias aisladas sino formaciones ms difusas o miceliares.

Efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento


Los microorganismos pueden crecer en una variada gama de pH que va
desde pH = 2 para los acidfilos hasta pH = 11 para alcalfilos. En
general los microorganismos que toleran pH cidos no toleran pH
alcalinos y viceversa. Independientemente del pH que pueda soportar un
microorganismo, es importante conocer cul es el pH ptimo para el
crecimiento. En la fig. 11 est representada en forma general la variacin
de um con el pH para hongos y bacterias. De la misma surge claramente
que en general los hongos tienen un pH ptimo cercano a 5 mientras que
para bacterias se da alrededor de pH = 7; adems debido a la forma
"achatada" de las curvas, variaciones de 0.5 unidades de pH alrededor
del ptimo no tienen mayor influencia. Durante el crecimiento los
microorganismos modifican el pH del medio de cultivo, normalmente
hacindolo disminuir; por tal motivo es frecuente incluir en el medio
substancias que acten como tampon (buffer) a fin de evitar que el pH
se aleje del ptimo.
El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado
cada reaccin qumica individual, de todas las que conforman el
metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento
de sta resulta en una mayor velocidad de reaccin. Esto se traduce en
un aumento de pm con la temperatura.

Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las


enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de um decrece
rpidamente. La temperatura ptima resulta de la interaccin de estos
dos efectos.
ASPECTOS GENERALES DEL GENERO kluyveromyces marxianus
var
Kluyveromyces marxianus var. marxianus, tambin conocida como
protena unicelular . Esta tiene un contenido proteico que oscila entre
40 y 80% en base seca y su calidad la asemeja ms a la protena animal
que a la vegetal .
MECANISMO DE ACCION
Las

levadura de fermentacin lcticas contenidas como es el caso de

Kluyveromyces marxianus var. LactisLas, poseen un grupo enzimtico,


capaz de realizar un rol esencial en los procesos que interesan en la
digestin de los azcares (el cido lctico en particular, gracias a una
actividad enzimtica, debida a la enzima - galactosidasa), en la
absorcin de los principales nutrientes, y en la formacin de factores
enzimticos. las cuales no poseen caracidad reproductiva, pero son
enzimaticamente activas. Las mismas tienen por funcin degradar los
azcares en particular los relacionados con el cido lctico, como por
ejemplo a travs de la enzima -Galactosidasa.
TIPO DE FERMENTACIN:
FERMENTACIN ALCOHOLICA
La fermentacin alcohlica consiste en una transformacin de azcar en
alcohol, de manera parecida como se ve en la fermentacin lctica por lo
que se puede explicar del mismo modo. Por fermentacin lctica se
puede entender en la fisiologa fermentativa la produccin de cido
lctico realizado por bacterias del grupo de cido lctico, por ejemplo
Lactobacillus del bruckii, Streptococcus lactis, Kluyveromyces marxianus
var.

Tambin procesos de la industria lctea son la coagulacin y maduracin


acelerada del queso utilizando quimosina de estmagos de rumiantes. El
gen de la quimosina de ternera se ha clonado en microorganismos:
Kluyveromyces marxianus var. LactisLas
Ecuacin global:

C6H12O6 2CH3CHOHCOOH

Este proceso tiene una gran semejanza con el proceso detallado de la


fermentacin alcohlica, la carboxilasa interviene descaboxilando el cido
pirvico,

mientras

que

en

la

fermentacin

lctica

la

cozimasa

deshidrogenada deshidrogena el cido pirvico. Morfolgicamente las


bacterias lcticas aparecen como cocos o como bastones, Los cocos
pueden ser diplo o estreptococos, las bacterias en forma de bastn que
no posean movilidad, pueden aparecer aisladas o en cadenas. Respecto
al tamao de las bacterias y de la longitud de las cadenas, la familia de
las bacterias lcticas

Lactobacillus del bruckii, Streptococcus lactis,

Kluyveromyces marxianus var.presenta grandes diferencias.


