Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
Facultad
Divisin de
de
In:
Mr.XII:n
Ciencias
Estudios Superiores
JOSE.
M~xico,
(Biologia)
Ciencias
en
Doctor
WAIZEL
D.
F.
.,
BUCAY
1979
,
Quiero dedicar esta pequea labor a mis padres, hermano, esposa e
hijos, por la ayuda y apoyo brindados en tantas ocasiones, hasta que sta lleg a ser realidad.
mi razn de existir.
VEO LOS BENEFICIOS QUE RECIBI, Y LA AXUDA QUE SE ME IMPARTIO, Y NO PUEDO MENOS QUE DESEAR PROCLAMAR LLENO DE INFINITA GRATITUD, QUE NADIE TANTO COMO USTEDES HA INFLUIDO EN MI FAVOR, QUE NADIE AYUDO EN TAN GRAN ESCALA A DARME CONOCIMIENTOS HASTA DONDE FUI CA
PAZ DE ASIMILARLOS; DIGNENSE USTEDES HONORABLES SEORES, RECIBIREN ESTOS SENCILLOS RENGLONES, EL TESTIMONIO DE MI MODESTA Y ETERNA GRATITUD.
A G R A D E C 1 M1 E N T O S
C o NT E N 1 D O
CAPITULO
1.-
INTRODUCCION.
a.1.) El problema del Cncer.
a.2.) La bsqueda de substancias con actividad antitumoralo
a.3.) Especies que se estudiaron y caractersticas de -sus principios activos.
a.4.) Objetivos de la investigacin .
PAGINA
1
11.- ANTECEDENTES.
a.1.) Breve historia de las plantas medicinales.
a.2.) Plantas empleadas como antitumorales y/o anticanc~
rgenas:
a.2.1) En la medicina indgena mexican~
a.2.2) En la medicina mexicana de principios de Siglo XX
a.2.3) Plantas utilizadas como remedios populares contempQ
rneos.
ft.3.) Algunas investigaciones para encontrar principiosactivos vegetales antitumorales.
a.4.) Actividad biolgica de las lactonas de Helenium bpp.
a.5.) El cultivo de las plantas medicinales.
111.- MATERIALES
A.)
Especies estudiadas.
B.)
Algunos aspectos sobre las especies empleadas
B.1.) Taxonoma.
B.2.) Distribucin geogrfica.
B.3.) Descripcin botnica.
B.4.) Utilidad de la especie.
B.5.) Procedencia del material propagado.
C.)
Sustrato de crecimieRto.
D.)
Algunos datos relativos a la zona de procedencia del sustrato empleado.
32
IV.
45
METODOS.
A. ) Extraccin y almacenamiento de semillas.
B.) Diseo de la siembra.
C. ) Siembra
D. ) Cuidados durante el cultivo
D.3) Condiciones climticas del rea de estudio.
E. ) Ensayo de propagacin asexual de las especies
F. ) Cosecha y procesamiento del material
F.l) Aislamiento de las lactonas sesquiterpnicas
F.2) Aislamiento de los alcaloides
V.
RESUL TADOS.
59
A.
V.2. V'gl.eJLa.
V.3. cathaanthuh
VI.
DISCUSION
A.
B.
C.
D.
E.
De
De
De
De
De
70
VII.
CONCLUSIONES Y SUGERENCIAS
80
VIII.
RESW1E:N .
83
IX.
BIBLIClGRAFIA
84
1.-
INTRODUCCION
a.1.
pl~
ricelulares, dando como resultado la reproduccin celular de un tejido sin control por el individuo, por lo que se le clasifica como enfermedad neoplsica (Berenblum, 1953).
"
De
de
substa~
cas principalmente de origen vegetal, inhibidoras del crecimiento de tumores, que no sean txicas para los tejidos sanos, para que sea factible su empleo en la clnica.
Los tratamientos teraputicos estn dirigidos hacia la inhibicin
de la nueva formacin anormal, permitiendo que el resto del organismo quede sin dao.
quimioterpicos y quirrgicos, aunque en ocasiones se les empleaen forma simultnea o bien, alternativamente.
Someramente describiremos ahora la quimioterapia del cncer, la -
ma1igno~.sin
les.
Como las clulas cancerosas difieren de las sanas, posiblemente difieren tambin en sus necesidades alimentarias; sta considera-
cin permiti abrigar la esperanza de descubrir productos qumi-cos o drogas capaces de destruir o envenenar selectivamente a las
clulas anormales.
prob~
pletamente curadas, es decir, que despus de 5 aos de ser tratadas no presentan ninguna recada o metstasis (desprendimiento de
clulas cancerosas Y su traslado por va vascular a otro sitio -del organismo. para crear nuevos focos cancerosos), (Kreig, 1970)
a.3.
veget~
les:
Hei.erwn
~o~eu6
V~ca ~o~ea
L.
pru~
bas farmacolgicas que ya se tienen "in vitro" e "in vivo" a ni-vel de ratn, en donde dieron prometedores resultados, hasta la clnica en humanos.
Algunos sesquiterpenos lactnicos como la amaralina, actan comoanalgsicos (Domnguez, ~.cit.), otros son amebicidas o antihelmnticos, como la santonina (Zetina, 1974), tienen propiedadesvenenosas para insectos y peces (Giral y Ladabaum, 1961 Y Kroch-mal y Krochmal, 1973) y an para animales mayores como ovejas,
v~
nas, por contacto con plantas de algunas especies de las tribus Heliantheae y Anthemidae, de la familia de las Compuestas (Mit--chelo 1969).
La misma helenina ya haba sido probada previamente por Rytel,et
~.,
pien, 1963).
Otras lactonas del mismo tipo son fitotxicas, entre ellas se encuentra la alantolactona; otras ms promueven la formacin de rai
cillas adventicias pero en presencia de la luz actan como inhibi
doras del alargamiento del tallo, como es el caso de la heliangina (Nishikawa, 1966; En: P. Martnez, 1974).
En cambio, la desa-
~,
diada, pero provenientes de plantas algunas veces registradas como medicinales (Domnguez, 1973); son insolubles en ter de petr.
leo y en agua, se disuelven en etanol o metanol caliente, y masan en cloroformo o ter etlico, de aqu que se empleen estas
propiedades para extraerlas y separarlas de otros compuestos.
Los sesquterpenos son substancias catalogadas como metabolitos secundarios y pueden tener diversos grupos funcionales como alcoholes, oxhidrilos. teres, lactonas, etc.
Son constituyentes de
40~euh
(L.) G. Don,
V~nca 4O~ea
ampliamente conocida
ros alcaloides que produce (la vincristina y la vincaleucoblas-tina), destacan por ser empleados con xito, desde 1963, en el -tratamiento de la leucemia y de otros cnceres humanos. (Neuss, et -L.. 1964).
Estas substancias se presentan en la planta en muy pequeas pro-porciones (0.00025%), por 10 que se requiere de grandes cantida-des de ella para una produccin comercial del medicamento; por -ejemplo, para obtener un gramo de vincristina. se necesitan 500 kilos de hojas secas de Catha4~~U6
406euh
(Claus
Tyler, 1965).
Para satisfacer la demanda mundial, dicha especie se colecta de fuentes naturales y cultivadas. localizadas en Madagascar,
Austr~
lia, Sudafrica, Antillas Britnicas, Sudamrica, Europa, India ySur de los Estados Unidos.
6
Aunque nuestro pas podra convertirse en productor y exportadordel producto ya terminado. no se sabe de intentos tendientes a -cultivarla comercialmente, no obstante que dicha especie prospera
bien dentro de las regiones clido-hmedas, donde se le cultiva a
escala domstica con fines ornamentales.
a.4.
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION
En vista de lo anterior, se considera como principal objetivo dela presente, el contribuir a aclarar algunas de las condiciones requeridas para el posterior cultivo de las tres especies. luegode ver si bajo dos condiciones diferentes de crecimiento, una alexterior, fuera de su habitat natural, y la otra en invernadero,producen los principios activos de inters.
Con su cultivo se PQ
dran obtener grandes cantidades de helenalina y de budlenas para continuar los estudios farmacolgicos que an faltan; mien---tras que con la propagacin intensiva de Cathananthu
O~eu6
se -
ANTECEDENTES
a.l.
culacin
esp~
la supersticin.
7
los primeros mdicos fueron guindose en gran parte por estas observaciones.
En todas las primeras civilizaciones hubo mucho inters en plan-tas medicinales.
Hay escritos en -
e~
perten~
- - - - - - , - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ ..
ej~
citos de Nern, escribi su gran tratado, "De Materia Mdica", -donde refiere la naturaleza y propiedades de todas las substan--cas medicinales conocidas en su tiempo.
Durante 15 centurias es
mona~
ve~
_.
,-----.-
a.2.
De
la primera planta Hernndez y Ximnez y Martnez (1928),mencionan que es un rbol que habita en Jalisco, Michoa-cn, Nayarit, Sinaloa. Puebla y Oaxaca, donde recibe losnombres vulgares de "llora sangre". "chicalote", "chicalQ.
te de rbol", "palo amarillo", enguamba", etc. "cuyos retoos despojados de su corteza y untados, disuelven las cataratas y nubes y cuyas hojas curan las llagas viejas y
machacadas y aplicadas destruyen las verrugas".
