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UNMSM FQIQ Dpto. Qum.

Orgnica

Gua de Prcticas de Microbiologa General y Aplicada

PRACTICA N 4
I.

COMPORTAMIENTO CULTURAL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

II.
INTRODUCCION
Los estudios de microorganismos en el laboratorio se realizan con cultivos puros, es
decir con una sola especie de microorganismos el cual es inoculado en medios
slidos y lquidos estriles que aseguren la pureza del cultivo.
Las muestras desde las cuales se les quiere aislar los microorganismos son complejas
presentan una gran variedad, es de aqu donde se toma una alcuota o inculo y se
transfiere a un medio estril que generalmente es un medio lquido siempre bajo
condiciones aspticas.
Para obtener cultivos puros de microorganismos se requiere de pasajes sucesivos de
medios lquidos a slidos o viceversa hasta lograr UFC los suficientemente aisladas
que permitan su pureza.
La pureza de estos cultivos permite estudiar sus caractersticas que presentan en los
diferentes medios en los cuales se les cultiva, que pueden ser slidos o lquidos.
Siguiendo el orden de los estudios microbianos in vitro de morfologa celular y de colonias
como caracteres de especies o grupos bacterianos, el alumno observar en esta prctica
las caractersticas culturales de 4 cepas con comportamiento caracterstico diferencial en
caldo nutricio, agar en plano inclinado y agar en columna. Cada carcter vara segn las
necesidades metablicas y de multiplicacin de las especies o grupos bacterianos y en
parte ayuda a la identificacin.
OBJETIVO
- Estudiar el comportamiento de los microorganismos aislados previamente en
medios de cultivo y comprobar la pureza de los mismos.
III.

MATERIALES

1.- Cepas puras de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus, Pseudomonas,


Saccharomyces, Aspergillus y Penicillium codificadas de 24 a 48 horas de incubacin.
2.- Tubos de ensayo con caldo nutritivo.
3.- Placas con agar nutritivo y agar sabouraud.
4.- Placas con agar papa dextrosa.
5.- Tubos con agar nutritivo semislido en columna.
6.- Asa de siembra, gradilla, plumn.
7.- Batera Gram: cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, fucsina fenicada de Ziehl. Lminas
portaobjetos, cubreobjetos limpias, papel lente.
8.- Microscopio, aceite de inmersin y alcohol 70.
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IV.

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PROCEDIMIENTO:

1.

Replicacin de lquido a lquido

1.

5.
6.

Tomar el cultivo de bacterias con la mano izquierda y destapar con el dedo meique de
la mano derecha a la altura del mechero.
Con el asa de Kohle previamente flameada al fuego extraer una alcuota del
inculo.
Tapar el tubo y colocarlo en la gradilla
Depositar el inculo en el nuevo tubo de caldo nutritivo agitando, flamear la boca
del tubo al mechero y taponar.
Esterilizar el asa al mechero
Rotular e incubar a 28 30.

2.

Replicacin de lquido a slido

1.
2.

Repetir los pasos (1), (2) y (3) de la tcnica anterior.


Tomar con la mano izquierda la placa con agar, destapar la placa a la altura del
mechero, introducir el asa y realizar estras en zigzag con el inculo en la superficie del
medio.
Cerrar la placa y flamear el asa de siembra.
Rotular e incubar a 28 30.

2.
3.
4.

3.
4.

V. CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS
1.

COMPORTAMIENTO EN MEDIO LQUIDO:

Mediante el siguiente cuadro se sintetizarn los caracteres de comportamiento


macroscpico en un medio lquido.
CUADRO I
DESARROLLO EN
SUPERFICIE

CANTIDAD DE
DESARROLLO

TURBIEDAD

Abundante

Homognea

Moderado

En grumos finos

Escaso
Nulo

En grumos gruesos
Algodonoso

- Formacin de pelcula,
De naturaleza:
Gomosa, lisa,
Corrugada, escamosa
Membranosa, Costrosa
- Sin pelcula: desarrollo
en anillo

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OLOR
ninguno

Fecaloide,
Aromtico
Parecido a.

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2. COMPORTAMIENTO EN MEDIO SLIDO:


La lectura se har en base a un desarrollo masivo en capa sobre la superficie del medio. Los
caracteres diferenciales son idnticos a los de las colonias.
CUADRO II
CANTIDAD DE
DESARROLLO
Abundante
Moderado
Escaso
Nulo

BRILLO
Vivo
Apagado
Opaco

FORMA
Filiforme
Difusa o Confluente
Arborescente
Rizoide
Perlada
Toruloide

TRANSPARENCIA
Opaca
Opalescente
Transparente

TEXTURA DE
SUPERFICIE

CONSISTENCIA

Lisa
Granular
Escamosa
Membranosa
Papulosa
Corrugada
Costrosa
Verrucosa
Lacerada

Cremosa
Butirosa
Viscosa o vidriosa
Gomosa o mucosa
Membranosa
Algodonosa

CROMOGENESIS ASPECTO DEL MEDIO


OLOR
Amarillo limn
Inalterado
Ninguno
Amarillo oro
Grisceo
Fecaloide
Amarillo plido
Negruzco
Sui generis
Anaranjado
Enrojecido
Aromtico
Azulado
Verdoso
Verde amarillento
Fluorescente
Verde azulado
Lechosa
Rojizo
Opalescente

Anotar y realizar la discusin de los resultados obtenidos.


