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Alimentos
Mdulo II
BIBLIOGRAFIA
Brock, T.D. & Madigan, M.T. Microbiologa, 6 Edicin. Prentice Hall Hispanoamericana. Mxico, 1993.
ICMSF Microbial Ecology of Foods. Volume 1: Factors affecting life and death of microorganisms. Volume 2:
Food commodities. Academic Press, New York, 1980. (Edicin en castellano: Editorial Acribia, 1985).
ICMSF Microorganisms in Foods. 1. Their significance and methods of ennumeration, 2nd Ed. University of
Toronto Press, 1978.
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2nd Ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1986.
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Doyle, M.P., Beuchat, L.R. & Montville, T.J. (Eds.). Food Microbioloy. Fundamentals and Frontiers. ASM Press,
Washington D.C., 1997.
Frazier, W.C. & Westhoff, D.C. Microbiologa de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza, 1993.
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Beuchat, L.R. (Ed.). Food and beverages mycology. 2nd Ed., Van Nostrand Reinhold, New York, 1987.
Vanderzant, C. & Splittstoesser, D. (Eds.). Compendium of methods for the microbiological examination of foods
3rd Ed. APHA, 1992.
Mossel, D.A.A. & Moreno Garca, B. Microbiologa de los Alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza, 1985.
Bourgeois, C.M., Mescle, J.F. & Zucca, J. Microbiologa Alimentaria, Volumen I y II. Ed. Acribia, Zaragoza,
1994.
Eley, R. (Ed.). Intoxicaciones alimentarias de etiologa microbiana. Ed. Acribia, Zaragoza, 1990.
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
INDICE DE CONTENIDOS
TRABAJO PRACTICO N 1: Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium perfringens ............................... 6
Staphylococcus aureus ............................................................................................................................................ 6
Salmonella spp. ....................................................................................................................................................... 7
Clostridium perfringens ........................................................................................................................................ 10
TRABAJO PRACTICO N 2: Anlisis microbiolgico de agua ........................................................................... 14
TRABAJO PRACTICO N 3: Anlisis microbiolgico de quesos ........................................................................ 17
Listeria monocytogenes .............................................................................................................................................. 25
Escherichia coli O157:H7 ......................................................................................................................................... 28
GUIAS DE ESTUDIO .............................................................................................................................................. 31
FUNDAMENTOS TERICOS ............................................................................................................................... 37
MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICOS ................................................................................. 37
RECOLECCION Y MANIPULEO DE LAS MUESTRAS ............................................................................... 41
BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS TOTALES ....................................................................................... 42
PROCEDIMIENTOS GENERALES PARA EL RECUENTO EN PLACA DE BACTERIAS AEROBICAS
TOTALES ............................................................................................................................................................. 43
NUMERO MAS PROBABLE ............................................................................................................................. 48
BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES A 45C Y E. COLI ................................................................. 50
BACTERIAS PSICROTROFICAS .................................................................................................................... 51
DIRECCIONES UTILES ......................................................................................................................................... 53
ANEXO: NDICE ..................................................................................................................................................... 54
TABLAS ................................................................................................................................................................ 57
METODOS DE TINCION ................................................................................................................................... 67
SOLUCIONES Y REACTIVOS.......................................................................................................................... 70
MEDIOS DE CULTIVO ...................................................................................................................................... 72
REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA ALUMNOS DE LABORATORIOS DE
QUMICA Y BIOLOGA - PAUTAS DE ACTUACION EN CASOS DE EMERGENCIAS ......................... 116
TRABAJO PRACTICO N 1
Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus
Preparacin de la muestra
Se entregar a los alumnos un homogenato preparado con 10 g de leche en polvo ms 90 ml de
agua peptona 0,1% sobre el cual se realizar el recuento del microorganismo.
Aislamiento
Se sembrar 0,1 ml del homogenato por duplicado en cajas de agar Baird-Parker. La siembra se
efectuar en superficie. Incubar a 37C, 48 h. Las colonias tpicas se pasarn a tubos de BHI
(Brain Heart Infusion) inclinado. Las colonias tpicas de S. aureus son circulares, suaves,
convexas, de 2 a 3 mm de dimetro en placas poco crecidas, de grises a negras, rodeadas de un
halo opaco y, frecuentemente de un halo claro ms externo. Ocasionalmente se encuentran cepas
no lipolticas que no presentan halos. La apariencia puede ser seca y el color menos intenso si
proviene de un alimento congelado o desecado.
Pruebas de identificacin
De los cultivos aislados del alimento se realizar:
1) Tincin de Gram.
2) Prueba de la Catalasa:
Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre portaobjetos. La efervescencia
causada por la liberacin de O2 indica la presencia de catalasa.
3) Siembra por estras en Agar Manita (Medio 110 para estafilococos) de las cepas de
Staphylococcus. Incubar a 37C, 48 h. Revelar con prpura de bromocresol para la fermentacin
del manitol. Revelar con solucin saturada de sulfato de amonio o con HCl diluido para
evidenciar la gelatinlisis.
4) Prueba de la Coagulasa:
Colocar 0,5 ml de plasma citratado de conejo o humano, diluido en solucin fisiolgica, en un
tubo de ensayo pequeo. Agregar un ansa de cultivo o 0,5 ml de cultivo en caldo e incubar a
37C.
La aparicin de grumos o cogulos en el trmino de 1 a 4 horas indica que la cepa es coagulasa
(+).
El cogulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+).
Paralelamente hacer un blanco sin sembrar y un testigo con cepa de estafilococo coagulasa (+).
5) Prueba de la Termonucleasa:
Las placas de Baird-Parker en las que se observan colonias tpicas se colocan en estufa de 60C
durante 2 h para inactivar las nucleasas termosensibles. Luego de la inactivacin verter en cada
placa 10 ml de TDA (agar con ADN y azul de toluidina) fundido. Incubar a 37C durante 1 o 2
h. La hidrlisis del DNA se evidencia por la aparicin de halos claros alrededor de las colonias.
6
Salmonella spp.
Enriquecimiento no selectivo
Se incubar un homogenato realizado con 25 g de leche en polvo y 225 ml de Caldo Lactosado
16 h a 37oC.
Enriquecimiento selectivo
Se efectuar en paralelo en dos medios de cultivo. Se sembrar 1 ml del caldo de
enriquecimiento no selectivo en 10 ml de Caldo Selenito Cistina y en 10 ml de Caldo
Tetrationato respectivamente. Se incubar el Caldo Selenito Cistina 18 h a 37oC y el Caldo
Tetrationato 18 h a 43C.
Aislamiento
Medios slidos de aislamiento. Observacin de colonias tpicas.
A partir de cada tubo del enriquecimiento selectivo sembrar por estra en:
1) Agar XLD (Xilosa Lisina Desoxicolato)
2) Agar Bismuto-Sulfito
3) Agar Verde Brillante (BPLS)
Incubar las placas invertidas a 37C durante 24 h. Observar las colonias resultantes.
Las colonias tpicas de Salmonella spp. son:
Agar XLD: colonias pequeas, color rosa con o sin centro negro.
Agar Bismuto-Sulfito: colonias con centro negro, borde claro, precipitado negro con brillo
metlico alrededor (ojo de conejo u ojo de pez).
Agar Verde Brillante: colonias pequeas, translcidas o incoloras. El medio a su alrededor vira
al rojo.
Las colonias tpicas se transfieren a Agar Nutritivo inclinado y se incuban a 37C durante 24 h.
Pruebas de identificacin
A partir de cada cultivo puro
1) Realizar tincin de Gram.
2) Prueba de oxidasa.
3) TSI. Sembrar por puncin y en superficie. Incubar a 37C, 24 h.
4) LIA. Sembrar por puncin y en superficie. Incubar a 37C, 24 h.
5) Caldo urea. Sembrar e incubar a 37C 24 h.
6) Prueba de la -galactosidasa: a partir de un cultivo en agar inclinado, tomar un ansa bien
cargada y emulsionarla en 0,2 ml de solucin salina fisiolgica hasta conseguir una suspensin
densa. Colocar un disco de ONPG. Incubar a 37C por 20 minutos. Observar hasta las 4 horas de
incubacin para dar un informe negativo. El color amarillo indica que la reaccin es positiva.
7) Produccin de Indol. Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37C.
Investigacin de Indol Tcnica de Kovacs:
Agregar al cultivo 0,2-0,3 ml de reactivo y agitar. Esperar unos minutos.
Coloracin roja en la parte superior del tubo indica formacin de Indol (+).
8) Produccin de acetil metil carbinol y/o rojo de metilo. Inocular un tubo de caldo Clark y
Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37C.
Investigacin de acetil metil carbinol Tcnica de Voges Proskauer:
Separar una alcuota del cultivo en un tubo y agregar, respetando el orden:
7
- 0,6 ml de -naftol al 5% y
- 0,2 ml de KOH al 40%
Agitar el tubo suavemente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y oxidar la acetona
(acetil metil carbinol) y permitir el desarrollo de color. Dejar descansar por lo menos 10-15
minutos. De ser necesario agregar unos cristales de creatina.
El mximo desarrollo de color se observa luego de dos horas.
Color rosado en la superficie: produccin de acetona (+), VP (+).
Color amarillo o cobrizo: no produccin de acetona, VP (-).
Investigacin de acidez Prueba del Rojo de Metilo:
Incubar 48 h ms a 35C despus de la prueba de Voges-Proskauer. Agregar 5 gotas de
reactivo rojo de metilo al cultivo y observar inmediatamente.
Color rojo indica acidez (+).
Caractersticas del indicador Rojo de Metilo:
pH< 4,4
rojo
4,4 < pH < 6 rango de viraje del indicador
pH> 6
amarillo
Resultados tpicos de Salmonella spp.:
1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas
2) Oxidasa (-)
3) TSI: profundidad: amarillo o negro, con o sin ruptura del agar por formacin de gas/
superficie inclinada: rojo o sin variacin. La mayora de las cepas de Salmonella son lactosa
(-) y sacarosa (-).
4) LIA: profundidad: violeta o negro (negro en la mayora de los casos) /superficie inclinada:
violeta. Salmonella es lisina decarboxilasa (+). Excepcin: Salmonella paratyphi A:
profundidad: amarillo /superficie inclinada: violeta.
5) Caldo Urea: medio sin cambio de color. Salmonella es siempre ureasa negativa.
6) -galactosidasa: (-), sin cambio de color. (El (+) se manifiesta por la aparicin de color
amarillo).
7) Indol (-).
8) Voges Proskauer (-) Rojo de Metilo (+).
Identificacin serolgica de Salmonella spp.
Toda cepa sospechosa de Salmonella debe identificarse bioqumicamente antes de efectuar el
anlisis serolgico. De lo contrario aglutinaciones positivas podrn ser originadas por otros
grmenes que poseen estrecha relacin antignica (Arizona - Citrobacter).
Sueros polivalentes somticos de Salmonella
Los sueros polivalentes somticos son 6: OS-A, OS-B, OS-C, OS-D, OS-E, OS-F.
Cabe sealar que los sueros OS-A y OS-B permiten identificar alrededor del 98% de los
serotipos ms frecuentes de Salmonella.
Tcnica:
Aglutinacin somtica:
-Preparacin del antgeno: utilizar un cultivo de estras de 24 h de incubacin a 37C. Suspender
el crecimiento de la estra con 1 ml de solucin fisiolgica.
8
-Reaccin: sobre lmina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes
somticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensin antignica.
Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada.
-Lectura: debe ser inmediata y no despus de 5 minutos. Las reacciones tardas o dudosas no
deben considerarse.
Aglutinacin flagelar:
-Preparacin del antgeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en
caldo. Luego agregar igual volumen de solucin formolada al 5%.
-Reaccin: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros polivalentes
y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensin antignica. Incubar en
bao mara a 50C.
-Lectura: se efectuar al cabo de una hora de incubacin. Debe considerarse nicamente la
aglutinacin de tipo ciliar (flculos esponjosos, fcilmente disociables).
Clostridium perfringens
Preparacin de la muestra
Se entregar a los alumnos un homogenato preparado con 10 g de leche en polvo ms 90 ml de
agua peptona 0,1% sobre el cual se realizar el recuento del microorganismo.
Aislamiento
Transferir 1 ml del homogenato a cada una de 2 placas con 10 ml de Agar TSC (Triptona-sulfitocicloserina) o TSN (Triptona-sulfito-neomicina) o SPS (sulfito-polimixina-sulfadiazina).
Adicionar 15 ml ms de agar y mezclar. Incubar a 37C, 48 h en anaerobiosis.
Colonia tpica: colonia negra aislada.
Las colonias tpicas se transfieren a Caldo tioglicolato y se incuban a 37C, 24 h en anaerobiosis.
Pruebas de identificacin
A partir de los cultivos aislados del alimento se realizar:
1) Coloracin de Gram: realizar la tcnica descripta en la gua de reactivos y medios de cultivo.
Observar forma y tincin de las clulas vegetativas, forma y disposicin de las esporas.
2) Coloracin de esporas: realizar la coloracin de verde de malaquita. Observar las esporas.
3) Utilizacin de azcares: sembrar 0,2 ml del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con
azcares (salicina-rafinosa-etc.), sin burbujear. Incubar 48 h a 37C. Agregar unas gotas de
indicador. Observar acidez y/o gas.
4) Reduccin de nitrato/movilidad: sembrar una ansada por puncin en un tubo de agar
semislido de nitrato. Incubar 24 h a 37C. Agregar unas gotas de los reactivos. Observar los
resultados.
5) Hidrlisis de la gelatina: sembrar 0,2 ml del cultivo en el fondo de un tubo con agar gelatinalactosa, sin burbujear. Incubar 24 h a 37C. Enfriar en hielo y observar el resultado.
6) Leche: sembrar 0,2-0,5 ml del cultivo en un tubo con leche. Incubar 24 h a 37C. Observar
coagulacin y degradacin del cogulo, por digestin de casena. Observar formacin de gas.
