EXTRACCION DE ADN SANGRE TOTAL Y MANCHAS

Marroqun Jorge, Reyes Carolina, Moreno Sally

2
Adis Ayala Fajardo
Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas
1
Estudiantes Biologa Molecular. 2Docente Biologa Molecular.
BOGOT D.C., 15 de septiembre 2015

Resumen.
En el presente informe se observan los resultados obtenidos a partir de la
extraccin y de ADN en una muestra de sangre. Para ello se realiz una lisis de
eritrocitos con Tris HCl 10 mM pH 7.6, MgCl2 5 mM, NaCl 10 mM,
mientras que los leucocitos se trataron simultneamente con una solucin
buffer de lisis (Tris HCl 10 mM pH 7.6, EDTA 10 mM y NaCl
50 mM) SDS al
5% y proteinasa K a fin de digerir las protenas y romper tanto la membrana
celular como nuclear para liberar los cidos nucleicos, se obtuvo el pellet con
isopropanol fro y se re suspendi en buffer de T.E. para su posterior
cuantificacin. De acuerdo a los datos tericos se espera extraer ----- de ADN.
La muestra de mancha fue tratada de manera similar a excepcin de que esta
se trat con resina chelex al 5% que protege la muestra de DNAasas
presentes.

INTRODUCCIN.
La extraccin del ADN lleva consigo
pasos
importantes
que
son
pertinentes explicar a fondo para su
mayor comprensin, en primera
instancia se separa
1. La sangre es un tejido encargado
de varas funciones entre las cuales
est el transporte de oxgeno y
nutrientes, adems de los productos
de desecho del metabolismo celular.
Cuando se toma una muestra y se
centrifuga
se
separan
dos
elementos : el plasma y el suero, los
cuales se diferencian por el hecho
de que al suero le falta el
fibringeno el cual es uno de los
factores de la coagulacin y dems
protenas que se han consumido en
el proceso de coagulacin

La principal diferencia entre plasma

y suero se encuentra en sus
factores
de
coagulacin
(fibringeno). Tambin podemos
encontrar diferencias y similitudes
entre leucocitos y eritrocitos.
Las clulas presentes en la sangre
son los glbulos rojos (eritrocitos) y
los glbulos blancos (leucocitos) en
la tabla 1 se realizan una
comparacin entre ambos tipo de
clulas.
Los glbulos blancos o leucocitos
Se clasifican en: granulocitos,
linfocitos y monocitos
Granulocitos: presentan ncleo poli
formo
con
grnulos
en
el
citoplasma. Se clasifican en:
Neutrfilos: fagocitan sustancias
extraas como bacterias.

Basfilos:
segregan
sustancias
anticoagulantes y controlan la
inflamacin.
Eosinofilos: eliminan complejos
antgeno-anticuerpo, defienden al
organismo contra microorganismos
no fagocitables como los parsitos.
Linfocitos: se localizan en los
ganglios linfticos se encargan de
producir anticuerpos y de destruir
clulas defectuosas.
Monocitos:
fagocitan
microorganismos y restos celulares
rodendolos con sus pseudopodos.
[1]
Tabla 1. Comparacin eritrocitos leucocitos

Eritrocitos

Leucocitos

La
estructura
fsica es la de
discos
bicncavos
y
sin ncleo en
los mamferos

Tienen
forma
irregular, ncleo
y
una
capa
exterior en los
mamferos.

La vida til de
los
glbulos
rojos suele ser
de 120 da
El
recuento
bajo
de
glbulos rojos
es sinnimo de
anemia

La vida til puede

ir de 4 a 30 das,
dependiendo del
cuerpo.
El nmero bajo
de
estos
(leucopenia)
puede
comprometer las
funciones
inmunitarias
Su funcin es la
de proporcionar
proteccin contra
materia
y
organismos
extraos

La
funcin
principal de los
glbulos rojos
es
la
de
transportar
oxgeno

Slo hay un
tipo
de
glbulos rojos

Los
glbulos
rojos
representan un
40-45 % del
volumen de la
sangre

Hay varios tipos

de
glbulos
blancos:
los
granulocitos, los
monocitos y los
linfocitos.
Los
glbulos
blancos
representan
un
1% del volumen
de sta.

