Manual 2014

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE CIENCIAS
MANUAL DE PRCTICAS DE BIOLOGA MOLECULAR DE LA CLULA II.
Semestre 2014-1
0
MANUAL DE PRCTICAS DE BIOLOGA MOLECULAR DE LA CLULA II.
Reglamento interno de higiene y seguridad del laboratorio

de biologa molecular de la clula II
Normas de seguridad en el laboratorio
Formas de expresar la concentracin de una solucin
Unidades fsicas
Unidades qumicas
Clculos y medidas de utilidad en bioqumica
Ejercicios
Prctica1. Propiedades generales de los lpidos
Prctica 2. Membranas y smosis
12
Prctica 3. Transporte a travs de la membrana
18
Prctica 4. Carbohidratos
22
Practica 5. Fermentacin de la glucosa por la levadura de panificacin
27
Prctica 6. Estudio del bombeo de protones por levaduras. Efecto de los inhibidores de la
cadena de transporte de electrones y de los desacoplantes
30
Practica 7. Metabolismo de lpidos. Conversin de grasas a sacarosa
33
Prctica 8. Reduccin del 2-6 diclorofenol-indofenol (DCPIP) dependiente de la actividad

fotosinttica de cloroplastos aislados de Spinacea oleraceae (espinaca)
38
Prctica 9. Actividad enzimtica de la Pirvico Transaminasa
42
Anexo I
45
REGLAMENTO INTERNO DE HIGIENE Y SEGURIDAD DEL LABORATORIO DE BIOLOGA

MOLECULAR DE LA CLULA II
ART. 1 La observancia del presente reglamento es obligatoria para el personal acadmico, alumnos y
personal administrativo que labora en el laboratorio de Biologa Molecular de la Clula II. Este
reglamento deber darse a conocer a cada uno de los integrantes.
ART 2 Se deber conocer el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de
evacuacin y las medidas de seguridad establecidas en el laboratorio.
ART. 3 Mientras se est en el laboratorio es obligatorio el uso de bata. Usar guantes y lentes de
proteccin cuando maneje material txico por contacto, radioactivo o contaminado infeccioso.
ART. 4 Mientras se est en el laboratorio, queda estrictamente prohibido fumar, beber, comer,
aplicarse cosmticos y el uso de celulares.
ART. 5 Queda prohibido sentarse en las mesas de trabajo.
ART. 6 Se debern conservar limpias y ordenadas las mesas de trabajo.
ART. 7 Es obligacin del alumno revisar y contar perfectamente el material de cristalera que le sea
entregado para la realizacin de la prctica as como revisar el buen funcionamiento de los aparatos
elctricos. Lo mismo aplica para la devolucin del material. Cualquier anomala presentada del
material o los equipos debida al mal uso de ste (prdida, rotura o descompostura) ser
responsabilidad del alumno.
ART. 8 Se deber evitar pipetear lquidos con la boca. Tambin se deber evitar dejar las pipetas
dentro de los frascos de reactivos y / o soluciones.
ART. 9 Es deber del alumno consultar con el profesor que imparte la prctica, cualquier duda en el
procedimiento y/o en el manejo del equipo.
ART. 10 Es obligatorio que se sigan las recomendaciones del uso de aparatos e instrumentos de
laboratorio, las cuales se les sern indicadas por el profesor que imparte la prctica.
ART. 11 Es deber del profesor de la materia nombrar una comisin de seguridad, la cual estar
encargada de vigilar el seguimiento de este reglamento as como de evitar dejar sin vigilancia el
laboratorio durante el periodo que abarque la clase.
ART. 12 Las personas a las quienes se le sorprenda haciendo mal uso de los equipos, materiales,
instalaciones, etc. propios del laboratorio sern sancionados conforme a la Legislacin Universitaria
segn la falta cometida.
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Conocer el sistema de alertamiento, zonas de seguridad, rutas de evacuacin y medidas de
seguridad establecidas en el laboratorio.
En caso de incendio: Ponerse a salvo. Activar el servicio de Bomberos de la UNAM,
extensiones 20565 20566 o a la Central de Emergencias 55 (red digital UNAM). Dar aviso.
En caso de presentarse un lesionado grave: Activar de inmediato al Servicio Mdico de
Urgencias, extensiones 20202, 20140 o marcar la Red de Emergencias 55.
Regla del yo-yo. Primero mi seguridad.
Al activar el servicio mdico de urgencias. Proporcionar la ubicacin. Dar referencias de vas
de acceso.
Mecanismo de lesin.
Nmero de lesionados.
Solicitar apoyo a Bomberos, vigilancia, etc.
Mantener el rea de trabajo, el equipo y los aparatos tan limpios como sea posible.
Se deber trabajar con bata obligatoria.
Mientras se est en el laboratorio queda prohibido comer, beber y fumar.
No arrojar a los desages o lavaderos residuos slidos (grasa, papel, cerillos, etc.),
depositarlos en los botes de basura.
Para desechar cidos fuertes y otras sustancias corrosivas, abrir primero la llave del agua
hasta tener un flujo conveniente para diluir y arrastrar la sustancia y vaciar lentamente el
material que se desee eliminar.
No arrojar a la tubera de desage varias sustancias simultneas ya que podrn reaccionar
entre s, hgalo de una en una, dejando correr el agua para espaciarlos.
Muchos productos qumicos son peligrosos porque son txicos o inflamables por lo que antes
de iniciar un experimento, se debe revisar las etiquetas de los reactivos que se van a emplear,
en busca de cualquier advertencia de peligro, prestando especial atencin a las precauciones
indicadas para su manejo.
Nunca dejar sustancias sin identificar con una etiqueta, y si se trata de reactivos preparados,
anotar tambin la fecha de su preparacin.
Utilizar una esptula cuando manipulemos sustancias slidas para evitar el contacto con la
piel y no las llevemos a la boca en ningn momento.
Para percibir el olor de un material, no acercarlo directamente a la nariz, hay que aproximar
los vapores a la cara soplando con la mano sobre la boca del recipiente que se mantendr a
unos 20 cm de distancia.
Cuando mida lquidos peligrosos, utilizar una probeta, pero si se requiere de mayor precisin,
colocar el lquido dentro, de un recipiente estrecho (probeta) y llenar la pipeta por inmersin o
utilizando una pera de hule.
Nunca pipetear lquidos con la boca, sino usando propipetas.
Para cada reactivo utilizar una pipeta diferente y de ser posible enjuagarla con agua
inmediatamente despus de terminar de usarla.
Cuidar el no derramar en las mesas cidos o lcalis fuertes, pero si esto ocurre, limpiar y
enjuagar bien con agua tanto la mesa como el exterior de los frascos.
El mismo cuidado debe tenerse cuando se trabaje con solventes voltiles ya que la mayora
son inflamables.
Cuando se trabaje con vapores irritantes, txicos o inflamables utilizar la campana de
extraccin.
No mantener el mechero encendido al trabajar con sustancias inflamables como son el ter,
alcohol, acetona, benceno, thiner, etc.
Para preparar una disolucin de un cido o de una base concentrada y muy especialmente el
cido sulfrico, vierta SIEMPRE EL CIDO SOBRE EL AGUA y nunca al revs, ya que el calor
generado para la disolucin, puede hacer hervir el agua con la consecuente salpicadura del
cido a la cara y manos de operador.
Al calentar lquidos en tubos de ensaye no apunte la boca del mismo hacia ninguna persona
ya que el lquido puede hervir violentamente y ser proyectado a gran distancia.
La vidriera es frgil por lo que debe manejarse con cuidado. El material de medicin
(probetas, buretas, pipetas o matraces aforados) no deben someterse a calentamiento. Si se
necesita insertar un tapn de hule en un tubo de vidrio o un termmetro, lubrquelo con unas
gotas de agua y haga girar el tubo dentro del tapn mientras lo va introduciendo (proteja su
mano con un trapo).
Todo producto qumico aunque no lo sea, debe ser manejado como si fuera txico.
No dejar quemadores, mecheros, parrillas, lmparas. etc. encendidos sin que alguien que los
atienda.
Las manos y la ropa, as como el piso y los bancos del laboratorio debern estar secos
cuando se utilicen aparatos elctricos.
Se deber consultar al profesor responsable para efectuar el desecho adecuado de sustancias
como la acrilamida sin polimerizar, bromuro de etidio, ter, istopos radiactivos o cualquier
sustancia que sea considerada peligrosa.
Todos los accidentes por triviales que parezcan, deben comunicarse inmediatamente al
profesor.
FORMAS DE EXPRESAR LA CONCENTRACIN DE UNA SOLUCIN

Una solucin es una mezcla en que dos o ms sustancias se han unido en una dispersin
homognea. A la sustancia que se encuentra en mayor proporcin se le llama disolvente y soluto al
compuesto que se encuentra en menor proporcin. La solubilidad de un soluto es la mxima cantidad
que se disolver en una cantidad dada de disolvente a una temperatura especfica.
Se pueden utilizar varias formas para expresar la concentracin de una solucin:
UNIDADES FSICAS
% p/p w/w, Porcentaje en masa: es la cantidad de soluto en gramos por cada 100 g de solucin.
% v/v, Porcentaje volumen: es la cantidad de soluto en ml por cada 100 ml de solucin.
% p/v w/v, Porcentaje en masa/volumen: es la cantidad de soluto en gramos por cada 100 ml de
solucin.
ppm, partes por milln: es igual a los miligramos de soluto en un Litro de solucin (mg/L).
Densidad, expresa la cantidad de gramos del soluto por cada mililitro de solucin (g/ml).
UNIDADES QUMICAS
Molaridad (M):
___No. de moles de soluto___
volumen de la solucin (1L)
Molalidad (m): _No. de moles de soluto_
peso del solvente (kg)
Normalidad (N):
____No. de equivalentes____
Volumen de la solucin (1 L)
El nmero de equivalentes es igual al peso molecular entre la valencia. La valencia es el nmero de
iones H+ OH- sustituidos o sustituibles.
Fraccin mol (X): No. de moles de soluto
# de moles totales
CLCULOS Y MEDIDAS DE UTILIDAD EN BIOQUMICA
En el ao de 1960 la Conferencia General de Pesas y Medidas y la Oficina Internacional de
Pesas y Medidas con sede en Pars, Francia acordaron crear el Sistema Internacional de Pesas y
Medidas (SIU o SI) con el objetivo de facilitar el intercambio de informacin cuantificable y
universalizar su uso. El SI es bsicamente una versin ampliada del sistema mtrico decimal y consta
de siete unidades bsicas independientes para cuantificar diferentes magnitudes fsicas. A
continuacin se describen estas unidades, adems de los smbolos que se deben utilizar cuando se
hace mencin a stas.
Unidades bsicas del SI
Magnitud fsica
Longitud
Masa
Tiempo
Corriente elctrica
Temperatura
Intensidad luminosa
Cantidad de sustancia
Nombre de la unidad
metro
kilogramo
segundo
amperio
kelvin
candela
mol
Smbolo
m
kg
s
A
K
cd
mol
Muchas veces las unidades bsicas o derivadas pueden ser muy grandes o muy pequeas para
representar una cantidad en particular. Para esos casos, el SI admite el uso de una serie de prefijos
que permiten formar mltiplos o submltiplos decimales de las unidades del SI. Estos prefijos se
muestran a continuacin:
Prefijos utilizados en el SI
Prefijo
Ato
Femto
Pico
Nano
Micro
Mili
Centi
Deci
Factor
10-18
10-15
10-12
10-9
10-6
10-3
10-2
10-1
Smbolo
a
f
p
n
m
c
d
Prefijo
Deca
Hecto
Kilo
Mega
Giga
Tera
Peta
Exa
Factor
101
102
103
106
109
1012
1015
1018
Smbolo
Da
h
k
M
G
T
P
E
Clculo y expresin de diluciones

