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06.11.

2009

Fundamentals of
Biochemistry
Third Edition
Donald Voet Judith G. Voet
Charlotte W. Pratt

Chapter 25
DNA Replication, Repair, and Recombination

Copyright 2008 by John Wiley & Sons, Inc.

U. Albrecht

Lernziele:
1. Verstehen, dass einige DNA Schden von einem einzigen
Enzym repariert werden knnen.
2. Verstehen, dass beschdigte Basen durch 'base excision
repair' und 'nukleotid excision repair' entfernt und ersetzt
werden knnen.
3. Verstehen, dass Replikationsfehler durch 'mismatch repair'
korrigiert werden knnen.
4. Verstehen, dass einige Reparaturmechanismen fehleranfllig
sind.

06.11.2009

U. Albrecht

5. DNA Reparatur
A. Einige Schden knnen direkt behoben werden
Pyrimidin Dimere

DNA Photolyase
gibt es im Menschen
nicht

N5,N10 methenyltetrahydrofolat absrobiert UV und transferiert


die Energie auf FADH-, welches ein Elektron zum Pyrimidin
Dimer bring und es dabei spaltet.
Damit das Enzym seine Wirkung haben kann muss das Dimer
nach aussen flippen, was relativ gut geht da das Dimer
konformationsstrungen in der DNA verursacht und die Basenpaarung von Pyrimidin Dimeren nicht sehr stark ist.

U. Albrecht

B. Base excision repair (BER) bentigt eine Glycosylase

DNA Glycosylase entfernen die defekten Basen.


Spalten glykosidische Bindung der vernderten
Base -> deoxyribose bleibt brig.
-> apurine oder apyrimidine Stelle = abasische Stelle.
= AP sites.
knnen auch durch spontane Hydrolyse von glykosidischen Bindungen entstehen.
Desoxyribose dann durch eine AP Endonuclease auf
einer Seite gespalten->
Deoxyribose und benachbarte Reste werden entfernt
durch eine Exonuklease.
-> die Lcke wird dann aufgefllt und verknpft durch
DNA Polymerase und DNA Ligase.
Die Enzyme fr Basen-Excisions-Reparatur enthalten
eine glycosylase (erkennt 8-oxoguanin) und eine
Uracil-DNA Glycosylase (UDG) welche Uracil Reste
entfernt.
(Uracil Reste entstehen durch Cytosine Desaminierung)
-> Grund warum DNA normalerweise Thymidin Reste
und keine Uracil Reste enthlt)

Figure 25-30

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U. Albrecht

RntgenStruktur eines Komplexes von Uracil-DNA Glycosylase und 10bp DNA mit U-G Basenpaar

Wie sieht dieses Enzym Uracil


Reste?
Scannen der DNA durch binden
-> wenn Uracil Rest -> DNA
wird einfacher gebogen und
Uracil kann einfach ausgeflippt werden.

Uracil Rest
AP site

Arg 272 des Enzyms interkaliert und fllt


Platz aus -> AP sites drfen nicht frei sein
da sie cytotoxisch sind.
Figure 25-31

U. Albrecht

Warum sind AP-sites cytotoxisch?


1) binden irreversibel topoisomerase I
2) die Ribose am AP-site hat keine glykosidische Bindung, d.h. Ring ffnet sich
reversibel in seine lineare Form -> freie Aldehydgruppe -> kann sich cross-linken
zu anderen zellulren Komponenten. -> AP-sites mssen von UDG enzym
bedekt bleiben -> anschliessend wird UDG von AP endonuclease verdrngt aber
schtzt die Zelle immer noch vor den cytotoxischen effekten von AP-sites.

06.11.2009

U. Albrecht

C. Nucleotide excision reparatur (NER) entfernt ein Segment eines DNA Stranges

Pyrimidin Dimere werden durch nukleotid excision


Reparatur (NER) korrigiert.
Helix distortionen bilden die Angerpunkte fr diese
Reparatur (nicht spezifische Nukleotiderkennung)
NER ist der Hauptmechanismus gegen 2 wichtige
Karzinogene: UV licht und Tabakrauch.
In e. coli ist NER ein ATP abhngiger Prozess
in dem UvrA, UvrB und UvrC proteine involviert
sind.
Dieses System spaltet den beschdigten DNA
Strang and der 7 bzw. 3-4 Stelle welche das Dimer
flankieren. Ein 11 oder 12nr langes Stck wird
entfernt durch binden von UvrD.
Auffllen mit Pol I und DNA ligase.