A la segunda especie. B. fC.ute;.,cen4, la citan como arbusto cuyas hojas semejan a los de la encina, y cuyo jugo -anaranjado. muy amargo. se dice que puede ser usado en el
11
(al reimprimir en 1880 en Morelia, Michoacn, la obra deHernndez) nos dice que en Uruapan, Michoacn, se obtena
de sus semillas un aceite amarillo muy til para resolver
los tumores y apostemas e hinchazones y para sanar las -llagas.
mencion~
Hern~
dez (p~.cit.) fueron hechas en diferentes pocas por: Urbina, Altamirano, Ramrez, Patoni, Ochoterena, Batalla. Ramrez. Rivera y Miranda.
12
En el Libro VII, Captulos I y II,se mencionan las plan-tas llamadas "cohixin o lagarto" y "ceyoxi o pie nico" cuyas hojas retraen los tumores, al ser colocadas sobre ellos.
En el Libro VII, Captulo IX, se hace referencia a la --"cunguricua" (posiblemente una apocincea), que nace en los lugares altos y clidos de Michoacn, "donde dicen -que cura las lceras cancerosas de las partes sexuales".
En los captulos XLI y XLII, tambin habla de otras dos plantas empleadas con la finalidad antes mencionada y que
se 11 aman "totoncaxi huitl" teoca 1i tzi ncenze y purpureo, respectivamente y las cuales. parece ser que son especiesdel gnero CM.6-W.
posibl~emente
C. ocden:ta-U6 L. (Stan---
dley, 1920).
Len (antes citado) menciona dos plantas que no se hallaron en la edicin de la misma obra llevada a cabo por la
U. N.A.r,l. en los aos de 1942 a 1946, Y que son, en primer
trmino, "el rbol llamado calamayo, de cuyas hojas,
sem~
jantes a las del laurel, aplicadas en forma de emplasto resuelven los tumores, sanndolos" y el "rbol del fuego"
(Rhw.; :tetea..tz..wftl F.M.), en segundo trmino, "del que se -
Pachyc~euA p~nglel
pectenabo~gnum
o Le.maJLeoceJl.l?u.6 qu~e.tMoen.,u.,
(S. Wats.)-
(Web.) Sa ff.; o L.
Neubuxbaum~ tetezo
Opu~
we.b~
(Web.); OpunaJl.bOf1.eJ.>cen.-
--
a.2.2.
t~
As
tonces por los dentistas, y que de, igual modo, posee una
accin vaso-constrictora rpida.
Es curioso referir, que ya otra especie de Plumbago, P. .6ccu'lden. L., 11 amada vul garmente "tepatl i", "yerba del --
14
obt~
(~.cit.)
G~~
posiblemente G.
h~nandeZ
o G. mexl
GeJlalUwn mac.ula;tum
es
uno de los mejores astringentes de Norte Amrica, debidoa su contenido en cidos tnico y mlico, lo que permite
tambin emplearlo como hemosttico, antidiarrico y antidisentrico".
a.2.3.
15
b~---
Poir., dice que se emplea en la misma forma que la ante-rior y con el mismo fin.
En nuestro pas se vende un medicamento de patente llamado "Podofilia No. 2" (LaboratoriOS Bustillos), el cual en
su composicin posee resina de podofilina, medicina muy txica y custica empleada con xito para destruir verrugas, aplicandola por va externa.
bscot para curar el cncer, y observ que mostr leve --efecto sobre la enfermedad de Hodgkin
en sarcomas de --
los ndulos linfticos. De la misma especie se vende en Suiza un medicamento que inhibe el crecimiento de tumores
slidos o de cnceres en pecho, pulmn, o del tracto
sup~
e.:t B. o Cu..phe.a lal1.ce.o.e.ata Aa .) el" rn i ca" (TUho ra. .6p. o He.:teJw:the.c.a .6pp.). y el "gordolobo" (Gn.aphCLUum .6ppj
S~
.tncUc.a L.
Kreig (op.cit.) hace referencia a varias plantas emplea-das en el tratamiento de tumores, entre las que estn las
siguientes:
Au..:tum11.
C40c.u...6
colchicina~
tra la viscotoxina, la que inhibe el crecimiento de tumores en ratones, necrosando los tejidos malignos, por lo que se le est estudiando ampliamente en Rusia, Alemaniay Suiza, aunque ya desde la antiguedad Plinio el Viejo. en su libro XVI, y Diosc6rides, recomendaban su uso. ---(Font Quer, 1962 y Kre i g, 1970).
Tambin desde los tiempos greco-romanos se empleaba la
~:toioc.h-<.a
El "acnito" o Ac.ol'LLtum na.pe11.u.6 L. planta muy venenosa debido a su riqueza en alcaloides y cultivada en nuestropas y en Espaa con fines farmacolgicos, es conocida -desde los tiempos de Plutarco como curativa de la
hidrop~
sa, y se le atribuyen tambin propiedades benficas contra neuralgias. cncer, reumatismo y gota (Alvarez,
1962
y Madueo, 1973).
a.3.
c~
laboradores (1976) mediante la recoleccin, extractado y prueba de 519 especies diferentes de vegetales. contra varias lneas celulares cancergenas.
de
confi~
aislaron varios compuestos que inhibieron significativamente la leucemia linfocitica P-388 (PS) en ratones (Bhakuni, et
~ . 1972).
Es digno de mencionarse que esta especie ya era usada por los --egipcios, por sus propiedades venenosas, laxantes e insecticidas.
La
V~zatl.6 p~p~ea
L.
va~atba,
prob~
18
---~.'--
procedi~
En los tumores -
cultivados en los huevos, 11 especies tuvieron substancias capa-ces de reducir en un 50% el crecimiento anormal inducido, mien--tras que cuatro especies de la familia Betulaceae inhibieron por
completo el tejido.
Slo
Cono~pU4 ~ecta
T!U..p-t~yg-Wm
dos en vivo en ratn, e "in vitro" contra clulas derivadas del carcinoma nasofarngeo humano (KB), (Kupchan, et
Del bulbo de Colchtcum
~pecio~um
na y la 3-desmetil-colchicina.
~.,1972).
substancias en ser empleadas como citosttica, pero la desmetil-colchicina mostr una mayor citotoxicidad (Kupchan, et
~.,1973).
19
--------,
Los autores antes citados encontraron en 1974 cuatro substanciasdel tipo de las lactonas sesquiterpnicas en ElephantopU6 eLatU6V~no~ hymenolep~
Bertol.y en
Eleph~pU6
la vernolepina y la vernomenina.
V~nonia
En el Instituto de Qumica de la Universidad Nacional se han aislado e identificado varias lactonas sesquiterpnicas, de las
pla~
1~
gares de nuestra Repblica, de las que son citables algunas parailustrar lo antes mencionado:
Panthe~um
elabora conchosina"A" (Romo, et -.l. ,1970) la que mostr activi-dad citotxica "in vitro" (Taboada, 1976).
De
zatuz~ ~oba,
zaluzanina "C"
la
-.l., 1978).
Hele~um me~canum,
canina 1, substancia que no se ha encontrado en la misma especiepero creciendo en el Valle de Mxico (Domnguez
De Zexmenia
b~ev~6o~,
Romo, 1963).
20
ll~
mada V"gtUeJta .6teno.f.oba. o "escalerilla", Maldonado, (1978), la -que elabora viguiestenina y desacetil-viguiestenina (Guerrero, -1974) .
Estos productos y los de las 4 especies antes mencionadas, fueron
probados "in vitre" en cultivo de tejidos celulares con 3 lneascelulares:
1)
2)
3)
La L-1210 (procedente de leucemia murina).mostrando citotoxicidad a dosis bajas (Tl1ez, Gonz1ez y Taboada, 1973 ; Gonz
lez, et -l., 1976).
buddte..ta.e6o~
tada una disminucin de los porcentajes de clulas en reproduc--cin y a una determinada concentracin no se encontr mitosis
(Guerrero, et -l., 1978). . Conviene recordar que esta es una de
las tres especies que se estudiaron en el presente trabajo y de la que no hay mucho escrito.
~.
p~
mexicanina 1.
De otra especie del mismo gnero, H.
qu~entatum Labill.,cole~
~.,
22
prod~
jo helenalina y carabrona (esta ltima tambin lactona sesquiterpnica), la que haba sido previamente aislada de CMpv.,,um a:b/totc(no,{.dv.,.
A la he1enalina, que fu primeramente aislada por Reeb, en 1910 (En Gira1 y Ladabaum, 1961), de la especie Helen,i.um autumnate L.se le atribuy el fuerte sabor amargo de la planta.
El mismo au-
tor entonces la llam "cido helnico", pero Clarck (1936) le del nombre actual y le asigna la frmula vlida de C15 H1804 y la aisla de otras especies del mismo gnero, como H. macJtoeephatum y
H.
qua~entaium.
de H.
a.4.
m,le!to eephatum
~pp,
~pp.
pue~
to que muchas de sus investigaciones no son suficientemente vlidas en la actualidad, ya que tan slo probaron los efectos en po23
El alcaloide es un convulsivo -
que determina la muerte por parlisis cardiaca o respiratoria". Utilizaron la planta en varios casos de ataxia locomotriz para -calmar los dolores y "an se ha llegado a conseguir que la marcha
de los enfermos mejore notablemente",
Reeb en 1910 y Lamson en 1913, (En: Clark, 1936) la consideran
mo antihelmintico.
c~
no contra peces y comienza las pruebas para ver sus efectos insec
ticidas, lo que comprueba aos despus junto con McGrovan y Mayer
(1942, En: Adams
lipas se conoce la planta con el nombre de "hierba de la pulga" porque los campesinos de esa regin la han empleado, y an la
usan con tal ffn, mucho tiempo antes de que se publicaran las investigaciones antes mencionadas (Giral y Ladabaum, 1961).
