Facultad de Ingeniera

INDICE
1. Introduccin..3
2. Mtodo de Obtencin....4
3.Caracteristicas del Proceso....5
4.Materias Primas.7
5. Suero de Leche..7
6. Inoculo...10
7. Nutrientes..10
8. Etapas del Proceso....10
9. Produccin.11
10. Separacin....12
11. Purificacin..13
12. Depsitos de
Almacenamiento....13
13.Carbon Activado...14
14. Esterilizacin...14
15. Fermentacin...15
16. Procesos Bioqumicos..16
17. Estequiometria de la
Reaccin...17
18. Ecuaciones del Fermentador tanque
agitado....18
19. Cintica de Fermentacin...19
20. Sistema de Agitacin..20
21. Sistema de Aireacin..20
22. Filtracin 1..20
23. Filtracin 2......21
24. Filtracin 3..21
25. Lechada de Cal21
26. Descomposicin del Citrato21
27. Evaporacin22
28. Cristalizacin...22
29. Centrifugacin.22
30. Secado..23
31. Sistema de Control..23
32. Control de Calidad...25
33.Control durante el proceso fermentativo.
...25
34.Control del producto terminado..26
35. Evaluacin de Impacto Ambiental27
36. Sistema de Gestin
Ambiental...28
37. Problema Propuesto...29
38. Referencias Bibliogrficas..30

PRODUCCIN DE CIDO CTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE

INTRODUCCIN
La biotecnologa es la disciplina que se refiere al uso de los organismos
vivos o de sus productos en procesos industriales a gran escala. Esta
tecnologa ha permitido desarrollar procesos microbianos para la
produccin de numerosos metabolitos o productos farmacuticos, as
mismo, ofrece una excelente alternativa en la biodegradacin de desechos
industriales y residuos contaminantes, como lo es el suero de leche,
convirtindolos a la vez en materias primas para la obtencin de
importantes productos de consumo, como lo es la obtencin de cido
ctrico.(5)
El cido ctrico es un cido orgnico tricarboxlico muy frecuente en la
naturaleza, es un compuesto intermedio en el ciclo de Krebs,
relativamente fuerte y muy soluble en agua, con 6 tomos de carbono que
est presente en gran cantidad de frutas, sobre todo en ctricos como el
limn y la naranja, su nombre proviene del latn citrus que significa limn.
Su frmula qumica es C6H8O7.
El cido ctrico y sus sales (los citratos) son muy utilizados porque no son
txicos, se puede manipular de forma segura, fcil, adems son
biodegradables.
Fue aislado por primera vez por Scheele al mezclar jugo de limn con cal y
disolviendo el precipitado con cido sulfrico. A principios del siglo XX la
obtencin del cido ctrico se haca a partir de limones, pero a mediados
de siglo ese proceso se hizo cada vez menos rentable, optndose
posteriormente, cada vez ms, por la produccin mediante la
fermentacin de un microorganismo.
El cido ctrico es usado principalmente en la industria de la alimentacin
para la elaboracin de bebidas y otros productos, tambin como
saborizante y conservante, aunque tiene otras muchas propiedades por
las que es utilizado en esta industria.
El cido ctrico tambin es utilizado en la industria farmacutica, textil,
cosmtica, agrcola y de detergentes.(4)
3

Acido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxlico

MTODOS DE OBTENCIN

Las alternativas de obtencin del cido ctrico se pueden clasificar en dos

grupos (2):
A partir de frutos ctricos:

El cido ctrico se puede obtener de frutas como la lima, el limn, la

naranja, la pia, los arndanos, remolacha, cereza, frambuesa, entre otros.
A partir de procesos microbiolgicos:

Hay tres tcnicas bsicas de procesos de fermentacin para el cido

ctrico:
Fermentacin en estado slido
El proceso no se ha empleado industrialmente a ningn grado importante
debido a su laboriosidad. Se emplean sustratos slidos como miga de pan
o pupa de almidn de papa dulce como medio de cultivo. Se esteriliza y se
inocula con esporas de Aspergillus niger. Se extiende sobre bandejas en
capas de 3 a 5 cm de espesor y se incuba a 25-30C durante 6-7 das, y
luego se extrae con agua caliente, se concentra y finalmente se purifica y
se obtiene el cido ctrico.
Cultivo en superficie
Un medio estril rico en azcares se hace fluir en recipientes de acero
inoxidable o de aluminio, arreglados en fila en cmaras de fermentacin
estriles. La mayora de las cmaras controlan la temperatura, la
humedad relativa y la circulacin del aire. El medio se inocula con esporas
de Aspergillus niger a una temperatura constante de 28-30C durante 812 das. Al final de la fermentacin el licor se drena y el cido ctrico se
cristaliza. El microorganismo crece y se extiende sobre la superficie
acidificando el medio.
4

Cultivo sumergido
Es el proceso ms utilizado en la actualidad. En ste se inocula el medio
seguido por la agitacin y aireacin vigorosas y controladas en grandes
fermentadores. El perodo de fermentacin se reduce bastante de 3-6 das
a 25- 30C. Despus, el licor se drena para la extraccin del cido ctrico y
el micelio se puede reutilizar.
El 80% de la produccin mundial de cido ctrico se hace mediante
procesos sumergidos. Aunque dura ms das que los otros mtodos
presenta varias ventajas.
Menor inversin en la construccin y menor inversin total.
Es necesaria menos mano de obra.

Una modificacin de este mtodo tiene un proceso en dos etapas en los

cuales inicialmente el medio se inocula primero con esporas y despus de
3 4 das, el micelio se separa y adiciona al medio de produccin.
Despus de 3 4 das ms a 25-30C con oxigenacin, se extrae el cido
ctrico.

CARACTERISTICAS DEL PROCESO

El suero de la leche es subproducto de la industria lctea que contiene

azcares y otros nutrientes beneficiosos para que el microorganismo
crezca y se desarrolle adecuadamente. La fuente de carbono que utilizar
el microorganismo para la fermentacin ser la lactosa presente en el
suero de la leche.
El valor agregado que posee el proceso a desarrollar en esta
monografa radica en ser un proceso que no solo extraer el acido
ctrico como producto de inters para la venta, si no que tomara
el suero de leche residuo de la industria lctea como materia
prima y reducir de esta forma el nivel y cantidad de los desechos
finales.
Microorganismo
Entre los microorganismos que dan una aceptable produccin de cido
ctrico podemos encontrar numerosos tipos de hongos, levaduras e incluso
bacterias, de todos ellos, se ha elegido el Aspergillus niger debido a que
puede crecer en medios de cultivo muy baratos, como las melazas de
caa o remolacha, lquidos de maceracin de maz o trigo, subproductos
5

de la industria lctea, como lo es el suero de leche, entre otros, con una

buena produccin de cido ctrico.
Las razones de la eleccin del dominio de Aspergillus niger sobre otros
microorganismos se resumen a continuacin (2):

Facilidad de manejo
El uso de materia prima, barata como sustrato
Rendimientos altos y consistentes
Econmicamente conveniente.