Figure 25-32

U. Albrecht

Cockayne Syndrome (CS): 3 genes defective as in XP but also 2 additional genes CSA and CSB

transcription arrest at nucleotide



dimer -> RNA Pol stops

CSA and CSB remove RNA Pol



and give way for DNA repair.

In cockayne syndrome DNA



cannot be reapired -> cells

undergo apoptosis.

-> death of transcriptionally

active cells -> developmental

symptoms of Cockayne syndrome

06.11.2009

U. Albrecht

Xeroderma Pigmentosum (XP)

im Menschen entfernen 16 proteine etwa 30 nt



lange Stcke.

Wenn defekt -> XP

Haut UV sensitiv -> Hautkrebs, Augenschden

U. Albrecht

D. Mismatch Reparatur korrigiert Replikationsfehler

Mismatch -> spezieller Reparatur Mechanismus = Mismatch Repair (MMR)


entstehen durch slipping der DNA Polymerase
Defekt in MMR -> hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome
(Lynch Syndrome)

In E. coli -> MMR via MutS, MutL and MutH


Erkennen des neuen Stranges anhand von nicht Methylierung
In Menschen -> neuer Stragn nicht ber Methylierungsmuster erkannt
wahrscheinlich via nicht geschlossene Nicks.

Figure 25-33

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E. Einige DNA Reparaturmechanismen fhren Fehler ein

UV-induzierte Thymin dimere knnen von DNA polymerase berbrckt werden. Es werden automatisch
2 A eingefgt. Dieses Enzym hat allerdings keine proofreading aktivitt und macht etwa alle 30 nt einen
Fehler. Solche Polymerasen sind relativ hufig da sie die fr die normale DNA Replikationmaschinerie
unzugnglichen DNA Abschnitte replizieren knnen. Mutation in DNA polymerase kann zu XP fhren.

Doppelstrangbrche knnen ber Endverbindungen repariert werden


Ionisiereden Strahlung und freie Radikale ->
Doppelstrangbrche (DSB).
2 Mglichkeiten fr Reparatur:
-Reparatur ber Rekombination (siehe spter)
-nichthomologes End-joining (NHEJ)
Bei NHEJ -> Protein Ku bindet DNA nicht sequenzspezifisch -> hlt enden zusammen -> trimming ->
generiert Mutationen aber ein nicht reparierter DSB
wre schlimmer.
In E. Coli SOS response system als letzte Antwort
auf Mutationen -> meiste Zellen sterben, aber ein
kleiner Prozentsatz berlebt.
Figure 25-34

U. Albrecht

6. Rekombination

Gene sind nicht unvernderlich.


Wenn sich homologe Chromosomen nebeneineander ausrichten knne die Einzelstrnge
ausgetauscht werden in einem sogenannten
crossing-over.
Fremde DNA kann sich auch auf diese Weise
in DNA Strang reinrekombinieren.
DNA Stcke knnen sich in DNA Strang bewegen
= Transposons.
In Figur ist ein Crossing-over gezeigt.
Die Nichtschwesterchormatide knnen dort wo
sie sich berkreuzen rekombinineren.

Figure 25-35

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Branch migration

U. Albrecht

Homologe Rekombination braucht mehrere


Protein Komplexe
Homologe Rekombination and Orten wo
hohe Sequenzhomologie zwischen den
DNA Strngen herrscht.
Site-specific Rekombination and 2 kurzen,
spezifischen Sequenzen.

Holliday Modell der homologen Rekombination

Figure 25-36

U. Albrecht

Rntgenstruktur einer Holiday-Junction

Figure 25-37

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U. Albrecht

RecA veranlasst Rekombination in E. coli

RecA Protein polymerisiert auf ssDNA oder dsDNA.


Bildet ein Polymer -> rechtshndige Helix mit ca 6.2 RecA
monomeren pro Umdrehung.
Pro monomer ca 3 Nukleotide -> 18 Nukleotide pro RecA
polymer turn.
RecA vermittelt DNA Strangaustausch zwischen ssDNA und
dsDNA

Figure 25-38

U. Albrecht

Modell von RecA vermittelter Rekombination

Initittionskomplex

dsDNA bindet-> 3 Strang Komplex

ATP vermittelter
Strangaustausch

Figure 25-39

06.11.2009

U. Albrecht

Modell fr RecA vermittelten Strangaustausch

Figure 25-40

U. Albrecht

RecBCD initiiert Rekombination durch Generieren von Einzelstrang-DNA


RecBCD Protein hat Helicase und Nuklease Aktivitt.
Bindet an freies Duplex Ende (kommt normalerweis in E. Coli nicht vor, nur wenn Rekombination)