24
En 1971 Y 1972, Lee et ~., demostraron la alta citotoxicidad dela helenalina que extrajeron de
CJr.oc.epha.fu.m
Hete~ autumnale L.
y de H. mi-
Tambin la probaron _
Ob--
~.,
1977).
(L.)
G. Von (V.inc.a
M/:,ea L.)
N2..
25
cuenta de que conejos con esta enfermedad, a los que se les administr un extracto de la planta, murieron a los pocos das vctimas de una infeccin causada por la bacteria
P~eudama~ ~p.,
que
Al-
analizar su sangre observan un marcado descenso en el nmero de leucocitos, razn por la que perdieron su defensa a la infeccin.
Esta accin selectiva (reduccin en el nmero de glbulos blan--cos) fue la que sugiri su posibilidad de empleo como antileuc-mica.
Sus investigaciones demostraron que los alcaloides responsables de ia leucopenia eran la vincaleucoblastina o VLB y tambin otro
que produce la planta llamado vincristina, o VCR, los que fueronamplian~nte
se expeden con los nombres comerciales de ONCOVIN y VELBAN (Laboratorios Eli Lilly Y Ca.),existiendo numerosos reportes de que ha "curado" 47 tipos de cncer y prolongado la vida de nios leucmicos, (Svoboda. 1962; Neuss, et
~.,
Su mtodo de accin no se conoce con exactitud, aunque se suponeque interviene en el metabolismo del cido glutmico y que "corta"
el aporte energtico en la clula (Calabresi y Parks, 1974).
Evi
~.,
1960), al impedir la --
formacin del huso acromtico; as que, en la clula se duplicanlos cromosomas pero .. tJo _se .. separan.
Hample y Gerhartz (1964). ya han demostrado "in vivo" e "in vitro"
que la VLB causa un bloqueo en la metafase.
La-
igu~
~.
cultivadas de la especie antes mencionada, contenan una pequeacantidad mayor de alcaloide que las plantas silvestres.
Sievers
(~.
"el porcentaje de alcaloides en las hojas de diferentes plantas cultivadas era extraordinariamente mayor, y que plantas ricas en
a1caloides continuaban produciendo descendencia con alto contenido, as que por simple seleccin se poda producir una mejora en el producto comercial'~
En relacin a
Vlg~ p~p~ea
h~
chos como el de que "las hojas del primer ao no son necesariamente ms dbiles que las
no se tenga que esperar dos aos para obtener una cosecha de hojas
con buen poder farmacolgico.
Pagani y Romussi, (1966) publican que el contenido de cardenli-dos, principios activos de
Vlg~ p~p~ea
L. en plantas sil--
vestres y cultivadas es similar, pero que en las cultivadas hay ms hetersidos y muestran marcadas propiedades farmacolgicas.
Por tal razn y con el objetivo de lograr un mayor porcentaje de-
28
------
-------------------------------
principios activos por planta, ya desde 1944 Pennick y Compaa inician el cultivo de
V~g~
p~
V~g~ ~P.,
~.
cont~
niendo su mxima concentracin en los meses de junio y julio". -Evans y Cowley (1972) obtienen resultados similares al estudiar la misma variacin pero en
V~~ punp~ea
L. en Londres Ingl~
terra y registran que la mayor concentracin de digitoxigenina -ocurre al 60. o 70. mes de vida de la planta y que en cambio la digitogenina se acumula en el 20. ao de vida cuando la planta
dura y florece
m~
"Como orientacin general y con toda clase de reservas, puede decirse, que los rendimientos cuatitativos de muchas especies de -plantas medicinales son siempre mayores a pequeas altitudes, --mientras que en 10 referente a la riqueza en principios activos la discrepancia es mayor y no permite ninguna conclusin de la -que se deduzca ni siquiera una simple orientacin.
r~
lacin con el metabolismo del nitrgeno es natural que en su formacin influya bastante la temperatura; por eso, se ha observadoque en algunas especies, a mayor altitud, y por consecuencia msbaja temperatura, disminuye su riqueza en alcaloides.
Es natural
que con compuestos como los glucsidos ocurra lo inverso, es de-cir, a mayor altitud mayor intensidad luminosa, la fotosntesis es ms enrgica y por tanto mayor la formacin de hidratos de car
bono" (Madueo, 1973).
El mismo autor continua diciendo: "En relacin a la accin de latemperatura y la iluminacin se ha observado resultados contradic
torios, pero parece frecuente que despus de varios das despejados y de fuerte temperatura baje la riqueza de alcaloides, lo
30
Adems se ha com
en un da soleado. al principio de la tarde, Silva (1966), dice -que se debe cosechar a media maana, tambin en un da soleado, y
que as se logra obtener un 40% o ms, de contenido en principios
activos, comparados con su existencia en las horas de la noche
0-
del crepsculo.
Por lo tanto, en esta investigacin se colectarn las plantas a diferentes edades y se compararn ambas, creciendo bajo condiciones de invernadero y al exterior.
31
111.
MATERIALES
A.
B.
ESPECIES ESTUDIADAS
A.1.
A.2
VlguLena buddtelae6a~
A.3.
Ca.tfuvta.n;thuJ., Jto.ew..
1.
TAXONOMIA
El gnero fue establecido por Linneo, pertenece a la familia Compositae.Subfamilia Tubuliflorae, la especie H. mexlcanum se encuentra
descrita en el prdromo de De Candolle, Tomo V, pgina 665 (Carri-110, 1887).
Gnero Helenium L.
vulg~
res: "rnica del pas, chapuz, amargosa, rosilla de Puebla, cabezona, hierba de las nimas o manzanilla monts".
11.
DISTRIBUCION GEOGRAFICA
El gnero Helenium se distribuye a travs del continente Americano-
32
pr~
Sus
In--
IV.
UTILIDAD DE LA ESPECIE.
Carece de empleo, y es nociva para el ganado.
v.
su peridica inundacin; la planta es regularmente abundante en 1azona,en donde alcanza a medir 90 cm. de alto; y fu obtenida en varias recolecciones efectuadas alrededor de los meses de julio a
se~
-_.~---
He/enium mexiconum H B. K.
Vig~eha buddteiae6o~
B.2.
l.
TAXONOMlA
Vig~eha
G~
buddteiae6o~
Bentham y Hooker ex Hemsl. (Biol. Centro Am. Bot. 2:177), quienes corrijieron a De Candolle, quien la llam en 1836
Hetia~
buddteiae6omi-
buddteiae6o~
es tpi
Vive en-
bosques de conferas, pero se le puede hallar en encinares y en matorrales, en el valle de Mxico y en el centro y sur del pas, (Paray, 1958).
III.DESCRIPCION BOTANlCA
Es una hierba o arbusto perenne, hasta de 3 m de altura, velloso, en su
parte superior peniculadamente ramificado, con 8 a 90 cabezuelas en ---panculas hasta de 25 cm de ancho.
riores,alternas cerca de la inflorescencia y angostamente oblongas, ovadas o lanceoladas; las inferiores ovadas agudas, cuneadas o redondeadasen la base, subenteras o aserradas, trinervadas con la nervacin reticulada.
citados).
IV.
UTILIDAD DE LA ESPECIE
No se le conoce algn empleo y en el estado de Hidalgo se llama vulgar-mente "cerote" (Ramrez y Alcocer,
V.
QE..
cit.).
alreded~
res del Km 15.5-17, de la carretera Mxico-Toluca (# 15), donde vive -formando algunos manchones puros, en una zona altamente perturbada.
gunos individuos alcanzan all hasta los 2 metros de altura y es
Al-
median~
36
-r
Ij
V. maJolt.
Ij
tre LochneJta
Ij
V'nca..
37
~o~ea
Cat~
al gne-
Tco~~,
con flo-
res color rosa: 2) varo atbU, de flores blancas; 3) varo ocetiatU6, con
flores blancas con un crculo prpura en el centro y 4) varo
V~OUUj
ma~
zo y el 8 de abril) aunque ya haba sido citada desde 1835 por su hermano David (En: 1764), tiene prioridad sobre
Lochn~a
(agosto de 1838).
El nombre
Lochn~
Lochn~
C~nthU6
Lochn~
una
~nthU ~o~~
V~nca ~~ea
Familia:
Apocinceas
Subfamilia:
Plumerioideae
38
Tribu:
Alsotonieae
Subtribu:
Ca.tiuVe.an.thu
G. Do n
11.
Do n.
DISTRIBUCION GEOGRAFICA
Es una especie pantropical que problablemente se origin en Madagascar o
en las partes tropicales del viejo mundo (Calderon, y Standley, 1941); se dispers por cultivo a la India, Indochina, Indonesia, Las Filipinas,
Australia, Sud-Africa y el Oriente, Amrica, Las Indias Occidentales, Eu
ropa y an en Rusia.
En Mxico se distribuye en las zonas tropicales de Jalisco, Yucatn, Pue
bla, Veracruz y Oaxaca y el autor la ha visto desarrollndose en los Estados de Michoacn, Guerrero, Morelos, Puebla, Veracruz, Campeche,
co y Quintana Roo, cultivada para ornato.
Taba~
39
Los
hermanos Dond (1905) la registran como conocida en Yucatn con el nom-bre popular de "vicaria" casualmente el mismo, con el que este autor laconoci en Cuba, e igualmente como le nombran en la Repblica de El Salvador (Calderon y Standley,
111.