3. COMPORTAMIENTO EN MEDIO SEMISLIDO (B. EN COLUMNA)
El crecimiento semislido se define a lo largo del trazo de siembra por puntura y tambin
de acuerdo al tipo de multiplicacin celular en la profundidad del medio. Permite adems la
lectura de la MOTILIDAD MACROSCOPICA de la bacteria a las 24 48 horas. De
incubacin.

1.
2.

Repetir los pasos (1), (2) y (3) de la tcnica N1.


Tomar con la mano izquierda el tubo con agar semislido, destapar el tubo con el
dedo meique de la mano derecha a la altura del mechero, e inocular en el agar la
muestra introduciendo el asa (usando alambre de micrn en punta) hasta la zona
media del tubo.
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3.
4.

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Flamear la boca del tubo, flamear el asa y colocar el tubo en la gradilla.


Rotular e incubar a 28 30 por 48 horas.

CUADRO III
DESARROLLO EN PUNTURA

ASPECTO DEL MEDIO

Filiforme

Inalterado

Granular

Grisceo

Perlado
Claviforme
Rizoide
En pino invertido
Arborescente
Velloso

Negruzco
Enrojecido
Verduzco
Lechoso
Fluorescente
Opalescente

MOTILIDAD

Crecimiento difuso
Parcial o total del
Microorganismo por
Toda la columna de
Agar: BACTERIA MOVIL
Crecimiento
Circunscrito al trazo
De siembra: BACTERIA
NO MOVIL

VI. COLORACIN GRAM DE LAS CEPAS


Hacer tincin de cada cepa, sea de caldo o de agar.
Hacer esquemas de las observaciones.
VII. PRESENTACIN DE INFORME
Con los resultados obtenidos de la caracterizacin morfolgica de las colonias, movilidad
bacteriana, respiracin celular, tincin gram y morfologa celular adems del uso de
bibliografa adecuada e identificar el nombre correspondiente (gnero y especie o solo
gnero) de cada una de las cepas estudiadas de las cepas puras Bacillus, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Sacharomyces presentadas en la prctica. Presentar su discusin de
resultado.

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VIII. CUESTIONARIO
1.
Cul es la razn de utilizar cultivos puros para el estudio morfolgico?
2.
La morfologa de los microorganismos varia con el medio de cultivo. Por qu?
3.
Cul es el fundamento de la cromognesis?
4.
Cul es el fundamento de la fluorescencia en los microorganismos?

M.O.
Caractersticas
Cantidad de
desarrollo
Forma
Textura
Consistencia
Brillo
Adherencia
Cromognesis
Aspecto del medio
Olor
Coloracin gram

M.O.
Caractersticas
Cantidad de
desarrollo
Turbidez
Desarrollo
superficie
Olor
Sedimento
Naturaleza
sedimento

Tabla I
Comportamiento Cultural de Bacterias en Medio Slido
Escherichia
Staphylococcus Pseudomonas
Salmonella
coli
aureus
sp
sp
Abundante
Abundante
Abundante
Moderado

Abundante

Difusa
Lisa
Cremosa
Mate
Moderada
Ausente
Opalescente
Fecaloide
(-)

Difusa
Lisa
Gomosa
Brillante
Moderada
Amarillo
dorado
Opalescente
Sui generis
(+)

Bacillus sp

Difusa
Lisa
Cremosa
Opaca
Moderada
Azul verdoso

Filiforme
Lisa
Cremosa
Mate
Debil
Ausente

Filiforme
Corrugada
Cremosa
Brillante
Moderada
Ausente

Fluorescente
Fruta podrida
(-)

Opalescente
Fecaloide
(-)

Opalescente
Descompuesto
(+)

Comportamiento Cultural de Bacterias en Medio Lquido


Escherichia
Staphylococcus Pseudomonas
Salmonella
coli
aureus
sp
sp
Abundante
Homognea
Abundante
Moderado

Abundante

Homognea
Sin pelcula

Homognea
Sin pelcula

Homognea
Anillo verde

Homognea
Sin pelcula

Homgnea
Sin pelcula

Fecaloide
Moderado
Mucoide

Sui generis
Moderado
Mucoide

Fruta podrida
Abundante
Grumoso

Fecaloide
Escaso
Granular

Descompuesto
Ausente
Ausente

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Bacillus sp

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Comportamiento Cultural de Bacterias en medio semi slido


M.O.
Escherichia coli Staphylococcus Pseudomonas
Salmonella
Caractersticas
aureus
sp
sp
Aspecto del medio
Opalescente
Opalescente
Fluorescente
Opalescente
Motilidad
(+)
(-)
(+)
(+)