Nota. Fuente autor

2. Cuando se realiza la extraccin

de sangre a esta se le aplica un
anticoagulante ya sea EDTA,
heparina o citrato; el hepirinato
previene la coagulacin unindose a
la trombina, por otro lado el EDTA y
el citrato fijan el Ca2+ y el Mg2+
interfiriendo en la accin de las
enzimas dependientes del calcio o
del magnesio que participan en el
proceso de coagulacin (Baynes &
Dominiczak, 2011). El presenta
problema sobre todo por los
inhibidores de las muestras como
son la heparina, los cidos biliares,
el dodecil sulfato sdico, entre otros.
[2].
Por otro lado La heparina es un
glicosaminoglicano, en el que se
alternan residuos de D-glucosamina
y cido urnico. Su efecto
anticoagulante est determinado por
un pentasacrido nico con alta
afinidad por la antitrombina III
(ATIII), que est presente en slo un
tercio de las molculas de heparina.
La interaccin de la heparina con la
ATIII
induce
un
cambio
conformacional en esta ltima,
acelerando en forma importante su
capacidad para inactivar la trombina
y otros factores [3].

EDTA y heparina pueden inhibir la

PCR pues es
fundamental la
presencia de cationes divalentes y
al ser quelados por estas soluciones
las concentraciones de iones como
el Mg+2 y el Ca+2 disminuirn, pero
hay que tener en cuenta que se
tienen
unos
rangos
de
concentracin
donde
estos
reactivos no la inhibirn (Tabla 1)
[4].
Tabla 1. Inhibidores de la PCR

La buffer de lisis de glbulos

blancos est conformada por TrisHCl 10 mM pH 7.6el cual tiene la
misma funcin que en el lisis de
rojos,
EDTA 10
mM como
componente quelante que se utiliza
para quelar los iones de magnesio,
manganeso y calcio dentro de la
clula as previene que la nucleasas
se una al grupo fosfato entre los
cidos nucleicos evitando que los
rompa y estabilizando el ADN.
La sal se usa para romper los
ncleos y liberar las fibras de
cromatina y el SDS rompe los
ncleos y libera el ADN

3. Para la extraccin de ADN de las

muestras de sangre es necesario
realizar una lisis celular lo cual es
una ruptura de la membrana celular
que produce la salida del material
intracelular, tambin es necesario
inactivar las nucleasas celulares
que hidrolizan el ADN y separar los
cidos nucleicos de los restos de
clula. Este proceso se puede hacer
con una solucin de lisis cuyos
reactivos cumplen una funcin
especfica
La solucin buffer de lisis de
glbulos rojos est compuesta por
Tris HCl
10 mM pH 7.6 el cual
acta como amortiguador, se
encarga de mantener el pH estable
con el fin de que el ADN y el ARN
en la clula no se degrade. El NaCl
explota la clula por presin
osmtica, y el MgCl2 5 mM es el
inhibidor
especfico
de
la
aglutinacin de eritrocitos [5].

4. La funcin principal de la
proteasa K es realizar una lisis en
las protenas de los glbulos
blancos, la actividad enzimtica se
basa en digerir las protenas, estas
protenas
se
digieren
completamente si el tiempo de
incubacin
es
largo
y
la
concentracin
de
proteasa
suficientemente alta. La digestin
con proteinasa K para la purificacin
de cidos nucleicos se realiza
generalmente en la presencia de
EDTA y la temperatura optima de
trabajo esta desde 37 C a-60 C
durante 30 a 45 min [6].
5. La incubacin del ADN se realiza
a 42C debido a que a esta
temperatura
se
inhiben
las
DNAasas que generan rupturas no
especficas en el ADN para liberar
cadenas con extremos terminales
5-fosforilados y 3-hidroxilados.
Acta sobre hebras de DNA simple
y doble, cromatina e hbridos de
ARN-DNA.