~.
cit.)
o biestipulado en su base; flores axilares, solitarias o en pares, ssiles, actinomorfas, hermafroditas, de color rosa, o blanco, plido por el
lado de abajo, y con el centro rojo o prpura oscuro, aunque hay varieda
des sin este punto rojo.
Cliz de 5 divisiones
(Snchez, 1976).
Los folculos o vainas tienen de 2.5 a 4 cm de largo y de 2-3 mm de-dimetro y contienen de 15 a 20 semillas cada una con un tegumento
do de color negro. (Stearn,
~.
delg~
cit.).
40
IV.
UTILIDAD DE LA ESPECIE.
La "pervinca", "maravilla de Espaa", "maravilla", "ninfa", "Teresita" ,"vicaria" o pata de perro" tal como se conoce popularmente a la planta en las zonas tropicales de nuestro pas, tiene una remota historia de -ser empleada como remedio en contra de una variedad de enfermedades, pero no en Mxico, en donde hasta lo que se pudo averiguar slo se le em-plea como ornamental.
En el Cuadro No. 1 se enlistan sus usos.
V.
PROCEDENCIA DE MATERIAL
~o4euh
La re-
coleccin se hizo durante los meses de mayo, julio, octubre y diciembrede 1976, cuando la planta tena frutos (vainas).
Esto tuvo que efectuarse de esa manera, ya que no haba semilla
comer--~
41
I
USO REGISTRADO
PARTE EMPLEADA
PA1 S
Hojas
Races
Toda la planta
Hojas y toda la planta completa
Antidisentrica
Antigalactagoga (que detiene
la produccin lctea)
Antisptico (vas urinarias)
Astringente (para retener las evacuaciones intestinales)
Depurativa (Laxante).
Diafortica (q~e provoca la sudoracin o transpiracin)
Dolor dental
Dispepsia (trastorno digestivo)
Emenagoga (que provoca y regula la
menstruacin)
Fiebres intermitentes (malaria)
Infecciones de la piel
Menorragia (Menstruacin excesiva)
Piquetes de avispa
Regulador menstrual
Vermfugo
Vomitivo
Vulneraria (que cura heridas o llagas)
El Salvador y Cuba
Fil ipinas
Viet Nam del Sur
Sud Africa, Natal, India, Australia,
Sud Viet Nam, Filipinas e Inglaterra.
Viet Nam del Sur
Planta completa
Raz
Hojas
Fil ipinas
Raz
Viet Nam del Sur y Central
Raz y planta completa
Hojas, raz o la planta completa Sud Viet Nam
Sud Africa
Raz y hojas
India
Jugo de la planta
Nor Viet Nam y China
Parte area
Madagascar
Raz
Madagascar
Hojas
Isla de Mauricio
Raz y planta completa
CUADRO NO. 1; Usos de CathananthU Aa~eU (L.) G. Van (Vinca Aa~ea L.) segn: Farnsworth, 1961; Caldern y
Standley, 1941 y Sayas, 1977.
,:..
t..;
SUSTRATO DE CRECIMIENTO.
Se emple como sustrato para el desarrollo de las plantas a tierra oscuraforestal, del Parque Nacional de Zoquiapan, ubicada en Ro Fria, Estado de
Mxico, la cual tiene las siguientes caractersticas fsicas y qumicas*
COL O R
En Seco:
En hmedo:
Gris-oscuro
Arena
Arcil1 a
Limo
43%
18%
39%
CLASIFICACION
TEXTURAL.
Franco
pH: 6.40
~/
Se le considera un buen suelo, slo que algo pobre de fsforo, deacuerdo con las tablas de niveles aplicables a suelos agrcolas
!~/
D.
Entre 3,000
3,200 metros.
Latitud: 1920'
Longitud: 9830'
44
IV.
METODOS:
A.
Hel~,
levemente, dejaron en libertad a los frutos (aquenios), que tienen una sol a semi 11 a cada uno (monosprmicos).
2)
En el caso de
V~~ena,
45
B.
DISEO DE LA SIEMBRA
La superficie til de un invernadero (facilitado por el Instituto Nacional
de Investigaciones Forestales), y su rplica al exterior en terreno de lamisma institucin en Coyoacn, D.F., fueron divididas en 9 partes en cadasitio. midiendo cada una de ellas aproximadamente 2.60 m2; cada una de las
cuales fue empleada para repetir 3 veces cada siembra.
Es decir, cada especie estuvo repetida en tres sitios separados a la intem
perie y en otros tres en el invernadero.
El cuadro No. 2 ilustra la disposicin escogida y en donde las letras a) significan He1.en.tum meuc.anwn; b) Ca.:thattan;thu,6
/U)~eu.6.
c) V.<.gc.vz.a budd---
ie.i.a.e.6ol'.mJ
. o
83
el-
183m
1""
b
le
o
N
o
N
,.;
'"
jO)
o
"!
"':
a ..,
'ti
e
t+
2UIO
0.84 m
+1
46
C.
SIEMBRA
Con tierra previamente fumigada con bromuro de metilo. se llenaron cajas o
mesas de crecimiento hasta lograr una capa uniforme de aproximadamente --16 cm de espesor.
semillas, cubriendo stas con una capa muy delgada de la misma tierra.
La cantidad que se sembr por separado en cada parcela fue:
8.90 g de semillas de
14.00 g de semillas de
6.00 g de semillas de
Hete~um mex~canum
Cath~ ~o~~
V~~~ buddt~ae6o~~
result~
47
D.
RIEGO Y SOMBREADO
Los riegos fueron dados en el invernadero diariamente mediante unsistema de aspersin automtico, y al medio ambiente con regaderade mano, efectundolos diario o cada tercer da; fue necesario cubrir por las tardes con medias sombras las parcelas del exterior,con malla mosquitero plstica negra, a fin de evitar la desecacin
del suelo, hasta que se regulariz la temporada de lluvias.
Fig. # 1
48
0.2.
PROBLEMAS SANITARIOS
Durante el curso de la investigaci6n, en el invernadero, se hicieron aplicaciones de fungicidas (Manzate y Captan) al suelo y plantas durante los tratamientos se suspendieron los riegos diarios y
se removi6 el suelo para combatir las enfermedades fungosas que se
presentaron en races y hojas.
Fig. # 2
Izquierda, estrangulamiento y necrosis del cuello,
"damping-off o mal del semillero"; derecha plantas sanas.
produ~
to llamado Tapps, para contener el excesivo nmero de caracoles dejardn y "tlaconetes" (He..Ux -6p. y Umax o PlUtomyc.w.. -6p. respectivamente).
49
D.3.
INVERNADERO
Se le dot con equipos de calefaccin y enfriamiento automtico, que permitan lograr que la temperatura mnima no fuera menor a 13-14C y que la mxima no sobrepasara los 35C,se llevaron registros diarios de la temperatura y humedad -con un higrotermgrafo y con varios termmetros de mxima ymnima, repartidos en el rea del invernadero (Fig. # 3 l.
Fig. # 3
al
b)
e)
d)
50
siguiente gr,fica:
50
40
"",.-
_._._._.-"-";
TEMPERATURA
M
M
E S E
(1977)
ASO
-- ---
'.
'._.N
MEDIA
GRAFICAIt 1
-._._._._
REGISTRO DE LA TEMPERATlJRA
OE.L.INVE.RNAOERO
51
3.2. EN EL EXTERIOR
Fueron recabados datos diarios de temperatura, humedad ambiental, precipitacin pluvial, nublados, etc., por la Srita. Ma. Luisa
~1aya
En la Grfica # 2, se presenta la informacin referente a la temperatura media y precipitacin pluvial, del ao de 1977, en Coyoacn(Mxico, D.F.).
11)00
200
...J
::)
en
Z
1&1
100
150
2l
Z
o
u
e
11:
::)
a::
101
L
...
.,::.
(O
30
CL
!si
2i
2l ~
&al
80
40
40
20
..,o
&al
e
c..
:lE
20
10
J
M
GRAFJCA~2
E S E S
(1977)
-_---.TEMPERATURA
- - - - PRECIPITACIOI't
COYOACAN. D.f.
52
E.
V~g~ena;con
Hetenlum no se in--
tent. por ser su tallo completamente herbceo adems de que dicha espe-ce es anual.
Se hicieron ensayos de estacado en tierra y en arena de ro mezclada convermiculita, aplicndoles hormonas vegetales (ROOTONE) a las porciones -que se enterraron, y dejando sus correspondientes testigos sin aplicacin.
Las estacas fueron colocadas en un cuarto mantenido a temperatura
consta~
te (20C). donde haba un humidificador de ambiente' tipo domstico medicinal", para lograr tener un 80% mnimo de humedad constante, y favore-cer
eJ~nraizamiento
Fig. # 4
de 1as estgcas ..
Ensayo de propagacin .de estacas de V~9~ena budd1.eJ.a.e.6orom~,a la izquierda con hojas y a la derecha desprovistas de ellas.
53
F.
s~
parando. las procedentes del invernadero, de las del exterior (Cuadro ---
No. 3).
Todas fueron arrancadas del suelo, enjuagadas con agua corriente para
l~
var las races, escurridas para eliminar el exceso de humedad, pesadas en verde y puestas a secar en compartimientos cerrados, adaptados para este fin, los cuales secaban lentamente a las plantas mediante corrien-tes de aire fro.