Comportamiento Cultural de Hongos en medio slido


M.O.
Saccharomyces
Candida sp
Aspergillus sp
Caractersticas
cerevisiae
Cantidad de
Abundante
Abundante
Moderado
desarrollo
Forma
Perlada
Perlada
Arborescente
Textura
Lisa
Lisa
Corrugadas
Consistencia
Mucosa
Cremosa
Algodonosa
Brillo
Brillante
Brillante
Opaca
Adherencia
Dbilmente
Dbilmente
Fuerte
Cromognesis
Ausente
Ausente
Azul verdoso
Aspecto del medio
Opalescente
Opalescente
Opalescente
Olor
Frutas
Frutas
Sui generis
Comportamiento Cultural de Hongos en Medio Lquido
M.O.
Saccharomyces
Candida sp Aspergillus sp
Caractersticas
cerevisiae
Cantidad de
Abundante
Abundante
Escaso
desarrollo
Turbidez
Homognea
Homognea
Escaso
Desarrollo superficie
Sin pelcula
Sin pelcula
Costrosa
Olor
Frutas
Frutas
Sui generis
Sedimento
Moderado
Moderado
Nulo
Naturaleza
Mucoide
Mucoide
Nulo
sedimento

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Bacillus sp
Opalescente
(+)

Penicillium sp
Moderado
Arborescente
Corrugada
Algodonosa
Opaca
Fuerte
Azul negruzca
Opalescente
Sui generis

Penicillium sp
Escaso
Escaso
Costrosa
Sui generis
Nulo
Nulo

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Comportamiento Cultural de Hongos en medio semi slido


M.O.
Saccharomyces
Candida sp Aspergillus sp
Penicillium
Caractersticas
cerevisiae
sp
Aspecto del medio
Opalescente
Opalescente Opalescente
Opalescente
Motilidad
(-)
(-)
(-)
(-)

II. DETERMINACION DEL NUMERO DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCION
I.
En muchas fases de la microbiologa se hace necesario cuantificar el nmero de
microorganismos que se encuentran en un cultivo o determinar su nmero en alimentos,
aguas y otros productos.
Los mtodos que miden el nmero de clulas son importantes para contar el nmero de
organismos unicelulares como bacterias y levaduras. En la determinacin de la masa de
clulas pueden emplearse para todo tipo de microorganismo.
Existen mtodos directos e indirectos:
A) Mtodos Directos
1.- Determinacin del nmero de microorganismos
- Recuento microscpico directo
- Recuento en placas
- Nmero ms probable
- Conteo electrnico
- Electrodos de Pt, inmersos en un electrolito. Tamao de partcula 1- 3 um
1. Contador coulter
2.- Determinacin de la masa celular
- Peso seco
- Turbidimetra
- Volumen empacado
B) Estimacin indirecta de masa celular
- Cuando el cultivo contiene slidos no celulares

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Bsicamente son valoraciones qumicas de los componentes celulares como por ejemplo
nitrgeno, CO2, protenas, ADN, lpidos, carbohidratos.
Todos los mtodos poseen ventajas y desventajas, se hace necesaria la combinacin de
varios mtodos para tener valores que muestren el nmero original de microorganismos.

OBJETIVO
Adiestrar al alumno en los mtodos usados en la determinacin del nmero de
microorganismos.
La cuantificacin permitir determinar la cintica en el caso de los Bioprocesos o el
grado de contaminacin de un producto determinado.

II.

III.
1.
2.
3.

MATERIALES
1 muestra de alimento de expendio pblico no cocinado (hamburguesa de carne y/o
pollo no cocinada, salsa de aj, cremas, etc.)
Frascos con 90 ml con agua destilada estril.
Placas Petri.
Tubos con 9 ml de solucin salina estril de 0.85%
Tubos con 9 ml de caldo lactosa
Pipetas de 1 y 10 ml
Tubos con 1 ml de agua destilada estril
Gradillas
Plumn indeleble.
Mechero
Encendedor
PROCEDIMIENTO
Tomar 1 ml 1 gr de la muestra problema segn sea lquida o slida y transferir a un
tubo de ensayo con 9 ml de agua destilada estril, sta constituir la dilucin 10-1.
Realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3, 10-4 en los tubos de agua destilada estril.
Proceder al aislamiento por los mtodos descritos abajo.

A) RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE PLACAS:


1.
2.
3.
4.

Tomar 1 ml de la dilucin de la muestra en condiciones estriles.


Destapar con la mano izquierda la placa Petri lo necesario y depositar el inculo.
Colocar la cubierta de la placa Petri.
Incorporar 10 a 15 ml del agar respectivo mantenidos a 45 C tapar y describir
movimientos rotatorios a fin de distribuir homogneamente el inculo.
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5.
6.
7.

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Rotular e incubar a 28 C.
Contar el nmero de colonias que aparecen al final de la incubacin.
Realizar los clculos pertinentes.
UFC/gr o ml = (N de colonias contadas x FDD) / (volumen de siembra)
FDD: Factor decimal de dilucin = 1 / Dilucin realizada

8.

Realizar la discusin de los resultados obtenidos.

B) RECUENTO DE MICROORGANISMOS COLIFORMES POR EL METODO DEL NUMERO


MAS PROBABLE ( NMP)
1.
2.
3.

4.
5.