Exonuklease Aktivitt -> mehr


am 3' -> krzere Segmente
-> bis zur Chi sequenz
-> 5' schnittrate wird erhht

-> 3' bleibt als ssDNA an welche


RecA bindet -> Einzelstrang
wird stabilisiert und kann fr
Rekombination eingesetzt
werden.
Chi Sequenzen -> erhhte
Rekombinationsrate.
Figure 25-41

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U. Albrecht

RuvABC vermittelt Branch Migration und Auflsen der Holliday junction

Rntegnestruktur eines
RivA-Holliday junction Komplexes

Figure 25-42

U. Albrecht

RuvAB Holliday-junction Komplex

Figure 25-43a

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U. Albrecht

RuvB

RuvA

RuvB

Auflsen des Komplexes ber Nuklease RuvC



Figure 25-43b

U. Albrecht

B. DNA kann durch Rekombination repariert werden


In haploiden Organismen wie Bakterien ist homologe Rekombination selten (in transformationen).
In mehrzelligen Organismen Gene shuffling nur whrend Meiose.
Warum haben dann Organismen ausgeklgelte Systeme fr
homologe Rekombination?
Defekte Replikationsgabeln mindestens 1 mal pro Bakteriengeneration.
10 x per eukaryontischem Zellzyklus.
-> solche DNA Schden ber homologe Replikation repariert.
d.h. homologe Rekombination ist primr da um Fehler zu
korrigieren.
RuvA und RuvB sind teil der SOS response in Bakterien.

Figure 25-44

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U. Albrecht

Reparatur durch Rekombination rekonstituiert Doppelstrangbrche

DSBs knnen durch nonhomologes end-joining


(NHEJ) repariert werden was aber zu Mutationen
fhrt.
Homologes end-joining fhrt keine Mutationen ein
setzt aber voraus, dass ein homologer DNA
Strang vorhanden ist.
Der Prozess findet ber Holliday junctions statt.
Reparatur durch Rekombination scheint wichtig
zu sein im Menschen. Defekte in BRCA1 und
BRCA2 welche beide mit Rad51 interagieren
sind korrelieren mit erhhtem Krebsrisiko
(breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer,
pancreatic cancer).

Figure 25-45

U. Albrecht

C. Transposition rearragiert Segmente von DNA


Barbara McClintock beobachtete, dass die unterschieliche Farbpigmentierung im Mais durch bewegliche genetische Elemente im
Maisgenom entstehen. War gegen die Theorie dass Gene in einer
fixierten Reihenfolge sind -> 20 Jahre unbeachtet bis auch in
E. coli mobile genetische Elemente gefunden wurden.
Transposons bewegen Gene zwischen beliebigen Stellen im Genom
in Prokaryonten wie in Eukaryonten. beeinflussen phenotypische Expression und evolutionre Entwicklung
brauchen keine Homologie zwischen Donor und Akzeptor Stelle in der DNA.
1. Simple Transposons
insertion elements max. 2000 bp codiert fr Transposase.
Zielsequenz repetiert -> Einbau geschieht an berhngenden Ende der Ziel DNA

Figure 25-46

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U. Albrecht

Modell fr Transposon Insertion

Figure 25-47

U. Albrecht

2. Komplexere Transposons haben auch Gene die keine Rolle in der Transposition haben
Tn3 Transposon ist 4957 bp lang mit 38 nt repeats
Rekombination geschiet an AT reichen Stellen beim Internal resolution site.

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U. Albrecht

3. Zusammengesetzte Transposons
knnen in der zentralen Region eine beliebige Sequenz haben und transponieren.

Figure 25-48

U. Albrecht

Der Transpositionsmechanismus involviert Replikation

Der Rekombinationsprozess wird durch eine transposon


codierte Resolvase katalysiert (nicht RecA).

konnte isoliert werden

Figure 25-49

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U. Albrecht

Transposition ist verantwortlich fr genetische Rearrangements


Transposons frdern Inversionen, Deletionen und Rearrangements der DNA des Wirtes.
Tranposons sind die genetischen Werkzeuge der Natur. -> z.B. neue Proteine zusammensetzen aus
transonierten Elementen, Transfer von genetischer Information zwischen nicht verwandten Spezies.

kann
weiter
transponieren

Figure 25-50

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