Segn S.Orla Jense, al grupo de las lactobacterias "verdaderas" solo
pertenecen las bacterias que:
1. son capaces de formar cido lctico.
2. Precisan de combinaciones nitrogenadas para su crecimiento, es
decir, los mismos complejos aminocidos que el organismo animal.
3. Son gran positivas.
4. Son anaerobia facultativas (no presenta crecimiento superficial o
este es escaso).
5. No poseen catalasa.
6. No reducen el nitrato.
REQUERIMIENTO NUTRITIVOS.
TEMPERATURA DE CRECIMIENTO.
Algunas especies del genero Lactobacillus del bruckii, Streptococcus
lactis, Kluyveromyces marxianus var.pueden crecer a temperatura que
descienden hasta los 3 C (pero casi siempre solo hasta los 10 C). La
temperatura ptima para, Kluyveromyces marxianus var. se encuentra
hacia los 30 C. La temperatura mnima de las lactobacterias bacilares se

encuentra alrededor de los 20 C y la temperatura mxima para muchas


especies por encima de los 50 C. La temperatura optima se encuentra
por lo general entre 30 45 C, Elsevier, 1990.
HIDRATOS DE CARBONO.
Para los cocos lcticos, el optimo de hidrato de carbono oscila entre 0.5 y
2 %, mientras que el optimo de carbohidratos para las formas bacilares
se encuentra comprendido entre el 2 y e 5 %.

Sin embargo, una

concentracin azucarada del 2% es especialmente favorable en casi


todos los casos. Ahora bien, si se quiere conservar las bacterias con vida
en cultivo durante mucho tiempo deben cultivarse sobre medio nutritivos
cuya concentracin de azcar no sobre pase el 0.25%, pues el acido
formado a partir del azcar resulta toxico para las bacterias.
Tambin algunos alcoholes superiores pueden ser utilizados como fuente
d carbono y ser transformado en acido lctico, Montao Ortega. M, 1991.
ALIMENTACIN NITROGENADA.
Como

fuente

productos

de

nitrogenada

prcticamente

degradacin

de

la

solo

protena,

se

tales

puede
como

emplear
peptonas,

aminocidos amoniaco. Pero la utilizacin de aminocidos y amoniaco


dependen en alto grado de la presencia de probiticos. Las lactobacterias
estn mal equipadas con enzimas proteoliticas, por ello, a la clula
bacteriana viva las protenas deben ofrecerse en forma soluble, en mejor
de los casos degradada en parte. La mayora de las lactobacterias
medran bien en leche, lo que entre otras cosas debe atribuirse a que las
bacterias, a pesar de carecer de exozimas proteoliticas, pueden
aprovechar los caseinatos coloidales. Si se eliminan estos ltimos, la
bacteria solo se desarrolla mal.

CUADRO DE CLASIFICACION
Especies
frecuentes

Gnero

mas
Caractersticas

Saccharomyces cerevisiae Levaduras


no
Saccharomyce unisporus
fermentadoras
de
la
lactosa,
que
producen
alcohol y CO2 a partir de
glucosa.
LEVADURAS

Candida kefir
Levaduras fermentadoras
Kluyveromyces marxianus de la lactosa.
var. marxianus.
Responsables de formacin
de CO2 y contribuyendo al
caracterstico
sabor
y
aroma.

IV.- MATERIALES Y METODOS


MATERIALES
4.1

Cultivo Kluyveromyces marxianus


Balanza analtica
Matraz de 250 mL.
Vasos precipitados.
Tubos de ensayo c/t
Varilla
Pipetas 10 mL.
micro pipeta
Autoclave.
Mechero bunsen

4.2

Determinacin de la cintica de consumo de la fuente de


carbono.
Reactivos

5 g/50 mL de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS)

10 mL/50 mL de NaOH 2 N

15 g/50 mL de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.