Tomar 1 ml de la muestra problema y transferir a un tubo con 9 ml de agua destilada


estril, sta constituir la dilucin 10-1.
Realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3 en los tubos de agua destilada estril.
Tomar 3 tubos con caldo lactosa e inocular 1 ml de la dilucin seleccionada a cada
uno, repetir el procedimiento con las otras diluciones tomando siempre 3 tubos para
cada dilucin, empezando siempre con la menor dilucin.
Rotular los datos en los tubos e incubar a 28 C por 48 horas.
Verificar este resultado en la tabla II para determinar el nmero ms probable.

IV. PRESENTACIN DEL INFORME


Realizar la discusin de los resultados de acuerdo a la procedencia de la muestra problema.

V. CUESTIONARIO
1.- Puede Ud. Medir el crecimiento de hongos por turbidimetra?
2.- En qu casos se emplea la Escala de Mac Farland?
2.- Cul es la desventaja que presentan los contadores electrnicos?
3.- Cul es el inconveniente que presenta el recuento directo al microscopio?

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TABLA II
Tabla 1. ndice del NMP para varias combinaciones de resultados positivos y negativos para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con alcuotas
de 0.1; 0.01 y 0.001g.

Referencia: Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 ed. 2005. Chapter 17.3, pag. 5

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PRACTICA N 5
ACCIN DE AGENTES FSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

Es bien conocido que las actividades vitales de los organismos estn condicionadas por su
ambiente. Modificando fundamentalmente estos factores, el organismo bien se adapta a las
nuevas condiciones o en todo caso muere; en esto est implicado la magnitud y el tipo de
cambio operado. Este es el aspecto en el que los microorganismos difieren de las clulas de
plantas superiores y animales.
El conocimiento de los factores fsicos que controlan la supervivencia y multiplicacin de los
microorganismos nos sirven como instrumento de control de la actividad bacteriana para
ser esta incrementada, disminuida o destruida completamente.
El tipo de muerte bacteriana por agentes fsicos est relacionado al nmero de bacterias
sobrevivientes, lo que significa que el proceso de desinfeccin no es repentino sino gradual,
en el que el nmero de microorganismos muertos por unidad de tiempo es mayor al
principio y mucho menor cuando la accin contina.

I. EFECTO DE LA TEMPERATURA
Las bacterias son capaces de una capacidad de sobrevivencia amplia con lmites de
temperatura variable, su rango de crecer y ejercer sus actividades est entre los 0 y 90C.
CONDICIONES QUE VARIAN LA MUERTE TRMICA:
1. Contenido DE AGUA DEL MEDIO: La muerte bacteriana se genera por coagulacin de
las protenas del protoplasma. Cuanto mayor es el porcentaje de agua en el medio,
menor ser la temperatura requerida para matar la bacteria.
2. Contenido de agua de los organismos: A menor cantidad de agua, los
microorganismos se secan y se produce mayor resistencia a la temperatura.
3. Concentracin de hidrogeniones: Lo microorganismos mueren fcilmente en
condiciones cidas o alcalinas, requirindose temperaturas menores que en medios
neutros.
4. Composicin del medio: Los medios que contienen alta concentracin de protenas
incrementan la temperatura requerida para destruir bacterias, ya que las protenas
forman una pelcula alrededor de los microorganismos como medio de proteccin
indirecta ante situaciones desfavorables.
5. Edad de las clulas: Las clulas viejas son ms resistentes que las clulas jvenes a
las condiciones adversas.

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Objetivo:
-

Determinar la temperatura de muerte trmica de los microorganismos estudiados


tratados a 40 C y 65 C durante diferentes intervalos de tiempo.
Determinar el nmero de microorganismos supervivientes resistentes al tratamiento
trmico.

Materiales:
Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Procedimiento:
1. Dos cultivos de 24 horas de edad de E. coli y S. aureus crecidos en Caldo Nutritivo se
sometern a 40 C y 65 C.
2. Cada 0, 40, 80 y 100 minutos se coger 1 ml de cada uno los tubos que contienen las
cepas microbianas en ambas temperaturas y se sembrar por el mtodo de difusin en el
medio de cultivo Agar Nutritivo. Realizar diluciones seriadas.
3. Rotular correctamente las placas Petri indicando el tratamiento y la cepa microbiana.
4. Incubar a 28 C por 48 horas en posicin invertida.
5. Realizar el recuento de microorganismos en cada uno de los tratamientos.
6. Resultados: Anotar los resultados en el siguiente cuadro:
Temperatura

40 C

65 C

Tiempo (min)

Crecimiento microbiano (UFC/ml)


Escherichia coli Staphylococcus aureus

0
40
80
100
0
40
80
100

7. Con los resultados obtenidos elaborar la curva de supervivencia de microorganismos en


papel milimetrado comparando el tiempo de exposicin (eje X) y las UFC/ml (eje Y) para
cada una de las temperaturas evaluadas por microorganismos evaluado.
8. Con los resultados obtenidos halle el Tiempo de Reduccin decimal o valor D en ambas
temperaturas utilizando la siguiente frmula:

Donde:

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Dt: Tiempo en minutos para reducir el 90% el nmero de microorganismos de una


poblacin a una temperatura dada.
x: Minutos a una determinada temperatura
No: n de clulas al inicio del tratamiento trmico
Nx: n de clulas supervivientes despus de un tratamiento

9. Interpretacin y Discusin de resultados. A partir de las curvas graficadas indique los


resultados obtenidos para cada una de las variables estudiadas y explique los resultados
obtenidos utilizando bibliografa adecuada (artculos cientficos, libros).