7) Esporulacin: sembrar 0,2 ml del cultivo en caldo Duncan-Strong al fondo y sin burbujear.
Incubar 24 h a 37C. Realizar tincin de esporas.
10
11
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Incubar 48 hs a 37C.
Picar las colonicas tpicas e
inocularlas en caldo BHI.
AISLAMIENTO
BP
BP
SIEMBRA EN SUPERFICIE
HOMOGENATO
12
XLD
BiSO3
10 ml
1 ml
10 ml
XLD
BiSO3
CALDO TETRATIONATO
1 ml
Incubar 24 hs a 35C
AISLAMIENTO
Incubar 18 hs a 37C
ENRIQUECIMIENTO
SELECTIVO
Incubar 16 hs a 37C
ENRIQUECIMIENTO
NO SELECTIVO
DETERMINACION DE SALMONELLA
13
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Incubar 24 hs a 37C en
anaerobiosis.
Picar las colonicas tpicas e
inocularlas en caldo tioglicolato.
AISLAMIENTO
TSN
TSN
SIEMBRA
HOMOGENATO
TRABAJO PRACTICO N 2
Anlisis microbiolgico de agua
Toma de muestra y preparacin de las diluciones
Utilizar frascos estriles de capacidad adecuada para la cantidad de agua necesaria para realizar los
anlisis. Si se supone la presencia de cloro o cloraminas en el agua, agregar 100 mg de tiosulfato de
sodio por litro de muestra en los frascos antes de su esterilizacin. Si pudieran hallarse presentes
metales pesados proceder de igual forma empleando 572 mg de EDTA por litro de muestra. Realizar
diluciones decimales sucesivas empleando como diluyente agua peptona 0,1% (9060. St. Meth. 18th Ed.
1992).
Recuento total de bacterias aerobias mesfilas
Sembrar en Agar para Recuento en Placa (APC). En la mayora de las aguas potables los recuentos
adecuados se logran sembrando 1 y 0,1 ml del agua tal cual y 1 y 0,1 ml de la dilucin 1/100. Realizar
como mnimo dos diluciones sucesivas por duplicado. Incubar a 37oC por 24 h. Informar UFC de
aerobios mesfilos/ml. (9215. St. Meth. 18th. Ed.1992).
Determinacin de coliformes totales por la tcnica de fermentacin en tubos mltiples (NMP)
Esquema del mtodo 9221. St. Meth. 18th. Ed. 1992.
Inocular tubos de fermentacin para NMP
con Caldo Lauril Sulfato. Incubar por 24 h a 35oC.
(1)
Crecimiento con produccin de gas
Transferir para confirmacin a Caldo Verde
Brillante Bilis Lactosa. Incubar 48 h a 35oC.
(a)
Produccin de gas +
PRESENCIA DE
COLIFORMES
(2)
Crecimiento sin produccin gas
Incubar 24 h +
(b)
Produccin de gas AUSENCIA DE
COLIFORMES
Ensayo presuntivo
Se inoculan series de 5 tubos de por lo menos 3 diluciones decimales sucesivas (Generalmente 10, 1 y
0,1 ml). Si el inculo es igual o mayor a 10 ml se utiliza el medio de concentracin adecuada para no
diluir los nutrientes. Se incuban 24-48 h a 35oC.
Ensayo de confirmacin
Los tubos producen gas y/o crecimiento abundante se transfieren con ansa a tubos de fermentacin de
Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Se incuban 48 h a 35oC.
Determinacin de E. coli por el mtodo de filtracin por membrana
Se filtra por membrana la cantidad necesaria de agua y se coloca el filtro en 25 ml de Caldo Lauril
Sulfato. Se incuba 4 h a 30oC y 14 h a 44oC (Directiva 95/131 CEE).
Produccin de gas y/o crecimiento abundante se confirma estriando en agar Endo.
14
A las colonias aisladas se les realizan las pruebas de IMViC y/o set de pruebas mltiples. Se informa
ausencia o presencia de E. coli en el volumen filtrado.
Determinacin de P. aeruginosa (Norma DIN 38411)
-Enriquecimiento:
a) Filtrar por membrana la cantidad adecuada de agua y colocar el filtro en 25 ml de Caldo Verde de
Malaquita.
b) Colocar la cantidad adecuada de agua en igual volumen de Caldo Verde de Malaquita doble
concentrado.
Incubar 48 h a 37oC.
-Aislamiento: Si se observa crecimiento en el caldo de enriquecimiento sembrar por estra en placas de
Agar Cetrimida. Incubar 48 h a 42oC.
-Confirmacin: de las colonias de agar cetrimida sembrar en:
Agar F (formacin de fluorescena), Agar P (formacin de piocianina) y Agar Acetamida.
Realizar la prueba de oxidasa.
PATRON MICROBIOLOGICO
Requerimientos Microbiolgicos del CAA
Art. 982 Agua potable de suministro pblico y de uso domiciliario.
Art. 983 Agua de bebida potabilizada envasada.
Bacterias mesfilas (APC 24 h a 37C): mx. 500 UFC/ml
Bacterias coliformes (NMP 48 h a 37C en Caldo Lauril Sulfato o Caldo Mac Conkey): igual o menor
que 3/100 ml.
E. coli: ausencia en 100 ml
P. aeruginosa: ausencia en 100 ml
15
CONCLUSIONES
16
TRABAJO PRACTICO N 3
Anlisis microbiolgico de quesos
a) Toma de muestra (FAO, Manual para el control de calidad de los alimentos. 4. Anlisis
Microbiolgico. 1981)
Las muestras se toman de los recipientes originales sin abrir, o de porciones representativas de
los recipientes abiertos, utilizando para ello instrumentos apropiados, como cucharas, cuchillos o
esptulas esterilizadas. Las muestras se deben proteger de la contaminacin, enfriar a 0-4,4C y
enviar rpidamente al laboratorio para ser examinadas. De los quesos duros y semiduros se
deben tomar por lo menos cinco muestras de diferentes partes del queso, cada una de cinco
gramos como mnimo.
b) Preparacin de la muestra y diluciones (FAO, Manual para el control de calidad de los
alimentos. 4. Anlisis Microbiolgico. 1981)
Se depositan aspticamente 10 g de queso en un recipiente estril y se aaden 90 ml de solucin
de citrato de sodio al 2% previamente calentada (40-45C). Se dispersa completamente en el
Stomacher o se mezcla durante dos minutos. Se obtiene la dilucin 1:10.
Se realizan las diluciones necesarias. Se transfiere 1 ml de la primera dilucin bien mezclada y
se agregan 9 ml citrato de sodio al 2%. Agitar para homogeneizar. Repetir esta operacin para
obtener las diluciones sucesivas.
c) Metodologa de anlisis.
c 1) Recuento de coliformes a 30C
c 2) Recuento de coliformes a 45C
c 3) Recuento de E. coli
c 4) Recuento de mohos y levaduras
c 5) Recuento de Staphylococcus aureus
c 6) Determinacin de Salmonella en 25 g
c 1) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A:1985)
El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio slido o en
medio lquido (por la tcnica de NMP: nmero ms probable).
c 1.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)
Sembrar por duplicado 1 ml de las diluciones (-1), (-2), (-3) en placas de Petri. Agregar
aproximadamente 12 ml de agar ABRV fundido a 44-46C. Mezclar. Dejar solidificar
completamente y agregar entonces 4 ml ms de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas
invertidas a 30C por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 15 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con dimetro de por lo menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar
a 30C por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den produccin de gas.
El resultado se calcula en base al nmero de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de
coliformes totales/g.
17
Escherichia coli puede presentar IMViC: ++-- (biotipo 1) o -+-- (biotipo 2), muy poco
frecuente.
c 4) Recuento de mohos y levaduras (Bacteriologycal Analytical Manual, 1998. Actualizado
a 2001)
Mtodo de siembra en superficie.
Pipetear aspticamente 0,1 ml de las diluciones (-1) y (-2) en placas con agar YGC o DRBC y
esparcir el inculo con esptula de vidrio, previamente flameada y enfriada.
Si se trata de alimentos con actividad de agua inferior a 0.95, se recomienda emplear agar DG18.
Plaquear cada dilucin por duplicado.
Incubar las placas en oscuridad a 25C. No invertir las placas ni apilar ms de 3 placas.
Contar las placas a los 5 das de incubacin. Si no hubiera crecimiento, reincubar otras 48 h.
Contar placas que contengan entre 10-150 colonias.
19
El lmite superior para un buen recuento depender del tipo de crecimiento que prevalezca,
hongos o levaduras, tamao de colonias, y deber ser decidido a discrecin del analista en cada
caso particular.
Notas:
1.- Eventualmente puede realizarse la siembra con el mtodo de vertido en placa (por ejemplo,
con agar YGC - extracto de levadura, glucosa y cloramfenicol). La tcnica de siembra en
superficie se considera ms conveniente que la de vertido en placa. En este ltimo caso, las
colonias de hongos en la superficie crecen ms rpido y, frecuentemente, enmascaran a las que
crecen debajo de la superficie, resultando enumeraciones menos exactas.
2.- El agar DRBC debe ser empleado nicamente en siembra en superficie.
3.- No mover las placas durante la incubacin hasta el recuento.
4.- Preferiblemente, no contar las placas antes de concluir el perodo de incubacin, porque la
manipulacin de placas puede provocar crecimiento secundario por las esporas que se hubieran
desprendido en el movimiento de la placa.
5.- Si se necesitara identificar las especies fngicas, aislarlas en agar PDA (papa dextrosa) o MA
(Agar Malta).
c 5) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990)
Sembrar por duplicado 0,1 ml de las diluciones (-1) y (-2) en superficie de placas de agar Baird
Parker perfectamente secas. Distribuir con una esptula de Drigalsky cuidadosamente (tener la
precaucin de enfriar bien la esptula para no matar los microorganismos). Dejar secar las placas
tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez secas,
incubarlas invertidas a 371C durante 24-48 h.
Tomar para enumerar placas con no ms de 150 colonias. Seleccionar un nmero representativo
de colonias tpicas y atpicas; y transferirlas a tubos de caldo infusin cerebro-corazn. Incubar a
37C 35C por 20 a 24 h.
Las colonias tpicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara, generalmente
un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.
Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar:
1 - Tincin de Gram
2 - Catalasa
3 - Coagulasa (comparar con cepa patrn)
Agregar 0,1 ml del cultivo a aproximadamente 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido en
un tubo estril. Incubar a 35-37C. Examinar despus de 4 a 6 horas. El cogulo formado
debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estril en lugar del cultivo. Para que el
ensayo sea vlido, no debe observarse ningn signo de coagulacin.
4 - Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.
S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo (3 o
4+) y termonucleasa positivo.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/g de muestra.
20
21
Reaccin: sobre lmina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes somticos
y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensin antignica. Mezclar
con un ansa previamente flameada y enfriada.
Lectura: debe ser inmediata y no despus de 5 minutos. Las reacciones tardas o dudosas no
deben considerarse.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en 25 g.
22
Muestra
I
II
III
IV
Coliformes a 30C/g
Coliformes a 45C/g
S. aureus/g
Salmonella/25 g
Listeria
monocytogenes/25 g
Conclusin del lote
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Firma y cargo del responsable
23
Criterio de Aceptacin
Categora
ICMSF
Coliformes/g (30C)
Coliformes/g (45C)
Staphylococcus
coagulasa positiva/g
Salmonella spp./25 g
10
Listeria monocytogenes/
25 g
10
Microorganismos
24
Mtodos de ensayo
Listeria monocytogenes
Determinacin de Listeria monocytogenes (FIL 143: 1990)
Enriquecimiento primario:
Pesar aspticamente 25 g de muestra en un erlenmeyer u otro recipiente asptico. Agregar 225
ml de caldo de enriquecimiento (triptona soja con acriflavina, cicloheximida y cido nalidxico)
a 45C. Mezclar hasta lograr una buena dispersin. Asegurarse que la temperatura no supere los
45C. Incubar por 48 h a 30C.
Aislamiento en medio slido
A partir del caldo de enriquecimiento, estriar una placa de agar Oxford para obtener colonias
aisladas. Incubar las placas invertidas por 48 h a 37C. Las colonias tpicas de Listeria spp. estn
rodeadas de una zona marrn oscura o negra por hidrlisis de la esculina.
Resulta conveniente agregar otro agar de aislamiento. Estriar tambin una placa de agar
PALCAM: se incuba a 35C por 24-48 h. Las colonias tpicas de Listeria spp. son de color gris
verdoso con halo negro-parduzco (por hidrlisis de la esculina), sobre fondo rojo (porque no
fermenta manitol)
Identificacin de gnero Listeria
- Crecimiento tpico en agar triptona de soja - extracto de levadura
Seleccionar cinco colonias tpicas de cada placa de aislamiento y estriarlas en placas de agar
triptona de soja-extracto de levadura (las placas deben ser muy finas) para obtener colonias
aisladas. Incubar por 24 h a 37C o hasta que se desarrolle un buen crecimiento.
Examinar las placas con iluminacin de Henry.
Observar desde
Haz de luz blanca
Trpode
Espejo
25
2) Prueba de la catalasa. Picar una colonia tpica y suspenderla en una solucin de H2O2 al 3% en
una placa de vidrio (portaobjeto, por ejemplo). Listeria spp. son catalasa positiva y se observa
desprendimiento de burbujas de gas (oxgeno).
3) Otra caracterstica tpica es la movilidad de los cultivos incubados a 25-30C. Se puede
observar en un preparado en fresco suspendiendo una colonia tpica en solucin salina al 0,85%
(bacilos delgados y cortos con dbil rotacin y movimiento en forma de volteo). Tambin se
comprueba la movilidad, inoculando por puncin un agar movilidad (o agar SIM) e incubando
hasta 5 das a 25C. Se observa una movilidad tpica en forma de paraguas.
