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1. Conceitos Bsicos de Gentica e Biologia Molecular
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4. Bibliografia
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5. Anexo I: Figuras
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que surgiu por mutao em alguma poca do passado recente ou remoto, e em geral
relativamente raro, substitui um alelo do tipo selvagem normal em um ou ambos os
cromossomos. Quando uma pessoa tem um par de alelos idnticos diz-se que
homozigtica (um homozigoto); quando os alelos so diferentes, ela heterozigtica
(um heterozigoto). Esses termos (homozigtico, heterozigtico) podem ser aplicados a
uma pessoa ou a um gentipo. Usa-se o termo mutao em gentica com dois sentidos:
para indicar uma nova alterao gentica que no era previamente conhecida numa
famlia e, s vezes, meramente para indicar um alelo alternativo.
1.4. Organizao do Genoma Humano
O genoma humano, na sua forma diplide consiste em aproximadamente 6 a 7
bilhes de pares bases (ou 6 a 7 milhes de quilobases [kb]) de DNA organizados
linearmente em 23 pares de cromossomos. Pelas estimativas atuais, o genoma contm
30.000 a 70.000 genes que controlam todos os aspectos da embriognese,
desenvolvimento, crescimento, reproduo e metabolismo essencialmente todos os
aspectos do que faz o ser humano um organismo funcional. Assim a influncia dos
genes e da gentica nos estados de sade e doena ampla e suas razes so as
informaes codificadas no DNA encontrado no genoma humano. Conhecemos o papel
de apenas uma pequena percentagem do nmero total de genes. No entanto, o projeto
molecular e estrutural geral do genoma, de seus cromossomos e de seus genes est
sendo esclarecido. A anlise da organizao do genoma humano uma rea de
considervel entusiasmo na gentica humana e mdica atual; espera-se que muitas (se
no todas) informaes genticas no genoma sero num futuro prximo identificadas e
examinadas a nvel molecular como parte do que foi denominado Projeto Genoma
Humano, um esforo internacional para mapear e estabelecer a seqncia de todo o
genoma humano.
Embora a grande maioria dos genes se localize no ncleo, um subgrupo pequeno
reside no citoplasma, nas mitocndrias. Os genes mitocondriais exibem herana
exclusivamente materna. Todas as clulas humanas possuem centenas de mitocndrias,
cada uma contendo vrias cpias de uma pequena molcula circular, o cromossomo
mitocondrial. A molcula de DNA mitocondrial mede apenas 16 kb de comprimento
(menos de 0,03% do comprimento do menor cromossomo nuclear) e codifica 13 genes
estruturais-chave, bem como vrios genes de cido ribonucleico (RNA) estruturais.
tero dos casos de estupro nos quais foi usado o perfil de DNA, o suspeito foi libertado
porque o seu DNA no correspondia amostra de evidncia. Assim, os perfis de DNA
podem beneficiar os que so falsamente acusados.
2.2. Deteco e Medida da Variao Gentica ao Nvel de DNA
Durante sculos, ficamos intrigados com as diferenas existentes entre as
pessoas. A ateno era enfocada nas diferenas observveis, como a colorao da pele e
a forma e o tamanho do corpo. Apenas no sculo XX tornou-se possvel examinar as
variaes dos genes, conseqncia de mutaes que se acumularam com o tempo. A
avaliao da variao gentica ao nvel dos genes foi levada a cabo pela anlise direta
dos polimorfismos de seus produtos, as protenas. Contudo, esta abordagem mostrou-se
insuficiente para finalidades forenses.
As diferenas genticas identificveis via polimorfismos de protenas tm sido
usada em laboratrios forenses desde o final da dcada de 1960. Inicialmente, os
marcadores proteicos baseavam-se nos grupos sangneos do sistema ABO.
Posteriormente, outros grupos sanguineos, protenas do soro, e, mais recentemente,
antgenos de histocompatibilidade (HLA) foram tipados por reao imunolgica ou
eletroforese. Como os genes, em sua maioria, representam regies do DNA
codificadoras de protenas e, portanto, sujeitas a rgidas presses seletivas, uma
desvantagem do uso de polimorfismos de protenas o limitado grau de variao
associado com esses marcadores. Assim, a identificao de alelos com alta freqncia
na populao entre duas amostras de menor valor se a probabilidade de ocorrncia
alta simplesmente por mero acaso. Portanto, a nfase na aplicao legal tem sido para a
excluso em vez da identificao positiva quando duas amostras so comparadas.
Outros problemas inerentes analise de protenas relacionam-se quantidade de
tecido necessrio para o teste e relativa facilidade com que as protenas se degradam.
Essas consideraes so particularmente relevantes quando se tem em mente a cena de
um crime onde freqentemente as condies de anlise da amostra esto longe da ideal.
Por fim, as regies codificadoras de protenas correspondem a apenas 3% do
genoma humano. E o que dizer sobre a diversidade gentica nos demais 97% de DNA?
Avalia-se que os seres humanos difiram em aproximadamente 1/300 a 1/500 pb. Assim,
aproximadamente 10 milhes de polimorfismos podem existir entre os 3 bilhes de
pares de bases que compem o genoma humano. Como existem apenas uns 100 grupos
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II)
III)
IV)
(95C mais ou menos) de modo que a molcula se desnatura e fica uniflamentar. Este
DNA ento exposto a grandes quantidades de iniciadores, com os quais se hibridiza por
meio das bases complementares do DNA, medida que resfriado a uma temperatura
de helicoidizao de aproximadamente 35 a 65C. O DNA ento aquecido a uma
temperatura intermediria (70 a 75C). Na presena de um grande nmero de
nucleotdeos livres, um novo filamento de DNA sintetizado pela DNA polimerase a
esta temperatura, estendendo a seqncia do iniciador. O DNA recm-sintetizado
consiste em um duplo filamento que tem a ponta 5 do iniciador em uma extremidade,
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seguido das bases adicionadas por meio da extenso do iniciador pela DNA polimerase.