Una dilucin consiste en preparar una solucin menos concentrada a partir de una ms concentrada.
Las diluciones generalmente se expresan como una razn matemtica, por ejemplo 1:5 (o 1/5), 1:10
(o 1/10), etc. En el caso de una dilucin 1:5, sta expresa la cantidad, sea volumen o peso de una
sustancia en un volumen total o final de la forma 1 volumen (o peso) en un volumen (o peso) total de
5 volmenes. Ntese que el volumen total o final estar compuesto de 1 volumen de la sustancia a
diluir y 4 volmenes del disolvente. Para calcular la concentracin final de una solucin diluida, se
multiplica la concentracin de la solucin original por la dilucin expresada como fraccin.
Ejemplo: una solucin de urea cuya concentracin es de 5 mg/ml es diluida 1/10.
La concentracin final de la solucin diluida es 5 x 1/10= 0.5 mg/ml.
La ecuacin ms comnmente utilizada para preparar soluciones es:
V1 x C1 = V2 x C2 donde,
V1 es el volumen de la solucin concentrada que se debe aadir para preparar la solucin diluida
C1 es la concentracin de la solucin concentrada.
V2 es el volumen de la solucin diluida.
C2 es la concentracin de la solucin diluida.
Al utilizar esta ecuacin debe tomarse en cuenta que tanto las unidades de V1 y V2 as como las de
C1 y C2 deben ser las mismas, preferiblemente ml y mol/l respectivamente.
El factor de dilucin representa el nmero de veces que fue diluida la solucin concentrada. Si se
hace una serie de diluciones, la concentracin de la solucin final se obtiene al multiplicar la
concentracin original por el producto de los factores de dilucin.
Ejemplo: si la solucin de glucosa a 45 mol/l del ejemplo anterior es primero diluida 1/9 y luego 1/100,
la concentracin final de la solucin ser 45 X 1/9 X 1/100= 0.05 mol/l, con un factor de dilucin de
900.
Las diluciones seriadas son tambin muy tiles. Estas diluciones son aquellas en las cuales todas las
diluciones hechas a partir de la primera o luego de la primera poseen el mismo factor de dilucin.
Ejercicios (para ser realizados por el estudiante en horas de estudio independiente)

1. Calcule las siguientes concentraciones:
10 M NaOH, diluido 1:20 = _____ M
2 M HCl, diluido 1:5 = _____ M
1000 mg/L glucosa, diluido 1:10 y luego 1:2 = _____ mg/L
250 ml de 5% NaCl contienen ____ g de NaCl
Cunto CuSO4 . 5 H2O debe ser pesado para preparar 100 ml de CuSO4 al 5%? PM del
CuSO4 . 5 H2O: 250 g/mol, PM del CuSO4 : 160 g/mol?
Qu porcentaje de CuSO4 . 5 H2O es agua?
2. Cuntos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2. 3 H2O? PM del MgCl2. 3 H2O: 149 g/mol, PM del
MgCl2: 95 g/mol
3. Cuntos mililitros de NaOH 0.4 M se necesitan para preparar 20 ml de una solucin 2M?
4. Qu porcentaje de Mg contiene el MgCl2. 3 H2O?
5. Cunto CuSO4. 5 H2O debe ser pesado para preparar 1 L de una solucin que contenga 80 mg de
CuSO4?
6. El peso molecular de CaCO3 es 100 g/mol, cuntos gramos son necesarios para preparar?:
1 L de 0.1 M CaCO3?
50 mg/L de CaCO3?
7. Una solucin estndar de hemoglobina contiene 200 g/L. Cuntos ml deben usarse para preparar
6 ml de las siguientes concentraciones?:
200 g/L
150 g/L
100 g/L
50 g/L
8. La solucin salina normal tiene una concentracin de 0.85%. Cul es su molaridad? (PM NaCl :
58.5 g/mol)
9. Cuntos gramos de Na2HPO4 deben ser pesados para preparar 1 L de una solucin cuya
concentracin es de 50 mg/ml?
10. Cul es la dilucin final de una muestra de suero en un tubo que contiene 200 l de suero, 500
l de solucin salina y 300 l de reactivo?
11. Cul es la concentracin en mol/l de una solucin que tiene 100 g de NaOH disueltos en 100 ml
de agua? PM NaOH: 40 g/mol
Prctica 1
PROPIEDADES GENERALES DE LOS LPIDOS
Introduccin
Los lpidos son un grupo de biomolculas que se encuentran ampliamente distribuidas en la
naturaleza. Desde el punto de vista qumico, son el grupo ms heterogneo y, de hecho, no
responden a ninguna composicin general. Su caracterstica general es la apolaridad o
hidrofobicidad, aunque dentro de ellos existen diferentes grados: desde lpidos totalmente apolares e
insolubles en agua hasta los que tienen parte de su estructura altamente polar y son por ello, capaces
de interactuar con el agua a travs de dicha zona.
Hablando desde un punto de vista general, los lpidos apolares cumplen funciones de almacn de
energa metablica, lubricacin y proteccin, mientras que los polares tienen funciones estructurales,
esto es, que participan en la composicin de las membranas biolgicas. Adems de stos, otros
lpidos cumplen otras funciones ms especficas, como vitaminas, hormonas, etc.
Debido a esa caracterstica fundamental, su grado de hidrofobicidad, los lpidos pueden extraerse de
materiales que los contienen mediante disolventes orgnicos ms o menos apolares. Por otra parte
como los procesos biolgicos en los que participan tienen lugar en medios acuosos, el cuerpo
humano se vale a veces, de mecanismos que facilitan su transporte, como la construccin de
lipoprotenas, o la utilizacin de emulsionantes (sales biliares) que facilitan el contacto con las
enzimas que participan en la digestin. Acerca de alguno de estos puntos trata esta prctica.
Numerosos productos naturales son ricos en lpidos. El aceite empleado normalmente en la
alimentacin, sea de oliva, girasol, soya, etc., es una mezcla hidrofbica de triacilglicridos y de
cidos grasos libres, entre los que destaca el cido oleico. Otra buena fuente de lpidos es la yema de
huevo. Un huevo de gallina, cuyo peso oscila entre 55 y 60 g, consta de clara (65 % del peso) y yema
(35 %), y su composicin aproximada en gramos es la siguiente:
Peso total (g)
Agua (g)
Protenas (g)
Lpidos(g) totales
Colesterol (g)
Yema
19-20
9-10
3-3.5
6-6.5
0.2-0.25
Clara
35-36
31-32
3.5-4
0.01
---------
Los lpidos presentes en la yema son de naturaleza variada, destacando los triacilglicridos, el
colesterol y los fosfolpidos. Mediante una extraccin fraccionada se pueden separar los menos
polares, solubles en acetona (triacilglicridos y colesterol) de los ms polares (fosfolpidos), que
seran solubles en disolventes como la mezcla cloroformo/metanol.
Objetivos
1. Aislar el colesterol de la yema de huevo, utilizando acetona como disolvente.
2. Determinar cualitativamente el colesterol mediante una reaccin especfica.
3. Estudiar la solubilidad del aceite de oliva en el disolvente polar, el agua y en otro disolvente
ideal para lpidos apolares, la acetona.
10
Material
*1 Huevo por equipo
Centrfuga
*Aceite de oliva por equipo
Espectrofotmetro
*Papel milimtrico
piceta
*Lentes de proteccin
*2 pliego de papel estraza
1 gradilla
2 celdas de vidrio para espectrofotmetro
recipiente para hielo
2 vasos de precipitado de 50 ml
1 pipeta de 10 ml
1 varilla de vidrio
2 pipetas Pasteur
2 propipetas
1 Micropipeta de 1000 l
2 tubos de centrfuga para solventes
13 tubos de ensayo
Hielo
1 probeta de 10 ml
2 pipetas de 1 ml
2 pipetas de 5 ml
*material que deber traer el alumno.
Reactivos
Colesterol 1mg/ml (disolver en cloroformo)
Acetona (poner en hielo antes de usarse)
cido sulfrico concentrado
Anhdrido actico
Cloroformo
25 ml por grupo
20 ml por equipo
12 ml por equipo.
4 ml por equipo.
5 ml por equipo
Mtodo
A. Extraccin de colesterol de la yema de huevo
1. Cascar un huevo de gallina con precaucin y separar la clara de la yema, teniendo cuidado de no
romper esta. Decantar la clara.
2. Aadir sobre la yema 10 ml de acetona fra y agitar con la varilla, hasta obtener una suspensin
homognea.
3. Verter el contenido en dos tubos de centrfuga y equilibrarlos.
4. Centrifugar a la mxima velocidad en la centrfuga de mesa durante 15 minutos.
5. Concluida la centrifugacin (cuando la centrfuga este totalmente parada) sacar los tubos con
sumo cuidado, retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
6. Guardar el sobrenadante, al que llamaremos extracto acetnico A1.
7. Agregar 10 ml de acetona al pellet (pastilla) restante, agitar con una varilla y repetir todo el
proceso otra vez para una segunda extraccin de colesterol. El segundo extracto obtenido se
llamar extracto acetnico A2.
NOTA: Los tiempos de espera en las centrifugaciones pueden emplearse en ir realizando el
apartado D de la prctica
11
B. Deteccin cualitativa de esteroides

1. Rotular adecuadamente los tubos del 1 al 4.
2. Pipetear en cada uno de los tubos los siguientes volmenes (en ml) de las soluciones que se te
piden:
NOTA: Utilice los lentes de proteccin al adicionar los reactivos.
Prueba de Salkowski
# TUBO
Colesterol (ml)
1
0
2
1 ml
3
0
4
0
Extracto A1 (ml)
1 ml
Extracto A2 (ml)
1 ml
Cloroformo (ml)
1 ml
1 ml
1 ml
cido Sulfrico* (ml)
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
* Resbalar por el tubo para formar una capa en el fondo

NUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL CIDO
3. Se mueven los tubos en el plano horizontal, con el fin de conseguir un buen mezclado.
4. La reaccin es positiva, indicando la presencia de colesterol cuando se observa una coloracin
azul-verde.
C. Deteccin cuantitativa de colesterol
1. Rotular 7 tubos de ensayo del 1 al 7.
2. Pipetear (usar una propipeta) en cada uno de los tubos los siguientes volmenes (ml) de los
reactivos, de acuerdo al orden que se ndica en la tabla.
NOTA: REACCIONES MUY EXOTRMICAS CUIDADO!

Utilice los lentes de proteccin al adicionar los reactivos.
Prueba de Liebermann-Burchard
Curva Patrn
Tubos problema
# TUBO
Colesterol (ml)
0.25
0.5
0.75
Extracto A1 (ml)
Extracto A2 (ml)
Cloroformo (ml)
0.75
0.5
0.25
Anhdrido actico (ml)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
cido Sulfrico (ml)
* Resbalar por el tubo para formar una capa en el fondo
NUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL CIDO
12
Se dejan los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos. La aparicin de un color azul-verdoso
indica prueba positiva para esteroides.
3. Despus de 20 minutos de reaccin leer la densidad ptica a 625 nm
Resultados y procesamiento de datos

Graficar la Absorbancia contra la concentracin de colesterol, calcular la pendiente y la ordenada al
origen, utilizando la ecuacin de la recta, calcular la concentracin del colesterol en las muestras
problema. Observar los colores del estndar, el blanco, y los extractos cetnicos (A1 y A2) en ambas
pruebas.
D. Solubilidad del aceite de oliva