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II. ACCIN DE LA PRESIN OSMTICA


Este factor viene a ser la presin desbalanceada que da lugar a los fenmenos de difusin y
smosis, en una solucin donde hay diferencia de concentraciones.
Si un organismo est inmerso en una solucin que tenga alta presin osmtica, el agua
saldr de la clula hasta que establezca un equilibrio entre el interior y exterior celular lo
que ocasionar que la membrana citoplasmtica y el protoplasma se contraigan hacia el
centro de la clula; es entonces que la clula ha entrado en el proceso de crenacin.
Lo contrario ocurre cuando una clula est en un medio con baja presin osmtica, el agua
ingresar a la clula hasta establecer equilibrio en el exterior celular, y si la diferencia de
presin es grande la membrana tender a explotar y se dir que la clula ha entrado en
estado de plasmlisis.
Objetivo:
-

Determinar la concentracin de NaCl que afecta el crecimiento microbiano.

Material
-

Cepa de Escherichia coli de 24 horas de edad crecida en caldo nutritivo


4 Placas con concentraciones crecientes de NaCl al 5%, 10%, 20% y 40% en medio
base Agar Nutritivo.
1 placa con Agar Nutritivo.
Asa de siembra
Encendedor

Procedimiento
1. En las placas con diferentes concentraciones de NaCl, sembrar la cepa de E. coli por
el mtodo del estriado.
2. Repetir el paso anterior utilizando una placa con Agar Nutritivo que contiene
concentracin normal de NaCl.
3. Rotular las placas Petri con la cepa microbiana utilizada.
4. Incubar a 28C por 48Hrs.
5. Comparar el crecimiento microbiano entre las placas que contienen las diferentes
concentraciones de NaCl y la placa con Agar Nutritivo que contiene concentracin
normal de NaCl.
6. Interpretacin y Discusin de resultados.

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ACCIN DE AGENTES QUMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS


I.

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE IONES HIDRGENO (pH) EN LOS


MICROORGANISMOS.

El efecto de distintas concentraciones de iones hidrgeno es considerado con respecto a su


capacidad para suprimir el crecimiento microbiano. Los microorganismos se inocularn en
un medio que es capaz de mantener el crecimiento siempre y cuando el pH sea tolerable. La
nica diferencia entre las distintas probetas de medio de cultivo radica en el pH de los
caldos en cuestin. Se observar el crecimiento y se tendr conclusiones. Para que estos
resultados sean vlidos es preciso la observacin de todas las probetas en un mismo
tiempo.
Objetivo:
-

Determinar el efecto del pH en el crecimiento y desarrollo microbiano.

Materiales
-

Cultivos de 24 horas de edad de Escherichia coli.


Tubos con caldo nutritivo estril previamente ajustados con HCl 1.0N y NaOH 1.0N a
valores de pH de 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 y 11.0 (1 de cada una)

Procedimiento.
1. Inocule con una azada el cultivo de E. coli en cada uno de los tubos de caldo nutritivo con
distintos valores de pH.
2. Incube a 28 C y anote sus observaciones en trminos de la cantidad de crecimiento al
segundo y cuarto da. Emplee la siguiente escala:
+
= Poco crecimiento
++
= Regular Crecimiento
+++ = Crecimiento moderado
++++ = Abundante crecimiento
3. Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:
TABLA DE RESULTADOS
pH 3.0

pH 5.0

E. coli

4. Interpretacin y Discusin de resultados.

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pH 7.0

pH 9.0

pH 11.0

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II. ACCIN DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS.


Objetivo
- Observar y comparar el efecto de los desinfectantes y antispticos en el desarrollo
microbiano.
Materiales
- Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
- Medio de cultivo: Agar nutritivo
- Desinfectantes: Leja al 10%, cresol al 5%, Pinesol.
- Antispticos: Alcohol al 70%, agua oxigenada, merthiolate, jabn medicado (Protex)
- Discos de papel filtro, pinzas.
- Plumn indeleble.
Procedimiento
Agentes desinfectantes
1. Dividir la placa de Agar Nutritivo en 3 mitades utilizando plumn indeleble.
2. A partir de un cultivo de 24 horas de edad de la cepa de E. coli coger con un asa de kohle
el inculo necesario y sembrarlo sobre la superficie de cada parte de la placa de Agar
Nutritivo.
3. Utilizando una pinza estril colocar un disco de papel filtro de 1.5 cm de dimetro
embebido en la solucin del desinfectante.
4. Realizar el mismo procedimiento para la cepa microbiana de S. aureus
5. Incubar las placas a 28C por 48 horas en posicin invertida.

1.
2.
3.

4.