Una vez logrado lo anterior, eran nuevamente pesadas y se les envasaba en bolsas de papel, cerrndoles bien y conservndolas en cajas de cartn
para su posterior anlisis qumico.
Mensualmente eran tomadas al azar 20 plantas de cada especie, a las quese le media y pesaba, registrndose su crecimiento.
54
CUi\DRO NO. 3
TABLA
DEt~OSTRATIVI'
r N V E R NA O E R O
E X TER 1 O R
ES P ECI E
FECHAS DE SIEMBRA
Y BROTACION
He...te.1'Um
me.Uc.a.ruul1
14 de dic.
27 de dic.
V-4JlelUt
28 de dic.
8 de febo
bu.dcU.a.e.6oltm,u
Ca.thaJLa.n.thU6
IW.6e.w..
------ -
4 de ene.
1 de febo
COSECHAS
MES
FECHAS DE SIEMBRA
y BROTACION
3 de dic.
13 de dic.
28 de d-ic.
10 de ene.
8 de dic.
15 de dic.
COSECHAS
MES
--- -
* Muestra procesada hasta extracto crudo total, con cuyo nmero aparecer en los cuadros de resultados.
** Muestra cromatografiada hasta separacin de los principios activos buscados.
CJ1
CJ1
S. O. N. E.
21*
F.1
sat~
filtr~
y extrajo varias veces con cloroformo, la.vndose con agua; para eliminarel alcohol; la porcin clorofrmica fue secada con sulfato sdico anhidro,
filtrada y concentrada al vacio casi a sequedad, en un rotavapor.
A los extractos as obtenidos, se les cromatografi en placas delgadas de
silice G. usando como testigo muestras autnticas de helenalina*y budlenas "A y B" **.(En el cuadro No. 3 aparecen los datos de las muestras prQ.
cesadas hasta ese paso).
Las placas fueron corridas en una cmara de vidrio empleando como eluyentes al benceno y acetato de etilo (4/1), y se revelaron aplicndoles una
aspersin de sulfato crico disuelto en cido sulfrico y enseguida se -les calent en parrilla elctrica apareciendo los diversos componentes en
forma de manchas oscuras.
*
**
cromat~
grafa en columna. empleando como adsorbente a la almina Alcoa F-20,(previamente lavada con acetato de etilo y secada antes de colocarla enla columna) y diferentes eluyentes (benceno puro hasta obtener en una -fracci6n a la helenaiina, y cloroformo-acetona (85/15), para separar las
budlefnas "A" y "B"); las fracciones que cristalizaron fueron recrista-lizadas con acetona y ter isoproplico, para determinarles puntos de fu
sin y anlisis espectroscpico con rayos infrarojos para confirmar su identidad.
57
F.2.
~.,
cas de vincristina (VCR) y vincaleucoblastina (VLB) (Cedidas por sus fabricantes, los laboratorios Eli Lilly de Mxico).
das de la separacin en columna de un extracto de estos alcaloides, fueron tambin cromatografiadas en placa delgada, y comparadas con muestras
autnticas (Vase figuras en el Captulo de Resultados).
58
V.
RESULTADOS
A.
Hde.n..J.m me.c.a.ywm
des~
fru~
not~
dose que bajo las condiciones del primero. complet su ciclo vital -dos meses antes (junio y agosto, respectivamente), adems la brota--cin fu mayor en un 55% y ocup tres das menos que en el exterior.
En ambos casos, se obtuvo semilla frtil. ya que la polinizacin la realiza el viento.
Fig. # 6
Heter~ me~anum
Esta planta present una brotacin superior hasta en un 60% en el invernadero, aunque sufri una mortalidad muy grande durante los dos -primeros meses de vida, posiblemente ocasionada por el ataque de hongos a las hojas y raz (a los que no fue posible aislar en los cultivos quese hicieron); pasada dicha etapa, las sobrevivientes empeza-ron a crecer muy raquticas, acamndose desde el 3er. mes.
En comparacin, las plantas manejadas al exterior tuvieron un creci-miento ms lento, lo que retras la primera recoleccin del materialpara anlisis qumico, hasta el sexto mes, en vez del primero o
segu~
60
Fig., # 7
V~g~~a buddlelae6orom~
crecimiento
en diferentes estados de
61
Fig. # 8
20~
o
o
o
110
,c'
70
(J
o::
lA'
60
Al
:)
1...J
50
lit.
40
.-
1.-
A
,O
30
20
(ji
oi
o
o
o
A/
0_0_0
'"
,...........-/;;:
000000
---
....... ,,..,../
j/
---
---
q, ~ <Il<llFLORACION
*** FRUCTIFICACION
_1
***
/0
-__
j,/!<D/~
o
o
I
I
lA
<'
""
80
<t
-tc_ oo _*
fJ/
90
/*
100
10
~.~.~
ff
o
o
~o__~o~______________
~~
_ _ _....;~
_ _~=~
_ _,
9
10 __~
11 __~
12 __- :13; -__~~.1la
14
~
2345
El
EDAD
GRAFICA
:3
(MESES)
d~
rante los dos primeros meses, con el fin de dejar mayor separacin entre plan-taso
63
B.
CUADRO NO. 4
ESPECIE
He1.eni.wn
lileJc.a.YIWn
11
11
11
11
FECHAS DE:
COSECHA
SIEMBRA
P R E T R A T A MI E N T O
31-VII
1976
75
28
N 1 NG UNO
25
28
G UN O
43
20
N I NG UN O
80
20
11
11
11
26-VII I
1976
diciembre
1977
POR CIENTO DE
GERMINACION.
DE
DIAS.
N('.
V.{.g Letw.
bu.ddtua.e6olln
11
"
11
11
11
Ca.thaJtaJrthU-6
9-XII
1976
lO-XII
1976
20-XII
1976
sept. 77
31-V-76
l-VI-76
81
12
ju1io-76
sept. 76
sin remojo
10
12
42
30
12
12
34
12
N1
r~
fLO~eU-6
" "
'""'"
C.
DE LA PROPAGACION ASEXUAL
En los ensayos de propagacin asexual se obtuvieron los siguientesresultados:
1.
Vigul~ buddteAae6o~,
2.
Positivos en el caso de
Catha4a~ ~o~~,
en los diferentes-
ellas formaron raicillas, a los 2 meses de estacado, sin la aplicacin de hormonas, empleando el sustrato arena-vermicul ita (75/25).
I
I
65
D.
me~c.a.n.um,
tot~
revelaron la presen--
cia de helenalina al ser comparados con muestras autnticas; en todos los casos se revel su presencia tanto en el exterior como en el invernadero. as como la muestra de planta que se cosech en --Ecatepec, Estado de Mxico y que creca en forma silvestre -------(Figura No. 10 ).
En el esquema que se muestra en la figura r-Io. U se aprecia una --comparacin de 1a cromatopl aca de 1a's diferentes fracciones obtenidas al hacer las respectivas cromatografas en columna de las muestras nmero 2, 10 Y 11.
Como all se puede notar, se obtuvo helenalina, la que se purificpor sucesivas cristalizaciones hasta que su escasez lo permiti; no
se logr una muestra de alto grado de pureza, sin embargo se identi
fic sin lugar a duda al comparrsele espectroscpicamente con ra-yos infrarojos* (Espectros nmeros 1 y 2)
dos sus puntos de fusin;** los que fueron: 165-167C de cristalesobtenidos en las fracciones 6 a 12 de la muestra No. 2.
:/ Determinados por el Quim. Rubn A. Toscano con un espectrofotmetro PerkinElmer Mod. 337 y corridos en penculas de cloroformo.
**/ Los puntos de fusin no estn corregidos y fueron determinados en un aparato Fisher-Jones.
66
y J. Romo, 1961).
perfe~
67
H S
~3
~,
~ ~ To ~ ~,
H ,;
E X TE RIO R
,NVERNADERO
silvestre.
FRACCIONES
O
O
5O
-o
~a
Fig. 11
T
2
O
b
0 <l O 00
00 O O O
00
00
(}
g 00 O~GO O~ o
GO O
O
e dT e f
10
\1 ~
T i
j
.11
a.
2-12
b. 13-17
C. 4-14
deiS-U
/j -29-39
'=33-52
9 =53-63
ti oS4-78
1=2-10
1'52
k =33-42
I "46- 00
4.0
(O.V
MICRONS
nO
5.0
1'.0
9.0
10.0
di ".---:: .
!
ESPECTRO #
- - -..:;: HELENALlNA
AUTE NTICA
4.0
3.5
MICRONS
5.0
8.e
6.0
9.0
.1_ - _.~_
~-
.,.
;.-_.~_.",:,-.
__
3eoe
-"------_
.. -_.. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ... _
-,:"",_"
,L-_ _ _ _ _
2500
ESPECTRO # 2
2000
f'RACC10N~5
1500
..... - - - - - . - . - .
1200
40 - 45 DE LA MUESTRA
11
1100
10
0--'
D. 2.
V-igu..{.e/r.a buddtca.e6oJun,u,
Esta planta tambin elabor bajo cultivo los principios activos de inters buscados, en las dos condiciones en que fue propagada, y a las diferentes edades en que fue cosechada (cuadro No. 3), como se puede notar en las figuras No.12
13.
correspo~
de una del
invernad~
"B".
Esto fu confirmado al comparar los espectros al infrarojo de dichas --fracciones con los de muestras autnticas, como se aprecia en los espectros 3 al 5.
No fue posible purificar dichas substancias, razn por la que sus puntos
de fusin no fueron coincidentes con los de muestras puras.
