Universidad Galileo de Guatemala

Extensin Quetzaltenango.
Facultad de Ciencia se la Salud.
Licenciatura en Qumica Biolgica
Curso: Microbiologa General.
IV Semestre.
Licda. Ximena Pinelo.

CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS CON AGAR SANGRE Y MAC

CONKEY, TINCIN DE GRAM.

Responsable de la ejecucin.

Quetzaltenango, 05 de octubre del 2015

I Antecedentes
La primera noticia de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui
aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina.
Sin embargo, este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no
fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado
en diluciones seriadas en un medio lquido.
Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como
soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por
Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para
la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas.
En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con
los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido
extrado de algas rojas) como solidificaste.
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas,
que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio
cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.
a. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre
las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre, sobre todo)
tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de
enriquecimiento.
b. Para aislar e identificar una especie bacteriana del medio y de otra especie que
pueda confundirse morfolgicamente es necesario usar medios de cultivos, ya que
nos permiten diferenciar las caractersticas del crecimiento de las bacterias y
establecer su identidad segn el medio de cultivo que se use.
c. Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales como el agua,
el suelo, aire, el hombre y otros seres vivos, alimentos, entre otros. Haciendo parte
de los diferentes ecosistemas. Por esto se deben usar los medios de cultivo
adecuados que se asemejen al ambiente si queremos posibilitar el crecimiento de la
bacteria.

II Diagrama de Flojo
A. Para la siembra de microorganismos por mtodo de estras y por el mtodo por
extensin en caja de Petri.

Inicio

Tomar las muestras a sembrar en los medios de cultivo de la prctica anterior; diluir segn sea el caso

Prender el mechero bunsen

Mtodo por estras

Si

Destapar caja de Petri cerca del mechero

Flamear el asa

Jalar 2 estras de la primera parte

Tomar muestra

Estriar el resto de la superficie teniendo en cuenta que cada vez las estras deben ser menos y m
Estriar la cuarta parte de la superficie aproximadamente

III Procedimiento
Tapar Fin
la caja de Petri, escribir los datos, voltear y proceder a incubar por 48 hr.

B. Agar Mac Conkey

a. Formula
i.
Digerido Pancretico de Gelatina 17.0 Sales Biliares 1.5
ii.
Digerido Pptico de Tejido Animal 1.5 Cloruro de Sodio 5.0
iii.
Digerido Pancretico de Casena 1.5 Cristal Violeta 0.001
iv.
Lactosa 10.0 Agar Bacteriolgico 13.5
v.
Rojo Neutro
b. Los microorganismos lactosa positiva dan colonias de color rosa con o sin zona
de precipitado alrededor.
c. Los microorganismos lactosa negativos dan colonias incoloras o de color muy
claro.
d. Procedimiento.
i.
Prender el mechero bunsen
ii.
Destapar la caja de Petri cerca del mechero Fisher
iii.
Flamear el asa hasta que se ponga al rojo vivo, dejar enfriar, tomar
muestra con la punta del asa
iv.
Ya con la muestra, estriar aproximadamente de la superficie total del
agar; las estras deben ser varias y muy juntas.
v.
Flamear el asa nuevamente
vi.
Jalar 2 estras de la primera parte y proceder con el estriado a un lado
esta vez ya sin tocar las primeras estras, las estras deben ser menos y
estar ms separadas que la primera vez.
vii.
Proceder con el estriado de la siguiente parte sin flamear el asa. Las
estras deben ser menos y estar ms separadas que la segunda vez.
viii. Estriar la ltima parte del agar tener en cuenta que deben estar ms
separadas y ser menos en cantidad a la tercera vez. El agar debe verse de
la siguiente manera:
ix.
Tapar la caja de Petri, escribir los datos necesarios (nombre del
microorganismo, nombre del medio, dilucin de la muestra (si la hay),
nombre del grupo y fecha), voltear y proceder a incubar por 48 horas.
x.
Hacer este procedimiento para el agar soya tripticasa y agar
pseudomonas con agua de tortuga, para el agar verde brillante utilizar la
muestra de tierra, y para el agar eosina azul de metileno utilizar muestra
de heces fecales.
Existen varios tipos de rallados o
estras

C. Agar Sangre
a. Formula
i.
Infusin de msculo de corazn. 375.0.
ii.
Peptona. 10.0. Cloruro de
iii.
sodio. 5.0.
iv.
Agar. 15.0.
v.
pH final: 7.3 0.2
b. Interpretacin
i.
Observar las caractersticas de las colonias.
ii.
Para el medio de cultivo conteniendo sangre, observar las reacciones de
hemlisis:
iii.
Hemlisis alfa: lisis parcial de los glbulos rojos. Se observa un halo de
color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la oxidacin de
la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) por el
perxido de hidrgeno generado por los microorganismos.
iv.
Hemlisis beta: lisis total de los glbulos rojos. Se observa un halo claro,
brillante alrededor de la colonia en estudio.
v.
Hemlisis gamma: ausencia de lisis de los glbulos rojos. El medio de
cultivo no presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la
colonia en estudio
c. Procedimiento
i.
Prender el mechero bunsen
ii.
Destapar la caja de Petri cerca del mechero Fisher
iii.
Flamear el asa hasta que se ponga al rojo vivo, dejar enfriar, tomar muestra
con la punta del asa
iv.
Ya con la muestra, estriar aproximadamente de la superficie total del agar;
las estras deben ser varias y muy juntas.
v.
Flamear el asa nuevamente
vi.
Jalar 2 estras de la primera parte y proceder con el estriado a un lado esta
vez ya sin tocar las primeras estras, las estras deben ser menos y estar ms
separadas que la primera vez.
vii.
Proceder con el estriado de la siguiente parte sin flamear el asa. Las estras
deben ser menos y estar ms separadas que la segunda vez.
viii. Estriar la ltima parte del agar tener en cuenta que deben estar ms
separadas y ser menos en cantidad a la tercera vez. El agar debe verse de la
siguiente manera:
ix.
Tapar la caja de Petri, escribir los datos necesarios (nombre del
microorganismo, nombre del medio, dilucin de la muestra (si la hay),
nombre del grupo y fecha), voltear y proceder a incubar por 48 horas.
x.
Hacer este procedimiento para el agar soya tripticasa y agar pseudomonas
con agua de tortuga, para el agar verde brillante utilizar la muestra de tierra,
y para el agar eosina azul de metileno utilizar muestra de heces fecales.