Agua destilada

Curva de Calibrado

3 g de glucosa

Materiales y equipos:
Fiola de 100 mL.
Vaso de precipitado de 250 mL
Varilla.
Agitador magntico.
Barra agitadora.
Rejilla, mechero, trpode.
Balanza analtica.
Balanza de platos.
Agitador de tubos.
Tubos con tapas (8).
1 matraz de 1 L, con tapn.
Espectrofotmetro.
Micropipetas
4.3

Determinacin de la cintica de crecimiento de biomasa


Reactivos
Agua destilada
Materiales y equipos
Tubos de ensayos con tapas.
Centrifuga.
Shaker
Pipetas (estriles)
espectrofotmetro
Desecador (campana)
Capachos de papel aluminio
Balanza analtica

Estufa.

METODOS
a.

Diseo del Medio de cultivo (medio mnimo)

Fuente de carbono: lactosa

Concentracin celular final de 2 g/l

Volumen del medio es el 20% del volumen del matraz. (Matraz


de 1000 ml y el 20% es 200 ml)

Ajustar el pH a 6.5 con cido ortofostorico o NaOH 2 M y llevar


el autoclave a 121C por 15 minutos.

Tabla N 1: Composicin del medio de activacin qumicamente


definido de kluyveromyces para un crecimiento en biomasa de g/0.02L

Elemento
C
N
Mg
P
K

Fuente
lactosa
NH4Cl
MgSO47H2O
K2HPO4
KCl

%
%
S0
S0
Yx/s
clula nutriente
(g/L) (g/0.02L)
50
42.1
0.506
3.95
0.08
9
27.27
3.03
0.99
0.0198
0.4
17.52
43.8
0.068
0.00136
2
17.82
8,91
0.337
0.00674
0.5
52.38
104.77 0.029
0.0058*

concentracin de este nutriente en el medio mnimo es satisfecho por


0.337 g/l de fosfato acido de potasio (K2HPO4), destinado para el
elemento fsforo que aporta lo requerido por el microorganismo en
potasio.

b. Activacin Celular y Desarrollo del inculo

Partimos desde la cepa congelada (kluyveromyces marxianus).

Agregamos la cepa en un tubo de ensayo que contena 5 ml de medio


rico previamente esterilizado. Ajustar el pH

Tapamos el tubo con un tapn de gasa y algodn.

Llevamos al shaker a 200rpm y un t = 12 horas, para posteriormente


sembrar con una o dos azadas en forma asptica en un tubo con 16ml
de agar inclinado.

Incubar a 37C por 1 a 2 das

Luego de la incubacin, inocular 1 o 2 azadas en un matraz de 125


que contiene 20 ml de medio rico.

Ahora se realizar el desarrollo del inculo

Llevar al shaker para la incubacin con una temperatura de 37 C con


una velocidad de control de 50 rpm. por un tiempo de 4 a 6 hrs. hasta
alcanzar

un

desarrollo celular

suficiente, evidenciado por el

incremento en la turbidez del medio.

Despus de la incubacin inocular los 20 ml de caldo (medio rico +


biomasa) a un matraz de 250 ml. conteniendo 180 ml. de medio
mnimo. A partir de este paso se determinar la cintica de
crecimiento de la biomasa.

c. Determinacin de la Cintica de Crecimiento de la Biomasa

Despus de la activacin, se inoculara este medio al matraz de 1 litro,


conteniendo 180 ml de medio mnimo. A partir de este paso se medir
la cintica de crecimiento.

Sacar 5 ml. del matraz de 1 litro y llevar a espectrofotmetro, para


obtener la biomasa inicial (Xo) a un tiempo cero.

Iniciar el medio de fermentacin (del cultivo en un medio mnimo) en


el shaker a 37 C, 200 rpm. y tomar la absorbancia por cada hora en
un cabo de 12 hrs. en total o hasta que las medidas de absorbancia
evidencien que el microorganismo haya alcanzado su fase de
estacionaria.