68
---------------.
OoOo60b
00
OooooobI
00
0Qoaoo?
O 80000c:oOoo
1
O O O O O 0:0 OO
OO~OR()!
00
0&
coooU.
Fill. 12
'----(}-
S .13
15
16 17 ,18
INVERNADERO
19 20,
EXTERIOR
Cromatograffa de muestras de
V'lPera buddleiaeformis
T=Budlena '~'
S = Planta Silvestre
FRACCIONES
a = 20- 30
b= 31-35
c= 36-42
d" 8 -19
()
e = 20-28
~ O~
O
o
O
00
10 O
000 00
00
AB e
17
Fil). 13
f = 30
<.; = 36-40
lo
Q
d A 8 ti f
19 .
hA
20
8i
h = 42-44
i = 46-56
A
B
= Budle(no'A
= Budle(na ''8''
fI
... '"!f
4.0
3.5
MICRONS
5.0
8.0
6.0
9.0
,
..... ..o.- __
O.rI
, '
JOOO
I ,
1200
1500
2000
2500
'lfOIIlNCY (CM")
ESPECTRO #
:3
----:
4.0
3.5
MICRONS 5.0
FRACCIONES
20 -
e.o
6.0
9.0
-:-
I .: ~ . ,
.10
1300
1200
(C~_l)
ESPECTRO It ..
fRACCIONES S - I~
FRACCIONES i5 /lo 19
MUESTRA
**'
19
! - "- .
.~~-+----+\~~~
1500
fUQl'E\iCY
.. :--..:1 :.: .. :.
,.
.~_.~
1100
11
3.5
4.0
.....ICRONS
5.0
6.0
9.0
8..0
: __ j__ ..L.~
t--~
2500
ESPECTRO ;: 5
2000
1200
1500
!"RACCIONES
3! A 42
MUESTRA tt 20
1100
DE LA'
10
las-
ce~
cana al sitio de aplicacin de la muestra, puede incluir a la vincristina (VCR) y dentro de la mancha naranja se puede hallar la vincaleucoblas
tina (VLB), (Farnsworth, 1964).
o sea
den a las plantas que crecieron en el exterior y las restantes del inver
nadero) se aprecian manchas azules y naranjas. 10 que indica que muy posiblemente en ambas condiciones y a pesar de las diferentes edades de
r~
coleccin, se produjeron los dos alcaloides de inters mencionados, adems de otros de los 65 que la especie elabora.
En la figura 15, se muestra un esquema tomado de la cromatoplaca de las
fracciones obtenidas al cromatografiar en columna el extracto No. 25.
Con lneas cortadas se marcan las manchas que fueron visibles con luz ul
travioleta de onda 1arga. y con lneas contnuas, las coloreadas al reve
lar con sulfato crico amoniacal.
Se puede ver que hay manchas que corresponden con las formadas por las substancias autnticas, utilizadas como patrones.
69
6 0
Muestra
prpura
azul
pardo verdoso
Muestra
amariUo
beige
purpura
amarillo
prpura
naranjo
violeta
2-
22
prpura
amarillo
eP
verde
naranja
amarillo
azul
pardQ claro
21
amarillo
azul
amarillo
azul
azul
prpura
amarillo
azul
gris rosceo
2
p~rpurQ
prpura
amarillo
naranja
rOlo
o
O
rosa
naranja
azul
gris
azul
violeta
pardo verdoso
pardo verdoso
0'=--------------
2-Muestra
25
(\
cP
O
amarillo
)Qazul
)J
azul
lJ"i.
prpura
naranjo Y
prpura
rosa
O _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _....pordo
~fo~~to
O-_
Mue.tra
24
2_
(}d
Muestro 23
tJ
amorillo
azul
prpc.;ra
amarillo
prpura
naranja
prpura
azul
2_
EXTERIOR
INVERNADERO
Fig.14 Cromat9graffas bidireccionales de extractos de Catharanthus roseus (L. ) G.
Don y su coloracin al revelar con sulfato crico amoniacal.
@)
1-5
Fig.15
~
"
/\ 8
:(0 O
O~ ,
r---"'--O
15-19
veR VLB
Prpura
rosa
fl
~ ~ ~-D ~
21
23
25 29-31
Prpura y
amarillo
Prpura
azul
f)O
o tJ:
u
7-13
O~
Pi
01v
Verde y
amarillo
': L
veR VLB
35-39
Naranja
Violeta
azul
VI.
DISCUSION
A.
explot~
do, no se deja lugar a la floracin, con su consiguiente deterioro gentico, ya que el hombre arranca los ejemplares ms vigorosos;
no
dejndolos llegar a la fructificacin y diseminacin de semillas y an podra llegar a ocasionar graves descensos de la poblacin, si no se le permite llegar a un equilibrio como ha sucedido con variasespecies tanto vegetales como animales, para las que se requiri la
70
implantacin de vedas.
Es necesario realizar varios estudios para llegar a lograr su
produ~
cin a escala comercial, entre los que destacan las investigacioneseconmicas previas que garanticen su redituabilidad sobre otros cultivos, por ejemplo de plantas comestibles, ya que no son muchas comparativamente con estasltima$, las .plantas medicinales que se culti
van, aunque no se excluye la posibilidad de que ambas crecieran si-multneamente, con beneficio doble.
Tambin se requiere ampliar los conocimientos acerca de la autoecolo
ga de las especies, aqu comenzadas a estudiar, mismos que haran posible que se les pueda cultivar con mayor margen de seguridad.
En el caso de Cathananthu6
~o~~
i~
71
Tambin nuestro pas podra exportar el producto semi terminado en vez de vender planta, ya que el producto terminado (sulfatos de vincristina y/o vinblastina) es muy laborioso y difcil de obtener, por
tener que hacer la separacin de los alcaloides activos (ya
mencion~
B.
(Hete~
V~guiena)
difere~
la
primera y de la segunda no se conoce casi nada, excepto la descrip-cin botnica y el anlisis qumico, que son mencionados en la literatura, ignorndose sus hbitos de crecimiento.
tercera especie. CathananthU6
40~eU6,
En relacin a la --
pa~
Hete~,
C~
fl~
m~
duran, y se caen, lo que podra ser debido a que los individuos son
jvenes todava, ya que se trata de especies perennes.
~,
arra~
carla totalmente, y as se dispondra de propgulos que podran sertiles por muchos aos.
Vigul~a buddl~e6o~
mKh, pues cosechando solamente los renuevos con hojas y dejando los
tallos, pueden efectuarse varios cortes al ao, sin causarle gran
d~
o a la planta.
Hete~
apreci que tal vez debido a la alta densidad con la que fue sembrada, se present una fuerte competencia, y a pesar del aclareo que se
hizo en varias ocasiones, no quedaron las plantas con un
espaciamie~
to adecuado, lo que pudo apreciarse ya que no todas las plantas emitieron tallos florales, es decir no todas maduraron, lo que si se
p~
do apreciar en aqullas que fueron trasplantadas y que crecieron enmacetas o botes individuales, donde una gran proporcin madur co--rrectamente, emitiendo flores que se transformaron en frutos.
El porqu
Vigul~a
llo tan largo y delgado que no se poda sostener erecto, es algo que
puede tener muchas causas; tal vez la combinacin, alta temperaturahumedad, la hizo desarrollarse muy aceleradamente, descompensando su
metabolismo normal. lo que se puede corroborar al ver las plantas
73
que estaban creciendo al mismo tiempo en el exterior las que lo hi-cieron a un ritmo mucho menor, pero con gran vigor y despus al ---14avo. mes dieron un espectacular incremento en altura (Vese
capt~
p~
Hete~
y --
para purificarlas, es decir,par,a sep3.rar los cristales de las subs-tancias, ya que ellas estn incluidas en aceites, lo que aunado a su
74
p~
no se pudieran separar ambas budlenas y aunque se les logr aislarde otros compuestos e identificar plenamente por medio de sus espectros en el infrarojo, no se les logr aislar muy puras, pues el proceso de purificacin tuvo que suspenderse por falta de material.
Aunque la helenalina se halla en la
pla~ta
las lactonas antes mencionadas., su cantidad varfa, segn la etapa -del ciclo vital en la que es determinada, desde 0.05 a 0.228% de --planta seca (J. Romo y A. Romo, 1961).
Como se v en las cifras anteriores, su presencia en la planta no es
muy abundante, y los autores antes mencionados para lograr esas de-terminaciones requirieron de 7 y 25 Kg de planta seca (respectiva-mente), lo cual
~aciendo
cie se requerir disponer si una planta de esta especie al llegar asu madurez pesa ya seca, 2 gramos.
En este trabajo se analizaron muestras de la planta de varios pesosen promedio 50 gramos, los que dieron una cantidad de extracto de -0.600 g.
75
Lo interesante es que a pesar de la baja cantidad de planta analizada, fue posible detectar que la planta elabor la 1actona, tanto en
condiciones de invernadero, como en las del exterior y en las dife-rentes edades en las que fue cosechada (Cuadro No. 3); apareciendo desde la muestra ms joven que se tom cuando la planta tena 2 me-ses de edad.
Los resultados obtenidos al tratar de separar los alcaloides de ---Ca.:thaJr.a.n.th no son conc1 uyentes en cuanto a que no se logr separar
de los 65 que la planta elabora, los dos de inters farmacolgico: s en cambio son positivos; ya que el proceso para separarlos es enextremo laborioso y complicado, lo que aunado a las tan bajas concen
traciones en que se presenta en la planta (0.00025% de vinca1euco--blastina), puesto que se trabaj tambin con muestras de planta pe-quea (100 g. aprox.), se obtuvieron extractos crudos totales de alcaloides de cantidades tan pequeas como 0.476 g. en promedio, lo -que lgicamente haca difcil su separacin total.