1. Etiquetar 2 tubos de ensayo limpios y aadir 5 ml de agua al primero y 5 ml de acetona al
segundo.
2. Agregar a cada uno de los tubos 60 gotas de aceite de oliva con una pipeta Pasteur limpia y seca.
3. Agitar los tubos y observar los resultados.
Discusin
1. Por qu desde el inicio se desecha la clara de huevo?
2. De qu est compuesta la yema de huevo? Y qu se disuelve de sta al agregar acetona?
3. Por qu escoger acetona y no otro solvente como por ejemplo etanol?
4. De qu tipo de lpidos est formado el aceite de oliva?
Conclusiones
Se cumplieron todos los objetivos?
Referencias
1. Mathews CK, van Holde KE. Bioqumica. 3a. ed. Espaa: McGraw-Hill Interamericana; 2003
2. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999.
13
Prctica 2
MEBRANAS Y OSMOSIS.
Introduccin
La sustancia ms abundante, con diferencia, que difunde a travs de la membrana celular es
el agua. Es preciso recordar que, a travs de la membrana del eritrocito, en condiciones normales
difunde por segundo en ambos sentidos una cantidad de agua equivalente a unas 100 veces el
volumen de la propia clula. Aun as, normalmente, la cantidad que difunde en ambas direcciones
est tan exactamente equilibrada que se produce prcticamente un movimiento neto de agua nulo.
Por tanto, el volumen de la clula permanece constante. Sin embargo, en ciertas condiciones, se
puede desarrollar una diferencia de concentracin para el agua a travs de una membrana, al igual
que se pueden producir diferencias de concentracin para otras sustancias. Cuando esto ocurre, se
produce un movimiento neto de agua a travs de la membrana celular, lo que hace que la clula se
hinche o se contraiga, dependiendo de la direccin del movimiento neto. Este proceso de movimiento
neto de agua causado por una diferencia de concentracin de la misma se denomina smosis.
Desde que, Pfeffer en 1887 fue el primero en describir la conducta osmtica de las clulas vivas, esto
ha sido un punto central en la Biologa. En 1908 Nernst reconoce que el agua puede pasar a travs
de las membranas biolgicas libremente pero no los iones, introduciendo as el concepto de la
membrana "semipermeable".
Para la investigacin de las propiedades osmticas de las clulas vegetales, Overton empleo el
mtodo de plasmlisis, desarrollado largamente por Nageli, de Vries y Pfeffer. Este mtodo se basa
en la observacin de la reduccin y aumento del protoplasma en la pared celular (plasmlisis) por la
accin de una solucin hipertnica de solutos inocuos (ej. sacarosa). Este fenmeno es reversible al
remover el soluto. Por otra parte, la barrera osmtica de clulas viables es tambin impermeable a
pigmentos de plantas (ej. antocianinas) y en el caso de clulas daadas, con venenos, se anulan
estas propiedades osmticas. Overton tambin midi los cambios de peso producido por variacin de
la tensin del soluto externo. La ms sencilla interpretacin de estas observaciones fue que el agua
es permeable a la barrera osmtica, mientras los solutos adicionados eran impermeables.
Objetivos
1. Observar la membrana que delimita a la clula.
2. Identificar el proceso de smosis mediante la observacin en el microscopio de los cambios que
sufre la clula vegetal y animal al modificar la concentracin del lquido extracelular.
3. Distinguir las soluciones hipotnica, hipertnica e isotnica, basndose en los cambios en masa o
volumen que cada solucin provoque en la clula vegetal.
4. Realizar una prueba de fragilidad osmtica de eritrocitos.
Material
Por equipo:
16 tubos de ensaye de 12 X 15 cm
8 tubos para centrfuga
1 gradilla
8 Celdas para espectrofotmetro
3 pipetas de 5 ml
3 pipetas de 1 ml
2 pipetas Pasteur
Papel filtro
1 probeta de 50 ml
1 esptula
1 horadador del #11
1 piceta
Balanza granataria digital
Espectrofotmetro
Centrfuga
Microscopio ptico
Micropipetas de 200 l y 1000 l
1 probeta de 100 ml
14
2 propipetas
Reactivos
Por grupo:
300 ml NaCl al 4%, 6% y 0.9%
500 ml Amortiguador de fosfato 1mM con NaCl al
1%, pH 7.4
Material que debe traer el alumno*:
*Solicitar en el bioterio de su facultad 5ml sangre
total (rata, cobayo, etc.) con EDTA heparina (por
grupo)
*1 cebolla fresca
*1 papa fresca
*1 cronmetro
10 ml Rojo Neutro al 0.5% preparado en

Amortiguador de fosfatos 1 mM
Agua destilada
*6 portaobjetos
*1 cuchillo
*6 cubreobjetos
*Sanitas
*1 Navaja de un filo
*1 par de guantes desechables por alumno
*5 reglas graduadas o vernier
Mtodo
I. Clula Vegetal
Cebolla
1. Hacer dos cortes transversales y paralelos en una cebolla con una separacin de un poco ms de
un centmetro de longitud.
2. En los extremos de los cortes, seccionar longitudinalmente, formando una ventana, desechar las
dos primeras hojas y conservar la tercera.
3. En la cara interna de esta ltima hoja, se le deber de desprender una membrana transparente.
No utilice la membrana de la parte externa (que parece ms brillosa).
4. Monte un fragmento de epidermis en el portaobjetos y coloque una gota de rojo neutro.
5. Coloque un cubreobjetos y vea al microscopio.
6. Observar al microscopio y dibujar
7. Reemplazar la solucin en que esta disuelto el rojo neutro de la preparacin por una solucin de
cloruro de sodio al 4%.
8. Para efectuar esta maniobra se toma un poco de solucin de cloruro de sodio al 4% con una
pipeta Pasteur y se deposita una gota sobre un lado de la preparacin, entre el portaobjetos y el
cubreobjetos se coloca un pedacito de papel filtro en el lado opuesto a fin de aspirar, por
capilaridad, la solucin amortiguadora de fosfatos con rojo neutro.
9. Realice un dibujo de los cambios que se observan
10. Reemplazar la solucin de cloruro de sodio al 4% por la de cloruro de sodio al 6%.
11. Observar al microscopio y dibujar
12. Para finalizar, reemplazar la solucin de cloruro de sodio al 6%, por agua destilada, utilizando la
tcnica indicada anteriormente.
13. Observar al microscopio y dibujar.
Papa
1. Utilizando un horadador (#11) realice perforaciones sobre una papa fresca
(1)
(2)
1cm
2. Obtenga varios cilindros de papa y realice cortes de 1 cm de largo de ste, hasta obtener 15
15
piezas. Nota: escoger la mejor porcin de papa que no tenga entrenudos y quitar la cscara.
3. Medir (dimetro y largo) y pesar cada cilindro de papa y anotarlos en la tabla 1.
4. Colocar 5 trozos de papa en cada uno de los siguientes tratamientos:
Vaso con 50 ml solucin isotnica (NaCl 0.9%).
Vaso con 50 ml solucin hipertnica (NaCl 6%).
Vaso con 50 ml solucin hipotnica (Agua destilada).
5. Dejarlos por 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Transcurrido el tiempo sacar los trozos, secarlos con papel absorbente.
7. Volver a medir y pesar.
8. Anotar los datos de cada cilindro en la siguiente tabla:
Tabla 1. Datos individualizados
Dimetro (cm)
inicial
final
Largo (cm)
inicial
Masa (gr)
final
inicial
final
Solucin isotnica
Solucin
hipertnica
Solucin
hipotnica

Calcular los promedios y desviaciones estndar (DE) para cada tratamiento de los cilindros de papa
al inicio y al final del experimento.
Elaborar una tabla con los datos anteriores con el formato que se muestra a continuacin
16
Tabla 2. Promedio DE de cada tratamiento
Tratamiento
dimetro (cm)
inicial
final
Promedio Promedio
DE
DE
largo (cm)
inicial
Promedio
DE
final
Promedio
DE
Masa (gr)
inicial
Promedio
DE
final
Promedio
DE
Calcular los cambios relativos que sufrieron los cilindros de papa. Para hacer esto se tomar como
valor de referencia el valor inicial de cada magnitud, como en el ejemplo siguiente:
Cambio relativo en masa (%)= 100*(masa final)/ (masa inicial)
Obtener los valores promedios de cada tratamiento y su desviacin estndar correspondiente.
Tabla 3. Cambios relativos (%)
Tratamiento
% dimetro
% largo
% masa
Elaborar graficas de barras con los datos de ambas tablas (2 y 3) independientemente.

Cada barra deber estar al lado de su contraparte, por ejemplo la barra que represente la longitud
inicial en agua destilada deber estar junto a la barra de longitud final de esa misma solucin.
Incluir los valores de desviacin estndar en cada barra.
Hubo diferencias en los parmetros medidos antes y despus del tratamiento? En qu casos? Por
qu?
En qu tabla o grafica se aprecian mejor estas diferencias?
Fueron significativas las diferencias en todos los casos?
II. Estructura y fragilidad osmtica de eritrocitos
Eritrocito
1. En tres portaobjetos colocar una gota de sangre y una gota de la solucin como se indica a
continuacin:
Sangre total + agua destilada.
Sangre total + sol. de NaCI al 6%.
Sangre total + sol. salina fisiolgica.
2. Colocar un cubreobjeto y observar al microscopio.
3. Dibujar lo observado
17
Fragilidad osmtica de eritrocitos

1. Solicitar en el bioterio de su facultad 5 ml de sangre de algn animal (rata, cobayo hmster)
utilizando como anticoagulante EDTA heparina y colocarla a 4C hasta su uso.
2. Numerar 7 tubos del #1 al #7
3.
4. Pipetear las soluciones en los tubos como lo indica la siguiente tabla:
Tubos
El % concentracin de NaCl
0
resultante en cada tubo es:
Sol. NaCl 1% pH 7.4 (ml)
0
Agua destilada (ml)
0.1
0.4
0.46
0.5
0.6
0.86
0.5
2.0
2.3
2.5
3.0
4.3
4.5
3.0
2.7
2.5
2.0
0.7
0.05
0.05
0.05
0.05
Mezclar por inversin

Sangre total (l)
0.05
0.05
0.05
Mezclar por inversin

5. Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
6. Mezclar nuevamente y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 5 minutos.
7. Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm, utilizando el tubo 7 como
blanco.
8. El tubo 1 equivale al 100% de hemlisis, mientras que el nmero 7 equivale al 0%.
9. La lectura del espectrofotmetro de cada tubo, dividido entre las unidades de lectura del tubo
1, multiplicado por 100, indica el porcentaje de hemlisis.
En el caso de la prueba de fragilidad osmtica de eritrocitos. En los sujetos normales se obtiene una
curva sigmoidea casi simtrica. El extremo inferior de la curva corresponde al comienzo de la
hemlisis, la porcin media corresponde a la salida de la hemoglobina en gran cantidad y el extremo
superior a la hemlisis total. Un aumento de la fragilidad osmtica desplaza la curva haca la derecha,
mientras que una disminucin la desplaza hacia la izquierda.
18
Se ha sugerido que los dos parmetros ms significativos son:

a) La concentracin de solucin salina en la cual se obtiene 10% de hemlisis.
b) La concentracin de solucin salina que produce 90% de hemlisis.
Normalmente se obtiene un 10% de hemlisis a una concentracin de solucin salina que vara de
0.48% a 0.44% mientras que el 90% de hemlisis se produce a una concentracin que va de 0.44% a
0.36%.
La relacin entre la concentracin de la solucin salina y el porcentaje de hemlisis en condiciones
normales es la siguiente:
% Solucin salina
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.85
% Hemlisis
97-100
90-99
50-95
5-45
0-6
0
La fragilidad osmtica de eritrocitos se incrementa en algunos padecimientos como esferocitosis