6. El Chelex se utiliza a menudo

para la extraccin de DNA en la
preparacin para la PCR. El Chelex
protege la muestra de DNAasas que
pudieran
permanecer
activas
despus de la ebullicin y,
posteriormente, podran destruir el
DNA, lo que hace que sea
inadecuado para PCR. Chelex se
une con cationes incluyendo Mg +. y
hace de las DNAasas inoperables,
protegiendo as el ADN de su
accin. [7].
Una vez se ha roto la membrana
celular con detergentes y quelantes,
se
han
eliminado
protenas
contaminantes del extracto y se
limpian con etanol los restos de
reactivos y solventes se debe tener
en cuenta los siguientes protocolos:
Protocolo para obtener DNA de
cadena doble
Para la extraccin de ADN
genmico (humano) se toman 5 mL
de sangre y se mezcla con 7 mg de
EDTA
(anticoagulante).
Se
centrifuga a 5000rpm durante 3
minutos,
desechando
el
sobrenadante
(plasma).
Se
resuspende el pellet con solucin de
lisis roja y se deja reposar durante
30 minutos. Se centrifuga a
3000rpm durante 5 minutos y se
desecha el sobrenadante en una
solucin de hipoclorito de sodio.
Se le aade al pellet 2 mL de
solucin de lisis de blancos, 100 L
de SDS al 10% y 25 L de
proteinasa K y se incuba toda la
noche a 42C. Se le aade 200 L
de acetato de sodio 3M pH 7 y se
centrifuga a 3000 rpm durante 5

min. Transferir el sobrenadante a un

nuevo tubo y adicionar 200 L de
isopropanol para precipitar el ADN y
se lava con etanol al 70%, luego
centrifugar a 6500 rpm por 5 min.
Eliminar el etanol por inversin y
dejar evaporar en cmara de flujo
laminar El pellet se resuspende en
Tris EDTA a 42C.
Protocolo para obtener DNA de
cadena simple
A la muestra se le adiciona 1 mL de
lisis roja y se incuba por 20 min a
temperatura ambiente, luego se
centrifuga durante 3 min a 12000
rpm, se retira el sobrenadante,
dejndose un volumen de 30 L a
los cuales se les adiciona 200 mL
de la resina Chelex al 5%, y se
incuba durante 30 min a 65 C.
La muestra se homogeniza por
vortex durante 10 s, y se expone a
ebullicin durante 8 min para luego
agitar por vortex durante 10 s
nuevamente. La resina y las
protenas
desnaturalizadas
se
separan mediante centrifugacin por
3 min a 5000 rpm, y se procede a
cuantificar. [8]
8. En la prctica se realizaron
ambos protocolos, para la mancha
de sangre en tela por chelex
(cadena sencilla) y para sangre total
por proteinasa K (cadena doble)
METODOLOGA
Se utiliz el mtodo de la gua N 23: Extraccin de DNA sangre total y
manchas Ayala
Con las siguientes modificaciones:

En la muestra de sangre total se

adicionaron
1000
L
de
isopropanol frio, con el fin de que

el ADN se hiciera visible y se

pudiese hilar.

Para la muestra de mancha se

realiz un lavado con H 20mq y
una posterior centrifugacin
durante 8 min ya que la muestra
presentaba
glbulos
rojos
despus de la lisis de los
mismos.

RESULTADOS Y DISCUSIN.

La extraccin de ADN se inici con

un
rompimiento
celular
e
inactivacin de las nucleasas
mediante
detergentes
que
solubilizaron los lpidos que se
encuentran en las membranas
celulares.
A la muestra de sangre total en
primera instancia se adicion EDTA
(agente quelante de Ca2+ y Mg2+) ya
que evita la precipitacin del ion
calcio en la cascada de coagulacin
de la sangre. Adems el Calcio es
clave tanto en la va extrnseca y la
va intrnseca activando los factores
de coagulacin. El EDTA adems no
permite que acten cofactores de
las nucleasas para la separacin de
DNA.