Agentes Antispticos
Dividir la placa de Agar Nutritivo en 4 mitades.
Realizar el mismo procedimiento descrito para los agentes desinfectantes y probar las
cepas de E. coli y S. aureus.
Incube a 28 C por 48 horas y anote sus observaciones en trminos de la cantidad de
crecimiento. Emplee la siguiente escala:
+
= Poco crecimiento
++
= Regular Crecimiento
+++ = Crecimiento moderado
++++ = Abundante crecimiento
Resultados: Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:

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Desinfectante

E. coli

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Antisptico

S.aureus

Leja

Alcohol al 70%

Cresol

H2O2

Pinesol

Merthiolate
Jabn Protex

5. Interpretacin y Discusin de resultados.

71

E. coli

S.aureus

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PRUEBAS DE DIFERENCIACIN BIOQUMICA


El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye
procesos de obtencin de energa, tales como, descomposicin de molculas orgnicas en
los quimitrofos (catabolismo) o la captacin de luz para el caso de los fottrofos.
Asimismo, se encuentran las de sntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales
(anabolismo).
Todas las reacciones metablicas son catalizadas por enzimas que en su mayora son
intracelulares aunque hay tambin extracelulares, sobre todo hidrolticas, que son liberadas
por la clula para catalizar reacciones fuera de esta.
Es posible conocer las caractersticas metablicas de los microorganismos por su
inoculacin en medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como
fuentes de energa, carbono, donadores de electrones, as como de otros nutrientes
esenciales necesarios para su crecimiento.
Existen numerosas pruebas bioqumicas con medios de cultivo adicionados de indicadores
de pH para detectar la produccin de cido o lcali, con inhibidores selectivos como bilis,
cianuro o con colorantes, sulfuros, etc. que facilitan la determinacin de diferentes
actividades metablicas. La actividad que se evala con mayor frecuencia es: capacidad
para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, etc.).
El desarrollo de pruebas bioqumicas es importante para la identificacin de especies
bacterianas que proliferan en el rea de alimentos, clnica y ambiental capaces de crecer
utilizando diferentes sustratos y por lo tanto su potencial deterioro.
Objetivo
- Caracterizar a los microorganismos en funcin de su capacidad fermentativa de
diferentes carbohidratos.
Materiales
- Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
- Caldo Base Rojo de Fenol
- Carbohidratos: Glucosa, Sacarosa y Lactosa
- Pipetas estriles
- Plumn indeleble.
Procedimiento
1. Inocular 0.5 ml de cada cepa en una serie de tubos de caldo rojo fenol con glucosa,
lactosa, y sacarosa.
2. Incubar los tubos a 28C durante 48 horas.
3. Resultados: Determinar si hay crecimiento y cambios en el color del indicador
Criterios de evaluacin:
Produccin de cido
Prueba positiva (+): color amarillo
Prueba negativa (-): color rojo
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4.

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Interpretacin de resultados y Discusin.

CUESTIONARIO
1. De los microorganismos estudiados qu estructuras bacterianas le confieren resistencia
trmica? Por qu?
2. Cul es el rango de temperatura en el cul los microorganismos crecen y se multiplican
rpidamente y en funcin de esto cul sera la temperatura recomendada para la
conservacin de los alimentos? Por qu?
3. Qu cuidados debemos practicar frente a la cantidad de agua extra o intra celular en
posibles productos frescos a temperatura ambiente?
4. Qu ejemplos de aplicacin estn basados en la fisiologa de la presin osmtica?
5. Cul es la razn de usar alcohol de 70?
6. En un proceso productivo de derivados de frutas, Cul sera el agente contaminante
principal? Cul sera su agente qumico de control? Qu funcin cumplira este agente?
Proponga un ejemplo.
7. Explique el efecto de los desinfectantes y antispticos en el desarrollo microbiano.
8. De acuerdo a la capacidad fermentativa de los carbohidratos por las bacterias estudiadas
indique los alimentos que pueden ser potencialmente deteriorados por esta actividad
metablica. Por qu?
Defina:
Desinfectante
Antisptico
Bactericida
Bacteriosttico
Plasmlisis

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PRACTICA N 6
IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE MOHOS POST COSECHA, CARACTERSTICAS DE
LOS PRINCIPALES GRUPOS DE HONGOS
La mayora de los hongos viven libres en el suelo o en el agua y obtienen su energa por
respiracin o fermentacin de materiales orgnicos solubles presentes en estos ambientes.
El aire no es un medio en el que pueden desarrollarse los microorganismos pero es el
portador de aerosoles biolgicos como polvo, gotitas de agua y otros, que pueden estar
cargados de los diversos grupos de microorganismos.
De las capas de aire se han encontrado esporas de hongos que proceden principalmente del
suelo, de la vegetacin y del mar. Algunos de los gneros ms comnmente aislados del aire
son Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor y Cladosporium entre otros.
Todos los hongos se reproducen por esporulacin. Cuando la espora se encuentra en un
medio nutritivo adecuado, se hincha y germina emitiendo uno o ms tubos germinativos
que se alargan distalmente hasta constituir filamentos delgados y largos que se denominan
HIFAS, las cuales pueden ramificarse despus. En algunas especies se forman septas a lo
largo de la hifa, quedando entonces dividida en pequeos compartimentos como una caa
de bamb llamndose entonces HIFA SEPTADA, otras veces no hay septacin y el
protoplasma fluye continuamente a lo largo de la hifa, describindose entonces como HIFA
NO SEPTADA CENOCITICA. En la mayora de los hongos las hifas son septadas. A medida
que las hifas se siguen dividiendo se forma un crecimiento algodonoso o filamentoso de
hifas entrelazadas llamado MICELIO. El conjunto de micelio se conoce como TALO. En
algunas formas superiores las hifas se unen formando cuerpos fructferos grandes y de
estructura compleja como es el caso de las setas. La parte del micelio que penetra en el
substrato y absorbe substancias nutritivas se llama MICELIO VEGETATIVO, la parte que se
proyecta sobre la superficie del substrato origina el MICELIO AEREO, que a su vez da origen
a esporas asexuales llamadas CONIDIAS, cuya misin es la de dispersar el hongo a nuevos
hbitats.
Algunos hongos tambin producen esporas sexuales formadas como resultado de la
reproduccin sexual. Las que estn encerradas en una especie de saco (Asca) se llaman
ASCOSPORAS y las que se forman en el extremo de un basidio se denominan
BASIDIOSPORAS. Las propiedades de las esporas sexuales son un criterio importante en la
clasificacin e identificacin de los hongos.
Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prcticamente hay tres grupos
importantes: Los mohos, las levaduras y las setas. Los mohos son hongos filamentosos que
estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y son habituales en pan viejo, queso, frutas
o cualquier tipo de alimento. Presentan una gran variedad de formas y tamaos. Las
levaduras son hongos unicelulares y la mayora son Ascomicetos. Normalmente tienen
forma oval o cilndrica y su principal forma de reproduccin es la gemacin, se desarrollan
bien en hbitats con abundante azcar tales como frutas, flores, e incluso la corteza de los
rboles. Las levaduras tienen gran importancia biotecnolgica en la industria cervecera y de
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la panificacin y en la produccin de protena de origen unicelular (Biomasa). El principal


agente de la fermentacin alcohlica es Sacharomyces cerevisiae. Las setas son hongos
filamentosos pertenecientes a los Basidiomycetes que forman cuerpos fructferos
denominados setas y que producen basidiosporas como esporas sexuales. Una actividad
ecolgica muy importante de los Basidiomycetes, es la descomposicin de la madera, papel,
ropa y otros derivados de productos naturales. Estos Basidiomycetes, por tanto, son
capaces de producir Celulasas con actividades degradantes de lignina que utilizarn como
fuente de carbono y energa. Debido a que muchas setas como Pleurotus ostreatus, son
comestibles, su produccin en gran escala es una actividad econmicamente importante,
aunque las hay tambin venenosas como Amanita virosa y Amanita phalloides.
Cada hongo tiene ciertas caractersticas macro (morfologa colonial, pigmentacin) y
microscpicas (tipos de hifas, de conidias, etc.) que permiten clasificarlo.
Caracterstica macro y microscpicas de los principales gneros de hongos ambientales
1. Aspergillus
Caractersticas Macroscpicas: El color es la principal caracterstica macroscpica para la
identificacin de los grupos de aspergilos. Poseen distintos tonos de verde, pardo, amarillo,
blanco, gris y negro.
Caractersticas Microscpicas: Presenta un conidiforo erecto septado en cuya parte apical se
encuentran las cabezuelas conidiales que presentan bajo el microscopio cuatro formas
bsicas: globosa, radiada, columnar o claviforme. Los conidios constituyen cadenas
alrededor de la cabezuela y que se originan a partir de las filides.

Cabezuela hemisfrica
Cabezuela
globosa

Cadena de conidias

Filides
Cabezuela
claviforme

Hifa septada

Fig. 1. Gnero Aspergillus

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2. Penicillium
Caractersticas Macroscpicas: Las colonias del gnero Penicillium son circulares si no hay
impedimento alguno para su crecimiento. ste es generalmente blanco, pero en algunas
especies es amarillo, anaranjado, prpura o pardo claro. La superficie de la colonia madura,
o sea con sus conidios formados, puede ser: aterciopelada, ligeramente algodonosa o con
pequeos haces (fascculos) de conidiforos.
Caractersticas Microscpicas: Este gnero se caracteriza por formar conidias en una
estructura ramificada semejante a un pincel. Los filamentos o hifas alcanzan un dimetro
entre dos o tres micrmetros y tienen septos. Presenta conidiforo erecto en cuya parte
aplica se encuentras las filides distribuidas en varias ramificaciones. Los conidios son
esfricos o elipsoidales, unicelulares, hialinos que en masa se ven de color verde, verde
azulado, verde aceituna o gris. La pared de los conidios es lisa o rugosa segn las especies.

Filides muy ramificadas o


sin ramificacin
Cadena de conidias

Conidiforo

Fig. 2. Gnero Penicillium

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3. Rhizopus
Caractersticas macroscpicas: Colonias algodonosas laxas, que cubre completamente la
caja de Petri y logra empujar la tapa hacia arriba. Inicia de color blanco y se torna gris con
puntos negros que corresponden a los esporangios.
Caractersticas microscpicas: Hifas gruesas y aseptadas, abundantes rizoides prominentes
de color caf, de los que salen esporangiforos largos, no ramificados, de color caf, cada
uno con un esporangio caf con esporangiosporas espiculadas. Dependiendo de la especie
puede poseer estolones o puentes de comunicacin entre los rizoides.

Esporangio

Esporangiosporas
Esporangiosporas

Esporangiforo

Estoln
Rizoides

Fig. 3. Gnero Rhizopus


4. Mucor
Caractersticas macroscpicas: Colonias algodonosas laxas, que cubre completamente la
caja de Petri y logra empujar la tapa hacia arriba. Presenta colonias Amarillo marrn plido.
Caractersticas microscpicas: Presenta esporangiforos largos sin ramificar o cortos
ramificados que en ocasiones se curvan hacia abajo. Los esporangios son de color marrn
plido. Las esporangiosporas son de de forma elipsoidales y de pared lisa. Se distingue de
Rhizopus por la ausencia de rizoides.

Esporangio

Esporangiosporas

Esporangiforo

Estoln

Fig. 4. Gnero Mucor


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Objetivo:
- Aislar e identificar los principales hongos ambientales causantes del deterioro de los
alimentos de acuerdo a sus caractersticas macro y microscpicas.
Materiales y sustancias
- Placas Petri conteniendo medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (APD).
- Asa de Kohle
- Alambre de nicrn en punta
- Lminas portaobjetos
- Papel lente
- Alcohol 70
- Agua destilada estril.
- Colorante Azul algodn de Lacto-fenol
- Cinta scotch
- Mechero Bunsen
- Encendedor
- Microscopio
- Plumn marcador
- Diversos tipos de alimentos con visible desarrollo fngico en la superficie: frutos,
cereales, granos, hortalizas, pan, etc.
Procedimiento
I. Observacin directa de las estructuras vegetativas y reproductivas asexuales de los
hongos
1. A partir de las muestras de alimentos con desarrollo fngico sobre su superficie colocar
la parte adherente de un trozo de cinta scotch y presionar con cuidado para favorecer la
adhesin de las estructuras.
2. Colocar una gota del colorante azul de algodn de lacto-fenol sobre una lmina
portaobjeto.
3. Colocar sobre la gota del colorante el trozo de cinta scotch adhiriendo con cuidado las
estructuras fngicas previamente tomadas del alimento deteriorado.
4. Examinar al microscopio con objetivo de menor aumento para buscar estructuras
reproductivas representativas y posteriormente cambiar a un objetivo de mayor
aumento para observar con mejor detalle las caractersticas de las estructuras
seleccionadas procurando que stas presenten la arquitectura completa del hongo para
facilitar su identificacin.
5. Reconocer la morfologa que conforman parte del talo vegetativo: tipo de hifa septada o
cenoctica, estoln, rizoide, etc. y, del talo reproductivo asexuales: esporangiforo,
conidiforo, filides, esporangio, esporas, vescula o cabezuela, etc.
6. Realizar la Identificacin preliminar del gnero del hongo
7. Dibujar las observaciones realizadas

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II. Aislamiento en medio de cultivo de hongos a partir de los alimentos deteriorados


1. Seleccionar en el alimento deteriorado una zona con el desarrollo de un solo tipo de
hongo: pigmentacin, tipo de crecimiento del micelio (algodonoso, velloso, pulverulento,
etc.), etc.
2. Coger un pequeo trozo del micelio seleccionado con la ayuda del asa de kohle y
depositarlo en el centro de una placa Petri conteniendo APD. Realizar este proceso a la
altura del mechero bajo condiciones estrictas de esterilidad.
3. Rotular la placa Petri indicando el tipo de alimento utilizado.
4. Incubar por 7 das a temperatura ambiente.
5. Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores por muestra
de alimento utilizado.
6. Anotar las caractersticas de las colonias: Forma, aspecto del micelio (algodonoso,
velloso, pulverulento u otro), pigmentacin, elevacin, consistencia, etc.
7. Realizar la relacin con las estructuras reproductivas asexuales observadas al
microscopio para la identificacin del gnero del hongo observado.
8. Dibujar las observaciones realizadas.
9. Indicar el gnero del hongo observado.
Recomendaciones
Antes y despus del trabajo en el microscopio limpie los lentes de los objetivos y oculares
utilizando papel lente y alcohol de 70.
Cuestionario
1. Explicar cul es el mecanismo de accin de los gneros Aspergillus, Penicillium y Rhizopus
para causar el deterioro de los alimentos y mencionar ejemplos de alimentos que son
comnmente atacados por estos hongos.
2. Dibujar las estructuras vegetativas y reproductivas asexuales y/o sexuales de 3 hongos de
diferente gnero de importancia agroindustrial, diferentes a lo visto en la prctica.
3. Describir otra tcnica de aislamiento de hongos.
4. Mencionar la importancia de los hongos en Microbiologa Agroindustrial.
5. A qu se denomina micosis? Mencione dos de las ms importantes y haga hincapi en la
prevencin y el tratamiento.

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