De las absorbancia obtenidas en cada medida podremos obtener la


concentracin celular en cada instante, utilizando la curva de
calibracin de biomasa que se encuentra en el Anexo

d. Determinacin de la Cintica de Consumo de la fuente de Carbono

Las muestras utilizadas para medir el crecimiento de la biomasa, las


centrifugamos por 20 minutos a 1000 rpm y guardamos los sobre
nadantes en viales conservndolos en refrigeracin.

Luego las muestra (viales) sern analizadas mediante el mtodo del


DNS como se explica a continuacin.

Mtodo del DNS (cido dinitrosaliclico)


Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:

Se aade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de muestra a analizar.

Se mantiene la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5


minutos para luego enfriar con agua helada.

Se aaden 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos,


luego agitar.

Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia


en la curva de calibrado.

V.- RESULTADOS Y DISCUSION


Concentracin de la biomasa durante la Fermentacin
Tiempo (h)
0
2
6
8
10
12

Absorbancia
(540 nm)
0.022
0.052
0.057
0.097
0.083
0.060

Concentracin
(g/l)
0.023
0.064
0.071
0.125
0.106
0.075

ln x/x0
0.000
1.035
1.137
1.711
1.545
1.193

Grfica 01

El tiempo de fermentacin terico es mucho menor que el de la prctica,


puede ser por: tratarse de un medio mnimo y la fuente de carbono esta
limitado, puede ser por la formacin de productos inhibidores, cambios
en el pH.
Durante la fermentacin, haciendo uso del medio mnimo, en el tiempo
cero, el crecimiento de la biomasa ha sido demasiada

lenta por la

adecuacin del kluyveromyces marxianus a un nuevo medio, adems


tuvo mucho que ver la falta de aireacin del microorganismo , una
posible causa

es tambin que al momento de tomar los pesos de los

nutrientes tales como sales o la maltosa misma no hayan sido los mas
exactos.
En la grafica tenemos representado que a 8 horas tenemos el valor
mximo de absorbancia 0.097 donde se alcanza el crecimiento de
biomasas de este microorganismo esto debido porque se tuvo un
sustrato limitado y las condiciones ambientales en la que se encontr el
medio. Teniendo as que a las 10 horas de empezada la experiencia
tenemos una absorbancia de 0.083 disminuyendo significativamente
despus de 2 horas a una absorbancia de 0.060 esto nos indica que no
hubo una fase estacionaria; teniendo una pendiente en donde nos indica
una etapa de decadencia, debido a que el kluyveromyces marxianus
tiende a morirse, produciendo despus la lsis de las clulas.
Grfica 02

Determinacin del mx :
mx = (lnx/x0)/(t-t0)

mx = (ln(0.125/0.071))/(8-6) = 0.2828 h-1

Concentracion de Maltosa durante la Fermentacin:


Tiempo (h)
0
2
8
10
12

Absorbancia
(640 nm)
0.127
0.126
0.109
0.098
0.084

Dilucin
20
20
20
20
20

Concentracin
(g/l)
51.617
51.247
44.954
40.882
35.699

Grfica 03

De acuerdo a la investigacin Optimizacin de las condiciones de cultivo


para una alta produccin de inulinasa con Kluyveromyces sp y su fase de
crecimiento de la fermentacin; el M terico (0.3838h-1) vara respecto
del M prctico (0.2828h-1). Estos varan porque el medio es limitante y
se trabaj con diferente fuente de carbono (maltosa), los parmetros
utilizados en la fermentacin son los mismos a excepcin de la aireacin,
donde la agitacin se dio a 400rpm y nuestra fermentacin con 200rpm
puede que este parmetro si influya debido a que esta relacionado con la
velocidad de transferencia de la materia; por lo tanto al haber una mayor
velocidad de agitacin habr una mayor velocidad de transferencia de
materia lo que dar como resultado una mayor velocidad de crecimiento.
Por lo que por esto podemos decir que no solo la temperatura influye en
el M sino que tambin la velocidad de agitacin.
Al tomar las medidas

de concentracion de maltosa y puede que en la

concentracion de la biomasa aya ocurrido lo mismo estas variaciones se


puedo dar al cambio de instrumento que fue el espectrofotmetro que
cada instrumento tiene una sensibilidad para leer las medidas, adems q
siempre es recomendable trabajar con el mismo equipo que se hizo la
curva de calibrado.
Rendimiento de maltosa en biomasa:

Yx/s = -

X
S

Yx/s = -

0.125 0.023
= 0.015
44.954 51.617

PH durante la fermentacin:
Tiempo (h)
0
4
6
8
10
12

pH
3.874
3.679
3.667
3.121
3.121
3.063
Grfica 04

En el grfico podemos observar que en

el tiempo cero su pH fue de

3.874; pasado 4 horas el pH fue del 3.679 y despus de 1 hora el pH fue


de 3.667; estos indica que en estos intervalos el pH no varia tan
considerablemente debido a que el consumo de sustrato no llega a ser
limitado y donde las clulas van teniendo un crecimiento de latencia; al
llegar a las 10 horas de la experiencia se tuvo un pH de 3.121 notndose
entonces que la actividad del kluyveromyces marxianus aumenta; en
la

fase logaritmica tenemos un cambio brusco en el pH, luego en el

grafica se presenta la fase de decadencia donde se produce la lisis de las

clula en donde dicha ruptura se comienzan a eliminar protones;


combinndose as el material gentico con el material extracelular.
La solucin tampn es importante tambin en la cintica de crecimiento
ya que este ayuda a amortiguar los cambios de pH en el crecimiento del
microbio en sus diferentes etapas lo cual se puede ver en la grafica N
04

en la cual no se ven cambios excesivos de pH durante la

fermentacin.
Datos tericos:
DETERMINACIN DEL m:
M = 0.3838 h-1
Determinacin del tiempo de fermentacin terico.

Calculo del tiempo de cintica


t= ln(xf/xo)(1/M)

Con los datos de la prctica:


t= ln(2/0.2)(1/0.3838)
t= 6h
RENDIMIENTO:
YX/S = X / - S
Yx/s = (42.1/50)x0.6 = 0.505

El rendimiento terico es 0.505 y el obtenido en la prctica es 0.015 la


variacin de estos rendimiento puede haberse debido a que es medio
limitante y

puede que algn nutriente haya limitado su optimo

rendimiento. El nutriente limitante no permite que crezca al mximo el


microorganismo. Adems de ello el rendimiento esta en base a la
concentracin de clulas el xf obtenido en prctica obtuvo un valor
menor a 2 g/l que fue el valor con que se trabaj el terico. Tambin
puede haberse debido por la presencia de algn inhibidor, o al
momento que se cambi de espectrofotmetro en la prctica dando
resultados de sustratos que no fueron los adecuados.

VI.- CONCLUSIONES

VII.- RECOMENDACIONES
No es necesario calibrar el pH de todos los componentes que
constituyen el medio de cultivo, ya que para eso estamos utilizando
una solucin Tampn, que mantendr el pH adecuado para el
desarrollo de microorganismo.
Se

debe

tratar

de

mantener

los

parmetros

de

fermentacin

constantes es decir no se debe variar ni la agitacin ni la temperatura


de desarrollo del m.o.
La esterilizacin de los materiales debe ser la mas adecuada con el fin
de evitar posteriores contaminaciones que puedan arrojarnos datos no
deseados.
El reactivo DNS debe mantenerse fuera de la luz para evitar
reacciones de oscurecimiento lo cual puede variar su modo de accin
frente a los azucares y as arrojarnos valores de absorbancia
errneos.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

BECERRA,

M.;

RODRGUEZ,

E.;

CERDN,

M.

Extraction

of

intracellular proteins from Kluyveromyces lactis. Food Technol.


Biotechnol 39(2): 135-139. 2001.