Transferir a agar triptona de soja con extracto de levadura las colonias que resulten ser cepas
bien aisladas y puras, bacilos cortos Gram positivos no formadores de esporas, catalasa (+) y de
movilidad caracterstica para proseguir con la identificacin.
Hemlisis. (Seleccin de especies hemolticas de Listeria)
Secar bien la placa de hemlisis antes de sembrar. Dibujar una grilla en la parte de abajo de la
placa de forma que queden entre 20 y 25 espacios por placa. Sembrar por puncin los cultivos
seleccionados anteriormente, uno en cada espacio, identificndolos. Conservar los cultivos puros
en agar triptona de soja con extracto de levadura.
Simultneamente inocular controles positivos y negativos (L. monocytogenes, L. ivanovii, L.
innocua). Despus de 48 h de incubacin a 37C, examinar las placas. L. monocytogenes
presenta zonas delgadas y dbiles de aclaracin (-hemlisis); L. ivanovii generalmente forma
una zona ancha y claramente delineada de -hemlisis y L. innocua no debe formar zona de
aclaracin alrededor de la puncin. Utilizar una luz brillante para examinar la hemlisis de los
cultivos en estudio y de los controles.
Identificacin de L. monocytogenes. Diferenciacin de otras especies hemolticas
A partir de los cultivos puros en agar triptona de soja extracto de levadura que hayan demostrado
hemlisis caracterstica de L. monocytogenes, transferir a caldo triptona de soja con extracto de
levadura e incubar 24 h a 37C. Este ser el inculo a emplear para las siguientes
determinaciones:
1) Fermentacin de ramnosa y de xilosa
Sembrar tubos de caldo de fermentacin de ramnosa y de xilosa. Incubar 7 das a 37C (las
reacciones positivas, viraje del indicador por produccin de cido, suelen verse entre las 24 y las
48 h de incubacin)
2) Test de Camp
Se realiza sobre una placa de agar sangre. Se inocula en forma de fina estra un cultivo fresco de
Staphylococcus aureus (S) y otra lnea paralela de un cultivo fresco de Rhodococcus equi (R). Se
requiere un inculo delgado y parejo, que se puede sembrar con un ansa recta o de rulo formando
un ngulo recto con el agar. De la misma forma, se estran transversalmente y sin llegar a
atravesar las estras ya hechas, los cultivos en estudio y los controles de Listeria monocytogenes,
L. seeligeri, L. ivanovii (las tres hemolticas) y L. innocua (no hemoltica) (ver esquema).
Una reaccin Camp positiva se observa por aumento de la hemlisis en la zona cercana a S.
aureus o R. equi. De cualquier forma la apariencia del resultado positivo depende del cultivo.
Una reaccin positiva con R. equi se ve como una zona ancha (5 a 10 mm) de hemlisis con
forma de punta de flecha. Se deben tomar como negativas las reacciones que den zonas angostas
(alrededor de 1 mm) de dbil hemlisis en la interseccin con R. equi. Una reaccin positiva con
S. aureus se ve como una zona pequea y redondeada de incremento de hemlisis que se
26
extiende solamente unos 2 mm desde la cepa de ensayo y entre la zona de dbil hemlisis debida
al crecimiento de la estra de S. aureus.
L. monocytogenes
L. seeligeri
L. ivanovii
Camp Test
S. aureus
+
+
-
R. equi
+
Xilosa
Ramnosa
+
+
+
-
27
Medios recomendados
a) Agar Mac Conkey-sorbitol (SMAC). El medio contiene sorbitol como azcar
fermentescible e inhibidores de flora no entrica. Las colonias son sorbitol negativas y
aparecen plidas, comparadas con las rosadas brillantes que son sorbitol positivas.
Cuando la muestra contiene una carga alta de coliformes se puede enmascarar la
presencia de E. coli O157:H7. Incluso, Escherichia hermanii y otras enterobacterias
pueden presentar fenotipos similares en SMAC y, por otra parte, Citrobacter freundii
puede aglutinar con suero O157, y, causar un falso positivo.
b) Agar HC (agar para cepas hemorrgicas). El medio contiene sorbitol y reactivo
fluorognico MUG (4 metil, umbeliferil, -D-glucurnido).
c) Agar Mac Conkey sorbitol-BCIG. El medio contiene sorbitol y un compuesto -Dglucurnido cromognico.
d) Agar CT Mac Conkey sorbitol. El medio es similar al a), pero contiene agentes selectivos
(cefixime y telurito). Con el empleo de este medio se gana sensiblemente en selectividad,
inhibindose notablemente la flora acompaante. La colonia tpica es plida como en a).
e) Agar Rainbow O157: contiene sorbitol, novobiocina y telurito de potasio.
Se incuba a 24-26 h a 352C.
Se identifican las colonias caractersticas de E. coli O157:H7/NM y se les realiza el ensayo de
aglutinacin para O157 segn las indicaciones del proveedor del reactivo.
Se procede a la identificacin bioqumica para diferenciar E. coli O157 de organismos
competidores. Incluir TSI, celobiosa y medio de movilidad.
Reacciones caractersticas de Escherichia coli O157:H7
- TSI (amarillo/amarillo, H2S negativo)
- Fermentacin de sorbitol (negativo)
- Fermentacin de celobiosa (negativo)
- Caldo triptona (indol positivo)
- Medio RM-VP (RM: positivo; VP: negativo)
- Citrato de Simmons (negativo)
- Lisina decarboxilasa (positivo) *
- Ornitina decarboxilasa (positivo)*
- Medio decarboxilasa base (negativo)
- Medio movilidad (+/-)
Todos los medios se incuban a 35C. Los azcares deben leerse a las 24 horas.
*Los caldos decarboxilasa deben llevar un sello de vaselina. Los positivos son prpura (medio
bsico por decarboxilacin) y el negativo es amarillo (por acidificacin por fermentacin de la
glucosa del medio).
Confirmacin serolgica
Para confirmar la presencia de E. coli O157:H7/NM, analizar los cultivos con ensayos de
aglutinacin de ltex (RIM E. coli O157:H7 Ltex Test Kit, o equivalente), para probar los
antgenos O157 (somtico) y H7 (flagelar).
29
30
GUIAS DE ESTUDIO
GUIA DE ESTUDIO I
1. Cmo clasifica a los microorganismos de acuerdo a su temperatura ptima de crecimiento?
2. Cul es el pH ptimo de crecimiento para bacterias? y para mohos y levaduras?
3. Por qu no puede emplearse agua destilada para hacer una suspensin microbiana? qu
lquido empleara?
4. Qu es un medio qumicamente definido y en qu casos se lo emplea?
5. A qu se llama un medio de cultivo complejo? Cite tres ejemplos de medios complejos que
vaya a emplear para la deteccin de patgenos.
6. Qu caractersticas tienen los medios empleados para el cultivo de anaerobios? Qu es una
jarra de anaerobiosis y para qu se utiliza?
7. Defina medio de cultivo selectivo. Cite un ejemplo de medio selectivo que vaya a emplear en
la prctica de patgenos.
8. Defina medio de cultivo diferencial. Cite un ejemplo de medio diferencial que vaya a
emplear en la prctica de patgenos.
9. Defina medio de cultivo de enriquecimiento. Cite ejemplos de medios de enriquecimiento
que vaya a emplear en la prctica de patgenos.
10. Clasificacin e identificacin de microorganismos. Qu informacin brinda cada una de las
siguientes pruebas?
a) Observacin microscpica
b) Tincin de Gram
c) Pruebas bioqumicas
d) Serologa
11. Diagrame un esquema para el aislamiento e identificacin de microorganismos a partir de
una muestra de alimento, mencionando las etapas necesarias en la marcha.
12. Complete el siguiente cuadro comparativo de mtodos de recuento microbiano:
Ventajas
Recuento en placa/
siembra por vertido en
placa
Recuento en placa/
siembra en superficie
Recuento por filtracin
por membrana
Recuento por tcnica del
nmero ms probable
Recuento microscpico
directo
31
Desventajas
GUIA DE ESTUDIO II
1. Complete la siguiente tabla:
Microorganismo
Agar de
aislamiento
Baird Parker
S. aureus
110
Bismuto sulfito
Salmonella
Verde Brillante
XLD
SPS
Clostridium
perfringens
TSN
Agente
selectivo
Agente
diferencial
Colonia caracterstica
Reaccin caracterstica
Salmonella
Clostridium
perfringens
3. Complete el cuadro:
Reservorios y Alimentos
Microorganismo Caractersticas del Enfermedad
microorganismo
(ETA) asociada transmisin
asociados a brotes
S. aureus
Salmonella
Clostridium
perfringens
Clostridium
botulinum
Bacillus cereus
32
Listeria
monocytogenes
Escherichia coli
O157:H7
4. Considerando la investigacin de los microorganismos del punto 3 en un alimento, seale
para cules considera apropiado hacer una prueba de ausencia/presencia y para cules un
recuento. Justifique.
5. Esquematice una marcha de ausencia/presencia y una de recuento. Seale las diferencias
entre ellas.
6. Cundo considerara adecuado determinar la ausencia de S. aureus enterotoxignico en
alimentos?
a) Explique cmo procedera indicando medios de cultivo y reacciones tpicas de
identificacin.
b) En qu circunstancias se justifica la investigacin de enterotoxina en la muestra de
alimento? Justifique brevemente.
7. Esquematice una marcha para determinar la ausencia de Clostridium perfringens en un
alimento. Cite los medios de cultivo y las reacciones caractersticas esperadas para cada uno
de ellos. Justifique sus respuestas.
8. En la marcha de determinacin de Salmonella de una muestra de leche en polvo, un analista
aisl cuatro colonias caractersticas a partir de los medios slidos. En el cuadro siguiente se
adjuntan los resultados de las pruebas de identificacin que ensay sobre cada una de las
cuatro cepas aisladas:
Pruebas de
identificacin
Colonia
I
II
III
Coco bacilo
Gram -
Coco bacilo
Gram -
Oxidasa
TSI (Prof./sup.)
LIA (Prof./sup.)
Negativa
Negro/rojo
Negativa
Positiva
Amarillo/amarillo Amarillo/rojo
Utilizacin de urea
Negativo
Tincin de Gram
Violeta/violeta Amarillo/violeta
Negativo
Coco bacilo
Gram -
IV
Coco bacilo
Gram -
Negativa
Negro/rojo
Negro/pardo
Violeta/violeta
rojizo
Negativo
Positivo
33
C
208/160
40/48
3/12
3. En una muestra de helados se hace NMP (series de tres tubos) de coliformes totales a 30C,
coliformes a 45C y E. coli. Se observan los siguientes tubos positivos:
Determinacin
Coliformes totales
Coliformes fecales
E. coli
1/100
3
3
1
1/1000
3
2
0
1/10000
2
0
0
Categora
2
5
8
11
n
5
5
5
10
c
2
2
1
0
m
103
<3
102
0
M
105
10
104
34
UFC/g de
muestra
Clase de muestra
d) La empresa usa este polvo para fabricar postres. Mezcla el polvo con agua, lo cocina, lo
enfra, lo envasa y los vende refrigerados. Sabe que el valor promedio de aerobios totales
en este producto al final de su vida til es de 100/g. Qu puede comentar sobre un
producto que al final de la vida til presenta un recuento de 105/g?
e) Identificar en el plan de muestreo para el polvo para postres cules son los
microorganismos indicadores, y comentar sobre su significado. Identificar los
microorganismos patgenos.
5. Se recibe un lote de leche en polvo y es necesario saber si resulta aceptable segn la siguiente
norma.
Determinacin
Aerobios mesfilos
Coliformes totales
S. aureus
Salmonella
Categora
2
5
9
15
n
5
5
10
60
c
2
2
1
0
M (UFC/g)
50000
3
10
0
M (UFC/g)
500000
100
100
-
35
36
FUNDAMENTOS TERICOS
MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICOS
Finalidad de los planes de muestreo
Para que el trabajo en el laboratorio resulte eficaz es de primordial importancia recibir una
muestra adecuada y en buenas condiciones.
Si las muestras no son correctamente tomadas y tratadas, o no son representativas, los resultados
del anlisis pueden carecer de sentido. Siempre que se vayan a hacer deducciones o a juzgar la
aptitud de una partida importante de alimentos, por el resultado obtenido del anlisis de una
muestra reducida de los mismos, es esencial seguir un procedimiento de muestreo adecuado. La
toma de muestra es especialmente importante cuando se trata de investigar en un alimento la
presencia de grmenes patgenos cuyo nmero puede ser escaso y su distribucin irregular, o
cuando el destino de una partida de alimentos, depende de que cumplan o no las normas
microbiolgicas legales.
Muchas veces no es posible ensayar el nmero de muestras necesario para demostrar la ausencia
de microorganismos peligrosos en un lote comercial, con el nivel de probabilidad que se
considerara deseable. La eleccin de un procedimiento particular de muestreo y del criterio de
decisin constituye el llamado plan de muestreo.
La severidad de los planes de muestreo est basada en los riesgos para el consumidor, que
dependen fundamentalmente de los tipos de microorganismos presentes en el alimento y de su
nmero. As por ejemplo, existen microorganismos que simplemente deterioran al producto,
otros que indican la posibilidad de contaminacin con patgenos y algunos que causan
enfermedades severas. El grado de peligro se ve modificado por las condiciones a las cuales ser
expuesto el lote y por las condiciones de uso del alimento, que pueden disminuir, mantener
inalterado o aumentar el nmero de clulas presentes originalmente en el mismo.
Existen 15 casos diferentes de acuerdo al riesgo y a como se modifica el mismo por las
condiciones de uso.