Aunque se estudiaron diferentes mtodos de extraccin y separacin,ninguno se consider ms adecuado que el recomendado por Farnsworth(1964), que agrupa los hasta ese ao descubiertos 63 diferentes a1-caloides en ocho categoras o clases de acuerdo principalmente a sus
reacciones cromognicas. al ser revelado el extracto con sulfato crico amoniacal, .as como se aprecia en las Figuras No. 14 a 15, donde
76
~. (1963)
empleando la mezcla de eluyentes que ellos recomendaban para la cromatografa en capa delgada.
D.
eanum y
Cathanant~ no~eu
m~
2).
3).
V8~ena
no perdieron su capacidad
germin~
tiva al cabo de 10 meses de almacenamiento, sino que la incrementa-ron, manifestando que pasaron por un perodo de latencia, al que sera conveniente tratar de interrumpir con remojos en agua fra,
77
rem~
s~
ron menores que las semillas que slo se enjuagaron, porque stas
t~
E.
I
, I
l.
ser esta especie anual y de ciclo corto (6 meses) no hubiera prosperado al ser enterrado su tallo herbceo en el suelo; ste fcilmente
podra ser atacado por organismos saprfitos o parsitos del suelo,los cuales los destruiran antes de la formacin por las yemas
res de raicillas.
axil~
de grandes cantidades de substancias de reserva que nutrieran a la planta, mientras ella lo haca por si misma.
2. V-tglLLVta.
fue que stas se mantuvieron dentro de un cuarto cerrado, a temperatura de 20C constantes dotado de iluminacin fluorescente, y alta humedad.
rpidamente pero estaban clorticos, es decir amarillentos, y tal -vez les falt iluminacin y les sobr humedad, ya que cuando murie-ron se sacaron las plantas del suelo y se vi que se form callos;-dad ms no races.
78
3. CathaAanthu4 ~O~eu6.
un porcentaje bajo (20%), 10 cual pudo deberse a que las estacas fue
ron tomadas de material muy joven (5-7 meses de edad), es decir, que
si el material hubiera tenido ms cantidad de reservas o mayor lig n1
ficacin en el tallo, se podra esperar un prendimiento de un nmero
mayor de estacas.
Conviene por ltimo, hacer notar que se requiere mayor investigacin
al respecto, de las tres especies aqu comenzadas a estudiar, para _
llegar a concluir y recomendar algo con suficiente apoyo experimen-tal pero con base en los resultados obtenidos y con las debidas re-servas, se puede llegar a concluir y sugerir 10 siguiente: aunquefalta an mucho para tener 1ista de serie de recomendaciones que pe!.
mitan cultivar y explotr comercialmente las plantas aqu estudiadas,
con esta contribucin, dentro de su modestia, se cree haber aportado
algo al conocimiento de tres especies muy prometedoras para nuestropas, y podra ser el inicio del completo esclarecimiento de todas _
las dudas que an quedaron en esta investigacin.
79
VII.
CONCLUSIONES Y SUGERENCIAS
1.
He1.erwn mec.anum
Esta especie puede ser cultivada en suelos impropios para los cultivos agrcolas, en lugares sujetos a inundaciones peridicas mismas que favorecen el desarrollo de la planta.
80
No soport las condiciones de crecimiento del invernadero, tal vez, fueron demasiado altas las temperaturas y la humedad.
Su desarrollo en el exterior, es muy lento durante su primer ao de vida,
incrementndose notablemente de los 14 a los 18 meses; posiblemente sta
sea la poca ptima de la primera cosecha.
Resiste y se vigoriza al hacerle podas despus del ao de edad.
Produjo bajo ambas condiciones de crecimiento, las lactonas sesquiterpnicas buscadas.
Se requiere volver a ensayar su propagaci6n vegetativa, empleando arenacomo sustrato, con estacas de 30 cm de largo por 1.5 de dimetro, de -consistencia leosa; ya que es factible ste mtodo de reproduccin, y posiblemente permita ahorrar ms de dos meses.
Se le puede sembrar desde el mes de marzo, dando riegos leves y espaciados, y dejando una distancia entre plantas mnima de 50 cm.
Esta especie no soporta suelos inundables, por 10 que ste debe tener -tanto buen drenaje externo como interno.
Es muy factible que 10 mismo que la especie antes citada, sta sea t6xica al ganado, por 10 que su propagacin debe realizarse con las debidasprotecciones.
Los principios activos que elabora, son difciles de purificar y separar
en pequeas muestras de planta.
81
de
altura.
Es factible por tanto, su cultivo a corto plazo, requiriendo para sto,realizar pruebas piloto de cultivo en el campo, y ya qued6 aclarado queesta especie pudo crecer fuera del tr6pico clido-hmedo, dndole algu-nos cuidados durante aproximadamente sus primeros 18 meses de edad, para
evitarle el dao causado por el granizo, y la desecaci6n del suelo.
82
VIfl.
RESUMEN:
Las es pec i es He1.e.r.um .me.:c.anurnH. B. K., V'gleJta. budd1.e.iae.60Jun.U, (DC.)
Benth. et Hook. ex Hems l. Y CafluvulnthUl.! fW.6 e.l1I.l (L.) G. Don (V'nc.a Jto.6ea L.) fueron propagadas sexualmente, bajo dos difel"entes condiciones
de crecimiento; en invernadero y al exterior, en la ciudad de Mxico,D. F.
Las dos primeras especies nunca haban sido cultivadas y aunque la ter
cera si lo haba sido, en esta ocasi6n se le reprodujo fuera de su habitat natural.
Estos vegetales elaboran substancias citadas como anticancergenas, dos
de las cuales (la vincristina y la vincaleucoblastina) , ya son empleadas en la terapia de ciertos cnceres humanos.
Con el fin de detectar la presencia y variacin de los princlplos acti
vos de inters, se les colect a diferentes edades; seleccionndose 27
muestras de las que se obtuvieron sus e~tractos; los que fueron separ~
dos en sus componentes por medio de cromatografa, logrndose aislar, helenalina, budlelnas "A" y "B" y los alcaloides totales de Ca.thaltanthUl.l
Jt0.6 e.l1I.l
Se lograron conocer algunos requerimientos para el crecimiento de las plantas, as; como su respuesta a las condiciones a las que fueron sometidas; He1.e.r.um complet su ciclo vital. mientras que V'gleJta. y Ca.thaJtanthu.6 a 23 meses de edad, an no lo terminan.
La primera especie mencionada no tuvo problemas para desarrollarse, encambio, las otras dos si afrontaron algunos, segn el sitio de crecimien
too
Se demostr que las tres especies, en las dos condiciones y a las diferentes edades en que fueron colectadas, produjeron las substancias anti
cancergenas antes mencionadas.
83
..IX.. - - -BIBLIOGRAFIA
.
.
.-
V"g..[t~
p~p~ea
-------------, J.L. HARTWELL, et al. 1976. Screening of Chilean Plants for anti
cancer act i vity. I., Ll oyd i a 39t4J;225-243.
BISSET, N.G. 1958. Alkaloids in the Apocynaceas. Anales Bogorienses
175.
(1): 171-
BITTNER, M., BHAKUNI, D. S. &M. SILVA, 1972. Anticancer agents from Chilean plants, C~6..[a obtuha. Rev. Latinoam. Quim. i (1): 8-15.
BULMAN, F., 1897. Ensayo del chapuz a enfermos con hemorragia cerebral y tabes
espasmdica. Anales del Inst. Med. Nal. (Mxico) --:175.
84
CALABRESI, P. y R.E. PARKS, Jr., 1974. En: GOODMAN, L. y A. GILMAN, 1974. Bases
Farmacolgicas de la Teraputica. Edit. Interamericana. Mex. pp. 1118-1147.
CALDERON, S. y C.P. STANDLEY. 1941. FLORA SALVADOREA. 2a. Ed. Imprenta Nacional, El Salvador, Rep. del Salvador. C. A., p. 221.
CARRILLO, A.P. 1887. Estudio sobre la Rosilla de Puebla (Tsis Farmacutico),Mxico, En: "El Estudio", Monografas Mexicanas de Materia Mdica. 1890. Of. Tipog. de la Sra. de Fomento. Mex.
CLARK, E.P., 1936. Helenalin l. Helenalin, the Bitter sternutative substance ocurring in Hetenium autumnale. J. Amer. Chem.Soc. 58: 1982-1983.
CLAUS. E.P. &V.E. TYLER, Jr. 1965. Pharmacognosy. Lea &Febiger Editors. Philadelphia U.S.A., pp. 315 - 317.
CONE, J. N. et~. 1963. Al kaloids of V.Lc.a
Don) XV. Jour. Pharm. Sci. ~:688.
M.ea L.
(Ca.thafLanthUf., MM.Uf.,
G. -
&
Hete.vl..U.m mJto-
c.epha.twn (smal1-head sneezweed). J. Amer. Veto Med. Ass. 145 (7): 694-69-6-.-
~:
1415.
punpunea
& Ca.:thaJta.n-
thUf.,.
---------------, et al. 1964. Studies on Ca.thaJLanthUf., alka1oids. Lloydia 27 (4): 302 - 314. - .FISHBEIN, M. 1967. Enciclopedia Familiar de la Medicina y la Salud. H. Stuttman
and Co. Editores. New York. U.S.A. p. 228.