Se realiz una lisis de rojo con el fin

de eliminar los eritrocitos los cuales
se centrifugaron y se descartaron en
una solucin de hipoclorito de sodio
debido a la inactivacin del efecto
desinfectante del hipoclorito con la
materia orgnica.
Posterior a esto se realiz una lisis
celular en donde se inactivaron las
nucleasas celulares y se separaron
los cidos nucleicos de las clulas,

luego se hizo una digestin

enzimtica (protena K). En la lisis
de glbulos se utiliz una solucin
Tris-HCl 10 mM pH 7.6 que cumple
como funciones amortiguar y
capturar los lpidos que integran la
membrana, el EDTA 10 mM se
utiliz quelante de Mg2+ (cofactor
de la desoxirribonucleica, por lo
tanto la actividad de esta enzima
disminuye y el NaCl quien logra que
el ncleo se rompa por presin
osmtica. Para la lisis de eritrocitos
se utiliz Tris-HCl 10 mM pH 7.6,
NaCl 10 mM y MgCl2 5 mM quien
es un inhibidor especfico de la
aglutinacin de eritrocitos. [5]
El SDS permiti romper enlaces no
covalentes entre protenas lo que
genera desnaturalizacin de las
mismas (se une a las zonas
apolares dispersando la lipoprotena
de las membranas) por lo tanto se
libera el DNA.

La protena K se utiliz para la

digestin enzimtica en donde
realiza una lisis en las protenas y
aminocidos presentes en los
glbulos
blancos,
para
estar
seguros de la completa digestin se
dej toda la noche a 42C. La
protena K nos permite tener la
cadena doble del ADN.
El acetato de sodio permite separar
el ADN cromosmico abierto del
ADN plsmido cerrado y el
isopropanol
en
presencia
de
cationes monovalentes induce el
cambio estructural en el DNA y por
lo tanto la precipitacin del mismo.
Finalmente el T.E funciona como
buffer, adems de quelar iones Mg

12 pg ADN
1mg
1leucocit
44 .000 .000 leucocit
=0.0 528 m g
109 pg

2+

, el objetivo es solubilizar ADN

protegindolo de la degradacin.

Por lo tanto los esperado en la

cuantificacin para la extraccin del
ADN genmico estar entre 0.0216
y 0.528 mg
1. Datos tericos de ADN extrado
De acuerdo a la cuantificacin por
peso de ADN genmico, se debe
tener en cuenta que la muestra
inicial de sangre fueron de 4 ml, y
que esta fue donada por una mujer
de 20 aos.

Conclusiones

La extraccin de ADN en cadena

doble es posible gracias a la
accin de lisis de rojos seguida
de lisis de blancos y proteinasa
K, mientras que la extraccin de
cadena sencilla se realiza
En mujeres, la cantidad de
mediante el protocolo de resina
leucocitos presente por cada l de
chelex
sangre oscila entre 4500 y 11000 [9]
La extraccin de ADN se debe
realizar bajo estndares de
1000 l
4500 leucocit .
bioseguridad tipo II por el peligro
1 ml
4 ml sangre
=18.000 .000
de contaminarse con posible
1 l
virus y/o bacterias adems de
1000 l
contaminar la muestra, en este
11000 leucocit .
1 ml
ltimo
caso
daando
los
4 ml sangre
=44 .000 .000
1 l
resultados de la extraccin y de
su cuantificacin
Para una muestra donada por
una paciente de 20 aos se
Tericamente
habr
entre
esperan extraer entre 0.0216 y
18.000.000 y 44.000.000 leucocitos
0.528 mg de ADN
en 4,0mL.
Ahora teniendo en cuenta que en
una clula diploide se encuentran
12 pg de ADN tenemos que:

BIBLIOGRAFA.

[1]. Bases de la fisiologa. (2007).

Editorial Tbar Flores, S.L.
12 pg ADN
1 mg
[2]. Baynes, J. W., & Dominiczak, M.
1 leucocit
18.000.000 leucocit
=0.0216
H.mg
(2011). Bioqumica mdica 3 ed.
9
10 pg
+ Student Consult 2011: Elsevier
[3]. Villatoro L. M. (2001). Obtencin
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http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/
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