Cmo se modifica el grado de riesgo
por las condiciones de uso
Riesgo
Disminuido
No se modifica
Incrementado
1) UTILIDAD
Ningn riesgo para la
salud
Caso 1
Caso 2
Caso 3
2) INDICADORES
Bajo riesgo indirecto
para la salud
Caso 4
Caso 5
Caso 6
37
3) RIESGO
MODERADO PARA
LA SALUD
Microorganismos que
no son rpidamente
diseminados
Caso 7
Caso 8
Caso 9
4) RIESGO
MODERADO PARA
LA SALUD
Microorganismos que
son rpidamente
diseminados
Caso 10
Caso 11
Caso 12
5) RIESGO SEVERO
PARA LA SALUD
Caso 13
Caso 14
Caso 15
38
1) Los planes de dos clases son aquellos que clasifican a las muestras analizadas como
aceptables o defectuosas. Estos planes estn definidos por tres nmeros: n, m, c.
Donde n es el nmero de muestras unidades que son analizadas, m es el valor que separa las
muestras aceptables de las defectuosas, y c da el nmero mximo de muestras subestndar
permitido (o sea las muestras que dan resultados insatisfactorios como ser la presencia de un
microorganismo o valores por encima de m).
m puede ser igual a cero o distinta de cero. Cuando m es igual a cero indica que el
microorganismo buscado estar ausente en la muestra analizada.
As por ejemplo un plan de dos clases definido por n=10, m=0, c=2 indicar que de cada diez
muestras del lote que se examinen, slo se permitir que 2 o menos den resultados positivos para
que el lote sea aceptado. Pero si tres o ms de las muestras dan resultado positivo (presentan el
microorganismo en cuestin), el lote ser rechazado.
2) Los planes de muestreo de tres clases, son aquellos que clasifican a las muestras analizadas
como: aceptables, marginalmente aceptables y defectuosas.
Estos planes quedan definidos por cuatro nmeros: n, m, M, c.
Donde n es el nmero de muestras analizadas, m es el valor que separa las muestras aceptables
de las marginalmente aceptables, M es el valor que separa las marginalmente aceptables de las
defectuosas y c es el nmero mximo de muestras para las cuales se acepta que den valores de
los recuentos entre m y M.
Un plan de tres clases con n=10, c=3, m=103/g, M=107/g, significa que de 10 muestras (tomadas
del lote) que son analizadas, slo tres o menos darn valores de los recuentos entre 103/g y 107/g
y ninguna dar recuentos mayores a 107/g, para que el lote sea aceptado. Mientras que el lote
ser rechazado si 4 o ms de las muestras analizadas dan recuentos entre m y M y/o una muestra
da valores mayores a M.
Los planes de muestreo de dos clases son ms severos y se aplican a los casos de riesgos que
involucran a microorganismos patgenos (Salmonella typhi, Shigella dysenteriae) cuya presencia
en el alimento es inadmisible.
Los planes de tres clases, en cambio, son menos severos y se aplican a situaciones en las que hay
riesgo de prdida de la utilidad del alimento, al recuento de microorganismos indicadores, y a
algunos microorganismos moderadamente riesgosos.
Definiciones
Lote:
Nmero de muestras producidas en un batch o en un perodo de tiempo especfico producidas y
manipuladas bajo condiciones uniformes, de manera que presenten la misma calidad. Un lote
comprende unidades de producto de un nico tipo, grado, clase, tamao y composicin. Puede
incluir un gran nmero de pequeos envases, cajas, barriles, o tambin un producto a granel, una
o ms cargas de furgn o de vagn.
Partida:
Una partida puede contener cierto nmero de lotes.
Muestra representativa:
Es aquella que se considera tpica de una poblacin, es decir que sus caractersticas son tan
similares como sea posible a las del lote del que precede.
39
Una manera de obtener una muestra representativa consiste en utilizar un muestreo al azar
mediante el uso de nmeros aleatorios. No hay garantas que la muestra elegida de esta forma
tenga caractersticas idnticas a las del lote, pero s aseguramos que la muestra fue elegida con
objetividad.
Primero, se deben numerar todas las unidades de un lote. Supongamos un lote de 1000 paquetes;
si las 1000 unidades del lote estn distribuidas en 10 filas por cantidades iguales, se asignaran
nmeros del 1 al 100 a las unidades de la primera fila, del 101 al 200 a la segunda, y as
sucesivamente. Para seleccionar los nmeros de muestras a analizar se utilizan tablas de nmeros
aleatorios, las cuales contienen una sucesin de nmeros correlativos al azar que deben elegirse a
partir de un punto que debe ser seleccionado tambin de forma azarosa.
Eleccin de un programa de muestreo
Fundamentalmente, segn el tipo de alimento, los microorganismos involucrados, su nmero y el
grado de peligro por la consumicin de los mismos en base a las condiciones de uso, quedan
determinadas las distintas pruebas a realizar y la rigurosidad de los planes de muestreo.
Pruebas a realizar:
a) Indice de utilidad: la alteracin debe ser considerada un riesgo para el alimento ms que
para el consumidor, por ello las pruebas de vida til, es decir, pruebas para organismos
indicadores de la vida comercial, tales como los recuentos de aerobios mesfilos, bacterias
psicrotrficas o grupos microbianos responsables de alteraciones relevantes como lipolticos o
proteolticos, tendrn los planes de muestreo ms indulgentes.
b) Anlisis de indicadores: las pruebas que determinan el nmero de microorganismos
indicadores revelan cmo ha sido el procesamiento, en qu forma se realiz el almacenamiento y
transporte de la partida. As, por ejemplo, los recuentos de Enterobacteriaceae o de coliformes
pueden proporcionar un indiio de la adecuacin de la higiene del proceso de elaboracin,
Escherichia coli es un microorganismo indicador de contaminacin fecal y de la posible
presencia de patgenos entricos, aunque no existe relacin directa por lo que la interpretacin
tampoco es definida. Debido a estas ambigedades, los anlisis de organismos indicadores slo
son de rigurosidad mediana. Sin embargo, puesto que ensayos positivos indican la posible
presencia de bacterias patgenas, se requieren programas de muestreo algo ms severos que los
utilizados para las pruebas de utilidad.
c) Peligrosidad moderada y grave: Cuando se buscan patgenos conocidos, son ms
apropiados planes de muestreo ms rigurosos, por lo que stos son ms exigentes a medida que
aumenta la gravedad del trastorno que causa el patgeno. En particular esta bsqueda se aplica
cuando se sabe que un determinado patgeno se encuentra con frecuencia en un alimento y es
capaz de producir enfermada, por ejemplo, C. perfringens en los platos preparados a base de
carne cocida, B. cereus en los alimentos desecados, Salmonella en las carnes de aves, etc.
Aquellos alimentos destinados a la bsqueda de patgenos caeran dentro de los casos de 7 a 15.
En la tabla 4 se describen con ms detalle estos microorganismos causantes de toxiinfecciones
alimentarias.
Es prcticamente imposible analizar todos los grupos microbianos en un determinado alimento,
se deben elegir los ms adecuados y para esta eleccin se deben tener en cuenta los siguientes
puntos fundamentales:
a) antecedentes de las enfermedades alimentarias transmitidas por el alimento.
b) condiciones probables de tratamiento y almacenamiento y posibilidad de alteracin posterior.
c) antigedad del lote.
40
Stomacher (dispositivo en base a paletas que agitan la muestra junto con el diluyente en bolsas
plsticas descartables). Es importante la normalizacin de este procedimiento inicial de
preparacin del homogenato, para obtener resultados comparables y reproducibles.
En el caso de los alimentos constituidos principalmente por grasas (p. ej. manteca, mayonesa,
cremas, etc.) el examen microbiolgico puede realizarse sobre el producto entero o empleando la
fase acuosa de los mismos (suero), que se obtiene fcilmente por fusin del alimento a 43C en
condiciones aspticas y posterior centrifugacin.
Normalmente se preparan diluciones decimales de la suspensin original de la muestra. La
naturaleza del diluyente utilizado tambin tiene importancia en la enumeracin o recuento de
microorganismos en el alimento. En algunos casos, p. ej. para ciertos microorganismos hay que
usar otros diluyentes especficos, tales como NaCl 3% para Vibrio parahaemolyticus (bacteria de
origen marino que requiere altas concentraciones salinas para su desarrollo). Si se analizan
alimentos grasos o con tendencia a formar grumos, se pueden emplear agentes tensioactivos tales
como Tergitol aninico 7 o Tween 80 (1%).
En sntesis las condiciones que debe presentar el diluyente son: impedir la aglutinacin de los
grmenes, no ser txicos, impedir la reproduccin de los microorganismos durante el tiempo de
exposicin y favorecer la reparacin de los microorganismos que pudieran encontrarse afectados
(estresados) por las condiciones del alimento o el tratamiento a que ste ha sido sometido
(desecacin, calor, etc.).
BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS TOTALES
El recuento de bacterias aerobias mesfilas (RAM) se utiliza como un indicador de la poblacin
microbiana de un alimento. Tambin se denomina recuento total en placa, recuento en placa de
aerobios, recuento en placa estndar (standard plate count, SPC) o recuento de mesfilos. Si bien
el mtodo presenta ciertas limitaciones, puede utilizarse para evaluar calidad sanitaria,
aceptabilidad organolptica, aplicacin de buenas prcticas de manufactura, etc. El recuento de
aerobios mesfilos aporta informacin acerca de las materias primas, condiciones del proceso,
condiciones de almacenamiento y manipulacin del alimento.
Para el recuento se utiliza como medio de cultivo el agar para recuento en placa (APC o SPC),
con una incubacin a 32C por 48 h, porque en estas condiciones crecen la mayora de las
bacterias aerobias contaminantes. La mayora de los alimentos se consideran no aptos para el
consumo cuando contienen un gran nmero de microorganismos, an cuando se sepa que stos
no son patgenos y que no han llegado a alterar marcadamente las caractersticas organolpticas
del alimento.
Existen varias razones que justifican este criterio:
1. Los recuentos altos de grmenes indican frecuentemente materias primas contaminadas,
limpieza y desinfeccin incorrectas, condiciones inadecuadas de tiempo-temperatura durante la
produccin o la conservacin de los alimentos.
2. Si existen recuentos altos de microorganismos mesfilos, las condiciones tambin fueron
favorables para el desarrollo de microorganismos patgenos, si es que existan y se encuentran,
por lo tanto, en gran nmero en el alimento.
3. Los recuentos altos indican de antemano que el producto va a alterarse muy pronto, ya que en
la mayora de los alimentos que contienen 106 a 108 mo/g la alteracin ya es evidente.
Es necesario advertir, sin embargo, que el recuento de la flora viable tiene en algunos casos un
valor limitado, por ejemplo:
a) En determinados alimentos, como los producidos por fermentacin o maduracin
(salchichas, quesos, etc.), es natural una gran multiplicacin de bacterias.
42
b) En los alimentos tratados por calor, los recuentos de grmenes viables pueden dar cifras muy
bajas, reflejando nicamente el grado de tratamiento trmico a que fueron sometidos. En estos
casos, el exmen microscpico directo nos dir si hubo o no una contaminacin intensa de la
materia prima.
c) Del mismo modo, entre los alimentos deshidratados y en los congelados, siempre se obtienen
recuentos de bacterias viables ms bajos. El recuento en placa no refleja la calidad bacteriolgica
de la materia prima, recurrindose tambin al exmen microscpico directo.
Es importante sealar que el mtodo de recuento en placa es el predilecto cuando las cifras de
grmenes no son demasiado elevadas (menor de 200.000) y pierde eficacia cuando se supera este
nmero.
Fuentes de error:
1. En el medio de cultivo no se distinguen las colonias formadas a partir de clulas individuales,
de las formadas a partir de cmulos de clulas.
2. Carencia de algunas bacterias de formar colonias, debido a la inadecuada composicin del
medio o desfavorable tensin de oxgeno o inadecuada temperatura de incubacin.
3. Errores en la medida de la toma de muestra y en el recuento de las colonias.
4. Incompleta esterilizacin o recontaminacin del material de vidrio, medio de cultivo o agua
de dilucin.
5. Presencia de sustancias inhibidoras en los diluyentes, en el material de vidrio, o en el mismo
alimento.
PROCEDIMIENTOS GENERALES PARA
BACTERIAS AEROBICAS TOTALES
EL
RECUENTO
EN
PLACA
DE
Los mtodos de recuento de colonias proveen una estimacin del nmero de microorganismos
viables en los alimentos de acuerdo al medio empleado, al tiempo y temperatura de incubacin.
Las clulas microbianas a menudo se encuentran formando cmulos o agrupadas en los
alimentos. Si bien la agitacin de las muestras y las sucesivas diluciones permiten lograr una
distribucin uniforme de dichos cmulos, no logran disgregarlos en su totalidad.
Consecuentemente, cada colonia que desarrolla en las placas de agar puede provenir tanto de una
clula aislada como de un cmulo, por lo tanto los recuentos obtenidos por este mtodo no se
reportarn como clulas viables/g o ml, sino como unidades formadoras de colonias/g o ml.
Se debe tener en cuenta que no todos los tipos de microorganismos crecern sobre un medio
simple agarizado incubado bajo determinadas condiciones, debido a requerimiento de nutrientes,
tensin de O2 desfavorable, temperaturas de incubacin inadecuadas, presencia de clulas
estresadas, entre otros factores. La presencia de sustancias inhibitorias presentes en el material de
vidrio o en los diluyentes, o producidas por microorganismos competitivos en el agar pueden
limitar el desarrollo de colonias.
Las condiciones y el medio ptimo para el mtodo de recuento en placa pueden variar de un
alimento a otro. Una vez que se seleccione el procedimiento ptimo, se pueden obtener
resultados precisos y reproducibles para el anlisis microbiolgico de rutina del alimento.
Reactivos y medios:
Para el recuento en placa de bacterias aerobias totales se deben usar medios no selectivos (agar
para recuento en placa, etc.).