O DNA bifilamentar ento aquecido novamente a uma alta temperatura, fazendo com
que ele se desnature. O ciclo de aquecimento-resfriamento ento repetido. Agora, o
DNA recm-sintetizado serve como molde para outras snteses. medida que os ciclos
de aquecimento-resfriamento so repetidos, o DNA ligado ao iniciador amplificado
geometricamente: o nmero de cpias dobra a cada ciclo (2,4,8,16, e assim por diante).
Da o processo ser chamado reao em cadeia. Tipicamente os ciclos so repetidos a
cada 20 a 30 vezes, produzindo milhes de cpias do DNA original. Em resumo, o
processo de PCR consiste em trs etapas bsicas: desnaturao do DNA em alta
temperatura, hibridizao do iniciador a uma temperatura intermediria e polimerizao.
O resultado um produto que consiste quase que inteiramente de uma seqncia de
DNA especfica. A Figura 12 resume todo o processo.
Como cada ciclo de aquecimento-resfriamento requer apenas alguns minutos ou
menos, uma tpica molcula de DNA pode ser amplificada para fazer milhes de cpias
em poucas horas. Sendo o procedimento simples e autocontido, foram desenvolvidos
aparelhos para automatiz-lo totalmente. Uma vez que o DNA tenha sido amplificado,
ele pode ser analisado de vrios modos.
A PCR tem vrias vantagens em relao s tcnicas anteriores. Primeiro, pode
ser usada com quantidades extremamente pequenas de DNA (nanogramas ou mesmo
picogramas, em oposio aos microgramas necessrios para clonagem). A quantidade
de DNA em uma mancha de sangue de vrios anos, um nico fio de cabelo ou mesmo a
parte de uma goma de um selo lambido so em geral suficientes para anlise. Segundo,
como no requer clonagem gnica, o procedimento portanto muito mais rpido. Um
exame de DNA, que requeria uma semana ou mais usando tcnicas antigas pode ser
feito em um nico dia com PCR. Finalmente, como a PCR pode produzir grandes
quantidades de DNA purificado, menos freqentemente necessrio usar sondas
radioativas para detectar seqncias ou polimorfismos especficos. Ao invs disso,
compostos marcadores no radioativos, como biotina, podem ser usados.
A PCR tem algumas desvantagens. Primeira, a sntese dos iniciadores
obviamente requer o conhecimento das seqncias de DNA que flanqueiam o DNA de
interesse. Quando no h nenhuma informao disponvel sobre a seqncia, outras
tcnicas devem ser usadas. Segunda, a extrema sensibilidade da PCR a torna suscetvel
contaminao no laboratrio. Vrias preocupaes so comumente tomadas de modo a
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de
tamanhos
variados,
cada
um
terminado
com
um
dos
quatro
de
DNA
usando-se
sistemas
de
deteco
fluorescente,
18
Tipo Sangneo
Gentipo
Nmero de Pessoas
LMLM
1.787
MN
LMLN
3.039
LNLN
1.303
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20
Gentipo
Freqncia
AA
p2
Aa
2pq
aa
q2
Gentipo
Freqncia de Hardy-Weinberg
LMLM
p2 = (0,5395)2 = 0,2911
LMLN
LNLN
q2 = (0,4605)2 = 0,2121
Estas previses correspondem aos dados originais dos quais as duas freqncias
allicas foram estimadas? Para responder a esta pergunta, devemos comparar os
nmeros de gentipos observados com os nmeros previsto pelo Princpio de HardyWeinberg. Obtemos estes nmeros previstos multiplicando as freqncias de HardyWeinberg pelo tamanho da amostra obtida da populao.
Gentipo
Nmero Previsto
LMLM
LMLN
LNLN
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Tipo Sangneo
Gentipo
Freqncia
IAIA
p2
IAIO
2pr
IBIB
q2
IBIO
2qr
AB
IAIB
2pq
IOIO
r2
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4. Bibliografia
Brown, T. A. (2003). Clonagem Gnica e Anlise de DNA: Uma Introduo. 4 Ed.
ARTMED.
Comit sobre a Tecnologia do DNA na Cincia Forense. (1999). A Tecnologia do DNA
na Cincia Forense. FUNPEC, Ribeiro Preto.
Jeffreys, A. J., Wilson, V., & Thein, L. S. (1985). Individual-specific fingerprints of
human DNA. Nature. 314: 67-73.
Krawczak, M. & Schmidtke, J. (1998). DNA Fingerprinting. 2nd edn. BIOS. Scientific
Publishers, Oxford.
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5. Anexo: Figuras
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Figura 2. A dupla hlice do DNA desenrolada para mostrar as ligaes desoxirribosefosfato e os degraus de pares de bases.
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Figura 4. Perfis de DNA de dois pares de gmeos monozigticos (ou idnticos) e um par
de gmeos dizigticos (ou fraternos).
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(A)
(B)
VNTR
Figura 5. Perfis de DNA de interesse forense utilizando sondas multilocal (A) e unilocal
(B) de VNTR.
Figura 6. Perfis de DNA de interesse forense utilizando sistema de PCR multiplex para
oito loci de STR.
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Figura 10. Comparao entre dois tipos de polimorfismo detectados por hibridizao de
Southern: (A) RFLP diallico e (B) VNTR multiallico.
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1 STR
Oligo A
Oligo B
Alelo 1
Oligo A
Oligo B
Alelo 2
32
...ATAGACCACATGGCAA...
...ATAGACTACATGGCAA...
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