CHAMPLUVIER, B.; KAMP, B.; ROUXHERT, P. Preparation and


Properties of b galactosidase confined in cells of Kluyveromyces sp.
Enzyme Microb. Technol 10: 611-617. 1988.

FENTON, D. Solvent treatment for b D galactosidase release from


Yeast cells. Enzyme Microb. Technol. 4: 229-232. 1982.

http://www.serbi.luz.edu.ve/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S079822592005010000012&lng=es&nrm=iso

SANTOS, A.; LADERO, M.; GARCA, F. Kinetic Modeling of lactose


hydrolysis with an inmobilized b galactosidase from Kluyveromyces
fragilis. Enzime and Microbiol. Technol.. 22: 558-567.1998

SCHENEIDER, A; MERKLE, R.; CARVALHO, M.; JONAS, R.; BURLAN,


S. Oxygen tranfer on b galactosidase production by Kluyveromyces
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Sugar

Cane

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Carbon

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1995.

VIII.- ANEXOS
8.1 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO SLIDO DE MANTENCION
1. Pesar los siguientes nutrientes

medio

Nutriente

Concentracin(g/l)

extracto de
levadura
peptona
mantencin
glucosa
agar
Slido de

Pesos
(g)

10

0.50

20
20
20

1.00
1.00
1.00

2. Luego se proceder a diluir los compuestos en 50 ml de agua


destilada, en matraz de 250 ml.
3. Se llevara al mechero hasta alcanzar la ebullicin (1 min.), todo
esto se mantuvo en constante agitacin.
4. En seguida extraer 10 ml del preparado

colocar en

cada

tubo de ensayo,
5. Posteriormente esterilizar los tubos en el autoclave durante 15
min.
MEDIO LQUIDO ACTIVACIN
1. Se calcularon los compuestos para el medio

Nutriente
lactosa
Extracto
levadura
K2HPO4
NH4Cl
MgSO4.7H2O
KCl

de

Concentracin
(g/l)
3.96

Peso de
compuesto(g)
0.0792

5.0

0.1

5.0
1.5
0.065
0.57

0.1
0.03
0.013
0.0114

2. esterilizar por separado el extracto de levadura en un tubo de


ensayo (enrazar hasta 5 ml con agua destilada),la lactosa en un
matraz de 125 ml (con 10 ml. de agua destilada); esto para evitar
la reaccin entre estos dos componentes; y por ultimo las sales en
otro tubo de ensayo (enrazar hasta 5 ml).

3. verter los tubos en el matraz uno por uno siempre bajo


mechero, quedando la mezcla lista para ser inoculada
PREPARACION DE MEDIO DE FERMENTACIN

Determinar los pesos necesarios de la muestra y reactivos

Nutriente
Concentracin (g/l) Peso de compuesto(g)
Maltosa
3,96
0.792
Extracto de levadura
5,0
1.0
K2HPO4
0,337
0.0674
NH4Cl
0,99
0.198
MgSO4.7H2O
0,068
0.0136
KCl
0,029
0.0058

Posteriormente diluimos los compuestos por separados en


matraces.

Llevamos a esterilizar en el autoclave

8.2 CURVA DE CALIBRACION DE AZUCARES REDUCTORES


MEDIANTE EL METODO DE DNS
Preparacin del Reactivo DNS
Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en
aproximadamente 20 ml de agua, paralelamente se disuelve el DNS en
pequeas cantidades con ayuda de un agitador magntico y calentando.
Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL y se agita
hasta

la

completa

disolucin

de

todos

los

componentes,

para

posteriormente aforar hasta 50 mL.

Curva de Calibracin de Maltosa


La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestras de
concentracin conocida y analizadas segn el siguiente procedimiento:

Se tomo como base 100 ml de una solucin patrn de 3 g/l de


maltosa.

Se hicieron diluciones segn el siguiente cuadro:


Tabla N 2
N
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8

Muestra
(ml)
1.0
0.8
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0

H2O
(ml)
0
0.2
0.4
0.5
0.6
0.8
0.9
1

Concentracin
So (g/l)
3.0
2.4
1.8
1.5
1.2
0.6
0.3
0

Se mantiene la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5


minutos para luego enfriar con agua helada.

Se aaden 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos,


luego agitar.

Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

Graficamos concentracin vs absorbancia.

Luego de lo explicado obtuvimos los siguientes resultados para una


solucin de 3 g/l (muestra):
Tabla N 3
ABS
0.150
0.142
0.127
0.119
0.083
0.043
0.014
0.00

[S] (g/l)
3.0
2.4
1.8
1.5
1.2
0.6
0.3
0

Grfica 05

8.3 CURVA DE CALIBRACION PARA LA DETERMINACION DE LA


CONCENTRACION CELULAR POR DENSIDAD OPTICA
Tabla N 4

0.208

Peso
capa.
0.2618

0.206

0.2877

0.289

0.0013

0.26

0.104

0.2647

0.2656

0.0009

0.18

0.065

0.2727

0.2735

0.0008

0.16

0.051

0.2812

0.2818

0.0006

0.12

0.041

0.2741

0.2746

0.0005

0.10

0.033

0.2719

0.2723

0.0004

0.08

0.027

0.2691

0.2694

0.0003

0.06

0.022

0.2737

0.274

0.0003

0.06

0.013

0.2739

0.2741

0.0002

0.04

Absorbancia

Peso M + Con. Cel


Bio (g/L)
C
(g)
0.2633
0.0015
0.30

Grfica 06

8.3 CINETICA DE CRECIMIENTO


Cintica de Crecimiento de Biomasa
De las medidas tomadas en el transcurso de la fermentacin obtuvimos
el siguiente cuadro:
Tabla N 5
tiempo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

absorbancia
0.014
0.022
0.036
0.041
0.052
0.067
0.058
0.162
0.266
0.360
0.423

X (g/l)
0.044
0.063
0.110
0.135
0.151
0.190
0.215
0.231
0.270
0.295
0.327

Ln (X/Xo)
0.000
0.2877
0.6931
1.2993
1.8458
2.2687
2.5649
2.6856
2.8134
2.8717
2.8717

Nota: Para calcular X(g/l) hicimos uso de la curva de calibracin para la


Biomasa. Luego hallamos LnX para calcular el del microorganismo.

Determinacin de cintica de consumo de fuente de carbono


Utilizando la curva patrn y su ecuacin y = 2.8721x - 0.0469,
calculamos la concentracin de lactosa en el transcurso del tiempo.
Tiempo

Biomasa

0.044

sustrato
6.693

0.063

6.558

0.110

6.480

0.135

6.279

0.151

6.255

0.190

6.231

0.215

6.207

7
8
9
10

0.231
0.270
0.295
0.327

6.183
6.147
6.111
6.104

8.4 PREPARACION DE LA SOLUCION TAMPON


3.5 = 3.56 + Log [B] / [A]
+0.0131]

3.3 = 3.56 + Log [B - 0.013] / [A

Log [B] / [A] = - 0.06

Log [B - 0.013] / [A +0.0131] = - 0.26

PKa = 3.5 Log ( 0.00302 / 0.00349)


PKa = 3.56
A = 2.64726
B = 3.93954
[B] / [A] = 0.87096359
[B - 0.013] / [A +0.0131] = 0.5495408789
[B] = 0.87096359 [A]
0.87096359A 0.0131 = 0.549540A + 0.007
0.32142A = 0.02198
A = 0.063 M
A = ( 0.063 / 5 ) * 210.1
B = ( 0.055 / 5 ) * 358.14

B = 0.055 M
A = 2.64726g
B = 3.93954g

3.5 = 3.56
3.5 = - Log [ H ]
- [ H ] = 10 -3.5
2H = 2 [10 -3.5]
- Log = [2 [10
pH = 3.19

-3.5

]]