Existen varios tipos de rallados o

estras

Referencia
MEDIO DE
CULTIVO

CEPA DE
REFERENCIA

# DE
COLONIAS

COLOR

BORDE

ELEVACIN

TAMAO

AS Agar
sangre

______________
______________

Blanco opaco

Puntiforme

Convexa

>1mm 2mm

Agar M.C

______________
______________

Crema traslucido

Circular

Plano convexa

>1mm a 5mm

IV Resultados

Flamear el asa calibrada para

siembra en estras

Tapar, voltear e incubar por 48

hr.

Tomar muestra

Abrir caja de Petri y estriar

de la forma como fue
explicado

Describir
las morfologas
Observar
la morfologa
de las
diferentes
y reportar resultados
colonias
obtenidas

V Discusin de Resultados
La siembra en cajas Petri nos permite cultivar microorganismos gracias a que contiene los
nutrientes necesarios para su desarrollo. El crecimiento de los microorganismos se
manifiesta de formas diferentes dependiendo de la tcnica utilizada para su siembra y del
tipo de medio en el que se realiz dicha siembra, de esta forma es posible obtener
caractersticas morfolgicas distintas cuando se realizan siembras de una misma muestra en
diferentes medios de cultivo o viceversa, esto queda mejor explicado en los resultados que
obtuvimos en la morfologa colonial de nuestro agar Sangre y Mac Conkey en el cual se
observ que algunas colonias tenan un color amarillo y otras eran rojas, las formas
observadas fueron variadas (regular, puntiforme, circular e irregular) y en cuanto a
elevaciones tuvimos planas, elevadas, planoconvexas y convexas.
En el agar Mac Conkey, los microorganismos lactosa positiva dan colonias de color rosa
con o sin zona de precipitado alrededor.
Los microorganismos lactosa negativos dan colonias incoloras o de color muy claro.
El desarrollo de colonias formadas a partir de los mtodos realizados por estras y por
extensin en placa difieren en forma, borde, elevacin, superficie y estructura interna, lo
cual es notablemente influenciado por las concentraciones de carga microbiana del medio
en el cual dichas colonias se desarrollaron as como por el mismo medio de cultivo, por eso
inclusive en nuestras cepas de referencia se visualiz con algunas diferencias morfolgicas
cuando se cultiv en agar Sangre y en agar Mac Conkey . Tambin aprendimos a describir
la morfologa de las colonias que obtuvimos, as como compararlas con las cepas de
referencia que se nos proporcion; tuvimos un poco de dificultad para la siembra por estras
en el agar Mac Conkey debido a que el agar estaba muy suave sin embargo aun as pudimos
realizar 2 siembras satisfactoriamente.
VI. Tincin de Gram
A. Materiales
a. Microscopio ptico

b. Colorantes para tincin de Gram

i.
Cristal violeta
(Coloracin de Membranas)
ii.
Lugol
(Mordiente)
iii.
Alcohol Cetona (Decoloracin)
iv.
Safranina
(Tincin de contraste)
c. 1 mechero
d. asa microbiolgica
e. Pizeta
f. Recipiente de plstico para las tinciones
g. Aceite de inmersin
h. Cultivos bacterianos
B. Procedimiento
a. Marcar un portaobjetos con el nombre del responsable a observar. (se
realizaron 2 frotes por alumno)
b. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar.
c. Aadir 1 2 gotas de cristal violeta a la preparacin, hasta que se cubra por
completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto.
d. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparacin con la pzeta sobre el
recipiente de plstico para tinciones.
e. Agregar 1 2 gotas de solucin lugol a la preparacin, y dejar actuar 1 minuto,
transcurrido el tiempo, lava.
f. Con cuidado, aadir con un gotero el alcohol-acetona lavando la preparacin
g. Aadir el colorante de contraste, safranina (1 2 gotas) y dejar actuar durante
30 segundos. Lava con la pizeta.
h. Dejar secar al aire y observar al microscopio, siguiendo la tcnica de la
prctica anterior para enfocar correctamente. Observar con el objetivo de
inmersin.
C. Discusin
En las 2 muestras se observaron bacilos Gram Negativos

VII. Anexos

Agar sangre para cultivo

Crecimiento de colonias

Agar Mac Conkey para cultivo

Crecimiento de colonias

Tincin Bacterias Gram

Negativos

La grafica muestra los tipos de forma de las

colonias de las bacterias

VIII. Bibliografa
Biologa de los microorganismos Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker
Editorial Pearson
Intro. a la Microbiologa Gerard J. Tortora Editorial Medica Panamericana