congnita, anemia hemoltica adquirida, enfermedad hemoltica del recin nacido debido a la
incompatibilidad ABO y puede estar disminuida en talasemia, anemia de clulas falciformes, ictericia y
anemia por deficiencia de fierro.
Realizar una grfica de Absorbancia contra concentracin de NaCl y otra de % hemlisis contra
concentracin de NaCl.
Conclusiones
Referencias
1. Kleinzeller, A. Ernest Overtons Contribution to the Cell Membrane Concept: A Centennial
Appreciation. News Physiol Sci. 1997.12:49-53.
2. Guyton AC, Hall JE. Tratado de Fisiologa Mdica. 10. ed. Mc Graw-Hill/Interamericana; 2001.
19
Prctica 3
TRANSPORTE A TRAVS DE LA MEMBRANA
Introduccin
El transporte a travs de la bicapa lipdica de las membranas es un requerimiento universal
entre los organismos vivos. Sin embargo, el agua no puede pasar realmente a travs de bicapas
lipdicas sintticas y solo difunde a travs de tales barreras muy lentamente con una alta activacin
de energa (Ea> 10 kcal/mol). En contraste algunas membranas de clulas son altamente permeables
al agua tal que el movimiento total del agua a travs de la membrana es como si no estuviera
presente en absoluto y la energa de activacin (Ea< 5 kcal/mol) es equivalente a la difusin del agua
en solucin. Adicionalmente, desde hace mucho tiempo se sabe que el transporte de agua a travs
de la membrana vara enormemente entre tipos celulares y aun dentro de un tipo celular la
permeabilidad del agua puede cambiar dramticamente en la presencia de ciertos compuestos.
Las clulas mantienen sus actividades biolgicas importando y exportando varias sustancias
tales como iones y molculas polares. Las membranas biolgicas son intrnsecamente impermeables
a estos compuestos pero stos son capaces de cruzar las membranas para la funcin normal de la
clula. Existen dos factores principales que determinan si una molcula puede atravesar la
membrana: 1) la permeabilidad de la molcula en una bicapa lipdica y, 2) la disponibilidad de una
fuente de energa. La permeabilidad es conferida por dos clases de protenas de membranas: las
bombas y los canales. Las bombas usan una fuente de energa para transportar iones o molculas
(ejem. transporte activo). Lo canales, en cambio, permiten que los iones fluyan rpidamente a travs
de la membrana (por ejem. Transporte pasivo o difusin facilitada).
La levadura Saccharomyces cerevisiae puede usar diferentes fuentes de carbn para su
crecimiento, pero evolutivamente ha seleccionado mecanismos para utilizar eficiente y
preferencialmente a la glucosa y fructuosa. En estos organismos, la glucosa regula la utilizacin del
carbn principalmente por la represin o activacin de la transcripcin de numerosos genes que
codifican enzimas implicadas en el metabolismo del carbn, adems una molcula puede afectar la
fisiologa de la levadura en muchos niveles (cambios en la concentracin celular de metabolitos,
modificacin y eventualmente degradacin de algunas enzimas y alteracin en la estabilidad de un
nmero de RNAm.
Existen sensores de glucosa en la membrana de la levadura como son los transportadores de
glucosa (HeXose Transporter: HXT). En la membrana plasmtica de S. cerevisiae, existen al menos
20 transportadores de glucosa. Los ms relevantes son Hxt1 y Hxt3, con una baja afinidad por la
glucosa, con una alta capacidad de transporte y Hxt2, Hxt4 y Hxt7 con una alta afinidad y una
capacidad baja de transporte.
Objetivo
Establecer el tipo de transporte por el cual las clulas de un cultivo aerobio de levaduras de
Saccharomyces cerevisiae introducen la glucosa.
Mtodo
20
Material
Piceta
1 matraz Erlenmeyer de 1000 ml
4 matraces Erlenmeyer de 250 ml
26 tubos de ensayo
2 gradillas
8 tubos de espectrofotmetro
2 propipetas
4 tubos de centrfuga
4 pipetas de 5 ml
4 pipetas de 10 ml
1 vaso de precipitados de 250 ml
Soporte, anillo metlico y tela de alambre con
asbesto
Pinzas para tubos
2 mecheros
Probeta 10 ml
1 micropipeta de 100 L c/puntas
1 micropipeta de 1000 L c/puntas

*Material que debe traer el alumno
Sanitas servitoallas*
Guantes y cubrebocas*
Canicas de diferente tamao limpias*
Algodn y papel
Material biolgico
Un sobre de levadura seca activa*
Equipo
Vrtex
Incubadora con temperatura controlable
Espectrofotmetro
Autoclave
Centrfuga
21
Soluciones (ver anexo I)

Reactivo de arsenomolibdato
500 ml de solucin de glucosa 0.3 % (abreviado como Glc)
Sol. Gluosa 0.15 mg/ml (Curva estndar)
2, 4-dinitrofenol 0.05 % abreviado DNP)
Reactivo de Somogyi (sol. 1 y 2)
Procedimiento
NOTA: Para la determinacin de glucosa en el medio, se determinar por el mtodo de NelsonSomogyi que es especfico para azcares reductores.
El mtodo de Nelson-Somogyi consiste en calentar un azcar reductor con una solucin alcalina de
tartrato de cobre producindose as xido cuproso, que reacciona con arsenomolibdato dando un
color azul. En la mezcla de reaccin se incluye sulfato de sodio para minimizar la entrada de oxgeno
atmosfrico a la solucin lo cual podra causar reoxidacin del xido cuproso
A. Incubacin de las clulas

Pesar 50 mg de levadura seca activa para c/u de las 4 condiciones experimentales.
1. Numerar y preparar los siguientes tubos (tubos problema):
i.
levadura + 1 ml de solucin de glucosa.
ii.
levadura + 1 ml de solucin de glucosa + 0.1 ml de solucin 2, 4-dinitrofenol.
iii.
levadura + 1 ml de solucin de glucosa + 0.1 ml de KCN
iv.
levadura + 1 ml de solucin de glucosa y a continuacin este tubo debe ponerse en agua

hirviendo 20 min.
2. Resuspender las clulas con el vrtex

3. Agregar las suspensiones a 4 matraces Erlenmeyer que contengan 100 ml de sol glucosada (Glc).
Etiquetar los matraces. Tomar 1 alicuota de 10 ml (tiempo cero) y proceder con el paso 5.
4. Tapar los matraces y colocar en incubadora a 37C y con 200 rpm de agitacin tomar alcuotas de
10 ml a los 15, 30, 45 y 60 min.
5. Centrifugar a 2500 rpm durante 5 min.
22
B. Determinacin de azcares por el mtodo de Somogyi

Colocar las soluciones (ml) de acuerdo a la tabla:
Tubos problema
Tubo:
ii
iii
Sobrenadante
0.1
0.1
0.1
Sol. de glucosa
0.0
0.0
H2O
0.9
Reactivo Somogyi
1.0
Curva estndar
iv
0.1
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.9
0.9
0.9
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
COLOCAR ESTOS TUBOS TAPADOS DURANTE 20 min EN BAO MARA. DESPUS,

ENFRIARLOS CON AGUA DE LA LLAVE
R. Arsenomolibdato
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
AGITAR UNA VEZ QUE HAYA CESADO LA EFERVESCENCIA, DEBE DILUIRSE CADA TUBO
CON AGUA DESTILADA HASTA OBTENER UN VOLUMEN TOTAL DE 10 ml.
Calibrar el espectrofotmetro con el tubo 1 de la curva estndar. Leer la absorbancia a 540 nm de

longitud de onda.
Graficar absorbancia contra cantidad de glucosa en microgramos, tomando como referencia las
lecturas de los tubos 1 al 5. Trazar una lnea recta, calcular su pendiente y ordenada al origen,
escribir la ecuacin que relacione cantidad de glucosa contra la absorbancia.
Conociendo la absorbancia de cada tubo problema, calcular la concentracin de glucosa, utilizando la
ecuacin de la curva patrn (tubos 1 al 5)
Calcular la cantidad de glucosa presente en los tubos i al iv en los diferentes tiempos con base en la
ecuacin de la curva patrn obtenida.
Resultados y procesamiento de los datos
Conociendo la absorbancia de cada tubo experimental, calcular la concentracin de glucosa,
utilizando la ecuacin de la curva patrn.
Presentar una serie de tablas con los resultados obtenidos

Tabla 1. Densidad ptica a 526 nm.
Absorbancia
Tratamiento
Tiempo (min)
0
15
30
45
60
Control
DNP*
KCN**
23
calor
24
Tabla 2. Cantidad de glucosa remanente en el medio de crecimiento.

Absorbancia=A526 interpolada de la curva patrn
Tratamiento
Glucosa (mg)
0
15
30
45
60
Control
DNP*
KCN**
calor
Con estos datos calcular los moles de glucosa transportada, teniendo en cuenta los moles tericos
iniciales del experimento. Indicar la cantidad en masa y mol de glucosa inicial.
Hacer una grfica de mg de glucosa remanente contra tiempo, de cada una de las condiciones
evaluadas.
Discusin
Hubo diferencias notables entre la cantidad de glucosa remanente en los lotes tratados con venenos
comparados con el control?
A qu se debieron las diferencias? Fue diferente el efecto del KCN y el DNP?
Qu tipo de mecanismo de transporte opera en la levadura para el caso de la glucosa? Haciendo los
clculos para cada uno de los matraces experimentales, pueden hacerse inferencias sobre el tipo de
transporte para glucosa en la levadura. La suposicin de transporte activo y pasivo ser confirmada o
rechazadas de acuerdo con las definiciones planteadas en la introduccin contrastadas por los
resultados experimentales.
Cules otros factores influyen en el transporte de glucosa y otros solutos al interior de las clulas?
Hacer una investigacin adicional sobre el transporte de glucosa en la levadura.
Presentar un modelo del transporte de glucosa y los sitios de accin de los venenos utilizados.
Conclusin
1. Se cumpli el objetivo?
Referencias
1. Berg J. M., Tymoczko J. L. y Stryer L. Biochemistry. 6a. ed. EUA: Editorial W. H. Freman and
Company; 2007.
2. Gancedo M. J. The early steps of glucose signalling in yeast. FEMS Microbiol. Rev. 2007.32(4):
673-704
3. Rintala E, Wiebe MG, Tamminen A, Ruohonen L, Penttil M. Transcription of hexose transporters
of Saccharomyces cerevisiae is affected by change in oxygen provision.BMC Microbiol.2008. 8:53.
25
Prctica 4
CARBOHIDRATOS
Introduccin
Los carbohidratos son polihidroxialdehdos y polihidroxicetonas o compuestos que, por hidrlisis, se
convierten en aqullos. Un carbohidrato que no es hidrolizable a compuestos ms simples se
denomina monosacrido. Un carbohidrato que por hidrlisis da dos o ms molculas de
monoscaridos por hidrlisis se conoce como polisacrido.
Un monosacrido se puede clasificar an ms: si contiene un grupo aldehdo, es una aldosa, si
contiene una funcin cetosa, es una cetosa. Segn el nmero de tomos de carbono que contenga, el
monosacrido se conoce como briosa, terrosa, pectosa, hexosa y as sucesivamente. Una
aldohexosa, por ejemplo, es un monosacrido de seis carbonos con una funcin aldehdo, mientras
que una cetopentosa es un monosacrido de cinco carbonos con un grupo cetnico. La mayora de
los monosacridos naturales son pentosas o hexosas.
Los carbohidratos que reducen los reactivos de Fehling (o Benedict), se conocen como azcares
reductores. Todos los monosacridos, sean aldosas o cetosas, son azcares reductores, como lo son
tambin la mayora de los disacridos, siendo una excepcin importante la sacarosa (azcar comn),
que no es reductora.
Objetivos
Al terminar esta prctica, el alumno ser capaz de entender la naturaleza de los carbohidratos y la
importancia prctica del conocimiento de los mismos, determinndolos cualitativamente con diversos
reactivos y reconociendo las diferencias entre azcares reductores y no reductores. Adems
determinar la presencia de azcares reductores en algunos alimentos mediante las pruebas de
Benedict y Fehling
Material
1 esptula
1 vaso precipitado de 50 ml
2 gradillas
1 tela de asbesto
1 cristalizador
40 tubos de ensaye
5 pipetas Pasteur
5 pipetas graduadas de 5 ml
1 piceta
1 parrilla
2 propipetas
1 vaso de pp de 50 ml
pinzas para tubo
Reactivos
Glucosa al 5 % en 10 ml de agua (por grupo)
Manosa al 5 % en 10 ml de agua (por grupo)
Fructuosa al 5 % en 10 ml de agua (por grupo)
Sacarosa al 5 % en 10 ml de agua (por grupo)
Trtaro de sodio y potasio 17.5 g
Citrato de sodio 17.3 g
Na2CO3 anhidro 10 g
CuSO4.5H2O 3.5 g
NaOH 5 g
-Naftol al 0.2%
Timol al 1% en etanol
Acido sulfrico concentrado
Material por equipo (que los alumnos deben traer)*