43
44
d) Recuento de colonias:
Para trabajos de rutina usar un cuentacolonias equipado con iluminacin, magnificador y una
placa gua graduada en cm. Contar todas las colonias en las placas seleccionadas que contengan
el nmero apropiado de colonias. Este nmero es una funcin que depede del tamao de la
colonia, el tamao de la placa, y tamao de las propiedades diferenciales producidas en el medio
(p.e. halos de precipitacin). Tpicamente se obtienen resultados confiables contando entre 25 y
250 colonias por placa. Se informa el resultado del recuento con slo dos cifras significativas.
e) Clculo del error:
Los lmites de confianza del 95% pueden ser calculados de modo aproximado como 2s = 2x1/2,
donde x es el valor promedio del recuento de colonias en las placas. As en una placa con slo 16
colonias, el lmite de confianza del 95% ser aproximadamente el 50% (esto es que tendramos
una confianza del 95% de que el recuento est comprendido entre 8 y 24 colonias por placa).
Reglas para computar el nmero total de microorganismos viables/g o ml de muestra
Se deben utilizar las siguientes reglas para seleccionar las placas adecuadas para realizar el
recuento y calcular el nmero de UFC/g o ml de alimento.
1. Una placa con 25 a 250 colonias:
Contar todas las colonias, incluyendo las muy pequeas, a menos que se excluya por difusin
(DIF) o accidente de laboratorio (AL). Teniendo en cuenta la dilucin, informar el nmero de
UFC/g o ml de alimento.
Muestra
1
2
3
4
Recuento
(UFC/g o ml)
23.000 = 2,3.104
31.000 = 3,1.104
42.000 = 4,2.104
24.000 = 2,4.104
Muestra
5
6
Recuento
(UFC/g o ml)
19.000 = 1,9.104
28.000 = 2,8.104
45
275
280
30.000 = 3,0.104
24
35
Muestra
8
9
10
11
12
28
30
28
DIF
Relacin
1,4
2,3
1,2
Recuento
(UFC/g o ml)
29.000 = 2,9.104
14.000 = 1,4.104
25.000 = 2,5.104
2,1
14.000 = 1,4.104
1,4
24.000 = 2,4.104
Muestra
13
14
Recuento
(UFC/g o ml)
33.000 est. = 3,3.104 est.
28.000 est. = 2,8.104 est.
46
Muestra
15
16
Recuento
(UFC/g o ml)
1.800 est. = 1,8.103 est.
1.700 est. = 1,7.103 est.
Muestra
17
18
Recuento
(UFC/g o ml)
<100 est. = <102 est.
<100 est. = <102 est.
Muestra
1013
1006
Recuento
(UFC/g o ml)
840.000 est. = 8,4.105 est.
>5.600.000 est. = >5,6.106 est.
8. Difusin:
Existen tres tipos diferentes de difusin. La primera consiste en una cadena de colonias, no lo
suficientemente separadas, aparentemente causada por la desintegracin de un cmulo bacteriano
cuando el inculo fue dispersado en la placa. Si una o ms cadenas parecieran provenir de
diferentes orgenes, contar cada una como una colonia. No deben contarse colonias
individuales en dichas cadenas.
47
El segundo tipo de difusin consiste en el desarrollo microbiano en una pelcula de agua entre el
agar y la placa. El tercer tipo consiste en el crecimiento de microorganismos en una pelcula de
agua situada en los bordes de la placa o sobre el agar. Si se presentan estos tipos de difusin,
contar las colonias en las zonas de la placa libres de difusin, siempre y cuando la distribucin
de las colonias en esas reas sea homognea y la difusin no exceda el 50% del rea total de la
placa. Calcular el recuento estimativo multiplicando el promedio de colonias por cm2 por el rea
de la placa como en el punto 7. Cuando la difusin exceda el 50% de la placa, informar como
difusin (DIF) o accidente de laboratorio (AL).
NUMERO MAS PROBABLE
Principios bsicos
La tcnica del nmero ms probable (NMP) se basa en la obtencin de resultados positivos o
negativos en una o ms diluciones decimales de la muestra para estimar el nmero de
organismos presentes en la misma. El resultado se expresa como el nmero ms probable de
microorganismos por gramo o por mililitro o por 100 mililitros segn los casos.
El mtodo deriva de la aplicacin de la teora de probabilidad para la determinacin de
microorganismos en una muestra. Los valores de la tabla de NMP son calculados presuponiendo
que los microorganismos buscados estn homogneamente distribuidos en la muestra y en el
homogenato. En las muestras de alimentos, las grasas y las partculas insolubles impiden la
formacin de un buen homogenato. Por esta razn los NMP derivados de muestras de alimentos
son algo menos precisos y reproducibles que aquellos derivados de muestras de agua, donde la
homogeneidad es ms fcil de conseguir.
A diferencia del recuento en placa, el NMP no constituye una medida directa del recuento
bacteriano y sus resultados suelen ser ms variables que los del recuento en placa. Es adecuado
para estimar la poblacin de microorganismos especialmente en situaciones donde se encuentran
densidades extremadamente bajas, ya que posee mayor sensibilidad que el recuento en placa.
El mtodo del NMP est basado en la subdivisin de la muestra y por lo tanto puede ser
descripto como el mtodo de dilucin hasta extincin en mltiples tubos. Cuando se realizan
sucesivas diluciones seriadas de una muestra, las diluciones ms altas contendrn una cantidad
tan pequea de muestra original que podran no contener microorganismos. La informacin ms
satisfactoria se obtiene cuando todos los tubos con la mayor porcin de muestra (menor dilucin)
muestran crecimiento y los tubos con la menor porcin de muestra (mayor dilucin) no muestran
crecimiento.
La precisin de esta tcnica aumenta con el incremento del nmero de tubos usados por dilucin
(la tcnica ms comn emplea entre 3 y 5 tubos de una misma dilucin).
Deteccin de tubos positivos
a) Turbidez:
Cuando se analizan muestras que no opacan el medio de cultivo la aparicin de turbidez luego de
la incubacin indica crecimiento (tubo positivo). Cuando las muestras causan turbidez, deben
emplearse otros mtodos para determinar los tubos positivos.
b) Productos metablicos finales:
1. Deteccin de la produccin de gas: Los gases producidos por el desarrollo de
microorganismos pueden atraparse en viales invertidos (campanita de Durham) colocados en el
medio de crecimiento. Se evidencia una reaccin positiva cuando el gas que se acumula en la
punta de la campanita desplaza al menos 1/5 del lquido contenido en ella.
48
Casos
1/10
1/100
1/1000
1/10000
a
b
c
d
e
f
g
5/5
3/3
4/5
5/5
0/5
5/5
3/3
5/5
3/3
3/5
5/5
1/5
3/5
2/3
2/5
2/3
1/5
5/5
0/5
1/5
1/3
0/5
0/3
0/5
3/5
0/5
1/5
1/3
49
Combinacin
de tubos +
5-2-0
3-2-0
3-1-0
5-5-3
0-1-0
5-3-2
3-2-2
BACTERIAS PSICROTROFICAS
El trmino psicrotrficos se aplica a aquellos microorganismos que son capaces de crecer
relativamente rpido a temperaturas de refrigeracin, pero poseen una temperatura ptima de
crecimiento mayor, en el rango de la temperatura ptima para mesfilos.
Especies de Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, y otras bacterias Gram
negativas, como tambin Geotrichum, Botrytis, Mucor, Fusarium, Rhodotorula, entre los hongos
y levaduras, desarrollan en alimentos refrigerados.
La presencia de bacterias psicrotrficas es importante tambin en productos congelados tales
como pollos y pavos que son descongelados para ser comercializados como alimentos
refrigerados. Algunas especies microbianas pueden crecer lentamente a temperaturas tan bajas
como -5 a -12C, causando deterioro en alimentos almacenados por largos periodos a esas
temperaturas.
Cuando las bacterias psicrotrficas estn presentes en gran nmero en alimentos, pueden causar
la aparicin de sabores y aromas atpicos como tambin defectos fsicos debido a la accin de
enzimas lipolticas y proteolticas.
Mtodos generales
- Las bacterias psicrotrficas son usualmente enumeradas en medios no selectivos como el agar
para recuento (SPC) con una incubacin de las placas a temperaturas de refrigeracin, tal como
7C por 10 das cuando el recuento se realiza por el mtodo de vertido en placa. Otras
combinaciones de tiempo y temperatura utilizadas son: 7-8 das a 7C para recuento en placa en
superficie, y una combinacin de 16 h a 17C seguida de 3 das a 7C.
51
52
DIRECCIONES UTILES
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManua
lBAM/default.htm: Bacteriological Analytical Manual (BAM) on line
http://www.fsis.usda.gov/Science/Microbiological_Lab_Guidebook/index.asp: Food Safety and
Inspection Service, USDA (United States Department of Agriculture)
USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook, USDA, 3rd edition, 1998
http://www.minagri.gob.ar/site/index.php: Ministerio de Agricultura, Ganadera y Pesca
http://www.alimentosargentinos.gov.ar/: Alimentos Argentinos, Ministerio de Agricultura,
Ganadera y Pesca
http://www.senasa.gov.ar/indexhtml.php: SENASA, Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria.
53
ANEXO: NDICE
TABLAS
Caractersticas bioqumicas de Enterobacteriaceae
Gneros de Enterobacteriaceae con respecto a su origen fecal, reaccin en las pruebas de
coliformes y a su patogenicidad...
Clasificacin y caractersticas bioqumicas del gnero Clostridium...
Tablas referidas en Mtodos de muestreo para anlisis microbiolgicos
Tablas de NMP
57
58
59
60
64
MTODOS DE TINCIN
Tincin de Gram-Nicole.
Tincin negativa..
Demostracin de cpsulas bacterianas
Tincin de esporas bacterianas
Tincin de bacterias en leche..
Observacin de movilidad de bacterias..
67
68
68
69
69
69
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Solucin de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 1%............................................................
Solucin de tetraciclina...
Solucin de telurito de potasio (3,5 %)...
Reactivo de Kovacs.
Reactivo de Voges-Proskauer.
Reactivo para la prueba de reduccin de nitrato
Reactivo para determinar diacetilo en jugo de fruta
Reactivo para oxidasa..
Vaspar.
70
70
70
70
70
70
71
71
71
MEDIOS DE CULTIVO
Instrucciones generales para su preparacin...
Acetamida Agar...................................
Almidn Agar......................................
Azul de toluidina DNA Agar..............
Baird Parker Agar................................
Base sangre Agar.................................
Bilis Rojo Neutro Cristal Violeta (ABRV) Agar ...................
Bilis Rojo Neutro Cristal Violeta Glucosa Agar segn Mossel..
Bismuto Sulfito Agar (Wilson y Blair)...................
Buenos Aires Medio (BAM) ..................................
Casena Agar...
Casoy Caldo........................................................
Carne Cocida Medio Comercial..............................
Carne Cocida Medio................................................
Cerebro Corazn Agar................................................
Cerebro Corazn Caldo...........................................
Cetrimida Agar....................................
Citrato de Koser Caldo........................................
72
73
73
73
74
75
75
76
76
77
78
79
79
79
80
80
80
80
54
81
81
81
82
82
83
83
84
84
84
85
85
86
86
86
86
87
87
88
88
89
89
89
90
90
91
91
91
92
93
93
93
94
95
95
96
96
97
97
98
98
99
100
100
100
101
101
102
PE-2 Medio.........................................
Pseudomonas: F Agar y P Agar..........
Rappaport Caldo de Enriquecimiento segn Wauters
Rappaport Vassiliades Caldo..............
Recuento en placa (APC) Agar...
Salmonella-Shigella Agar...
Selenito Caldo.
Selenito Cistina Caldo.....
SIM Agar............................................
Suero de Naranja (OSA) Agar........................
Suero de Naranja (OSB) Caldo...........
Sulfito Hierro Agar......................................................
Sulfito Hierro Neomicina Agar...............................
Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS) Agar...
Termoacidurans (TAA) Agar..............
Tetrationato Caldo segn Mueller-Kauffmann...
Tioglicolato Caldo...............................
Triple Azcar Hierro (TSI) Agar............
Tributirina Agar..................................
Triptona Glucosa (GTA) Agar............
Triptona Glucosa (GTB) Caldo...........
Triptona Sulfito Clicloserina (TSC) Agar...
Triptona Sulfito Neomicina (TSN) Agar
Urea Caldo..........................................
UVM Caldo........................................
Verde Brillante 2% Sales Biliares (BRILA) Caldo
Verde Brillante Rojo Fenol Lactosa Sacarosa (BPLS) Agar......
Verde Brillante Rojo Fenol Lactosa Sacarosa (BPLS) Agar modificado...
Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) Agar
YGC Agar..............................................
56
102
103
103
104
104
104
105
105
106
106
107
107
107
107
108
108
109
109
111
111
111
112
112
112
113
113
113
114
115
115
57
+
+
+/-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+/-
+
-
lactosa
+
d
+
d
-
sacarosa
E. coli
Shigella
flexneri
Salmonella
P. vulgaris
P. mirabilis
Enterobacter
cloacae
Serratia
marcescens
Klebsiella
pneumoniae
Yersinia
enterocolitica
Morganella
morganii
Citrobacter
freundii
gas
glucosa
Tabla 1. Enterobacteriaceae
+/-
+/-
+
+
+
-
+
+
rojo de
metilo
+**
+/+
Voges
Proskauer
+/-
+/d
+/+
citrato
+/-
+
-
+
-/+
indol
+***
+
+
+
+
+
-
mov.