El Aspergillus niger es un gnero de alrededor de 200 hongos (mohos). Los

hongos se pueden clasificar en dos formas morfolgicas bsicas: las
levaduras y las hifas.(5)
El Aspergillus niger, es un hongo filamentoso, su nombre hace referencia
al color negro de sus esporas. Se clasifica dentro de la familia
Trichocomaceae, orden Eurotiales, clase Eurotiomycetes, filum
Ascomycota.

Aspergillus niger

Una caracterstica del Aspergillus niger es su crecimiento en forma de

esferas de 2 mm de dimetro, la cual se da a partir del quinto da de
fermentacin.
A parte de ser una efectiva forma de reproduccin, no aumenta la
viscosidad del medio, lo cual favorece la agitacin y la aireacin, adems
da muchos menos problemas de crecimiento en paredes o en tuberas y la
separacin de biomasa formada por filtracin es ms efectiva.
Una de las cepas ms usadas para la produccin de cido ctrico es la
ATCC 11414.
6

La estructura microscpica del Aspergillus niger es nica. Tiene hifas

tabiculares y conidiforas cuya cabeza est localizada en el extremo de
una hifa, compuesta por una vescula rodeada por una corona de filides
en forma de botella directamente insertadas sobre la vescula. De las
filides se desprenden las esporas (conidios).(5)

Estructura microscpica de Aspergillus niger

MATERIAS PRIMAS
AGUA (1)
El agua se usar para diluir los azcares de manera que se reduzca la
densidad y viscosidad, hacindolas aptas para el cultivo microbiano. El
agua usada se deber esterilizar para evitar el crecimiento de otros
microorganismos que compitan por el alimento. Tambin ser utilizada
como refrigerante en la etapa de fermentacin y en las etapas de filtracin
para el lavado de la torta y como fluido calefactor o refrigerante en las
reacciones qumicas. Adems estar disponible para servicios auxiliares
como limpieza, sanitario y contra incendios. Para evitar fallos en el
suministro de agua y obtener los caudales deseados, se utilizarn
depsitos de almacenamiento que asegurarn el suministro de agua
cuando esta sea requerida.
AIRE (1)
Para la produccin de cido ctrico se utiliza un microorganismo que es el
que, mediante su metabolismo, transforma la materia prima en producto.
7

Dentro de las clulas se dar la reaccin que transforma el azcar

fermentable en cido ctrico, esta reaccin requiere oxgeno.
Como fuente de oxgeno, necesario para el metabolismo celular, se usar
aire en exceso, que ser suministrado por un compresor y conducido hasta
los fermentadores. Un dficit o ausencia de oxgeno provocara otro tipo de
reacciones que daran otros productos distintos al que se busca obtener.
El aire deber ser esterilizado, ya que podra transportar microorganismos
que podran alterar el proceso, para ello se usar un sistema de filtros, que
adems limpiarn el aire de polvo y suciedad.

SUERO DE LECHE
En general se puede decir que todos los productos y sub-productos lcteos
poseen una elevada carga de contaminacin.
El lacto suero o suero de leche es un lquido claro, de color amarillo
verdoso translcido, o incluso a veces, un poco azulado, pero el color
depende de la calidad y el tipo de leche utilizada en su obtencin.
Es el subproducto ms abundante de la industria lctea, que resulta
despus de la precipitacin y la remocin de la casena de leche durante la
elaboracin del queso y la fabricacin de casena. Es un producto de difcil
aceptacin en el mercado, ya que sus caractersticas no lo hacen apto
para su comercializacin directa como suero lquido. Es un excelente
medio de cultivo debido a sus propiedades y composicin y por ello se
utiliza en gran nmero de procesos fermentativos.
Se estima que a partir de 10 litros de leche de vaca se puede producir de
1 a 2 Kg de queso y un promedio de 8 a 9 Kg de suero.
COMPOSICIN DEL SUERO (5)
Su composicin vara dependiendo del origen de la leche y el
tipo de queso elaborado, pero en general el contenido
aproximado es de 93.1% de agua, 4.9% de lactosa, 0.9% de
protena cruda, 0.6% de cenizas (minerales), 0.3% de grasa,
0.2% de cido lctico y vitaminas hidrosolubles.
Tiene un perfil de minerales en el que se destaca sobre todo la
presencia de potasio y sodio que favorece la eliminacin de
lquidos y toxinas.

Composicin
mineral del lctosuero-

Para la fermentacin ctrica utilizando Aspergillus niger es de gran

importancia el control de los metales; los cationes divalentes deben estar
en concentraciones muy bajas, sin llegar al punto de su ausencia.
El Aspergillus niger produce cido ctrico:
En medios con presencia del in Mn+2 (5 x10-5 ), mientras que en
medios con ausencia de ste la secrecin aumenta
significativamente. Adems tiene efectos sobre la morfologa del
microorganismo favoreciendo la formacin de pequeos pellets
esponjosos y redondeados, que son los deseados para una mxima
productividad de cido ctrico.
Altos niveles de Zn en cultivos de hongos mantienen el
microorganismo en fase de crecimiento y el cido ctrico no se
acumula.
La adicin de Mg+2 y Cu+2, en pequeas cantidades, aumenta
significativamente la produccin ctrico. Adems se ha encontrado
que el Cu+2 puede reducir el efecto negativo en la produccin de
concentraciones inadecuadas de hierro o manganeso.
La remocin de metales divalentes no es necesaria ya que los
elementos de mayor influencia como el Mn, el Zn y el Fe que se
encuentran en concentraciones de 0,001, 0,2 y 1 ppm,
respectivamente, estn dentro de los intervalos recomendados para
la produccin de cido ctrico con Aspergillus niger.
TIPOS DE SUERO LCTEO (5)

El suero se clasifica generalmente en dos grupos de acuerdo a su acidez,

este se divide en dulce (pH mayor de 5.8 6.6) y cido (pH menor a 4.5
5.0).
LACTOSUERO DULCE: Procede de fabricaciones de coagulacin enzimtica
por uso de enzima coagulante.
La precipitacin de las protenas se produce por hidrlisis especfica de la
casena. Por lo tanto el pH es prximo al de la leche inicial y no hay
variacin de la composicin mineral.
LACTOSUERO CIDO: es obtenido por una coagulacin cida o lctica de la
casena, presentando un pH prximo a 4,5.Es un suero muy mineralizado
pues contiene ms del 80% de los minerales de la leche de partida. Se
utiliza en esta fermentacin, suero de leche dulce porque es el ms
empleado por la industria y tiene una composicin qumica ms estable, lo
que permite estimar los valores medios de composicin.