*1 sobre de canderel o de nutrasweet (preparar una solucin al 1 % en 10 ml de agua) por grupo
*azcar de mesa (preparar una solucin al 5 % en 10 ml de agua ) por grupo
*1 lata de refresco de dieta sin colorante
*1 lata de refresco normal sin colorante
*1 lata de jugo de manzana
*Lentes de proteccin
26
*Papel estraza
Preparacin de soluciones por grupo
-Naftol, disolucin al 0.2%
Timol, disolucin al 1% en alcohol etlico
Reactivo de Fehling
Solucin A (3.5 g de CuSO4 en agua y aforar a 50 ml).
Solucin B (17.5 g de tartrato de sodio y potasio, y 5 g de NaOH en agua y aforar a 50 ml)
Reactivo de Benedict
En 60 ml de agua disolver 17.3 g de citrato de sodio y 10 g de Na 2CO3 anhidro. Esta mezcla se
aade lentamente y con agitacin a una solucin previamente preparada de 1.73 g de CuSO 4
pentahidratado en 15 ml de agua. La solucin final se afora a 100 ml.
Procedimiento
Reacciones de reconocimiento de carbohidratos
A. Prueba con -naftol.
Esta reaccin es general para los carbohidratos y se aplica para detectar la presencia de stos
en los materiales biolgicos. Mediante la accin del cido sulfrico concentrado se forma furfural a
partir de las pentosas; 5-hidro-ximetilfurfural a partir de las hexosas.
Numerar una serie de nueves tubos.
Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 1
Tabla 1: Preparacin de los tubos para la prueba de -naftol
Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Glucosa (ml)
1
Fructosa (ml)
1
Manosa (ml)
1
Sacarosa (ml)
1
Jugo de manzana (ml)
1
Refresco normal sin colorante (ml)
1
Refresco de dieta sin colorante (ml)
1
Canderel o Nutrasweet (ml)
1
Azcar de mesa (ml)
1
Solucin -naftol (gotas)
5 5 5 5 5 5 5 5 5
H2SO4* (ml)
1 1 1 1 1 1 1 1 1
* En todos los tubos de ensayo se vierte con cuidado, por la pared. En el contacto con las capas,
aparece una coloracin violeta
27
B. Prueba con Timol.

Numerar una serie de nueves tubos.
Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 2
Tabla 2: Preparacin de los tubos para la prueba de Timol
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Glucosa (ml)
1
Fructosa (ml)
1
Manosa (ml)
1
Sacarosa (ml)
1
Jugo de manzana (ml)
1
Refresco normal sin colorante (ml)
1
Refresco de dieta sin colorante (ml)
1
Canderel o Nutrasweet (ml)
1
Azcar de mesa (ml)
1
Solucin timol (gotas)
5
5
5
5
5
5
5
5
5
H2SO4* (ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
* En todos los tubos de ensayo se vierte con cuidado, por la pared. En el contacto con las capas,
aparece una coloracin roja
C. Prueba de Fehling
La coloracin azul de la solucin cprica de cobre (II), en un medio alcalino (NaOH), cuando se
calienta en presencia de azcares reductores, se reduce a oxido de cobre (I) generndose un
precipitado de coloracin que va de amarillo a rojizo.
1. Numerar una serie de nueve tubos.
2. Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 1
Tabla 3: Preparacin de los tubos para la prueba de Fehling
Tubos
1
2
Solucin A (ml)
1
1
Solucin B (ml)
1
1
Glucosa (gotas)
3
Fructosa (gotas)
3
Manosa (gotas)
Sacarosa (gotas)
Jugo de manzana (gotas)
Refresco normal sin colorante (gotas)
Refresco de dieta sin colorante (gotas)
Solucin de canderel o nutrasweet (gotas)
Solucin de azcar de mesa (gotas)
3. Calentar a ebullicin durante 5 minutos.
4. La formacin de un precipitado rojizo y la decoloracin de la
azcar reductor.
3
1
1
4
1
1
5
1
1
6
1
1
7
1
1
8
1
1
9
1
1
3
3
10
10
10
10
10
solucin indica prueba positiva para
28
D. Prueba de Benedict
En esta prueba los azcares reductores por tener un grupo ceto o aldehdo potencialmente libre
reducen la sal cprica de cobre (II), en medio alcalino, a xido de cobre (I). Generndose un
precipitado que va de amarillo a rojo. Dependiendo de la concentracin del azcar.
1. Como en la prueba anterior, preparar una serie de nueve tubos.
2. Aadir las soluciones como se indica en la tabla 2
Tabla 4: Preparacin de los tubos para la prueba de Benedict
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Reactivo de Benedict ( ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Glucosa (gotas)
5
Fructuosa (gotas)
5
Manosa (gotas)
5
Sacarosa (gotas)
5
Jugo de manzana (gotas)
10
Refresco normal sin colorante (gotas)
10
Refresco de dieta sin colorante (gotas)
10
Solucin de canderel o nutrasweet (gotas)
10
Solucin de azcar de mesa (gotas)
10
3. Calentar a ebullicin durante 5 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente.
4. La presencia de un precipitado cuya coloracin vara desde amarillo hasta rojo, con decoloracin
de la solucin, indica prueba positiva.
29

1. Anotar los resultados en el siguiente cuadro y describir lo que se observa en cada tubo (color,
formacin de precipitado, etc)
Muestra
Prueba
-Naftol
Prueba
Timol
Reaccin de
Fehling
Reaccin de
Benedict
Glucosa
Fructosa
Manosa
Sacarosa
Jugo de manzana
Refresco normal sin
colorante
Refresco de dieta sin
colorante
Canderel o Nutrasweet
Azcar de mesa
Discusin
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Comparar los resultados y diga qu tipo de azcar son la glucosa, manosa y sacarosa?
Los alimentos probados contenan azcares reductores? Discutir la respuesta.
Las determinaciones en esta prctica son cuantitativas o cualitativas? Por qu?
Para qu tipo de carbohidratos utilizas las pruebas de Timol y -naftol?
Qu similitud en su composicin presentan el reactivo de Fehling y el reactivo de Benedict?
Qu efecto puede tener en el organismo, la presencia de azcares reductores en los alimentos?
Conclusiones
Bibliografa
1. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioqumica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega;
2005.
2. Morrison RT, Boyd R N. Qumica rganica. 5a ed. Mxico: Ediciones Addison-Wesley
30
Longman; 1998.
31
Prctica 5
FERMENTACIN DE LA GLUCOSA POR LA LEVADURA DE PANIFICACIN
Introduccin
Hay dos diferentes vas en la clula que pueden ser llevadas a partir de los alimentos: la
fermentacin y la respiracin celular. Ambas vas inician con los mismos pasos, a este proceso se le
llama gluclisis, la cual es el rompimiento de los tomos de glucosa (6 carbonos) en dos molculas
de tres carbonos llamadas cido piruvico. La gluclisis es conocida probablemente como la va ms
vieja en donde se produce ATP.
Hay varios tipos de procesos de fermentacin, dos de las tipos ms conocidos de
fermentacin son: la fermentacin del cido lctico y la fermentacin alcohlica.
La fermentacin alcohlica es realizada por las levaduras y algunas especies de bacterias. El
producto final de este va fermentativa es el etanol y el dixido de carbono (CO 2). La levadura de
panificacin Saccharomyces cerevisiae es capaz de efectuar la gluclisis a partir de la glucosa hasta
etanol en condiciones anaerobias y hasta anhdrido carbnico en condiciones aerobias. Los
humanos han utilizado esta va para producir de manera industrial bebidas y vinos. En el caso que
nos ocupa, se estudiar el transcurso de la gluclisis en condiciones anaerobias, observando la
produccin de una cantidad considerable de gas, lo que nos permitir seguir la reaccin con respecto
al tiempo
Objetivo
Que el alumno observe y conozca la produccin de etanol por medio de la fermentacin alcohlica.
Material
2 pipetas de 10 ml y 1 ml
1 vaso de precipitado de 50 ml y 100 ml
1 gradilla
1 mechero, tripe, malla de asbesto
1 pipeta Pasteur
2 tubos de ensayo de 10 ml
propipetas
1 varilla de vidrio
Pinzas para tubos
*2 jeringas de plstico de 10 ml con aguja, nuevas.
*1 o 2 bloques de parafina (veladora).
*guantes y cubrebocas
*1 g de levadura fresca
*material que deber de traer el alumno por equipo.
Equipos
Centrfuga
Balanza granataria
Reactivos
1. 10 ml de glucosa al 5% en amortiguador de acetato (se debe hervir antes de usarse para reducir
el contenido de oxgeno disuelto)
2. Amortiguador de acetato: 12.112 g de acetato sdico cristalizado y 0.78 ml de cido actico
glacial en 500 ml de agua destilada
3. Solucin de 2,6-diclorofenol-indofenol sdico al 2%
4. Solucin sulfocrmica: 1 g de dicromato potsico en 50 ml de cido sulfrico 0.5 N
5. Etanol 10 mM. Medir 0.29 ml de etanol y aforar en 50 ml de agua destilada.
32
Mtodo
1. Pesar 1 gramo de la levadura y disolverla en 10 mililitros de la solucin de glucosa al 5% en buffer
de acetato. La suspensin se prepara agitando con una varilla la levadura hasta que la suspensin
sea homognea, es conveniente efectuar el procedimiento de mezclado con relativa rapidez
procurando que no entre aire en la disolucin, a esta suspensin adicionarle 1 ml de 2,6
diclorofenol-indofenol sdico.
2. Inmediatamente despus de preparada, tomar 3 ml. de la suspensin con una jeringa de 10 ml,
posteriormente se coloca la aguja de la jeringa en la parafina para evitar la entrada de oxigeno,
este paso se hace por duplicado.
3. A intervalos de 10 minutos (1 hora de incubacin), se va tomando la nota del volumen del
contenido de la jeringa y el color de la suspensin. Es importante utilizar jeringas cuyos mbolos
cierren hermticamente y sean de fcil desplazamiento, ya que, de lo contrario, las lecturas de gas
producido pueden resultar alteradas. La produccin de gas no es inmediata, ya que la levadura
consume el poco oxgeno disponible, primero, mediante la oxidacin aerobia de la glucosa. El color
del indicador de xido-reduccin indica el ambiente rdox del interior de la jeringa (azul = alcalino;
rosa = cido; coloreado = oxidado; incoloro = reducido).
4. Despus de 1 hora de fermentacin se toman los 3 ml de la suspensin y se colocan en un tubo de
centrfuga. Se centrfuga a 2000 rpm 5 minutos, terminada la centrifugacin se toma 1 ml del
sobrenadante para la determinacin de etanol.
5. A este mililitro del sobrenadante se le adiciona 0.5 ml de solucin sulfocrmica diluida, se mezcla y
se calienta en bao de agua hirviendo; aparece un color verde, percibindose el olor caracterstico
del acetaldehdo.
6. Por otra parte en otro tubo colocar 1 ml de etanol (10 mM) y adicionar 0.5 ml de solucin
sulfocrmica diluida, se mezcla y se calienta en bao de agua hirviendo esto corresponde al
control positivo de la produccin de etanol por la fermentacin alcohlica. La presencia de etanol
se puede comprobar mediante su oxidacin con cido sulfocrmico a acetaldehdo.
Hacer una grfica de los mililitros de gas producidos (ordenadas) frente al tiempo (abscisas),
indicando en el mismo los cambios de color observados.
Discusin
1. Explique por qu la formacin de gas no se produjo inmediatamente en el experimento.
2. Por qu se debe hervir la solucin de acetato de sodio y cido actico?
3. Describe brevemente la gluclisis y sita el experimento dentro de este proceso
4. Qu nos indica el cambio de color en la reaccin?
5. Para qu es la solucin 2,6 diclorofenol-indofenol sodico y la sulfocrmica?
6. Cules son las reacciones que son irreversibles en el proceso de la gluclisis?
7. Qu gas es el que se produce durante el experimento?
8. En la industria, qu importancia tiene esta levadura?
Conclusiones
33
Referencias
1. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioqumica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega.
2005.
2. Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell, 4a. ed. New York. Garland Science. 2002.
34
Prctica 6
ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS
EFECTO DE LOS INHIBIDORES DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES Y DE LOS
DESACOPLANTES
Introduccin
El metabolismo energtico es la base de las funciones celulares. Una adecuada transferencia
de electrones a travs de una serie de reacciones redox garantiza la obtencin de sustratos
energticos necesarios para el ptimo funcionamiento de las clulas.
En la membrana interna mitocondrial se encuentran la cadena respiratoria, que est formada
por protenas que se ensamblan en complejos multiproticos denominados I, II, III y IV. El complejo I
denominado NADH-deshidrogenasa recibe los electrones de la oxidacin del NADH y los transfiere a
la coenzima Q, la cual se desplaza libremente a travs de la membrana interna mitocondrial; el
complejo II, succinato deshidrogenasa se encarga de transferir los electrones del succinato a la
coenzima Q, sin translocar protones; el complejo III, citocromo c-coenzima Q oxidoreductasa recibe
los electrones de la coenzima Q y los transfiere al citocromo c, un transportador electrnico protico
soluble que se encuentra en el espacio intramembranal; y el complejo IV o citocromo oxidasa acopla
la oxidacin del citocromo c con la reduccin del oxgeno molecular a agua. Las reacciones globales
de los complejos I, II, III y IV son exergnicas y la energa liberada en ellas crea un gradiente de
protones a travs de la membrana interna mitocondrial al resultar los protones bombeados al espacio
intermembranal. Este gradiente de protones libera la energa suficiente para que tenga lugar la
sntesis de ATP por la ATP-sintasa.
Un mtodo indirecto el cual se utiliza ampliamente para evaluar la funcionalidad mitocondrial es el
desarrollado por Mosmann en 1983, el cual se basa en la reduccin de MTT (Bromuro de 3-(4,5dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) por las deshidrogenasas mitocondriales. En trminos generales,
las sales de tetrazolio al reducirse pasan al estado formazn, el cual es un compuesto de color azul e
insoluble en agua. El empleo de esta tcnica nos permite evaluar la actividad de los complejos de la
cadena respiratoria bajo diferentes condiciones experimentales.
Objetivos
1. Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras
2. Evaluar el efecto de diferentes inhibidores y los desacoplantes de la cadena de transporte de
electrones en la funcionalidad mitocondrial a travs de la reduccin de MTT.
3. Correlacionar los cambios de pH con la reduccin de MTT.
Material
2 Pipetas de 5 y 10 ml
6 tubos eppendorf de 2 ml
1 micropipeta de 100 L y 1ml con puntas
Espectrofotmetro
Potencimetro
4 Celdas de espectofotmetro
Piceta
Microcentrfuga
Solucin de glucosa al 10 %
Solucin de dinitrofenol 40 mM en etanol
Solucin de azida de sodio 400 mM
Agua destilada
Solucin MTT (5mg/ml)
35
Isopropanol cido (192 ml de isopropanol + 8 ml de HCl)