+/-
+
+
+
-
SH2
+*
+
+/+/-
ureasa
+
-
d
-
LDC
TABLAS
Arizona
Citrobacter
Edwardsiella
Enterobacter
Erwinia
Escherichia
Hafnia
Klebsiella
Proteus
Providencia
Salmonella
Serratia
Shigella
Yersinia
Predominantemente
de origen fecal (F), de
origen no fecal (-), o
de ambos orgenes (a)
F
(-)
F
(-)
(-)
F
a
a
a
(-)
F
(-)
F
F
V
+
(-)
+
(-)
+
(-)
+
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
58
Patogenicidad:
P = la mayora de las cepas patgenas
por va digestiva para el hombre
p = pocas especies entero-patgenas
(-) = casi ninguna especie
enteropatgena
P
(-)
P (p)
(-)
(-)
p
(-)
p
p
p
P
(-)
P
P (p)
59
b - hidroliza la gelatina
b - hidroliza la gelatina
Grupo IV
C. putrificum
C. tetani
y otros
C. thermosaccharoliticum
y otros
+
+
+
+
+
+
+
Coagula
digiere
+
+
+
+
d
Sin
cambio
C. pasteurianum
+
Sin
cambio
C. propionicum
+
+
+
+
+
+
+
+
Acidez sin
cambio
C. paraperfringens
d
+
+
+
Acidez sin
cambio
C. tyrobutiricum
-
Produccin de H2S
Casena
Lecitinasa
Lipasa
Movilidad
Almidn
Glucosa
Manosa
Maltosa
Lactosa
Salicina
Leche
Reduccin de NO3
+
+
+
+
+
+
+
v
fermentacin
tumultuosa
C. perfringens
d
+
+
+
+
+
v
d
digiere
C. sporogenes
+
+
+
+
v
v
digiere
v
+
+
+
+
v
coagula
no digiere
+
+
digiere
lentamente
Tipo G
-
Produccin de H2S
Movilidad
Lecitinasa
Almidn
Glucosa
Manosa
Maltosa
Lactosa
Salicina
Leche
C. butyricum
d
Grupo V
C. brevifasciens
C. thermocellum
y otros
FUENTE:
Bergeys Manual of Determinative
Bacteriology. 8 Edicin. 1974
REFERENCIAS:
(+) positivo
(-) negativo
(d) difiere segn las cepas
(v) variable dentro de una cepa
C. sporogenes
C. botulinum
C. perfringens
y otros
B - Espora terminal
C. butyricum
C. pasteurianum a - no hidroliza la gelatina Grupo III
C. propiionicum
y otros
Reduccin de NO3
Grupo II
A - Espora subterminal
Tabla 4
Distribucin
Vehculosb
Clostridium botulinum
(Botulismo)
Muy extendido
Alimentos (enlatados o
curados) elaborados
defectuosamente; productos
crnicos; pescado crudo y
ahumado
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi y
S. choleraesuis
(Fiebres tficas y
paratficas)
Endmica en muchas
partes del mundo;
ocasionalmente
epidmica
Mundial
Shigella dysenteriae Ic
(Shigae)
(Shigelosis, disentera de
Shiga)
Espordica o epidmica
Amrica Central;
Agua, verduras y ensaladas
Mjico, Africa del Norte
y Central, Japn y
Sureste asitico
Vibrio comma
(Clera)
Espordica, endmica y
epidmica
ocasionalmente
Brucella melitensis
(Brucelosis)
Clostridium perfringens
tipo C
(Enteritis necrtica)
Rara
Espordica en Europa,
Nueva Guinea
Carnes cocidas
Virus de la hepatitis
infecciosad
Frecuente
Mundial
Microorganismo
I MUY PELIGROSOS
Alta mortalidad; se
diagnostica con frecuencia
errneamente
Tabla 4 (continuacin)
Frecuencia
Distribucin
Vehculosb
Frecuente, endmica en
ciertas reas
Mundial
Vibrio parahaemolyticus
Frecuente en Japn; en
todo el mundo est
aumentando la incidencia
Lejano Oriente.
Probablemente muy
extendido
El peligro es ms grave
cuando procede de pescado
crudo o inadecuadamente
cocido
Escherichia coli
(Enteropatgeno)
Est aumentando en
diversas reas
Estreptococos
-hemolticos
Enfermedad alimentaria
poco frecuente
Muy extendido
60
Tabla 4 (continuacin)
Frecuencia
Distribucin
Vehculosb
Productos reconstituidos
derivados de los cereales;
leche; pudn y natilla; arroz
Brucella abortus
Espordica en varias
partes del mundo
Muy extendido
Clostridium perfringens
Frecuente
Extendido
probablemente por todo
el mundo
Carnes cocidas
Staphylococcus
(enterotoxignico)
(intoxicacin
estafiloccica)
Frecuente
Mundial
a
b
c
d
e
Consltese la obra de Bryan (1971) para mayor informacin sobre las enfermedades alimentarias
Vanse las Conclusiones de la Comisin Mixta FAO/WHO (1970) para mayor informacin sobre las enfermedades transmitidas por la leche
Shigella dysenteriae causa, a veces, una enfermedad leve
El virus an no se ha aislado a partir de alimentos
Vanse las Conclusiones de la pg. 40 para la explicacin de difusin limitada y extensa
Tabla 5
Programas de muestreo recomendados para combinaciones de diferentes grados de peligrosidad para la salud y diversas
condiciones de manipulacin (es decir, las 15 categoras)
Grado de importancia en
relacin con la alteracin y
el peligro para la salud
Condiciones en que se espera el alimento sea manipulado y consumido despus del muestreoa
Condiciones que reducen el
grado de peligrosidad
Sin modificacin
Categora 2
3-clases n = 5, c = 2
Peligrosidad reducida
Categora 4
3-clases n = 5, c = 3
Sin modificacin
Categora 5
3-clases n = 5, c = 2
Peligrosidad aumentada
Categora 6
3-clases n = 5, c = 1
Categora 7
3-clases n = 5, c = 2
Categora 8
3-clases n = 5, c = 1
Categora 9
3-clases n = 10, c = 1
Categora 10
2-clases n = 5, c = 0
Categora 11
2-clases n = 10, c = 0
Categora 12
2-clases n = 20, c = 0
Grave, directo
Categora 13
2-clases n = 15, c = 0
Categora 14
2-clases n = 30, c = 0
Categora 15
2-clases n = 60, c = 0
a
b
Deben emplearse programas de muestreo ms rigurosos para alimentos delicados destinados a poblaciones especialmente sensibles.
Vase Conclusiones, pg. 40 para la explicacin de difusin extensa y limitada
61
Tabla 6
Interrelacin entre las categoras (grado de importancia)a y el tipo de alimento, pruebas microbiolgicas y condiciones de
tratamiento del alimento (se ofrecen ejemplos de diversos tipos de alimentos)
Tipo de problema
Alteracin y vida til
Influencia de las
condiciones
Categora
Peligrosidad
reducida
Producto alimenticio
Pescado fresco congelado
Huevos congelados
Pruebas
microbiolgicas
SPC
Alimentos preparados
SPC
congelados
Alim. desecados en polvo
SPC
(leche, alim. para emergenc.)
Sin modificacin
en la peligrosidad
Peligrosidad
aumentada
SPC
Mohos, levaduras
SPC
SPC
SPC
Mohos
SPC
Peligrosidad
reducida
Sin modificacin
en la peligrosidad
Termfilos
SPC
Coliformes fecales
Estafilococosb
Se sometern a coccin
Verduras escaldadas y
congeladas
Queso
Alimentos desecados
SPC
Coliformes
Colif. fecales
Coliformes
Se sometern a coccin
Coliformes
Estafilococosb
Coliformes
Verduras frescas o
refrigeradas
Pescado ahumado Refrig.
Carne de cangrejo de mar
preparada a mano y
sometida a coccin
Leche en polvoc
Verduras congeladas
Peligrosidad
aumentada
Gambas cocidas
congeladas
Platos precocinados
congelados
Marisco fresco o
congelado
Leche en polvo, alimentos
para emergencias
Alimentos congelados en
general
62
Colif. fecales
Coliformes
Estafilococosb
SPC
Coliformes
SPC
Coliformes
Coliformes
Estafilococosb
SPC
Coliformes
Coliformes
SPC
Coliformes
Estafilococosb
SPC
Coliformes
Tabla 6 (Continuacin)
Tipo de problema
Peligro directo para la
salud pero moderado
(difusin limitada)
Influencia de las
condiciones
Categora
Peligrosidad
reducida
Sin modificacin
en la peligrosidad
Peligrosidad
aumentada
Peligrosidad
reducida
10
Pruebas
microbiolgicas
Estafilococosb
Platos cocinados y
congelados
Estafilococosb
Ensaladas de verduras
refrigeradas o congeladas
Pescado ahumado
refrigerado
Alimentos desecados,
leche en polvo
Helados
Queso fabricado con leche
pasteurizada
Postres congelados
Salmonella
Se consumirn crudas
Producto alimenticio
Estafilococosb
Estafilococosb
Salmonella
Carne cocida
C. perfringens
No se refrigerar inmediatamente
Alimentos amilceos
cocidos, mayonesa
Queso
Leche en polvo, alimentos
para emergencias
B. cereus
Peligrosidad
aumentada
Peligro directo y
grave para la salud
Peligrosidad
reducida
Sin modificacin
en la peligrosidad
Peligrosidad
aumentada
11
12
13
14
15
Estafilococos
Estafilococos
Estafilococosb
Carne cruda
Salmonella
Se someter a coccin
Verduras frescas
Salmonella
Shigella
Salmonella
Se sometern a coccin
Estafilococosb
Se sometern a coccin
Pescado fresco y
congelado
Pescado de agua dulce
procedente de zonas
clidas
Marisco cocido y
congelado
Carne cruda
Salmonella
Salmonella
Se sometern a refrigeracin
Pescado fresco y
congelado
Carnes perecederas
C. botulinum
Refrigeracin
Salmonella
Verduras crudas
V. comma
Sh. dysenteriae I
Marisco
S. typhi
Enterotoxina
estafiloccica
Pescado ahumado
C. botulinum E
C. botulinum B
C. botulinum A y B
63
64
3
3
3
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
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1.400
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300
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130
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34
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300
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120
170
230
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110
63
97
140
Tabla I. - Nmero ms probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no ms de tres diluciones
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700
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270
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13
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210
370
72
110
89
140
200
23
38
62
92
42
..
..
..
..
..
20
21
27
28
36
16
20
9,1
14
15
3,0
3,6
7,3
11
15
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
530
920
1.600
..
..
260
330
420
190
320
70
110
85
130
190
23
37
60
90
41
..
..
..
..
..
20
21
27
28
36
16
20
9,1
14
15
3,0
3,5
7,3
11
15
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
140
..
..
..
69
..
..
21
..
..
..
37
35
..
..
..
..
..
20
..
27
..
15
..
8,9
..
14
3,0
3,5
7,2
11
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
370
..
..
..
130
190
59
..
67
100
..
21
34
..
..
36
35
43
..
..
..
20
20
26
27
34
15
19
8,8
14
14
3,0
3,5
7,1
11
15
..
..
..
..
..
710
..
..
..
..
250
..
..
..
300
..
..
..
130
180
57
85
65
100
140
21
33
51
..
36
35
43
..
..
..
19
20
26
27
34
15
19
8,8
14
14
3,0
3,5
7,1
11
15
..
..
..
..
..
470
1.100
..
..
..
230
300
..
..
270
170
..
..
120
170
56
83
63
97
140
21
33
50
73
35
35
42
..
..
..
19
20
26
27
34
15
19
8,7
14
14
3,0
3,4
7,1
11
15
..
..
..
..
..
390
700
1.400
..
..
220
280
360
..
240
170
210
..
110
160
54
81
61
94
130
21
32
49
71
35
34
42
..
..
..
19
20
26
27
33
15
19
8,7
14
14
3,0
3,4
7,1
11
15
..
..
..
..
..
330
540
920
1.600
..
210
270
340
420
220
160
210
240
110
160
53
78
59
91
130
20
32
48
69
34
34
42
..
..
..
19
20
26
26
33
15
19
8,7
13
14
2,9
3,4
7,0
11
15
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
160
..
..
..
92
....
..
..
51
..
..
19
..
..
..
32
33
..
42
..
..
..
19
..
26
..
15
..
8,5
..
13
2,9
3,4
6,9
11
..
Tabla II. - Nmero ms probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no ms de tres diluciones
390
..
..
..
..
210
..
..
..
..
..
..
..
..
150
..
..
..
89
120
47
..
50
77
..
19
29
..
..
31
33
40
41
49
..
19
19
25
25
32
15
18
8,5
13
13
2,9
3,4
6,9
11
14
330
720
..
..
..
200
260
..
..
..
160
..
..
..
150
..
..
..
86
120
46
67
49
75
100
19
29
43
..
31
33
40
41
49
57
18
19
25
25
32
15
18
8,4
13
13
2,9
3,3
6,9
11
14
290
480
1.100
..
..
190
240
310
..
..
150
190
..
..
140
130
..
..
83
120
46
65
48
73
99
19
29
42
59
30
32
39
41
48
56
18
19
24
25
31
15
18
8,4
13
13
2,9
3,3
6,8
11
14
260
400
700
1.400
..
180
230
290
370
..
150
180
220
..
140
130
150
..