INCULO
Aunque puede no ser considerado como una materia prima, se va a
considerar al inoculo como tal ya que se introduce antes de la
fermentacin y es indispensable para la formacin de producto (1). La
correcta preparacin del inoculo es esencial para obtener unos buenos
resultados en la fermentacin posterior.
El inoculo provendr de un fermentador en el que se habr desarrollado un
cultivo crecido previamente en el laboratorio.
El inoculo de los fermentadores se preparar, con Aspergillus niger del tipo
ATTC 11414. El volumen ideal de inoculo para la produccin de cido
ctrico es de 1% del volumen de trabajo del fermentador donde se trabaja,
este volumen de inoculo debe contener aproximadamente entre 5,5 y 25
millones de esporas por litro.

NUTRIENTES

10

Aunque el suero de leche posee varios nutrientes muy beneficiosos para el

crecimiento celular, ser necesario suplementar algunos de estos
nutrientes de manera que su carencia no se convierta en limitante para el
crecimiento microbiano (1).
El medio de cultivo deber contener los siguientes suplementos:

ETAPAS DEL PROCESO

ETAPA PRELIMINAR
Para llevar a cabo los procesos de obtencin de diversos productos
basados en la fermentacin del lacto suero es conveniente realizar un
fraccionamiento previo total o parcial, con el fin de extraer y/o concentrar
los componentes a ser utilizados como sustrato (3). El fraccionamiento
convierte al lactosuero en una materia prima til, logrando lacto sueros
desproteinizados, desmineralizados y con altas concentraciones de
lactosa.
Los procedimientos de fraccionamiento se pueden realizar usando tcnicas
separativas tales como microfiltracin, ultrafiltracin, nanofiltracin,
smosis o tratamientos no qumicos entre otros.
El lactosuero se puede preparar para la fermentacin por:
Hidrlisis de sus protenas, logrando obtener una fuente de nitrgeno
adecuado para promover el crecimiento y eliminar o reducir la necesidad
de costosos suplementos.
Desmineralizado, que favorece solamente a algunas levaduras.
Hidrlisis de la lactosa, por ser difcilmente fermentable.

11

El proceso comienza con la concentracin de la lactosa, se realiza la

hidrlisis de sta, total o parcial, dependiendo del tipo de fermentacin
microbiana y el producto a obtener. Con la hidrlisis de la lactosa se logra
incrementar notablemente el nmero de bioproductos (6).
Los medios que se pueden utilizar son suero entero y suero hidrolizado (4).
El medio hidrolizado tiene mayor disponibilidad inicial de glucosa en
comparacin con el suero entero, esto es debido a la accin de una
enzima galactosidasa la cual desdobla la lactosa en glucosa y galactosa.
Para el suero entero se puede inferir que a medida que el microorganismo
desdobla la lactosa, la convierte de inmediato en cido ctrico.
En el caso de la obtencin de cido ctrico con A. niger se
alcanzan mayores concentraciones al usar lactosuero
desproteinizado, evaporado e hidrolizado (3, 7, 8, 9).

TRANSFORMACIN DE LACTO SUERO MEDIANTE FERMENTACIN A PARTIR

DE LA ELABORACIN DE QUESO (3)

PRODUCCIN
El proceso de produccin de cido ctrico se va a dividir en tres partes
claramente diferenciadas: produccin del cido ctrico, separacin del
cido ctrico de las impurezas del licor y, por ltimo, purificacin y
conformado de producto (1).

12

Se
carga
el fermentador luego se produce la esterilizacin. Se introduce vapor por
medio del sistema de aireacin del fermentador procedente de la caldera.
El vapor aumentar la temperatura del medio hasta los 100C.
Una vez terminado el proceso de esterilizacin, comenzar a circular agua
hasta la temperatura idnea de fermentacin. Una vez alcanzada la
temperatura, se introduce el inculo, una vez producida la inoculacin, el
microorganismo comenzar a crecer en el medio, consumiendo la lactosa
y fabricando cido ctrico.
La fermentacin va a ser la etapa ms duradera de todo el proceso que
tiene lugar en la planta, aproximadamente 6 das.

SEPARACIN
Esta
fase
comienza
con la
llegada del licor post-fermentativo al
filtro. Luego en el tanque de
lechada, el lquido que
se va filtrando en la etapa anterior se ir
mezclando. Se produce una reaccin
qumica que transforma el cido ctrico, presente en el licor
post-fermentativo, en citrato clcico, el cual es slido y precipita. La
reaccin de lechada se realizar en discontinuo.
Una vez acabado el proceso de lechada, y calentado el licor, ser enviado
hacia un nuevo filtro. Este equipo separar el citrato clcico en forma de
torta y lo enviar hacia el reactor de descomposicin del citrato.
En el reactor de craqueo, la torta de citrato clcico se ir mezclando con
una disolucin de cido sulfrico, producindose una reaccin qumica que
forma yeso (el cual es slido y precipita) y deja libre en disolucin el cido
ctrico. Como en el caso de la lechada, la reaccin ser de tipo batch o
discontinuo.
13

Tras el craqueo del citrato clcico, la masa reaccionante se conduce a un

filtro de banda, el lquido filtrado ser conducido por tubera hasta un
sistema combinado de desmineralizacin y carbn activado que eliminar
ciertas impurezas que an arrastra el producto.
PURIFICACIN

La fase de purificacin comienza cuando la disolucin de cido ctrico

abandona la columna de intercambio inico y carbn activado y es
conducida hacia el evaporador.
En esta fase todos los procesos actuarn en continuo en contraposicin a
la fase de separacin y de produccin en la que haba unidades que
trabajaban en discontinuo.
La corriente que sale del evaporador se introduce en un equipo de
cristalizacin. En el interior del aparato se crear cristales de cido ctrico.
Estos cristales, ser conducido hasta una centrfuga continua que separar
los cristales recin formados de producto del licor y sus impurezas,
abandonando el equipo prcticamente secos.
La corriente cristalina es conducida, a un secador de lecho fluidizado
donde los cristales de cido ctrico pierden el agua restante, quedando
totalmente secos. En esta etapa se le darn las caractersticas finales al
producto.

DEPSITOS DE ALMACENAMIENTO

Los residuos que va a producir la planta y que no pueden verterse a la red

de alcantarillado o tratarse como residuo slido urbano, sern los
siguientes:
14

 Micelio, microorganismo muerto, que ha de ser separado del licor

post-fermentativo.
Licor post-fermentativo separado del cido ctrico tras la lechada de
cal.
Licor madre, resultado de la cristalizacin y separado del cido
ctrico cristalizado.

CARBN ACTIVADO
Para el caso de la reaccin de descomposicin del citrato se incorporar
una columna de carbn activado para, en primer lugar, eliminar las
sustancias orgnicas solubles que puedan quedar y que daran mal color y
olor al producto final y , en segundo, para eliminar iones Ca2+ y SO42- que
quedan tras el proceso cal-sulfrico.(1)

ESTERILIZACIN

El medio de cultivo donde se inocular el Aspergillus niger posee una gran

variedad de clulas vegetativas y de esporas que deben ser eliminadas
antes de la inoculacin. Para ello se utilizar como agente esterilizante el
calor, ya que un agente qumico poda alterar la composicin del medio.
El mtodo que se utilizar ser el de inyectar vapor a 140C procedente
de una caldera a travs de la lnea de aireacin a la disolucin del suero y
otros nutrientes cargados en el reactor. El vapor mantendr la disolucin
de nutrientes a 100C durante unos 25 minutos, as se conseguir,
adems de esterilizar el medio de cultivo, esterilizar el interior del reactor.
La introduccin de este vapor sin duda alterar la dilucin del medio, por
lo que, a la hora de diluir el lactosuero habr que tener en cuenta la
cantidad de vapor que se introducir para esterilizar.
Tras esterilizar cada fermentador en cada ciclo deber hacerse un
recuento de microorganismos en el medio, si ste no es satisfactorio se
deber proceder a esterilizar de nuevo el medio de cultivo. (1)

15

FERMENTACIN

A partir de experiencias y como sugiere la bibliografa el fermentador ms

aconsejable es el tipo Tanque Agitado discontinuo, ya que gracias a la
agitacin se puede controlar la morfologa del cultivo y la trasferencia de
oxgeno al lquido, siendo sta, una variable clave para la produccin de
cido ctrico.
El fermentador es la unidad clave del proceso ya que es donde se va a
producir el cido ctrico a partir del crecimiento controlado de Aspergillus
niger. En esta unidad van a influir numerosos factores: temperatura,
agitacin, concentracin de oxigeno, nutrientes y pH son las ms
importantes.
El inculo provendr de otro fermentador de menor capacidad en el que se
habr desarrollado un cultivo crecido previamente en laboratorio. Es
imprescindible inocular el microorganismo ya adaptado al medio y eliminar
en lo posible el tiempo de latencia.
Se ha optado por el uso de fermentadores discontinuos que, aunque
tienen una menor produccin, tienen menor coste que los continuos y al
estar su uso ms implantado, se tiene una mayor experiencia en su
manejo.
A la hora de adquirir un fermentador hay que tener en cuenta que posea
un sistema adecuado de aireacin y agitacin para un ptimo crecimiento
celular.

16

Tambin es importante tener un control de temperatura y pH al ser estos

parmetros cruciales para el proceso. Para que no se den acumulaciones
de microorganismos y facilitar su limpieza, ha de tener paredes internas
totalmente lisas, adems debe poder funcionar aspticamente durante el
ciclo de produccin.
Tambin ha de buscarse un equipo con cierta versatilidad que permita
hacer variaciones del proceso; debe de ser lo ms sencillo de manejar y
operar posible.
Ha de tener una geometra similar a los otros de la planta de manera que
se puedan hacer escalamientos y extrapolaciones.
Aunque el proceso es bsicamente discontinuo, las unidades que no son
reactores trabajarn en continuo, por lo que tendrn tiempos de trabajo y
de parada y producirn un flujo continuo de producto que generalmente
alimentar a un reactor, excepto para las ltimas etapas en las que se
agrupan varios procesos continuos que trabajarn simultneamente,
siendo el tiempo de retencin, en este caso, el evaluado para estas
etapas. (1)

En la figura se muestra un esquema de un fermentador bsico y las partes principales de las que est
compuesto este tipo de equipos:
A: motor de agitacin.
B: reductor de velocidad de agitacin.
C: entrada de aire.
D: salida de aire
E: vlvula de aire en bypass.
F: tapa del eje.
G: cristal de visin con luz.
H: lnea de limpieza del cristal de visin.
I: boca de hombre con cristal de visin.
J: eje de agitacin.
K: palas rompe-espuma.
L: salida de agua de refrigeracin.
M: deflector.
N: serpentn refrigerante.
O: entrada de agua de refrigeracin.
P: palas mezcladoras.
Q: difusor.
R: cojinetes y rodamientos del agitador.
S: salida.
T: vlvula de ejemplo

PROCESOS BIOQUMICOS

Es importante destacar que el cido ctrico es un intermediario estndar el ciclo de los

17

cidos tricarboxlicos y se produce como un producto de exceso debido a una

operacin incorrecta del mismo.
Dos enzimas claves son importantes en la fermentacin del cido ctrico, la Aconitasa
y la Isocitrato deshidrogenasa.
Las actividades de estas enzimas disminuyen a niveles muy bajos durante la etapa de
produccin.

La Aconitasa es una de las 2

enzimas claves, ya que es sensible a
altas concentraciones de iones metlicos como el Fe +2, la restriccin de la actividad de
esta enzima es clave para tener xito en la fermentacin del cido ctrico. Sin
embargo, la produccin del cido y su secrecin por clulas son dos problemas
completamente separados.
As, es importante no solamente regular la actividad de las enzimas clave del ciclo
TCA por medio de elementos de traza, si no tambin hacer permeables a las
membranas para que la concentracin intracelular del cido ctrico permanezca baja,
previniendo as la retro inhibicin de sus sntesis y facilitar la extraccin del producto.

ESTEQUIOMETRIA DE LA REACCIN

Debido a que se trata de un proceso microbiolgico la estequiometria verdadera

involucra una gran cantidad de reacciones qumicas catalizadas por enzimas.

18

Glucosa + 02 Biomasa + CO2 + H20 + Acido ctrico

La reaccin terica seria obtener dos molculas de acido ctrico por dos molculas de
lactosa sin embargo la reaccin no se da en forma completa (con un rendimiento del
100%) puesto que el hongo utiliza parte de la lactosa para su propio crecimiento y
para mantenimiento de sus funciones vitales.
El rendimiento de la fermentacin es de entre 60 y el 70% del rendimiento mximo, y
el 40% de las materias primas pasan a ser cido ctrico.
Se puede concluir que el Aspergillus niger, es un microorganismo adecuado para la
produccin de cido ctrico a partir del suero lcteo, presentando poca diferencia
entre el suero entero e hidrolizado, es decir que este microorganismo es capaz de
sintetizar de forma eficiente la lactosa y tomar la glucosa como fuente de energa
para su crecimiento; y as realizar la fermentacin para producir este cido.
El tiempo de seguimiento escogido de 8 (ocho) das siendo suficiente para agotar la
glucosa y producir el cido ctrico, su produccin fue en forma logartmica
proporcional al crecimiento de los microorganismos cada 100 ml iniciales de suero
hidrolizado con una concentracin final de cido ctrico es de 9,581x10-3 g/ml en
suero hidrolizado y una biomasa de 15.21 x10-3 g/ml. La cantidad de glucosa en
el medio el da ocho fue de 2x10-4 g/ml en suero hidrolizado.
Se recomienda que el cido ctrico obtenido a partir del suero lcteo por Aspergillus
niger, sea extrado y refinado para posteriores aplicaciones en la industria alimentaria,
adems que su efecto sea comparado con el obtenido industrialmente con la melaza
de la caa (4).

ECUACIONES DE BALANCE DEL FERMENTADOR TANQUE AGITADO

La ecuacin que modela el funcionamiento del fermentador son los respectivos

balances de:
Masa de clulas viables (pellets de A. niger):
19

Balance de consumo de sustrato:

Balance de formacin de productos:

Balance del volumen del reactor:

0 t ts
X
S

0
0

S S

P0 P Ps
CINETICA DE FERMENTACION

Dentro de la curva de crecimiento se pueden distinguir cuatro etapas:

1) Fase de retraso o adaptacin, al inocular una poblacin microbiana en
medio fresco hay un tiempo de retraso en el crecimiento inicial, que puede
ser corto o largo, dependiendo de las condiciones del medio.
2) Fase exponencial o de reproduccin asexual de la clula, se caracteriza
por el rpido crecimiento celular.
3) Fase estacionaria, donde el crecimiento cesa por el agotamiento de los
nutrientes o por la accin inhibitoria del exceso de producto de desecho
fabricado en el medio. La concentracin de clulas producidas en la fase
anterior se mantiene constante, sin embargo todas las funciones celulares
continan. En esta fase se producen la mayor parte los metabolitos
secundarios.
20

4) Fase de decline o muerte, el conteo microscpico directo puede

permanecer constante, pero la viabilidad de las clulas disminuye
lentamente debido al agotamiento total de nutrientes.

SISTEMA DE AGITACIN

La agitacin que requiere el sistema para la necesaria homogeneizacin

del medio, vendr dada por tres palas giratorias situadas en el eje central
del fermentador, dispuestas en la parte de abajo, arriba y centro y girando
aproximadamente a 70 u 80 rpm, aunque ha de ajustarse el valor ptimo
una vez se encuentre en funcionamiento la planta.
Habr una entrada de aire por un difusor y que conectar con las palas de
agitacin. El aire entrar con la ayuda estas palas a distintos puntos del
fermentador. Se Tendr as un mayor control de la entrada de aire en
distintas zonas de la unidad. (1)

SISTEMA DE AIREACIN
21

La fermentacin del cido ctrico es esencialmente un proceso aerobio y,

por lo tanto, necesita una oxigenacin apropiada (2). Existen dos claras
posibilidades, usar oxgeno puro o utilizar el aire exterior. La primera
posibilidad ahorra la esterilizacin necesaria para que ningn
microorganismo externo contamine el proceso, pero habra que adquirir
regularmente el oxgeno gas, lo cual a la larga resultara ms caro. La
segunda alternativa obliga a incorporar un sistema de esterilizacin del
aire pero da libertad con respecto al suministro. Adems la bibliografa
consultada indica que el rendimiento del proceso en presencia de aire es
ligeramente mayor que con oxgeno puro.
Se ha optado por utilizar aire del exterior como fuente de oxgeno, para la
esterilizacin se usar un sistema de filtrado que retenga los
microorganismo y partculas.

FILTRACIN 1

Entre los distintos tipos de filtros, se ha escogido los de vaco debido,

principalmente, a su gran capacidad, pequeo tamao, posibilidad de
trabajo en continuo y bajo coste de operacin. Dentro de los filtros a vaco
se usarn
principalmente los de
tambor rotatorio.

Tras acabar el ciclo

fermentativo, y antes
de la lechada de cal,
se debe separar el
micelio (microorganismo muerto) del medio post-fermentativo, es
importante separarlo en su totalidad y lo ms limpiamente posible ya que
se trata de un subproducto de la planta comercializable.
FILTRACIN 2
En esta etapa se separa el citrato clcico producido por la lechada del
resto del licor. Para ello se usar un filtro de tambor rotatorio a vaco que
separar el citrato precipitado en forma de torta, quedando como residuo
el resto del licor compuesto principalmente por agua, nutrientes,
22

deshechos de la fermentacin, cido ctrico e hidrxido clcico sin

reaccionar.
FILTRACIN 3
Tras la descomposicin del citrato clcico con cido sulfrico, el cido
ctrico quedar libre en disolucin, pero se formar una gran cantidad de
sulfato clcico (yeso) que ha de separarse del producto. Para este fin se
usar un filtro de banda horizontal de vaco.

LECHADA DE CAL
Para separar el cido ctrico se utilizar el denominado proceso calsulfrico. En esta etapa, el licor entrar en un tanque agitado donde se
mezclar con la lechada paulatinamente. La agitacin y la lenta
incorporacin favorecern la reaccin que formar el citrato clcico a
partir del cido ctrico y el hidrxido de calcio.

DESCOMPOSICIN DEL CITRATO

Tras separar el citrato clcico del licor post-fermentativo el proceso calsulfrico ha de completarse aadiendo cido sulfrico al citrato clcico, lo
que provocar que se forme cido ctrico libre, que se queda solubilizado,
y sulfato clcico o yeso, que precipita. El cido sulfrico provendr de una
disolucin al 10% en peso la cual contendr un exceso del 5% en el cido
para tener la seguridad de que todo el citrato se transforma. Esta reaccin
es exotrmica por lo que ha de mantenerse refrigerado el reactor y no
permitir que supere los 60C ya que a partir de esa temperatura la
conversin disminuye.

EVAPORACIN
23

Tras separar el sulfato clcico del cido ctrico quedar una disolucin de
baja concentracin de ste debido a la gran cantidad de agua usada
durante la separacin. Antes de proceder a cristalizar el producto se hace
necesario concentrarlo para que, posteriormente, puedan formarse los
cristales. El objetivo ser alcanzar una concentracin en cido ctrico en
torno al 67%, que es la que se utiliza en la industria como alimentacin del
cristalizador, partiendo de una concentracin aproximada del 10%
obtenida tras la reaccin de descomposicin del citrato clcico. Para esta
tarea la opcin ms empleada industrialmente es la evaporacin, que
consiste en la separacin de un disolvente voltil de un soluto no voltil
por vaporizacin del disolvente, agua en este caso.

CRISTALIZACIN

Tras concentrar la disolucin de cido ctrico en el evaporador se necesita

transformarla en un producto slido con las caractersticas comerciales
apropiadas. En esta etapa lo importante ser el rendimiento en cristales y
la pureza de los mismos, pero tambin es de gran importancia el aspecto y
tamao. Un tamao uniforme es importante para que no se formen
agregados ni aglomeraciones una vez envasado, adems los cristales
intervienen en operaciones posteriores de secado, transporte y
almacenado, en las cuales tambin interesa un tamao de cristal
uniforme. El tipo ms comn de cristalizador usado para este proceso es el
de vaco.

CENTRIFUGACIN

Tras la etapa de cristalizacin se obtiene un licor saturado en cido ctrico

que acompaa a los recin formados cristales. Se necesita separar esta
mezcla bifsica ya que lo que interesa, como producto, son los cristales de
cido ctrico lo ms puros y secos posibles. La filtracin que se plantea que
es la que ms se utilizacin industrialmente, es un filtrado por
centrifugacin; utilizando una fuerza centrifuga de varios cientos de G se
separara el cristal slido del licor madre.

24

SECADO

Se usar una unidad de secado para eliminar toda el agua posible que
quede en los cristales de cido ctrico tras la centrifugacin. Los cristales
entrarn al secador con una humedad mxima de 5% y perdern agua
hasta contener un mximo de 0,5% de agua. Los secadores adiabticos o
directos hacen contactar el slido con un gas caliente que elimina la
humedad, la velocidad del gas es baja de manera que el lecho se fluidiza y
no se arrastran los cristales.

SISTEMA DE CONTROL

TEMPERATURA
El conocimiento en todo momento de la temperatura de operacin de los
equipos de la planta es crucial, ya que de ella depende en gran medida el
rendimiento del proceso al tener gran influencia en las reacciones que
tienen lugar y en las operaciones de intercambio de calor.
La temperatura a controlar ser diferente segn la operacin considerada:
fermentacin, lechada, craqueo, evaporacin, etc. Se utilizar un sistema
de control P.I.D. (proporcional, integral, derivativo). Un PID es un
mecanismo de control por realimentacin que calcula la desviacin o error
entre un valor medido y el valor que se quiere obtener, para aplicar una
accin correctora que ajuste el proceso. El algoritmo de clculo del control
PID se da en tres parmetros distintos: el proporcional, el integral, y el
derivativo. El valor Proporcional determina la reaccin del error actual. El
Integral genera una correccin proporcional a la integral del error, esto nos
asegura que aplicando un esfuerzo de control suficiente, el error de
seguimiento se reduce a cero. El Derivativo determina la reaccin del
tiempo en el que el error se produce.
Las consignas a controlar ser la
temperatura estipulada para cada proceso
un rango de medida de 1C con un error
0,1C. Los lazos y conexin sern de la
manera

con
del
siguiente

PRESIN

25

Tanto en la fermentacin como en las reacciones qumicas se producen

gases que pueden dar lugar a sobrepresiones perjudiciales para el
sistema, adems otros equipos, como los evaporadores, trabajan con
presiones diferentes a la atmosfrica, por lo tanto es obligatorio conocer
en todo momento la presin de trabajo de estos equipos.
Se instalar una sonda interna de presin absoluta y un controlador P.I.D.
para anticiparse a las variaciones de los sistemas que trabajen a presin.
Una vlvula de regulacin neumtica influir en la entrada o salida de
gases para mantener la presin adecuada en todo momento.

MEDIDORES DE FLUJO
Es importante conocer el caudal de sustancia que circula de un equipo a
otro de la planta, para ello se necesita algn sistema de medicin del flujo.
Para cada flujo ocupamos un medidor distinto:
- Fluidos limpios: rotmetro.
- Fluidos con slidos: medidor de coriolis.
- Slidos: vlvulas rotatorias con forma de cruz ubicadas en la salida de la
tolva de almacenamiento de los slidos.
MEDIDORES DE NIVEL
Se usarn medidores de nivel para controlar el volumen de los depsitos
de la planta y conocer su estado de llenado. Los dispositivos de nivel
empleados en el proceso, tambin en funcin de la naturaleza del fluido,
son:
Medidores elctricos para suspensiones con cristales y slidos
Medidores de presin para lquidos limpios.

PH
Mantener un pH adecuado es muy importante tanto en la fermentacin
como en las reacciones de lechada y craqueo del citrato, por lo que se
usarn sensores de electrodo de vidrio para controlar el pH dentro de cada
una de las unidades involucradas. El sensor mide el pH mediante
diferencias de potencial con un error de 0,03 0,1% de pH.
El controlador P.I.D. actuar con un rango de voltaje que ser convertido
en 3 bar a 15 bar de presin para accionar una vlvula neumtica que
26

controlar la entrada de cido o base dependiendo de la unidad en la que

se encuentre.
OXIGENO
Para controlar el correcto crecimiento de la biomasa dentro del
fermentador as como conocer el avance de la fermentacin, se usar un
sensor de conductividad trmica que proporcionar la relacin entre el
oxgeno y el dixido de carbono presentes en el medio.
Un sensor de conductividad trmica con salida en intensidad alimentar el
control P.I.D. que mandar la seal a un convertidor de intensidad-presin
que accionar la vlvula de entrada de aire.

CONTROL DE CALIDAD

CONTROL DE MATERIAS PRIMAS

El primer anlisis se realizar en el momento de la recepcin en planta del
suero lcteo, buscando conocer varios parmetros bsicos:
Cantidad de azcares fermentables.
Cantidad de agua.
Cantidad de nitratos.
Se tomarn muestras de todas y cada una de las materias primas a la
recepcin en plantas. Se analizarn las muestras en el laboratorio de la
planta y se almacenar un valor de muestra suficiente para los futuros
anlisis.
CONTROL DURANTE EL PROCESO FERMENTATIVO
Para medir el crecimiento microbiano, unos de los principales indicativos
del estado de la fermentacin, se utilizarn dos tipos de medida: turbidez
de la masa fermentativa y crecimiento en placa Petri.
Una ventaja de los dispositivos autmatas programables es la posibilidad
de, con los datos experimentales obtenidos en planta, reprogramar los
ciclos en funcin de las necesidades y experiencia obtenida.
La experiencia ser la que dicte el momento exacto del final del proceso
fermentativo y principio del resto de procesos post-fermentativos.
Una vez que se tengan los valores de las variables que permitan la
mxima produccin, se har una reprogramacin de los automatismos de
la planta de manera que se opere siempre con estos valores, para ello las
27

unidades escogidas para construccin de la planta deben de poder ser

fcilmente reprogramables y compatibles con el resto de unidades.
Existir una serie de factores clave a la hora de determinar la viabilidad
del proceso fermentativo, tanto en el crecimiento adecuado de la biomasa
como en la acumulacin de cido ctrico en las clulas.
Estos factores sern los siguientes:
- Nitrgeno: Para la produccin ptima ser necesario mantener una
concentracin de nitrato de amonio (la fuente de nitrgeno) alrededor del
0,20%, por encima o debajo de este valor la produccin de biomasa y de
cido ctrico disminuyen notablemente.
- Tiempo de fermentacin: El tiempo de fermentacin ptimo es de 144 a
146 horas.
- Temperatura: La temperatura ptima es de 30C, por debajo de ella el
metabolismo celular es bajo y la produccin es menor y por encima de
30C disminuye el rendimiento en cido ctrico y aumenta la produccin de
otros compuestos, principalmente cido oxlico.
- Cantidad de inculo: Se ha demostrado que la cantidad de inculo ideal
es de un 1% del volumen efectivo del fermentador.
- Ferrocianida (K4Fe(CN)6): 200 ppm es la concentracin ideal de
ferrocianida en el medio, si se aade. La adicin de ferrocianida se realiza
tras 24 horas de fermentacin y su presencia es beneficiosa tanto en
produccin como en mantenimiento de la viabilidad de las clulas a lo
largo del proceso (1).
- Mantener el rango de pH: Inicialmente el suero tiene un pH de 4 y
despus de los ocho das de anlisis el pH obtenido estuvo entre 3,5 y 3,8.
Lo cual indica una acidificacin del medio producido por la fermentacin
que realiza el Aspergillus niger al producir el cido ctrico. Para mantener
la productividad es comn aadir CaCo3 o NaOH para mantener el pH (2).
CONTROL DEL PRODUCTO TERMINADO
Una vez obtenido el producto final y antes de proceder a su embalaje se
realizarn una ltima medida de ciertos parmetros en el laboratorio.
Humedad.
Residuo seco.
Pureza.
Aspecto y textura mediante inspeccin visual.
Metales pesados.
Olor y color mediante inspeccin visual.
28

Finalmente se rellenar automticamente con el programa Microsoft Excel

una tabla a partir de los datos obtenidos en las mediciones (1).

EVALUACIN DE IMPACTO AMBIENTAL

RESIDUOS SLIDOS
Entre los residuos slidos se encuentra envases de cartn y plstico que
se tratarn como residuos slidos urbanos. Los aceites usados por la
maquinaria se entregaran a terceros para su adecuada disposicin.
Pero el principal residuo slido producido va a ser el sulfato clcico o yeso
proveniente de la descomposicin del citrato clcico el cual este
subproducto ser vendido como aglomerante y relleno en la industria de la
construccin o como filtrante en la industria de la alimentacin. El yeso
ser almacenado en unos depsitos en espera de su venta.
EMISIONES GASEOSAS
Aproximadamente entre el 80% y 90% del total de las emisiones de los
compuestos orgnicos voltiles (COVs) es etanol y del 10% al 20%
consiste en otros alcoholes y acetaldehdo.
La velocidad de formacin de alcoholes es ms alta en las primeras etapas
de la fermentacin ya que en ellas hay un exceso de azcar y menor
aireacin, por lo que se realiza un control en la etapa intermedia donde la
produccin es cuantitativamente mayor.
Estas emisiones se pueden prevenir o reducir, evitando la produccin de
etanol, con un estricto control del proceso aplicando las siguientes
medidas:

Evitando el exceso de azcar en el suero de la leche, y controlar

diluyndolo.
Cuidar la agitacin mecnica del fermentador para que la
distribucin del oxgeno sea la ptima.
Implantar un sistema de monitorizacin y un control de
retroalimentacin permite reducir la formacin de etanol desde un
75% a un 95%

VERTIDOS LQUIDOS

29

En primer lugar, las aguas de refrigeracin, las de lavado y desinfeccin de

maquinaria y las de uso sanitario se evacuarn a la red de alcantarillado.
Un efluente de gran volumen que se obtendr como subproducto es el
licor madre que sale del cristalizador, con un porcentaje de cido ctrico
del orden de 30% y que no puede usarse para cristalizacin debido a que
las impurezas se incrustaran en los cristales.
Con esta corriente se pueden tomar diversas acciones:

Ser vendido como emulsionante para la industria alimenticia.

Otra opcin empleada industrialmente es la recirculacin de esta
corriente a la etapa de lechada o de intercambio inico, esta
prctica tambin supone un incremento de coste tanto en materia
prima como en energa.

El efluente con ms carga contaminante, sin embargo, es el licor postfermentativo, para este y el resto de los efluentes se diseara un proceso
con digestores anaerbicos seguido de un tratamiento aerobio para
eliminar entre un 70% a 80% de la demanda qumica de oxgeno (DQO) lo
que producira, adems, un biogs til para producir energa.
Otro efluente que debe tenerse en cuenta es el propio licor fermentativo
poco fermentado o a medio fermentar; debido a que puede darse un mal
proceso y tener que eliminar todo el volumen de reactor por algn fallo en
el crecimiento microbiano, al tener la produccin dividida en varios
fermentadores las consecuencias de este fallo y el problema que acarrea
la disposicin de este efluente ser menor (1).

SISTEMA DE GESTIN MEDIOAMBIENTAL

A nivel internacional la norma ISO 14.000 regula la gestin ambiental
dentro de las empresas en lo que respecta a la implementacin de un
sistema de gestin ambiental y auditoras ambientales a las que se
someten la empresas, entre otros.
De forma particular, la norma ISO 14.001 "Sistemas de Gestin Ambiental"
especifica los requisitos para un sistema de gestin ambiental.
La implementacin de este tipo de sistema permitir a la empresa
anticiparse a las regulaciones ambientales ms estrictas permitiendo que
el ajuste a la nueva realidad legislativa se realice de manera gradual y
mediante cambios en los procesos de produccin, en vez de recurrir a
grandes inversiones en plantas de tratamiento de residuos (1).

30

PROBLEMA PROPUESTO (10)

En la manufactura del acido citrico usando un cultivo sumergido con
Aspergillus niger usando un reactor batch operando a 30 C por un periodo
de 2 dias, 2500 kg de glucosa, 860 kg de oxigeno son consumidos para
producir 1500 kg de acido citrico, 500 kg de biomasa y otros productos.
El amoniaco es usado como recurso de nitrogeno. La potencia de entrada
de la agitacion mecanica para el caldo es 15 kW, posee un impulsor de un
D1 = 0,02 metros y una velocidad del impulsor de N1 = 80 rpm.
Aproximadamente 100 kg de agua es evaporada por periodo de cultivo.
Estime los requerimientos para el enfriamiento del reactor.
Calcule la velocidad de agitacion para un diametro de impulsor 2
veces mas grande.
Solucion:
Diagrama del problema

31

Asumimos:

Sistema homogneo
Sin fugas
Solucin ideal
Calor sensible despreciable
El calor de reaccin a 30C es - 460 kJ/gmol 02 consumido

Tomamos como base 1500 kg de acido ctrico producidos en 2 das.

Dato extra: Hv agua a 30C = 2430.7 kJ/kg
Reaccin: Glucosa + 02 + NH3 Biomasa + CO2 + H20 + Acido ctrico
Balance de Energa: El objetivo de este balance para cultivo batch es
clculo del calor el cual ser removido produciendo una acumulacin de
energa igual a cero en el sistema, donde cada termino se refiere a dos
das de
periodo de cultivo.
Clculos:
Este trmino hace referencia a la cantidad de O2 consumida.

La prdida de calor por evaporacin

La potencia de entrada por
agitacin mecnica en un periodo de 2 das:
32

Estos trminos pueden ser sustituidos en el balance de energa:

El calor es positivo indicando que se debe extraer el calor del sistema.

Note las magnitudes relativas de las contribuciones energticas por el
calor de reaccin, el trabajo de eje y evaporacin, pudiendo usualmente
los efectos de evaporacin ser ignorados.
Por lo tanto: 1,5 x 10 kJ deben ser extrados del fermentador por cada
1500 kg de acido ctrico producidos.
Finalmente: La mayora de los procesos para produccin de cidos
orgnicos tienen el siguiente scaling up para sistemas largos. Esta
ecuacin expresa la relacin entre el tamao del impulsor y la velocidad
de agitacin:

Siendo

N2=50,4 rpm
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
(1) Planta industrial de produccin de cido ctrico a partir de melazas de
remolacha (2008). Francisco Javier Rivada Nez .Universidad de Cdiz
Facultad de Ciencias.
http://rodin.uca.es/xmlui/bitstream/handle/10498/6411/34254675.pdf?
sequence=1
(2) Biotecnologa para Ingenieros: Sistema biolgico en procesos
tecnolgicos. Alan Scragg. Limusa 2000.
(3) Uso de la fermentacin para el aprovechamiento del lactosuero Juan
Sebastin Ramrez-Navas, PhD -Escuela de Ingeniera de Alimentos33

(4) Produccion de cido ctrico a partir de suero lcteo entero e hidrolizado

con aspergillus niger, por va fermentativa leal d. 1, pico y2, castro j.3,
guerra j.4, castro g.5* Programa de ingeniera de alimentos.
(5) Obtencin de cido Ctrico por medio de fermentacin sumergida a
partir de Aspergillus niger ATCC 16404 utilizando suero de leche como
medio de cultivo-Trabajo de graduacin presentad o por Berta Eunice
Lorena Elizondo Gmez y Roberto Salvador Manzanares EstradaLicenciatura en Qumica y Farmacia, Diciembre de 2009, San Salvador, El
Salvador Centro Amrica.
http://ri.ues.edu.sv/2608/1/16101588.pdf
(6) YANG, S.T. Y SILVA, E.M. Novel products and new technologies for use of
a familiar carbohydrate, milk lactose. Journal of Dairy Science, 1995, vol.
78, no. 11, p. 2541-2562.
(7) LPEZ ROS, C.A., ZULUAGA MENESES, A., HERRERA PENAGOS, S.N.,
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NRRL 2270 from milk whey. DYNA, 2006, vol. 73, no. 150, p. 39-57.
(8) SINGH, R., SOOCH, B.S., KAUR, K. Y KENNEDY, J. Optimization of
parameters for citric acid production from cheddar cheese whey using
Metschnikowia pulcherrima NCIM 3108. Journal of Biological Sciences,
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whey by Aspergillus niger. International Journal of Food Microbiology, 1996,
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(10) Bioprocess Engineering Principles. Pauline Doran Example 5.8: Citric
acid production page 105

34