FLORES, L. 1907. "Manual Teraputico de Plantas Mexicanas". An. Inst. Med. Nac.
(Mxico) ~: 297 - 391.
FONT-QUER, P. 1962. Plantas Medicinales, El Dioscrides Renovado. Editorial Labor. Espaa, pp. 139,416.
85
I~
Helenalina. Cien-
GOMEl. C. 1884. Estudio sobre la yerba del alacrn. Tsis Farmacia, Mxico. En:
El Estudio, 1890. Ensayo de la Materia Mdica Mexicana Vegetal. Monografas Me
xi canas de materia mdica. Oficina Tipogrfica de la Sra. de Fomento. Mxico.
pp. 61 - 69.
GONZALEZ D.M ..et al. 1976. Estudio Preclnico de Lactonas Sesquiterpenicas como Agentes Anticancerosos. En: Memorias de la Jornada Conmemorativa del Dcimo
Aniv. de la Invest. Cientfica del Inst. Mex. del Seguro Social. Mxico. D.F.,
22 - 26 Nov. 1976.
GOOD, R. 1974. The Geography of the Flowering plants. Fourth Ed. Longman Ltd.
London. p. 97.
GOODMAN. L. &A. GILMAN, 1974. Bases Farmacolgicas de la Teraputica. Editorial Interamericana. Mxico. pp. 1118 - 1147.
GUERRERO, C., 1974. Nuevos Terpenoides en Compuestas Mexicanas. (Tsis Doctor
en Qumica), Fac. de Qumica, Univ. Nal. Autnoma de Mxico
------------, et al. 1975. Determinacin de la estructura y estereoqumica de
la elemanlida'Verafinina C y Aislamiento de la Verafinina B, dos substancias
citotxicas aisladas de V~be6ina aff. eoahuiten6~ Gray. Rev. Latinoamer. Quim.
~ (3): 119 - 123.
1978. Comunicacin verbal.
------------, P. ROCHE, N. ROSAS, J. TABOADA, M. GONZALEZ D. Y J. TELLEZ M. 1978. Algunos derivados de las Budlenas A y B Y actividad citotxica en dos lneas celular de la substancia A., Rev. Latinoam. Quim. en prensa.
HAMPEL, K.E. & H. GERHARTZ. 1974. The Cytostatic action of Vincaleukoblastine.
IN: 8 th. International Cancer Congress. Moscow, 1962.
HERNANDEZ, F. 1615. Cuatro Libros de la Naturaleza y Virtudes de las plantas y
animales que tienen uso medicinal en la Nueva Espaa. Anotados, traducidos y publicados por Francisco Ximnez, Reimpreso por Dr. Nicols Len., 1888. fy!orela, Mex. '
HERNANDEZ, F., 1615. Historia de las plantas de la Nueva Espaa. Editado de 1942 a 1946 por el Instituto de Biologia, Univ. Nal. Autnoma de Mxico.
HERNANDEl, R., A. SANDOVAL, A. SETlER &J. ROMO. 1968. Estudio Qumico del
HelenIum qua~dentatum Labill. Bol. Inst. Quim. U.N.A.M. 20 : 81-83, (Mxico),
En: Biol. Abstracts. ~: 10810 (1969)
86
et~.
et~.
1969. J. Org.
Ch~
et~.
et~.
33~
Soco
- 346.
-------------, 1974. Novel natural products with antitumor activity. Fed. Proc.
33 (11): 2288 - 2295.
LANGMAN, K.l. 1964. A selected guide to the literature on the flowering plants
of Mxico. University of Pennsylvania Press. U.S.A.
LEE, K.H. FURUKAWA, H. & E.S. HUANG. 1971. Antitumor Agents. 3. Synthesis and citotoxic activity of helenalin amine adducts and relate derivaties. J. Med. -Chem. 15 (6): 609 - 61l.
---------, HUANG. E.S., PLANTADOSI, C. et al. 1971. Citotoxicity of Sesquiterpene lactones. Cancer Research ll: 1649~ 1654.
---------, Meck, R., &C. PLANTADOSI, 1972. Antitumor agents. 4. Jour Med. Chem.
(3): 299 - 301.
---------, H. HALL, MAR, E, Ch., et al. 1977. Sesquiterpene Antitumor Agents: Inhibitors of Cellular Metabolism~SCience 196 (4289): 533 - 535.
LOPEZ DE LA ROSA, M. L. 1975. (Tesis Doctoral ), Biologa, Fac. de Ciencias, Universidad Nal. Autnoma de Mxico.
LUCAS, H. et al. 1971. El Gran Libro- de la Salud, Enciclopedia Mdica de Selecciones dellReader's Digest. Mxico. D. F.
MADRIGAL, S. X. 1967. Contribucin al conocimiento de la Ecologa de los Bosques
87
de Oyamel (Abie ~etgio~a CH. B. K.) Schl, et Charo.} en el Valle de Mxico. Bol. Tec. No::-TIl, Inst. Nal. de Investig. Ftales., S.A.G., Mxico.
MADUE~O,
et~.
~:
1858.
MITCHEL, J.c. 1969. Allergic control dermatitis from Compositae. Trans. St. -John's Rosp. Dermatol. Soco 55 (2): 174 - 183. In: Biological Abstracts 53 (3):
4060, (1970).
NEUSS, N., 1.S. JOHNSON. J. ARMSTRONG & C. J. JENSEN. 1964. The Vin.c.a alkaloids
(Antitumor agents). Advance Chem. 1:133 - 174.
-NOBLE, R. L., BEER, C.T. & J. H. CUTTS, 1958. Role Of Chane e observations in chemotherapy: Vin.c.a ~o~e.a. Ann N.Y. Acad. Sci. 76: 882 - 894.
ORTEGA, A. et al. 1971. La Orizabina y la Zexbrevina B; nuevos germacranlidos
furnicos. Rev:-Latinoamer. Quim. ~ (1): 38 - 40.
ORVAANOS, D. 1897. Redaccin de artculos de teraputica de la 2a. parte de la
Materia Mdica Mexicana, relativos al He1eniwnme.xiean.um y ~~a me.xic.ana.
An. Inst. Med. Nal. (Mxico) 2:117.
OLECHNOWICZ, S.W. &S. STEPIEN, 1963. "In vitro" and "in vivo", Studies on the
88
The pseudoguaiano-
-----------, et al. 1974. Antineoplastic agents. 34. HeteJ'11m a.u.tumn.al.e. L., -Jour. Med. Chem. 17 (9): 1013 - 1016,
PRIETO, 1. 1896. Preparacin de un extracto alcohlico del chapuz. An. Inst. Med. Na1. (Mex.). ~:117.
RAMIREZ, J. y G. V. ALCOCER. 1902. Sinonimia vulgar y cientfica de las plantas
mexicanas. Oficina Tipogr!fica de la Sria. de Fomento. Mxico.
REICHE, C. 1926. Flora Excursoria en el Valle Central de Mxico. Reproducida y
Editada por la Subsria.de Ensenanzas Tcnicas y Superior, S.E.P. Mxico. 1963.
pp. 193, 197, 204 Y 206.
RIO DE LA LOZA, M.F. 1900. Estudios de perfeccionamiento con el "chapuz" (Hete.--
--------------------, 1961.
, (Mex.).
(1): 33 - 35.
____________________ , et al. 1970. New pseudoguaianolides from Panihenium conteJL.tum Gray (Compositae).Tetrahedron 26:2775 - 2780.
RYTEL, W. M., R. E. SHOPE &E. D. KILBOURNE. 1966. An antiviral substance from
Peni~ tuniCOlO~L~ V. Induction of interferon by helenine. J. Exp. Med. 123 (4):577 - 588. In: Biological Abstracts 47:9425.
SANCHEZ, S. O. 1976. La flora del Valle de Mxico. Herrero Editor. Mxico.
SAYAS, A. 1977. Comunicacin personal.
SILVA, F. 1966.. Heredity and alterations of sorne qual ities in chemocultivars of
the foxglove (V'g.i.ta.U.6 lana.ta. Ehrh.). Planta Hed . .1! (3):303 - 309. In: Bio10gical Abstracts 48:4167 TI967T.
SILVA, F. 1966. Results concerting cultivation of V'g~ lanata Ehrh. Agr.
4: 70 - 81.
STANDLEY, P. C. 1920. Trees and shrubs of Hxico. Contr. U.S. Natl. Herb. 23:
(1):405 Washington Government Printing Office. Washington. U.S.A.
STEARN. T. W. 1966. Cathana~ 40~~. The correct name for the Magadascar Periwinkle. Lloydia 29 (3):196 - ~
STOCK, A. J. 1970. Chemotherapy of cancer. Chm Britain.
J
~:11
- 16.
SVOBODA, G. H. et al. 1962.Current Status of Research on the alkaloids of - Vi.nc.a 4o~ea L. TCaIJUvran:thM M~~ G. Don) J. Pharm. Sci. ~ (8) :707 - 720.
TABOADA. J. 1976. Comunicacin Verbal.
TELLEZ, M. J., et~. 1973. VI. Congreso Nal. de Ciencias Farmacuticas. Mxico.
VILLASEOR, F. F. 1896. Preparacin del alcaloide del "chapuz"
Ca.1W11
H.B.K.) An.lnst. Med. Nal. (Mex.). ~:1l6.
(He1.eni~
me.d--
90