*base de unicel
*Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ ml
*lo debe traer el alumno
Mtodo
Experimento 1 (control)
1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada
2. Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces (total tres) con intervalos de 3
minutos para obtener la lnea basal
3. Adicionar 5ml de glucosa al 10%, agitar y medir el pH
4. Determinar el pH de la solucin cada 5 min (4 veces) y luego cada 10 min (2 veces ms)
Experimento 2 (dinitrofenol)
1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada
2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.2 ml de la solucin de dinitrofenol 40mM, concentracin
final de 200 M
3. Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces ms con intervalos de 3 minutos
para obtener la lnea basal
4. Esperar 5minutos
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control
1.
2.
3.
4.
5.
Experimento 3 (azida de sodio)

Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada
Aadir por decantacin (no pipetear) 0.5 ml de la solucin de azida de sodio 400mM,
concentracin final de 5mM. Agitar con cuidado
Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces ms con intervalos de 3 minutos
para obtener la lnea basal
Esperar 5 minutos
Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control
Experimento 4 (Reduccin de MTT)
1. Tomar 1.5 mililitros de las soluciones de levaduras de los experimentos 1, 2 y 3 a los 15 minutos
despus de haber adicionado los inhibidores y colocarlo en un tubo eppendorf de 2 ml (Todo se
realiza por duplicado).
2. Agregar a cada tubo 12l de MTT (5mg/ml) e incubar los tubos 20 min a 37C.
3. Pasado el tiempo de incubacin, sacar los tubos y observar la coloracin.
4. Centrifugar los tubos a 12000 rpm durante 3 min.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de isopropanol-cido.
6. Leer las muestras a 570nm.
1. Hacer una grfica de los experimentos 1, 2 y 3, usando los valores de las lecturas de pH contra
tiempo.
2. Discutir el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como
desacoplante y con azida de sodio como inhibidor.
3. Para el experimento 4 hacer una curva en porcentaje considerando la absorbancia de los tubos
control como el 100% de la capacidad de las mitocondrias de las levaduras de reducir el MTT y
ver qu efecto tienen los inhibidores y/o desacoplantes empleados.
36
4. Hacer una relacin de las vas que producen estos cambios, tomando en cuenta que las
levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de
sintetizar ATP; y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmtica cuya funcin es
similar a la bomba de Na+/K+ en las clulas de los mamferos.
Conclusiones
Referencias
1. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to
proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods. 1983. 65: 5563.
2. Pea A. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch. Biochem Biophys. 1975.
167:397-409.
3. Pardo JP. La ATPasa de H+ de la membrana plasmtica de los hongos. Mensaje Bioqumico.
1990. 13:119-172.
37
Prctica 7
METABOLISMO DE LIPIDOS
CONVERSION DE GRASAS A SACAROSA
Introduccin
Durante el proceso de germinacin, se llevan a cabo diversos cambios. En condiciones favorables, a
la imbibicin de agua en las semillas siguen muchas actividades. El protoplasma se hidrata y sus
enzimas empiezan a funcionar y se desencadenan procesos que activan diferentes reacciones
qumicas que inicial el crecimiento.
Existen programas metablicos que han evolucionado para garantizar el uso rpido y eficiente del
almacenamiento de las reservas para la iniciacin de la germinacin de las semillas. La movilizacin
del almacenamiento de lpidos implica la induccin coordinada de un nmero de vas bioqumicas con
diferentes localizaciones subcelulares. El primer paso en la descomposicin de lpidos esta catalizada
por lipasas que hidrolizan a los cidos tricarboxlicos para producir cidos grasos libres y glicerol. Los
cidos grasos se introducen a organelos denominados glioxisomas donde la -oxidacin y el ciclo del
glioxilato se producen. Los glioxisomas son estructuralmente similares pero metablicamente distintos
de los peroxisomas, los glioxisomas contiene dos enzimas que son nicas para el ciclo del glioxilato
la malato sintasa y la isocitrato liasa.
El ciclo del glioxilato, que es una forma modificada del ciclo de los cidos tricarboxlicos, tiene lugar
en la mayor parte de las plantas y microorganismos, pero no ocurre en los animales superiores. El
objetivo primordial del ciclo del glioxilato es el de permitir a las plantas y a los microorganismos, la
utilizacin de los cidos grasos o del acetato, en forma de acetil CoA, como nica fuente carbonada,
sobre todo para la biosntesis de glcidos a partir de los cidos grasos. El ciclo del glioxilato elude
mediante un rodeo, las etapas de desprendimiento de CO 2 del ciclo de los cidos tricarboxilcos. Sin
embargo, la escisin del isocitrato se produce a travs de una ruta en la que se eluden tres de las
reacciones del ciclo de los cidos tricarboxlicos. El isocitrato es escindido en primer lugar por la
isocitrato liasa, para formar succinato y glioxilato. La malato sintasa cataliza a continuacin la
condensacin del glioxilato con otra molcula de acetil-CoA para formar malato. El malato se oxida
entonces, a oxalacetato, que puede condensarse de nuevo con el acetil-CoA e iniciar otra vuelta del
ciclo del glioxilato. A cada vuelta del ciclo se incorporan dos mleculas de acetil-CoA y se forma una
molcula de succinato. Este ltimo se emplea con fines biosintticos, particularmente como precursor
en la gluconeognesis.
Objetivos
Demostrar que los lpidos de las semillas de ajonjol son transformados a sacarosa
Cuantificar la cantidad de lpidos, carbohidratos y protenas de semillas germinadas y no
germinadas
Explicar las diferencias en ambos tipos de semillas tomando en cuenta el ciclo de glioxilato durante
el proceso germinativo.
Materiales
2 frascos de boca ancha
ligas
8 paquetes de gasas
papel aluminio
charola
20 tubos de ensaye
gradilla
recipiente para hielo
1 vaso de precipitado de 250 ml
1 vaso de precipitado de 500 ml
4 pipetas 1 ml
2 pipetas 5 ml
2 pipetas 10 ml
2 pipetas Pasteur
Micropipetas 100 l y 1 ml con puntas
38
8 tubos eppendorf
2 embudos
papel filtro
2 propipetas
2 pipetas Pasteur
balanza
granataria
esptula
2 morteros
Equipo
espectrofotmetro
microcentrfuga
8 celdas de espectrofotmetro
hielo
4 jeringas con aguja (3 ml)*
2 cucharitas de plstico*
guantes desechables*
sanitas servitoallas
mechero, tripe, tela de asbesto
parafilm
Piceta
*material que debe traer el alumno
Reactivos
Mezcla cloroformo-metanol 2:1
Solucin amortiguadora de fosfatos 0.1M, pH 7.5, 3mM de MgCl2
Reactivo de Biuret.
Solucin patrn de glucosa 150 g/ml.
Solucin patrn de casena 20 mg/ml
Solucin de NaCl al 1%
Sol. de hipoclorito de sodio al 1%.
Sulfato de sodio anhidro
Fenol 5%
Material biolgico
10 gr de semillas de ajonjol*
Procedimiento
Consta de varios pasos los cuales se numeran a continuacin
I.
Germinacin de las semillas
1 Pesar 4 lotes de semillas de ajonjol de 2.5 g cada uno.

2. Lavar 2 lotes de las semillas con 50 ml de sol. de hipoclorito de sodio y enjuagarlas con agua
previamente hervida y enfriada.
3 Colocar en cada uno de dos frascos de boca ancha, 2.5 g de semillas, tapar con 2 capas de
gasa sostenindolas con una liga. Guardar los dos lotes de semillas restantes.
4. En una bandeja con un poco de agua colocar los dos frascos boca abajo. Mantenerlos frascos
en la bandeja con agua durante 4 das tapados con papel aluminio, a temperatura ambiente.
39
40
II. Preparacin de los extractos

1. Homogenizar en un mortero a baja temperatura (colocar en hielo), 2.5 g de semillas
germinadas y por separado 2.5 g de semillas sin germinar, cada lote con 10 ml de solucin
amortiguadora de fosfatos pH 7.5, MgCI2 3 mM.
2. Centrifugar 15 000 rpm durante 15 minutos. Si es necesario filtrar los sobrenadantes a travs
de varias capas de papel filtro, a que los filtrados salgan claros. Guardar los extractos en fro
mientras se utilizan.
III.- Determinacin de protenas
Curva Patrn
Tubos
Tubos Problema
Sol. Patrn de casena (ml)

0.25
0.50 0.75
1
Ext. Enz.Sin germ.(ml)
Ext. Enz. Germinado (ml)
Ext. Enz. Sin germ. Diluido
1:10 (ml)
Ext. Enz. germinado Diluido
1:10 (ml)
NaCl 1%(ml)
6
5.75
5.5
5.25
5
Reactivo de Biuret (ml)
4
4
4
4
4
El tubo 1 corresponde al blanco. Despus de 30 min. Leer a 540 nm.
1
-
5
4
5
4
5
4
5
4
IV.- Determinacin de carbohidratos

Curva Patrn
Tubos
Sol. Patrn de glucosa
(ml)
H2O Destilada (ml)
Ext. Enz. Sin germ. 1:20
(ml)
Ext. Enz. Germinado
1:20 (ml)
Ext. Enz. Sin germ.
Diluido 1:50 (ml)
Ext. Enz. germinado
Diluido 1:50 (ml)
Fenol (ml)
H2SO4* (ml)
Tubos Problema
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.6
3.6
10
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
*En todos los tubos de ensayo se vierte con cuidado, por la pared
41
Calibrar el espectrofotmetro con el tubo 1. Leer la absorbancia a 485 nm.