81
110
45
64
47
71
97
19
29
41
58
30
32
39
40
48
56
18
19
24
25
31
14
18
8,3
13
13
2,9
3,3
6,8
11
14
240
350
540
920
1.600
170
220
280
350
430
140
180
210
250
130
120
150
180
79
110
44
63
46
69
94
19
28
40
57
30
32
39
40
48
56
18
19
24
25
31
14
18
8,3
13
13
2,9
3,3
6,8
10
14
MPN index and 95% confidence limits for various combinations of positive results when various
numbers of tubes are used. (Inocula of 0.1, 0.01, and 0.001g)
95% Confidence
limits
95% Confidence
limits
Lower
Upper
MPN index
per g
Lower
Upper
0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3
<0.5
<0.5
<0.5
<0.5
1
1
3
3
1
3
3
7
4
10
4
7
15
7
14
30
15
30
35
36
71
150
>150
<9
9
13
20
21
23
36
36
36
37
44
89
47
150
120
130
380
210
230
380
380
440
470
1,300
2,400
4,800
>4,800
<2
2
2
4
2
4
4
6
6
5
7
7
9
9
12
8
11
11
14
14
17
-
<0.5
<0.5
<0.5
<0.5
<0.5
<0.5
<0.5
<0.5
<0.5
<0.5
1
1
2
2
3
1
2
2
4
4
5
-
<7
7
7
11
7
11
11
15
15
13
17
17
21
21
28
19
25
25
34
34
46
-
<3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1,100
>1,100
66
METODOS DE TINCION
TINCION DE GRAM-NICOLE
-Primer colorante: Violeta de Genciana
Solucin A:
Violeta de Genciana ..................................... 1,0 g
Alcohol etlico ............................................ 10,0 ml
Solucin B:
Fenol ............................................................. 1,0 g
Agua destilada .......................................... 100,0 ml
Se mezclan las soluciones A y B
-Mordiente: Solucin de Lugol
Yodo ............................................................. 1,0 g
Yoduro de Potasio ........................................ 2,0 g
Agua destilada .......................................... 300,0 ml
Se disuelve primero el yoduro en poca agua, se agrega luego el yodo y una vez disuelto se agrega
el resto del agua.
-Segundo colorante (de contraste): Fucsina Bsica
Fucsina Bsica .............................................. 0,1 g
Agua destilada .......................................... 100,0 ml
Mtodo:
1- Extender y fijar el material sobre un portaobjetos limpio, desengrasado y seco.
2- Cubrir el preparado durante un minuto con el primer colorante, volcar el colorante y lavar
con agua corriente.
3- Cubrir el preparado con el mordiente, dejarlo actuar por un minuto y volcar el exceso.
4- Decolorar con alcohol durante 10 segundos y lavar con agua.
5- Colorear durante 30 segundos con el segundo colorante, lavar con agua y secar.
6- Examinar al microscopio usando objetivo de inmersin.
67
TINCION NEGATIVA
Es un mtodo muy sencillo y eficaz para poner de manifiesto la forma externa de las bacterias en
una extensin. Las bacterias quedan rodeadas de una fina capa de colorante negro y aparecen
como objetos blancos sobre fondo gris.
Mtodo:
1- Se prepara una extensin muy fina de la forma habitual utilizando un portaobjetos limpio,
desengrasado y seco.
2- Se coloca en un extremo del portaobjetos una gota de solucin de nigrosina al 10%.
3- Se toma otro portaobjetos y se apoya sobre el primero formando un ngulo de 30 y tocando
la gota de nigrosina. Luego se pasa resbalando, arrastrando la gota de nigrosina, de forma que se
extienda por toda la superficie del portaobjetos. De esta manera, la extensin queda cubierta de
una fina pelcula de colorante.
4- Se deja secar el colorante y se examina la preparacin con objetivo de inmersin.
68
69
SOLUCIONES Y REACTIVOS
SOLUCION DE CLORURO DE TRIFENILTETRAZOLIO (TTC) AL 1%
Esterilizar 3 ml de agua destilada. Una vez fra, agregarle 30 mg de TTC. Disolver y guardar en
heladera.
REACTIVO DE KOVACS
Se disuelven, en bao mara, 5 g de p-dimetilaminobenzaldehdo en 75 ml de alcohol amlico.
Luego aadir lentamente y bajo campana 25 ml de HCl concentrado. Guardar en frasco oscuro y
en heladera.
REACTIVO DE VOGES-PROSKAUER
a) Solucin de KOH al 40 %
Se disuelven 40 g de KOH en 100 ml de agua destilada.
b) Solucin de -naftol al 5 %
Se disuelven 5 g de -naftol en 100 ml de alcohol etlico.
Ambos reactivos deben guardarse en frasco oscuro y en la heladera.
71
MEDIOS DE CULTIVO
Instrucciones generales para su preparacin
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Estas condiciones pueden variar para
algunos medios de cultivo. Cuando as suceda, se aclarar inmediatamente debajo de la
composicin.
72
ACETAMIDA AGAR
Acetamida
.............................................. 2,0 g
Sulfato magnsico .................................... 0,158 g
Cloruro sdico ............................................. 0,2 g
Sulfato ferroso ....................................... 0,0005 g
Fosfato dipotsico ....................................... 0,2 g
Molibdato sdico ..................................... 0,005 g
Rojo fenol
......................................... 0,012 g
Agar-agar
. ....... 15,0 g
Agua destilada ............................................. 1,0 l
Disolver los ingredientes en el agua destilada a temperatura ambiente. Comprobar el pH y en
caso de ser necesario ajustarlo. Esterilizar en autoclave.
Este medio contiene adems de algunas sales inorgnicas, acetamida como nica fuente de
carbono y nitrgeno. En l solo pueden crecer microorganismos que puedan aprovechar la
acetamida. Muchos de ellos, lo hacen formando amoniaco, lo que puede utilizarse como
caracterstica taxonmica, por ejemplo, para la diferenciacin de las especies de Pseudomonas.
ALMIDON AGAR
Extracto de carne .......................................... 3,0 g
Peptona ......................................................... 5,0 g
Almidn soluble ........................................... 2,0 g
Agar-agar .................................................... 15,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
Disolver los ingredientes en el agua destilada, llevar a ebullicin agitando regularmente, calentar
3-4 minutos hasta disolucin. Enfriar a 50-60C. Esterilizar en autoclave.
Este medio se utiliza para identificar microorganismos que degradan el almidn.
La hidrlisis del almidn se evidencia cubriendo la placa con una solucin de Lugol (I2-KI). Se
forma un complejo color azul con el almidn, ausente en las zonas donde hubo hidrlisis. Si las
colonias son almidn positivas, aparece un halo transparente alrededor de las mismas.
73
76
Microorganismo
Salmonella
Shigella
Proteus rettgeri
Proteus mirabilis
Proteus morganii
Proteus vulgaris
Enterobacter
Escherichia
Klebsiella (x)
Klebsiella pneumoniae
movilidad
+ (-)
+
+
+
+
+
+ (-)
-
indol
- (+)
+
+
+
+
-
H2S
+ (-)
+
+
+
-
gas
+
+
+
CASEINA AGAR
Peptona de carne........................................... 5,0 g
Extracto de carne .......................................... 3,0 g
NaCl ............................................................. 5,0 g
Casena ......................................................... 2,5 g
CaCl2 ............................................................ 0,05 g
Agar-agar .................................................... 13,5 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
Suspender los ingredientes, calentar a bao mara hasta disolucin y mantener 10 minutos.
Esterilizar en autoclave, fraccionar en placas.
pH = 7,2
Se pueden agregar 5-10 g de leche descremada para reforzar turbidez.
Este medio se utiliza para la investigacin de microorganismos proteolticos. Estos son capaces
de degradar la casena, y aparecen con un halo transparente alrededor de las colonias. Si el halo
78
no es muy visible, agregar cido actico 1N, que refuerza la opacidad del medio por
desnaturalizacin de la casena, y se destaca el halo de degradacin.
CASOY CALDO
Peptona de casena ..................................... 17,0 g
Peptona de harina de soja ............................. 3,0 g
D(+) glucosa ................................................. 2,5 g
NaCl ............................................................. 5,0 g
K2HPO4 ..................................................................................... 2,5 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
pH 7,3 0,1
Este es un medio de cultivo universal, exento de sustancias inhibidoras, concebido para un
amplio espectro de aplicaciones. Por su rica y abundante base nutritiva, este medio se utiliza para
el cultivo de microorganismos exigentes.
79
CETRIMIDA AGAR
Peptona de casena ..................................... 20,0 g
MgCl2 ........................................................... 1,4 g
K2SO4 ......................................................... 10,0 g
Bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio . 0,3 g
Agar-agar .................................................... 13,6 g
Glicerol ....................................................... 10,0 ml
Agua destilada .............................................. 1,0 l
pH = 7,2
Este medio se utiliza para aislamiento e identificacin de Pseudomonas aeruginosa, a partir de
diversos materiales. La cetrimida es un potente inhibidor de la flora acompaante. Las colonias
de P. aeruginosa forman en este medio un pigmento verde azulado (piocianina), y son
fluorescentes a la luz U.V.
81
ENDO AGAR
Peptona ......................................................... 10,0 g
Hidrogenofosfato dipotsico .......................... 2,5 g
Sulfito sdico (anh.) ....................................... 3,3 g
Pararrosanilina (Fucsina)................................ 0,3 g
Agar .............................................................. 12,5 g
Agua destilada .................................................... 1 l
pH = 7,4
Este es un medio selectivo que se utiliza para el aislamiento de E. coli fecal y coliformes en
diversos materiales. El sulfito sdico y la fucsina inhiben las bacterias Gram positivas. E. coli y
coliformes consumen lactosa formando aldehdo y cido. Por otra parte, el aldehdo libera
fucsina a partir de la combinacin fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloracin roja de las
colonias. En el caso de E. coli, esta reaccin es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar dando
a las colonias un brillo metlico estable, de reflejo verde tpico.
FRASER CALDO
Peptona Proteosa .......................................... 5,0 g
Peptona de caseina ....................................... 5,0 g
Extracto de levadura ..................................... 5,0 g
87
GLUCOSA CALDO
Peptona de casena ..................................... 10,0 g
Extracto de carne .......................................... 3,0 g
NaCl ............................................................. 5,0 g
88
Neopeptona................................................... 1,3 g
Triptona ........................................................ 1,3 g
Dextrosa ....................................................... 5,0 g
Almidn soluble ......................................... 10,0 g
Casena isoelctrica ...................................... 2,0 g
NaCl ............................................................. 5,0 g
NaNO3 .......................................................... 2,0 g
Gelatina ...................................................... 20,0 g
Agar-agar .................................................... 15,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
pH = 7,3
Prehidratar y disolver los ingredientes, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave.
Este medio se utiliza para el aislamiento y cultivo de organismos anaerobios, favoreciendo su
esporulacin.
90
KF STREPTOCOCCUS AGAR
Proteosa peptona ........................................ 10,0 g
Extracto de levadura ................................... 10,0 g
NaCl ............................................................. 5,0 g
Glicerolfosfato de sodio ............................. 10,0 g
Maltosa ....................................................... 20,0 g
Lactosa ......................................................... 1,0 g
Azida sdica ................................................. 0,4 g
Prpura de bromocresol ........................... 0,015 g
91
KG AGAR
Peptona ......................................................... 1,0 g
Extracto de levadura ..................................... 0,5 g
Rojo fenol ................................................. 0,025 g
Agar-agar .................................................... 18,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
Disolver los ingredientes en agua, ajustar el pH a 6,8. Esterilizar en autoclave. Enfriar a 50C y
agregar 100 ml de suspensin yema de huevo y 1 ml de solucin de sulfato de polimixina B (10
mg/ml) estril. Distribuir en placas. Este medio se utiliza para el aislamiento y la identificacin
de B. cereus en alimentos. El Rojo fenol y la Polimixina B inhiben buena parte de la flora
acompaante. El medio promueve la esporulacin de Bacillus, lo que permite la confirmacin
directa de las colonias lecitinasa positivas, como las del grupo I de Bacillus, y B. cereus en
particular. Ciertas colonias de Bacillus del grupo II lecitinasa positivas, que sern B. cereus
presuntivas en MYP, no dan la reaccin en este medio relativamente pobre en nutrientes.
92
LACTOSA CALDO
Peptona de gelatina....................................... 5,0 g
Extracto de carne .......................................... 3,0 g
Lactosa ......................................................... 5,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
El medio se utiliza para ensayos orientativos de bacterias coliformes, especialmente E. coli; no
contiene sustancias inhibidoras.
La utilizacin de la lactosa se demuestra por produccin de gas, que se recoge en campanitas de
Durham. El medio se utiliza tambin como caldo de enriquecimiento no selectivo para
Salmonellas. En presencia de una flora mixta, la fermentacin de lactosa provoca una
disminucin del pH, con lo que se inhibe la flora competitiva, especialmente coliformes. El
crecimiento de Salmonellas no se ve afectado por el descenso de pH; esto permite su
recuperacin sin prdidas al cabo de hasta una semana.
Incubacin: 24 horas a 37C.
Este medio se utiliza para el crecimiento selectivo de levaduras a partir de alimentos. El pH bajo
favorece el crecimiento de levaduras inhibiendo el crecimiento bacteriano.
Produccin de H2S
Arizona
Salmonella *
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Morganella morganii
Providencia
Citrobacter
Escherichia coli
Shigella
Klebsiella
Yersinia
+
+
+
+
+
-
94
LECHE AGAR
Peptona ......................................................... 5,0 g
Extracto de levadura ..................................... 3,0 g
Leche en polvo descremada ......................... 1,0 g
Agar-agar .................................................... 12,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
pH = 7,20,2
Esterilizar por tindalizacin 30 minutos. Este medio se utiliza para la demostracin de la
hidrlisis de la casena por microorganismos aerobios. El medio es blanquecino opaco. La
protelisis se evidencia por halos claros transparentes alrededor de las colonias (debidos a la
degradacin de la casena).
LECHE TORNASOLADA
Leche descremada en polvo ..................... 100,0 g
Clorhidrato de cistena ................................. 0,3 g
Agar-agar ...................................................... 0,5 g
Tornasol (Litmus) ....................................... 0,75 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
Disolver la leche en el agua tibia, agregar los otros ingredientes y calentar a bao mara.
Fraccionar en tubos con tapa de rosca. Esterilizar por tindalizacin (30 minutos a 100C, tres
das consecutivos).
pH = 6,8
Este medio se utiliza para determinar varias funciones metablicas:
Fermentacin de lactosa. La leche tornasolada presenta un color purpreo a pH = 6,8. Si el
microorganismo fermenta la lactosa con produccin de cido lctico, el descenso de pH hace
virar el indicador a color rojo rosado. Si la bacteria no fermenta la lactosa, y por su metabolismo
se alcaliniza el medio, el indicador vira de prpura a prpura azulado.
Formacin y digestin del cogulo (peptonizacin). La coagulacin puede deberse a la
precipitacin de la casena por la formacin de cidos, o por la conversin de la casena en paracasena por la enzima renina. En el primer caso, el cogulo es firme y gelatinoso, no se separa de
las paredes del tubo y se disuelve en medio alcalino. En el segundo caso, el cogulo es blando, se
separa de las paredes del tubo dando un lquido grisceo (suero). La peptonizacin o digestin
del cogulo se produce si la bacteria posee la enzima caseasa.
Formacin de gases. Se generan como producto final de la degradacin de la lactosa. Se
produce una fermentacin turbulenta que puede llegar a descomponer el cogulo cido
(Clostridium perfringens).
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NITRATO CALDO
Extracto de carne .......................................... 3,0 g
Peptona ......................................................... 5,0 g
KNO3 ............................................................ 1,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
Disolver a bao mara y fraccionar en tubos (2 ml por tubo). Esterilizar en autoclave.
pH = 7,0
La reduccin de NO3 a NO2 y N2 se da en condiciones anaerbicas en las que el NO3 acta
como aceptor final de electrones de la cadena respiratoria. Muchas bacterias anaerobias
facultativas pueden crecer en anaerobiosis reduciendo nitrato.
El fundamento de la prueba consiste en la deteccin del nitrito formado, que al reaccionar con
los reactivos para la prueba de reduccin de nitrato forman un compuesto diazoico rojo.
Si la reaccin es dbil, y no aparece color dentro de los 30 segundos, se agrega polvo de zinc,
que acta como agente reductor, en medio cido actico y reduce al compuesto formado, con
aparicin de color rojo dentro de los treinta segundos. Si no aparece color, la prueba se considera
negativa.
PALCAM AGAR
Peptona ......................................................... 23,0 g
Almidn .......................................................... 1,0 g
NaCl ............................................................... 5,0 g
Agar-agar ...................................................... 13,0 g
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PE-2 MEDIO
Peptona ....................................................... 20,0 g
Extracto de levadura ..................................... 5,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
Prpura de bromocresol 1 % ........................ 4,0 ml
Arvejas ......................................................... 6 por tubo
Disolver los ingredientes, fraccionar en tubos con tapa de rosca, agregar 6 arvejas por tubo.
Este medio se utiliza para la recuperacin primaria de microorganismos anaerobios en el anlisis
de conservas alteradas.
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C) Oxalato de Verde
de Malaquita ... 4,0 g
Agua dest. ....... 1,0 l
SALMONELLA-SHIGELLA AGAR
Extracto de carne ............................................ 5,0 g
Proteosa peptona ............................................ 5,0 g
Lactosa ......................................................... 10,0 g
Sales biliares ................................................... 8,5 g
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Microorganismos
Shigellas y la mayora de las Salmonellas
Algunas Salmonellas y Proteus
Escherichia coli y dems coliformes
SELENITO CALDO
Triptona ........................................................ 5,0 g
Lactosa ......................................................... 4,0 g
Na2HPO4..................................................... 10,0 g
Selenito de sodio .......................................... 4,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
pH = 7,0
Esterilizar en vapor fluente durante 30 minutos. No autoclavar.
Este medio se utiliza para el enriquecimiento selectivo de Salmonella y, eventualmente, Shigella
sonnei a partir de alimentos, agua, heces y orina. El medio inhibe el crecimiento de bacterias
intestinales coliformes y enterococos. Salmonella y Proteus son inhibidos en menor grado por el
selenito de sodio.
Incubacin: 24 horas a 37C o 6-12 horas a 43C.
SIM AGAR
Peptona de casena ....................................... 20,0 g
Peptona de carne............................................. 6,6 g
Citrato de amonio e hierro (III) ...................... 0,2 g
Tiosulfato sdico ........................................... 0,2 g
Agar-agar ........................................................ 3,0 g
Agua destilada ................................................. 1,0 l
pH = 7,3 0,1
Disolver los ingredientes, distribuir en tubos (aproximadamente 4 cm de altura) y esterilizar en
autoclave 15 minutos a 121C. Dejar solidificar en posicin vertical.
Medio de cultivo de ensayo para comprobar la formacin de sulfuro, de indol y la motilidad de
Enterobactericeas.
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TIOGLICOLATO CALDO
Extracto de levadura ..................................... 5,0 g
Peptona ....................................................... 15,0 g
Glucosa ......................................................... 5,5 g
Cistina........................................................... 0,5 g
NaCl ............................................................. 2,5 g
Na2S2O3 ........................................................ 0,5 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
pH = 7,10,2
Fraccionar en tubos con tapa de rosca, dejando poco espacio libre. Esterilizar en autoclave.
Si el medio no es utilizado inmediatamente, calentar a ebullicin 15 minutos y enfriar
rpidamente en el momento de usar.
Se utiliza para el crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos. La cistina y el
tioglicolato proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes.
Sembrar con pipeta en el fondo del tubo, sin burbujear.
Microorganismos
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi A
Salmonella cholerae suis
Salmonella paratyphi B
Salmonella typhimurium
Shigella flexneri
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Escherichia coli
Citrobacter
Klebsiella
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Morganella morganii
Proteus rettgeri
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Al. faecalis
OA
SG
SG
SG
SG
S
SG
SG
SG
SG
SG
SG**
SG**
SG**
S (A)
S/SG
OA
OA
OA
OA
OA
OA
OA
S
S
S
S
S
S
A/S
OA
OA
OA
OA*
OA
Formacin de H2S
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TRIBUTIRINA AGAR
Extracto de levadura ..................................... 3,0 g
Peptona ......................................................... 5,0 g
Tributirina................................................... 10,0 g
Agar-agar .................................................... 15,0 g
Agua destilada .............................................. 1,0 l
pH = 7,5
El medio se utiliza para la identificacin de microorganismos lipolticos. La degradacin de
tributirina produce halos de aclaramiento alrededor de las colonias, en contraste con el resto del
medio que permanece turbio. La incubacin es de hasta 72 h en condiciones ptimas.
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UREA CALDO
Extracto de levadura ....................................... 0,1 g
Dihidrogenofosfato potsico .......................... 9,1 g
Hidrogenofosfato disdico ............................. 9,5 g
Urea .............................................................. 20,0 g
Rojo fenol ..................................................... 0,01 g
En este medio de cultivo slo crecen aquellos microorganismos que pueden utilizar urea como
nica fuente de carbono. Los grmenes que utilizan urea producen un viraje del indicador hacia
el rojo y turbidez del medio de cultivo.
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UVM CALDO
Peptona Proteosa .......................................... 5,0 g
Triptona ........................................................ 5,0 g
Lab Lemco Polvo ...................................... 5,0 g
Extracto de levadura ..................................... 5,0 g
NaCl ........................................................... 20,0 g
KH2PO4 ......................................... 1,35 g
Na2HPO4 .................................................... 12,0 g
Esculina ........................................................ 1,0 g
Acido Nalidxico (2% en 0,1 M NaOH) ...... 1,0 ml
Clorhidrato de acriflavina........................... 12,0 mg
Agua destilada .............................................. 1,0 l
pH = 7,2
Autoclavar a 121C, 15 minutos Este medio se utiliza para el enriquecimiento selectivo de
Listeria.
La combinacin de diferentes peptonas, extractos, sales y sustancias tampn permite un buen
crecimiento de Listeria. La selectividad del medio viene dada por el cido nalidxico y el
clorhidrato de acriflavina, que son sustancias inhibidoras del crecimiento.
Microorganismos
Salmonella, Proteus (sin dispersin)
Pseudomonas (colonias pequeas y dentadas)
Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter,
Klebsiella y otros
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_____________________________
Las prcticas que se realizan en los laboratorios presentan riesgos propios de
cada actividad. Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de normas
destinadas a proteger la salud de los alumnos y a evitar accidentes y
contaminaciones tanto dentro del mbito de trabajo, como hacia el exterior.
Es un elemento clave en la seguridad la informacin que permita reconocer y
minimizar o evitar los riesgos presentes en el laboratorio. Ser fundamental
respetar la metodologa de cada tcnica, y trabajar con cuidado y en forma
ordenada.
MEDIDAS GENERALES
1. Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de
trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignfugas,
lavaojos, gabinete para contener derrames, accionamiento de alarmas, etc.
2. No se debe comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio.
3. No se debe guardar alimentos en heladeras que contengan drogas o
preparados.
4. Se debe utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio,
guardapolvo abrochado (preferentemente de algodn y de mangas largas) y
zapatos cerrados. Evitar el uso de accesorios colgantes (aros, pulseras,
collares, etc.). Llevar el cabello recogido.
5. Las mesadas de trabajo, deben estar despejadas, sin libros, ni abrigos ni
objetos personales. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada
persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos
los lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier manipulacin
de laboratorio y antes de retirarse del mismo.
7. Se deben utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias
qumica o material biolgico. Toda persona cuyos guantes se encuentren
contaminados no deber tocar objetos, ni superficies, tales como: telfono,
lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.
8. No se permite correr en los laboratorios.
9. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con bancos, sillas,
equipos, mquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulacin.
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LABORATORIOS DE QUMICA
1. No se permite pipetear con la boca.
2. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o
impactos se utilizarn anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u
otros dispositivos de proteccin. Cuando se manipulen productos qumicos
que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitar el uso de
lentes de contacto.
3. No utilice el contenido de un recipiente que no este identificado. Los envases
que contengan agentes qumicos deben adecuadamente etiquetados con la
denominacin del compuesto y el tipo de riesgo (Ej.: corrosivo, txico,
inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo).
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LABORATORIOS DE BIOLOGIA
1. Leer Reglas Bsicas para Laboratorios de Qumica.
2. Se deben utilizar mascarillas descartables cuando exista riesgo de produccin
de aerosoles (mezcla de partculas en medio lquido) o polvos durante
operaciones de pesada de sustancias txicas o biopatgenas, apertura de
recipientes con cultivos despus de agitacin, etc.
3. Est prohibido descartar material biolgico por los desages de las piletas,
sanitarios o recientes comunes para residuos. En cada caso se debern
seguir los procedimientos establecidos para la gestin de residuos.
4. La superficie de trabajo se deber descontaminar una vez terminadas las
tarea o luego de cada derrame de material viable, utilizando productos
probadamente efectivos contra los agentes con que se trabaja.
5. El derrame o cada de muestras contaminadas, diluciones y medios
sembrados o inoculados ser informada al docente de inmediato. Se
proceder a tratar el rea afectada con la solucin desinfectante que
corresponda, la cual se dejar actuar y se recoger con papel absorbente que
ser luego descartado con los residuos patognicos.
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Hospital Pirovano
INTOXICACIONES:
Hospital de Nios. Dr. R. Gutirrez
QUEMADURAS:
Hospital de Quemados
P.Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022
OFTALMOLOGA
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Por cidos. Sacar o cortar lo ms rpidamente posible la ropa. Lavar con agua
corriente abundante la zona afectada. Neutralizar la acidez con bicarbonato
sdico durante 15-20 minutos. Esperar la asistencia mdica.
Por lcalis. Lavar la zona afectada con agua corriente abundante y luego con una
solucin saturada de cido brico. Secar y esperar la asistencia mdica.
5. Fuego en el cuerpo.
Si se te incendia la ropa, pide ayuda. El afectado no correr, tiene que tirarse en
el suelo y rodar sobre si mismo para apagar las llamas. Es tu responsabilidad
ayudar a alguien que se est quemando. Cubrirlo con una manta antifuego,
conducirlo hasta la ducha de seguridad, si est cerca. No utilices nunca un
extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona
tendida, hasta que llegue la asistencia mdica.
6. Actuacin en caso de producirse corrosiones en los ojos.
En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se
lave el ojo, menos grave ser el dao producido. Lavar los dos ojos con agua
corriente abundante durante 15 minutos como mnimo en una ducha de ojos, o
con solucin fisiolgica. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de
los dedos para facilitar el lavado debajo de los prpados. Es necesario recibir
asistencia mdica, por pequea que parezca la lesin.
7. Actuacin en caso de ingestin de productos qumicos.
Antes de cualquier actuacin concreta pide asistencia mdica. Si el paciente est
inconsciente, ponerlo en posicin inclinada, con la cabeza de lado. Si est
consciente, mantenerlo apoyado. No dejarlo slo. No provocar el vmito si el
producto ingerido es corrosivo.
8. Actuacin en caso de inhalacin de productos qumicos.
Identificar el vapor txico. Si se trata de un gas, utilizar el tipo adecuado de
mscara para gases durante el tiempo que dure el rescate del accidentado. No
arriesgarse. Conducir inmediatamente la persona afectada a un sitio con aire
fresco. Requiere asistencia mdica lo antes posible. Ante el primer sntoma de
dificultad respiratoria, iniciar la respiracin artificial boca a boca.
) INCENDIOS
1. Fuego en el laboratorio.
Mantenga la calma.
Informe al docente responsable.
Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control (Interno 311)
informando el lugar y las caractersticas del siniestro
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2. Fuegos pequeos
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Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja
(patognicos) o negra (peligrosos) y cirrela.
Si el derrame es de algn elemento muy voltil deje dentro de la campana
hasta que lo retire para su disposicin.
Disponer la bolsa con los residuos (consultar al Servicio de Higiene y
Seguridad, int. 275)
Lave el rea del derrame con agua y jabn. Seque bien.
Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido
salpicados por el derrame.
Lave los guantes, la mscara y ropa.
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Fecha: ..................................................................
Firma:...................................................................
Aclaracin:............................................................
L.U. N: ...............................................................
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