NOTA: Las diluciones se realizan con solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.5.
V. Determinacin de lpidos
1. Lavar y secar perfectamente dos vasos de precipitados de 25 ml y pesarlos.
2. Tomarlos dos lotes de semillas restantes (uno sin germinar y otro germinado) y pasar cada grupo
de semillas por separado a un mortero para macerarlas con 10 ml de sol. Cloroformo-metanol fra
(Evitar que las semillas germinadas pasen con agua).
3. Separar el sobrenadante pasndolo a u tubo para centrifuga convenientemente rotulado.
4. Volver a homogenizar las semillas con 5 ml de cloroformo-metanol y pasar el sobrenadante a su
respectivo tubo de centrfuga.
5. Centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos.
6. Si se observa agua en el sobrenadante, filtrar a travs de sulfato de sodio anhidro.
7 Pasar los sobrenadantes a sus respectivos vasos y eliminar los solventes mediante calentamiento
en bao Mara y pesar los vasos nuevamente.
8. Por diferencias, calcular la cantidad de lpidos en cada lote de semillas.
Resultados y procesamiento de los datos
1)
2)
Graficar absorbancia vs. mg de protena y obtener lo siguiente:

a) Pendiente, ecuacin de la recta y ordenada al origen (tomar en cuenta diluciones)
b) Calcular lo siguiente para cada lote de semillas (germinados y sin germinar)
Miligramos de protena/ml de extracto
Miligramo de protena/gramo de semillas
Graficar absorbancia vs. mg de carbohidratos y obtener lo siguiente:
a) Pendiente, ecuacin de la recta y ordenada al origen
b) Calcular lo siguiente para cada lote de semillas (germinados y sin germinar)
Microgramos de carbohidratos/ml de extracto
Microgramos de carbohidratos/gramos de semilla
3)
Calcular por diferencia de peso miligramos de lpidos/gramo de semilla.
4)
Completar la siguiente tabla:

Lpidos
(mg/ml)
Carbohidratos
(g/ml)
Protenas
(mg/ml)
Semillas
germinadas
Semillas no
germinadas
5)
Comparar los resultados obtenidos en los lotes de semillas germinadas contra los obtenidos en los
lotes de semillas sin germinar.
Discusin
1. Hubo diferencias entre la cantidad de lpidos, carbohidratos y protenas de semillas germinadas y
no germinadas?
2. A qu se debieron las diferencias en dichos casos y por qu se realizaron diluciones?
3. Qu importancia tiene el ciclo del glioxilato para el proceso germinativo?
4. En qu procesos metablicos de la semilla interviene los lpidos, protenas y carbohidratos?
42
5. Qu ventaja evolutiva pueden tener los organismos que realizan el ciclo del glioxilato?
6. Qu procesos metablicos ocurren durante la germinacin de las semillas?
7. Mencione alguna utilidad desde el punto de vista biotecnolgico del ciclo del glioxilato
Conclusiones
Referencias
2005.
2. Theodoulou FL, Eastmond PJ. Seed storage oil catabolism: a story of give and take. Curr Opin
Plant Biol. 2012.15:322-328.
43
Prctica 8
REDUCCIN DEL 2-6 DICLOROFENOL-INDOFENOL (DCPIP) DEPENDIENTE DE LA ACTIVIDAD
FOTOSINTTICA DE CLOROPLASTOS AISLADOS DE Spinacea oleraceae (espinaca)
Introduccin
En los vegetales superiores los cloroplastos se presentan generalmente como cuerpos ovales de
aproximadamente 5 a 10 m de largo. Es en los cloroplastos donde se llevan a cabo las reacciones
fotosintticas de las clulas eucariticas.
El proceso fotosinttico en plantas superiores, lo podemos separar en dos fases: la primera, llamada
fase luminosa fotoqumica, requiere de la energa luminosa y sus productos principales son: ATP,
NADPH y O2. La segunda fase, tambin llamada la fase obscura de la fotosntesis, requiere del ATP y
de NADPH para transformar, por medios bioqumicos, al CO2 en carbohidratos y otros productos.
En 1937, Roberto Hill observ que un homogenizado de hojas conteniendo cloroplastos intactos,
tena la capacidad de reducir el oxalato de potasio frrico (un aceptor artificial de electrones) en
presencia de la luz con desprendimiento de O 2. La reaccin podra representarse de la siguiente
manera:
H2O + Aceptor de electrones
Luz
de O2 + Aceptor de e- reducido
La absorcin de la luz por los pigmentos fotosintticos es el primer evento de la fotosntesis, siendo la
clorofila el principal pigmento en bacterias fotosintticas, algas y plantas superiores. Actualmente se
sabe que las reacciones fotoqumicas de la fotosntesis se llevan a cabo en el sistema de membranas
tilacoidales, que se encuentran en el interior de los cloroplastos, mientras que en las reacciones de la
fase obscura se realizan en el estroma.
El proceso fotosinttico representa un punto crtico de gran importancia dentro de los ciclos naturales
del carbono y del oxgeno.
Muchos de los herbicidas (como el DCMU) empleados por el hombre para combatir malezas, y ciertos
contaminantes, actan inhibiendo la fotosntesis y provocando con ello la muerte del vegetal.
Objetivo
Determinar colorimtricamente la actividad fotosinttica de los cloroplastos en diferentes condiciones
mediante la reduccin del DCPIP.
Material y Mtodos
Soluciones
Las siguientes soluciones se prepararn para todos los equipos:
Medio de aislamiento de cloroplastos.
Preparar 500 ml de una solucin con agua desionozada, que contenga sacarosa 400 mM, tricina 20
mM, KCl 20 mM, MgCl2 5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH
Medio de transporte de electrones.
Preparar 500 ml de una solucin con agua desionizada, que contenga sacarosa 100 mM, MgCl 2 5
mM, KCl 10 mM, tricina 15 mM, KCN 0.5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH.
Medio de reaccin con DCPIP.
Tomar 400 ml de medio de transporte de electrones y agregar la cantidad necesaria para obtener una
solucin 0.3 mM de DCPIP en el medio de transporte de electrones.
44
Acetona al 80%.
Tomar 80 ml de acetona y agregarle 20 ml de agua destilada, guardar a 4C.
Herbicida comercial, DCMU (dicloro metil urea) 3 mM.
NOTA: Se prepararn 10 ml de DCMU 3mM disueltos en etanol, el DCMU preparado se encontrar
en el congelador, en donde se guardara nuevamente para los siguientes grupos que realicen la
prctica.
Matraz de 250 ml
7 tubos de ensayo
6 tubos de espectrofotmetro
1 probeta de 100 ml y 50 ml
Micropipeta de 100l
Micropipeta de 1000l
recipiente metlico para hervir
Soporte, anillo, mechero
tela de asbesto
Agitadores de vidrio
Pipeta Pasteur
agua destilada
*Cubreobjetos y portaobjetos
*1 lmpara de luz incandescente con
foco de 100 watts
Hielo picado
1 licuadora
1 charola grande
*1 reloj (cronmetro)
*Papel aluminio
*Toallas de papel o sanitas
*Parafilm
*5 paquetes de gasa
*Papel filtro
*Hojas frescas de espinaca
*base de unicel
*Espejo
*tela negra
Precaucin: El aislamiento de los cloroplastos debe realizarse a una temperatura entre 2C-5C
y en obscuridad.
A. Obtencin de cloroplastos
1. Seleccionar 40 g de hojas integras y frescas de espinaca, lavarlas con agua de la llave,
procurando que el agua no caiga directamente sobre las hojas y secarlas con toallas de papel
2. Cortar el tallo, la nervadura principal y el pice de cada hoja y desecharlos
3. Colocar los pedazos de hoja en un vaso de licuadora previamente enfriado en hielo y agregar
100 ml de medio de aislamiento fro, homogenizar a la velocidad ms alta por unos segundos,
destapar la licuadora y con una esptula mover los pedazo de hoja de arriba hacia abajo, para
cuando se mjense de nuevo no daar los cloroplastos por dao mecnico, homogenizar
nuevamente por unos segundos, hasta obtener pedacitos muy pequeos de hoja de aprox. 3
mm de dimetro.
4. Filtrar la suspensin usando 8 capas de gasa colocadas en embudo y este a su vez en un
matraz, repartir equitativamente el filtrado en 6 tubos de centrfuga de 15 ml cada uno y
balancear los tubos.
5. Centrifugar por 5 min. a 4000 rpm, decantar el sobrenadante y desecharlo.
6. El sedimento de todos los tubos se resuspende con 2.0 ml de medio de aislamiento de
cloroplastos ayudndose de una pipeta Pasteur. Durante toda la prctica la suspensin de
cloroplastos se mantiene en bao de hielo y tapados con un pedazo de tela negra.
45
B. Cuantificacin de clorofila
1. Para determinar la concentracin de clorofila (Chl), colocar en dos tubos de vidrio 5 ml de
acetona al 80% y 20 L de la suspensin de cloroplastos.
2. Cubrir con parafilm los tubos, agitarlos bien e incubar el tubo en la obscuridad por 5 minutos a
4C.
3. Centrifugar los tubos a 5000 r.p.m. durante 5 minutos, y colocar el sobrenadante en tubos de
espectrofotmetro.
4. Leer su absorbancia a 645 y 663 nm calibrando el cero de absorbancia con acetona al 80%
(Esto se hace por duplicado).
5. Una vez obtenida la absorbancia sacar el promedio de las dos lecturas de cada longitud de
onda ledo y aplicar la siguiente formula.
6. La clorofila total en g/ml se calcula con la siguiente frmula:
Recuerde que la cuantificacin se realiza por duplicado.
[Chl en g] = [ 8.05 (PromedioAbs663) + 20.29 (Promedio Abs645)] 5 = _____g en 20 l Chl
Tenemos que en 20 l
_____l
_____g
60 g de Chl
Calcule el volumen necesario para tomar 60 g de chl, despus poner la chl como se indica en la
siguiente tabla.
NOTA: Limpie la punta de la micropipeta antes y despus de tomar la suspensin de cloroplastos.
C. Determinacin de la reduccin del DCPIP
1. Para determinar la reduccin del DCPIP preparar 5 tubos de espectrofotmetro como se indica
en la tabla siguiente:
Tubos de espectrofotmetro
ml
Medio de reaccin con DCPIP (300 M)
ml
Herbicida comercial
50
Suspensin de cloroplastos
60 g
0 g
60g
60 g
60 g
Medio de transporte de electrones
2. Colocar los tubos en una gradilla de unicel.

3. Tapar los tubos con papel parafilm y mezclar su contenido invirtindolo suavemente. Evitar la
formacin de burbujas.
4. Tapar el tubo 4 con papel aluminio.
5. Medir inmediatamente la absorbancia de cada uno de los tubos a la longitud de onda de 660 nm
ajustar a cero con el tubo 1. Anotar los resultados tiempo cero.
6. Colocar todos los tubos frente a una lmpara de 100 watts a 10 cm de distancia durante 1
minuto y tomar nuevamente lectura en el espectrofotmetro. Repetir este proceso 4 veces ms.
46
D. Observacin de cloroplastos
1. Tomar, con una pipeta Pasteur una gota de la suspensin de cloroplastos y observarla al
microscopio a 10X y 40X, hacer un diagrama de sus observaciones.
E. Resultados y procesamiento de datos
1. Hacer una grfica de Absorbancia contra tiempo, interpretarla y discutirla.
F. Discusin
1. Hubo reduccin del DCPIP en todos los casos?
2. A qu se debieron las diferencias en dichos casos?
3. Cul es el sitio de inhibicin del DCMU?
5. Qu paso en los cloroplastos cubiertos con papel aluminio?
Conclusiones
Referencia
1. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentos de bioqumica.2a ed. Mxico: Editorial Mdica
Panamericana; 1999.
2. King-Daz B et al. A diterpene -lactone derivative from Pterodon polygalaeflorus Benth is a
Photosystem II Inhibitor and Uncoupler on Photosynthesis. Z. Naturforsch C, 2006. 61: 227233.
47
Prctica 9
ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA PIRVICO TRANSAMINASA
Introduccin
Las reacciones de transaminacin son catalizadas por las aminotransferasas y se llevan a
cabo en todos los organismos durante el metabolismo de aminocidos. Estas enzimas se encuentran
prcticamente en todos los tejidos pero abundan en el corazn, cerebro, riones, testculos e hgado
y en los vegetales durante la maduracin de las semillas. En la reaccin enzimtica se realiza la
transferencia de un grupo amino (-NH2) de un aminocido a un cetocido. La transaminasas ms
abundantes en la naturaleza son: la glutmico-oxaloactica (GOT) y la glutmico-pirvica (GPT), la
cual es tambin conocida como Alanina aminotransferasa la cual cataliza la transferencia del grupo
amino de la Alanina al -cetoglutarato. Los productos de esta reaccin reversible de transaminacin
son el piruvato y el glutamato como es presentado en la siguiente reaccin:
GPT L-Alanina + -Cetoglutarato ------> Piruvato + L-Glutamato
En el plasma, la actividad de estas enzimas es indicador de algunas patologas, tales como el
infarto o el traumatismo del msculo esqueltico, ya que ambos provocan un aumento en dicha
actividad enzimtica. Para medir cuantitativamente la actividad de la GPT, se mide la cantidad de
cetocido (cido pirvico) obtenido durante la reaccin. Los cetocidos reaccionan en forma
estequiomtrica con la 2,4 -dinitrofenilhidrazina, dando lugar a un compuesto caf-rojo (2,4dinitrofenilhidrazona) que tienen un mximo de absorcin a 505 nm.
Objetivos
Medir la actividad enzimtica de la Alanina aminotransaminasa en un extracto crudo de semillas de
chcharo mediante un mtodo espectrofotomtrico.
Determinar parmetros cinticos, tales como Km y V max de la transaminasa extrada de chcharos
frescos.
Material
1 Centrifuga
1 charola para hielo
1 Gradilla para tubos
1 Pipeta Pasteur
3 Pipetas graduadas de 5 ml
1 Vaso de precipitados de 600 ml
1 Tripi con tela de asbesto
6 tubos para espectrofotmetro
1 Embudo de vidrio
1 Mortero con pistilo
Chicharros en vaina*
Navaja filosa*
5 paquetes de gasa*
6 tubos de centrifuga
15 tubos de ensayo
1 Pipeta graduada de 10 ml
3 Pipetas de 1 ml
2 Pipetas graduadas de 10 ml
1 Mechero
Espectrofotmetro
Micropipeta de 100l con puntas
Micropipeta de 1000l con puntas
48
Reactivos
Solucin patrn de piruvato (cido pirvico 1 mM).
Sustrato (Alanina/-cetoglutarato 1 mM/ 1mM).
Solucin amortiguadora de Tris-HCl 0.1 M pH 7.5 y EDTA 4%.
Solucin amortiguadora de Tris-HCl 40 mM pH 7.5 y EDTA 0.25 mM.
Reactivo de Color (Solucin de 2,4-dinitrofenilhidrazina al 0.01% en HCl 1.0 N).Prepara al momento.
Solucin de Hidrxido de sodio 0.4 N.
Procedimiento
A. Procedimiento de obtencin de la enzima
1.- Poner el mortero en la charola con hielo (bao de hielo).
2.- Pesar 10 gramos de chcharos, sin vaina, picarlos con una navaja sobre el mortero fro.
3.- A los trozos de chcharo, adicionar 20 mililitros de la solucin amortiguadora de Tris-HCl 40 mM y
macere hasta obtener una suspensin homognea (manteniendo siempre el mortero en el bao de
hielo).
4.- Filtrar la suspensin homognea de chicharos a travs de cuatro capas de gasa, y con ayuda de
un embudo de vidrio recuperar el filtrado en un tubo de centrfuga.
5.- Equilibrar los tubos de centrfuga, y centrifugar a 3 000 rpm por 5 minutos.
6.- Recuperar con una pipeta Pasteur la parte lquida (sobrenadante), teniendo cuidado de no tocar
el botn. El sobrenadante colocarlo en un tubo de ensaye y etiquetarlo como enzima, mantener la
enzima siempre en bao de hielo.
B. Efecto de la concentracin de sustrato y curva patrn
1.- Preparar un bao a 37C.
2.- Prepare los siguientes tubos de acuerdo a la siguiente tabla:
Curva Patrn Piruvato
Reactivos
Patrn de piruvato (ml)
Tubos problema
10
11
12
13
0.1 0.2 0.4 0.6 0.8
---
---
---
---
---
---
---
Agua destilada (ml)
1.2 1.1 1.0 0.8 0.6 0.4
---
---
---
---
---
---
----
Sustrato (ml)
---
---
---
---
---
---
Tris-HCl 0.1M pH 7.5 (ml)
---
---
---
---
---
---
1.0 0.95
0.9
0.8
0.6
0.2
Enzima (ml)
---
---
---
--
---
---
0.2 0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.05 0.10 0.20 0.40 0.80
1.0
Incubar A 37c por 30 minutos

Sol. 2-4 dinitrofenilhidrazina (ml)
Agite vigorosamente y espere 20 minutos

NaOH 0.4 N
Deje reposar por 5 minutos

Leer la absorbancia a 505 nm
49
1.- Tabular los datos obtenidos de la absorbancia para la curva patrn:

ml de solucin patrn
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
molas de pirvico
Absorbancia a 505 nm
2.- Realizar una grfica usando como en el eje de las X las molas de pirvico y en el eje de las Y la
absorbancia. Si los puntos no quedan dentro de la recta, normalice haciendo una regresin por
mnimos cuadrados.
3.- Tabular los siguientes datos:
Tubo No.
Sustrato Molas de
Alanina
Absorbancia
505 nm
Producto molas de
pirvico/30 minutos
7
8
9
10
11
12
13
4.- Con ayuda de la curva patrn calcule las molas de pirvico obtenidas en cada uno de los tubos
de incubacin
5.- Para determinar Km y Vmax, grafique la inversa de la vo (velocidad inicial: molas de pirvico/min)
como ordenadas, versus la inversa de la concentracin de sustrato [S] (molas de alanina).
Conclusiones
Cuestionario
1.- Qu mtodo para graficar se utiliz para calcular la Km y la Vmax de la transaminasa?
2.- Todas las transaminasas deben tener el mismo valor de Km?
3.- La Km obtenida en este experimento representa gran afinidad por su sustrato? Explique.
4.- Qu trascendencia tiene la determinacin de Km para el metabolismo de aminocidos?
Referencia
2005.
2. Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell, 4a. ed. New York. Garland Science. 2002.
50
Anexo I
Soluciones Prctica 3
REACTIVO DE SOMOGYI
Soluci Disolver en 600 ml de agua destilada 25 g de
n1
carbonato de sodio anhidro (Na2CO3), 25 g de
tartrato doble de sodio y potasio, 20 g de
bicarbonato de sodio y aforar a 1000 ml. Para
que se disuelvan mejor las sales, puede
calentarse un poco
Soluci Disolver 15 g de sulfato de cobre (CuSO 4) en 80
n2
ml de agua destilada. Agregarle 2 gotas de
cido sulfrico concentrado. Aforar a 100 ml
Mezclar 25 partes de la solucin 1 con 1 parte de la
Solucin 2 en el momento de usarse.
REACTIVO DE ARSENOMOLIBDATO
Soluci Disolver 25 g de molibdato de amonio
n1
[(NH4)2MoO4)] en 450 ml de agua destilada, ms
25 ml de cido sulfrico concentrado
Soluci Disolver 3 g de arseniato sdico heptahidratado
n2
(Na2HAsO4 7H2O) en 25 ml de agua destilada
Agregar la solucin 2 a la 1, mezclar y colocar en
incubacin a 37 C durante 24 h. A esto se le conoce como
maduracin de la solucin.
Guardar en frasco mbar
Reactivo de Biuret.
CuSO4
0.75 g
Tartrato de Na y K
3g
Disolver en 250 ml de agua destilada
Aadir 150 mL de NaOH 10%
Aforar a 500 mL con agua destilada
Dinitrofenol
PM: 184.1
Disolver en etanol
-cetoglutarato
PM: 146.10
51

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Reglamento interno de higiene y seguridad del laboratorio

Normas de seguridad en el laboratorio

Formas de expresar la concentracin de una solucin

Clculos y medidas de utilidad en bioqumica

Prctica1. Propiedades generales de los lpidos

Prctica 2. Membranas y smosis

Prctica 3. Transporte a travs de la membrana

Practica 5. Fermentacin de la glucosa por la levadura de panificacin

Practica 7. Metabolismo de lpidos. Conversin de grasas a sacarosa

Prctica 8. Reduccin del 2-6 diclorofenol-indofenol (DCPIP) dependiente de la actividad

REGLAMENTO INTERNO DE HIGIENE Y SEGURIDAD DEL LABORATORIO DE BIOLOGA

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

FORMAS DE EXPRESAR LA CONCENTRACIN DE UNA SOLUCIN

Clculo y expresin de diluciones

Ejercicios (para ser realizados por el estudiante en horas de estudio independiente)

Peso total (g)

ideal para lpidos apolares, la acetona.

B. Deteccin cualitativa de esteroides

cido Sulfrico* (ml)

* Resbalar por el tubo para formar una capa en el fondo

NOTA: REACCIONES MUY EXOTRMICAS CUIDADO!

Anhdrido actico (ml)

cido Sulfrico (ml)

* Resbalar por el tubo para formar una capa en el fondo

NUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL CIDO

Resultados y procesamiento de datos

D. Solubilidad del aceite de oliva

10 ml Rojo Neutro al 0.5% preparado en

Resultados y procesamiento de datos

Tabla 2. Promedio DE de cada tratamiento

Elaborar graficas de barras con los datos de ambas tablas (2 y 3) independientemente.

Fragilidad osmtica de eritrocitos

Mezclar por inversin

Mezclar por inversin

Se ha sugerido que los dos parmetros ms significativos son:

La fragilidad osmtica de eritrocitos se incrementa en algunos padecimientos como esferocitosis

1 micropipeta de 1000 L c/puntas

Soluciones (ver anexo I)

A. Incubacin de las clulas

levadura + 1 ml de solucin de glucosa.

levadura + 1 ml de solucin de glucosa + 0.1 ml de solucin 2, 4-dinitrofenol.

levadura + 1 ml de solucin de glucosa + 0.1 ml de KCN

levadura + 1 ml de solucin de glucosa y a continuacin este tubo debe ponerse en agua

2. Resuspender las clulas con el vrtex

B. Determinacin de azcares por el mtodo de Somogyi

COLOCAR ESTOS TUBOS TAPADOS DURANTE 20 min EN BAO MARA. DESPUS,

Calibrar el espectrofotmetro con el tubo 1 de la curva estndar. Leer la absorbancia a 540 nm de

Presentar una serie de tablas con los resultados obtenidos

Tabla 2. Cantidad de glucosa remanente en el medio de crecimiento.

Material por equipo (que los alumnos deben traer)*

B. Prueba con Timol.

Resultados y procesamiento de datos

Isopropanol cido (192 ml de isopropanol + 8 ml de HCl)

Experimento 3 (azida de sodio)

Germinacin de las semillas

1 Pesar 4 lotes de semillas de ajonjol de 2.5 g cada uno.

II. Preparacin de los extractos

Sol. Patrn de casena (ml)

IV.- Determinacin de carbohidratos

Calibrar el espectrofotmetro con el tubo 1. Leer la absorbancia a 485 nm.

Graficar absorbancia vs. mg de protena y obtener lo siguiente: