Appostilas de Práticas de Microbiologia

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS UNIFAL-MG
INSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
MICROBIOLOGIA BSICA
Roteiro de aulas prticas
Professores da Disciplina no 2 Semestre de 2014
Amanda Latrcia Tranches Dias

Daniela Cristina de Macedo Vieira
Jorge Kleber Chavasco
Marlia Caixeta Franco Ariosa
Ana Carolina Padovan
Eliane de Oliveira Silva
NDICE
1- INTRODUO .................................................................................................................................. 3
2- NORMAS DE SEGURANA E TRABALHO NO LABORATRIO................................................. 6
3- MTODOS DE COLORAO EMPREGADOS EM BACTERIOLOGIA: ....................................... 8
SIMPLES, NEGATIVA E DE ESPOROS ............................................................................................... 8
4- MTODO DE COLORAO DIFERENCIAL DE GRAM .............................................................. 12
5- MTODO DE COLORAO PELA TCNICA DE ZIEHL-NEELSEN (LCOOL-CIDO
RESISTNCIA) .................................................................................................................................... 15
6- PREPARO DE MEIOS DE CULTURA ............................................................................................ 17
7- MTODOS FSICOS DE CONTROLE MICROBIANO ................................................................... 20
8- TCNICA DE ESTERILIZAO POR FILTRAO ..................................................................... 21
9- AVALIAO DA EFICINCIA DA AUTOCLAVE NA ESTERILIZAO .................................. 22
10- LAVAGEM DAS MOS ................................................................................................................ 23
11- AVALIAO DA AO ANTIMICROBIANA DE ANTISSPTICOS E DESINFETANTES ..... 25
12- TCNICAS DE INOCULAO DE BACTRIAS EM MEIOS DE CULTURAS ......................... 27
13- IDENTIFICAO DE COCOS GRAM-POSITIVOS ..................................................................... 30
14- IDENTIFICAO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS PROVAS BIOQUMICAS ......... 34
15- ANTIBIOGRAMA .......................................................................................................................... 40
16- PROPRIEDADE OLIGODINMICA DE METAIS ....................................................................... 43
17- ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS DO SOLO ....................................................................... 44
18- ALTERAES FENOTPICAS E GENOTPICAS ........................................................................ 45
19- UROCULTURA.............................................................................................................................. 47
20- ESTUDO DOS FUNGOS ANEMFILOS ...................................................................................... 50
21- MTODOS PARA O ESTUDO DE LEVEDURAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES ................. 53
1- INTRODUO
O conhecimento no material a ser fragmentado, as cincias se complementam e
vivendo esta totalidade que podemos compreender um pouco do funcionamento do universo.
A idia da criao de uma apostila de prticas de microbiologia surgiu com a finalidade
de facilitar o entendimento das prticas exercidas por um profissional de microbiologia dentro
de um laboratrio, mas importante deixar claro que teoria e prtica andam juntas e que,
normalmente, as aulas criadas tm resultados previsveis para o certo, o que no acontece em
um laboratrio. Porm, so estes resultados imprevisveis, que levam s grandes descobertas
e da que nasce a principal caracterstica de um pesquisador, a persistncia.
Importncia da Microbiologia
Seria muita pretenso de nossa parte achar que todas as pessoas que entram em
contato com a microbiologia tornem-se grandes amantes da rea. Porm, no podemos
minimizar a importncia desta cincia para o conhecimento geral dos profissionais das cincias
biolgicas e para os das demais reas.
Meu Deus, que maravilhas existem em uma criatura to pequena!, foi o relato de
Leeuwenhoek em sua carta enviada para a Society de Londres em 1693, quando visualizou
pela primeira vez os micro-organismos. Seres que fascinaram e ainda fascinam muitos
cientistas, importantes por estarem em praticamente todos os lugares que se pode imaginar,
gerando benefcios e malefcios para a sociedade.
A microbiologia, cincia que estuda a vida em miniatura, foi uma ferramenta criada pelos
estudiosos a fim de ampliar os conhecimentos do mundo microscpico. Os micro-organismos,
os seres minsculos, apesar do tamanho, so seres muito complexos, esto em todas as
partes do planeta, convivendo de forma harmnica ou no com o homem e outros seres,
fundamentais para a sobrevivncia na Terra. Participam ativamente de diversos ciclos
biogeoqumicos, devolvendo para o meio ambiente os nutrientes essenciais, alm de
auxiliarem na degradao da matria orgnica. Alm disso, atuam nos processos de
biolixiviao e biorremediao.
As indstrias, farmacuticas e alimentcias, principalmente, deleitam-se com a grande
capacidade desses seres produzirem metablitos importantes para a produo de suas
matrias primas.
Mas o aspecto mais importante e que deve sempre ser lembrado, que os microorganismos fazem parte da biosfera, so encontrados em quase todos os ecossistemas, sendo
assim, qualquer fator que provoque um desequilbrio em suas populaes, estar afetando
todo um ecossistema e, consequentemente, a biosfera.
Estudar para conhecer e preservar estas formas de vida a importante tarefa dos
microbiologistas, uma vez que ainda h muito que se descobrir sobre o universo dos microorganismos.
Alfenas MG
2004
Os Autores
Termos
empregados
no laboratrio
de
microbiologia
Micro-organismo - Grupo de organismos, procariontes ou eucariontes, cujas estruturas

morfolgicas so, geralmente, observadas ao microscpio ptico e crescem em uma ampla
faixa de temperatura.
Microbiota normal Conjunto de micro-organismos que vivem na pele ou em algumas
superfcies internas do corpo dos animais, inclusive o homem, que no causam mal ao
hospedeiro e esto altamente adaptados sobrevivncia e ao crescimento nessas reas.
Microbiota residente - Conjunto de micro-organismos que so encontrados regularmente em
um dado stio, sem causar doena.
Microbiota transitria - Conjunto de micro-organismos que se instalam temporariamente no
hospedeiro, podendo, com o tempo, desaparecer.
Desinfeco - Processo de eliminao de micro-organismos patognicos, em suas formas
vegetativas, de material inanimado pelo calor ou substncias qumicas. Exemplo: uso de
desinfetantes em salas cirrgicas.
Anti-sepsia - Processo de eliminao de micro-organismos patognicos, em suas formas
vegetativas, de tecidos vitalizados por substncias qumicas. Exemplo: uso de polivinil
pirrolidona iodo para lavagem das mos.
Assepsia - Conjunto de medidas que visam minimizar a entrada de micro-organismos num
local assptico, isto , onde no existam micro-organismos ou estejam em baixo nmero.
Exemplo: Utilizao de cabine de fluxo laminar para manipulao de culturas.
Esterilizao - Conjunto de medidas que levam a destruio total dos micro-organismos de
materiais inanimados podem ser empregados mtodos fsicos e qumicos. Exemplo:
autoclavagem de meios de cultura.
Flambagem - Ato de eliminao dos micro-organismos de materiais inanimados pela ao do
calor. Exemplo: ala de platina na chama do bico de gs.
Repicagem Transferncia do inculo de micro-organismos para um novo meio de cultura.
Meio de cultura a fonte de nutrientes essenciais, necessria para o crescimento dos microorganismos.
4
Esfregao - Camada de clulas de micro-organismos espalhada uniformemente na rea

central da lmina de vidro (limpa).
Inoculao Introduo de um micro-organismo em um meio de cultura.
Incubao Exposio temporria de um micro-organismo em condies fsicas e qumicas
ideais para o seu crescimento.
Membrana filtrante ou Millipore - Filtros de celulose com dimetros de poros variados,
suficientes para reter os micro-organismos. Usados para a filtrao de substncias termolbeis
como soro, antibiticos, vitaminas, colrios.
Apresentao de equipamentos e materiais utilizados no laboratrio de microbiologia
Materiais:
Equipamentos:
Ala e agulha de platina
Autoclave
Bico de Bunsen
Banho Maria
Cemitrio
Centrifuga
Descarte
Cabine de fluxo
Lmina
Esterilizador de ala
Lamnula
Estufas
Pra
Leitor de Microplacas (Elisa)
Placa de Petri
Liofilizador
Pipetas
Microscpio
Pipetas semi-automticas
Microondas
PVPI
pHmetro
Recipiente de sulfocrmica
Shaker
Suporte de pipetas
Termmetro
Tubo
2- NORMAS DE SEGURANA E TRABALHO NO LABORATRIO

Nas aulas prticas trabalharemos, muitas vezes, com micro-organismos patognicos
para o ser humano. Por isso, torna-se necessrio adotarmos medidas preventivas de
segurana, para evitar possveis contaminaes:
1. Observe o horrio de incio das aulas prticas, a fim de evitar contratempos na
execuo dos trabalhos estipulados;
2. obrigatrio o uso do avental, luvas e culos de proteo em todo trabalho prtico onde
h riscos de contaminao microbiana;
3. No permitido fumar, comer ou beber no ambiente do Laboratrio;
4. Evite tocar os olhos, boca ou nariz com as mos;
5. No faa uso de lenos ou avental para limpar objetos ou instrumentos de trabalho,
principalmente a objetiva do microscpio.
6. Lave sempre as mos aps manusear culturas ou materiais contaminados com microorganismos, patognicos ou no;
7. Comunique imediatamente ao responsvel, qualquer suspeita de haver contrado
enfermidade como conseqncia de infeco no Laboratrio;
8. Trabalhe sempre de maneira ordenada, tranqila, constante e metdica;
9. Evite conversas desnecessrias, principalmente com as pessoas que estejam
trabalhando, pois a concentrao indispensvel para o sucesso da atividade prtica;
10. Anote todos os detalhes da atividade prtica para a elaborao do relatrio;
11. Limpe e desinfete a superfcie da bancada de trabalho antes e aps o trabalho de cada
dia;
12. No caso de derramamento acidental de material contaminado com micro-organismos,
desinfete imediatamente o local;
13. Tome cuidado na pipetagem de soros, solues antignicas ou suspenses de microorganismos, utilizando para tal propsito pipetas semi-automticas (no use pipetagem
com a boca);
14. Flambe a boca de tubos de ensaio ou outros frascos que contenham culturas, aps a
retirada de tampas ou tampes de algodo e, tambm, antes de recoloc-los;
15. No coloque de qualquer modo sobre a mesa o instrumental, alas e agulhas de platina,
aps ter sido utilizado; esterilize-o antes de guard-lo. H um cemitrio para as placas
e tubos contaminados e depsito prprio para pipetas, lminas e lamnulas
contaminadas. Algodo, gaze, papel-toalha e papel de filtro, quando no contaminados,
devero ir para a lata de lixo; quando contaminados, devero ir para o saco branco,
apropriado para esta finalidade.
16. Nunca deixe placas de Petri e tubos de ensaio abertos desnecessariamente sobre a
bancada;
17. Antes de acender o bico de Bunsen, verifique se a entrada de ar est na posio
correta; risque o fsforo e abra a chama convenientemente. Para desligar, feche
primeiro o registro da bancada, espere at esgotar todo o gs e, ento feche o registro
do bico de Bunsen;
18. Aps a utilizao do microscpio, diminua ao mnimo a intensidade de iluminao,
desligue-o, coloque-o na posio inicial, retire a lmina e limpe suas objetivas com
papel da bancada ou leno de papel, sem esfregar at que retire todo o leo;
19. No retire ou fornea qualquer cultivo ou material do laboratrio sem a prvia
autorizao dos responsveis pelo mesmo;
20. Utilize todo material com o mximo de cuidado e ateno a fim de evitar perdas
desnecessrias;
21. No deixe, desnecessariamente, abertas as portas de armrios, geladeiras e estufas.
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22. Aps a utilizao de reagentes e solues, retorne os frascos aos seus locais de
origem;
23. Antes de conectar qualquer aparelho a tomada, verifique se a voltagem a correta;
24. Qualquer dvida sobre o seu modo de agir no Laboratrio esclarea com os
responsveis pelo mesmo;
25. Ao sair do Laboratrio no final da jornada de trabalho, verifique se no h aparelhos e
lmpadas ligados desnecessariamente.
3- MTODOS DE COLORAO EMPREGADOS EM BACTERIOLOGIA:

SIMPLES, NEGATIVA E DE ESPOROS
A visualizao de bactrias aps o emprego de mtodos de colorao foi introduzida por

Robert Koch em 1876, baseando-se em observaes anteriormente feitas por Goeppert &
Cohn em 1849.
Os corantes quanto origem podem ser classificados como naturais e artificiais. Quanto
natureza qumica os artificiais so classificados em cidos, bsicos e neutros. Dentre os
corantes naturais temos o carmin e a hematoxilina. J entre os corantes artificiais podem ser
destacados os seguintes:
Corantes bsicos: cristal violeta, violeta de genciana, azul de metileno, fucsina bsica,
verde malaquita, etc.
Corantes cidos: Fluorescena, eosina, vermelho do congo, etc.
O corante possui um cromforo que pode ser negativo (corante cido ou aninicos) ou
positivo (corante bsico ou catinico).
Os corantes cidos tm forte afinidade por constituintes positivos da clula como as
protenas. Os corantes bsicos tm afinidade por constituintes negativos da clula, como os
cidos nuclicos e componentes da parede celular. Estes ltimos so ideais para corar
bactrias, pois o cido nuclico est disperso no citoplasma.
As principais etapas do preparo de um espcime microbiano corado para exame
microscpico so: confeco de um esfregao a partir de uma camada fina do espcime sobre
uma lmina de vidro, fixao do esfregao lmina, normalmente pelo calor e colorao com
um ou mais corantes.
A colorao simples utilizada para visualizar tipos morfolgicos e arranjos celulares.
Neste processo o esfregao corado por um nico reagente. Corantes bsicos so os
preferidos. Os mais utilizados so o azul de metileno, cristal violeta ou a fucsina carblica.
A colorao negativa indicada em situaes especiais, tais como a necessidade de
observar a clula sem distores, pois no h fixao pelo calor, ou ainda, observar
microscopicamente micro-organismos tnues e difceis de corar, como o caso dos espirilos.
Emprega-se corante acdico, tal como a eosina ou a nigrosina. O corante cido, com sua
poro cromgena carregada negativamente, no penetra na clula devido carga negativa
da superfcie da mesma. A clula aps o processo aparecer no corada contra fundo escuro
(fortemente corado).
Colorao de esporos: espcies de bactrias anaerbicas dos gneros Clostridium e
Bacillus, so exemplos de organismos que tem a capacidade de existir tanto na forma
metabolicamente ativa denominada de clula vegetativa, como tambm em clulas inativas
chamadas de esporos. Essa estrutura intracelular formada quando as condies ambientais
tornam-se desfavorveis para manter a atividade da clula vegetativa.
O esporo constitudo por uma parede (composta de peptidoglicano e dipicolnato de clcio), o
crtex (composto de peptidoglicano com ligaes menos rgidas), uma capa (composta de
protenas rica em ligaes dissulfetos intramoleculares) e exsporo (membrana lipoprotica
que contm aminoaucares. A capa do esporo confere resistncia a agentes qumicos).
Devido sua estrutura, o esporo resistente a efeitos deletrios como o calor excessivo,
radiaes, ao de agentes qumicos, etc. Quando as condies ambientais tornam-se
favorveis, o esporo germina, assumindo a forma vegetativa da bactria.
O mtodo de colorao de esporos de Wirtz-Conklin baseia-se no grau de afinidade que
a estrutrura do esporo possui ao corante. Nesse mtodo, usado o verde de malaquita a
quente como corante principal. Devido ao drstica do calor sobre a clula e o esporo h
penetrao do verde-malaquita. No esporo o corante resiste a lavagem com gua, porm, as
estruturas vegetativas (clulas) no retm esse corante e se descoram. Em seguida usada a
safranina, como corante de contraste, que cora a estrutura vegetativa de vermelho ou rsea.
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Atividades Prticas
Preparo dos esfregaos de micro-organismos
Limpe a lmina de vidro com papel, flambe-a e deixe esfriar a temperatura ambiente;
Esterilize a ala de repicagem;
Aguarde at a ala esfriar;
Se a cultura estiver em meio liquido, transfira uma gota da cultura para o centro da
lmina. Se a cultura estiver em meio slido, transfira uma gota pequena de gua para o
centro da lmina e em seguida, com auxlio da ala (esterilizada) retire uma pequena
poro, tocando levemente na superfcie do meio de cultura;
Espalhe a cultura sobre a parte central da lmina e deixe o esfregao secar ao ar;
Passe a parte de baixo da lmina sobre a chama por trs vezes para fixar o esfregao;
Deixe a lmina esfriar. Identifique-a com lpis de cera na parte superior (com um
nmero). Circule o esfregao pelo lado inverso da lmina.
Colorao simples
Preparar o esfregao segundo tcnica acima, utilizando cultura de micro-organismo j

identificado (padro*).
Cobrir o esfregao com a soluo de um corante e deixar o tempo estipulado. Se
empregar azul de metileno deixar 2 minutos, cristal violeta: 1 minuto e fucsina carblica:
30 Segundos, Lavar a lmina em gua corrente e deixar secar ao ar;
Observar em microscpio com objetiva de imerso (100x).
Anotar os resultados.
Interpretao dos resultados: Observar a forma e o arranjo, em seguida desenhar.
Culturas padres:
Staphylococcus aureus e Bacillus cereus.
Forma
Arranjo
Colorao negativa
Colocar uma pequena gota de eosina a 2%, sobre a superfcie de lmina de vidro;
Transferir para a lmina, com o auxlio de ala de platina, pequena poro da cultura de
Bacillus cereus. Homogeneizar com a prpria ala de platina, procurando espalhar o
material na regio central da lmina; Secar ao ar;
Examinar em microscpio com objetiva de imerso (100x). Leveduras devero ser
observadas com objetiva a seco (40x);
Anotar os resultados.
Interpretao dos resultados: Observar e desenhar a forma e o arranjo.
Forma
Arranjo
Colorao de esporos
Preparar esfregao a partir da cultura de 48-72 horas de Bacillus cereus.

Cobrir o esfregao com soluo de verde malaquita a 5% em gua destilada e deixar a
lmina sobre a superfcie de placa aquecida durante 3 minutos, tendo o cuidado de no
deixar ferver o corante. Colocar poucas lminas de cada vez. Podemos utilizar tambm
o aquecimento pela ao direta de uma chama;
Lavar a lmina em gua corrente;
Cobrir o esfregao com soluo de safranina durante 30 segundos. Escorrer o corante e
lavar em gua corrente;
Secar a lmina e observar em microscopia de imerso.(100X)
Interpretao dos resultados: Observar a forma e o arranjo, em seguida desenhar.
Forma
Arranjo
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Materiais utilizados para execuo das tcnicas de colorao:

Lminas de vidro, corantes, leo de imerso, placa de aquecimento, culturas de microorganismos.
Normas para a observao de micro-organismos ao microscpio ptico
Oculares
Prisma
Revlver
Objetivas
Platina
Lmpada
Brao
Mesa de platina
Boto macromtrico
Boto micromtrico
Condensador
Base
Gire o revlver (sem segurar nas objetivas), encaixando a objetiva de menor aumento
(4X);
Coloque a lmina sobre a platina, prenda-a com a presilha;
Verifique se o boto de intensidade luminosa est no mnimo;
Acenda a luz do microscpio;
Regule a quantidade de luz utilizando o diafragma e abaixando o condensador;
Movimente o boto macromtrico at seu ponto mximo levantando a platina;
Olhando pela ocular e utilizando o parafuso macromtrico, abaixe lentamente a platina
at focalizar o material. Utilize o micromtrico para corrigir a focalizao;
Observao: Certifique-se de que o material foi focalizado, movimentando o charriot.
Encaixe a objetiva de 10 X e focalize com auxlio do boto micromtrico;
Selecione com o charriot uma rea contendo micro-organismos;
Coloque uma pequena gota de leo de imerso sobre a lmina no local onde a objetiva
de 100X ser colocada (sob o feixe luminoso); Encaixe a objetiva de 100 X. Suba
cuidadosamente a platina com o macromtrico at encostar na objetiva de imerso;
Olhando pela ocular e utilizando o parafuso macromtrico abaixe a platina at focalizar
o material;
Anote seus resultados
Para desligar o microscpio diminua a intensidade luminosa, desligue o fio da tomada.
Gire o revlver, encaixando a objetiva de menor aumento e limpe a objetiva de imerso
com papel higinico. Coloque a capa no microscpio.
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4 - MTODO DE COLORAO DIFERENCIAL DE GRAM

O mtodo de colorao diferencial de Gram foi descrito em 1884 pelo mdico
dinamarqus Hans Christian Joachin Gram. Sua finalidade facilitar a observao
microscpica das bactrias e separ-las em dois grupos, segundo a cor revelada pelas
mesmas ao final do processo de colorao. O mtodo no se aplica a todas as espcies de
bactrias, alm disso, no um mtodo diferencial para fungos, uma vez que todos eles so
Gram positivos.
O processo de colorao iniciado com a aplicao de um corante primrio (cristal
violeta) sobre o esfregao, cuja funo corar todas as clulas bacterianas pertencentes aos
dois grupos. A seguir aplica-se o lugol, que forma um complexo insolvel e de difcil remoo,
atravs de ligaes com o corante primrio. Em seguida, aplica-se o descorante (lcool e
acetona). Dependendo da composio qumica dos componentes celulares, o agente da
descolorao pode ou no remover da clula o complexo formado pelo corante primrio da
clula. Finalmente, aplicado o corante final (fucsina ou safranina), que tem cor contrastante
em relao ao corante primrio. Se o corante primrio no for removido aps o processo de
descolorao o corante final no ser absorvido, neste caso a clula retm a cor inicial (roxo).
Quando ocorre a remoo do complexo formado pelo corante primrio e lugol, os
componentes celulares descorados assumem a cor do corante final (vermelho).
Atividades Prticas
Tcnica da colorao:
Preparar o esfregao em lmina de vidro, conforme procedimentos detalhados

anteriormente;
Coloque a lmina sobre o suporte e cubra toda a regio do esfregao com cristal violeta.
Aguardar 1 minuto; escorrer o corante, no sendo necessrio lavar a lmina em gua
corrente.
Cobrir o esfregao com soluo de Lugol. Aguardar 1 minuto; escorrer o lugol, no
sendo necessrio lavar a lmina em gua corrente.
Com a lmina inclinada, proceder a descolorao com lcool Acetona, gotejar o
descorante, por tempo rpido (mximo 3 segundos). Lavar em filete de gua corrente;
Cobrir o esfregao com soluo de fucsina. Aguardar 30 segundos; Lavar em filete de
gua corrente;
Secar a lmina ao ar e examin-la microscopicamente, empregando objetiva de imerso
(100 X), conforme instrues do roteiro de normas para a observao de microorganismo ao microscpio ptico.
Anotar os resultados: clulas coradas em roxo: Gram positivas, clulas coradas em
vermelho: Gram negativas.
Culturas Empregadas:
Staphylococcus aureus, Streptococccus pyogenes, Proteus mirabilis.
Interpretao dos resultados: Observar a forma, o arranjo e o comportamento

cromognico da clula frente ao mtodo de Gram.
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Micro-organismo 1:_________________________________________
Forma
Arranjo
Colorao
Micro-organismo 2: ___________________________________________
Forma
Arranjo
Colorao
Micro-organismo 3: ___________________________________________
Forma
Arranjo
Colorao
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Anexos
Composio das solues utilizadas na colorao diferencial de GRAM
Soluo Estoque de cristal violeta do Gram
cristal violeta
etanol
20g
100 mL
Soluo de oxalato de amnio 1%

oxalato de amnio
gua destilada
1g
100 mL
Soluo de uso do cristal violeta

cristal violeta (estoque)
soluo de oxalato de amnio 1%
gua destilada
1 mL
40 mL
10 mL
Soluo de iodo-iodeto (lugol)

iodo metlico
iodeto de potssio
bicarbonato de sdio
gua destilada
1g
2g
3g
300 mL
Soluo para descolorao

mistura v/v de acetona e etanol 95%
Soluo estoque de safranina
safranina
etanol 95%
2g
100 mL
Soluo de uso da safranina

Misturar 1 parte da soluo estoque com 5 partes de gua destilada.
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5- MTODO DE COLORAO PELA TCNICA DE ZIEHL-NEELSEN (LCOOL-CIDO

RESISTNCIA)
A maioria das espcies bacterianas corada por mtodos simples ou pela tcnica de
Gram. Porm, espcies de alguns gneros, particularmente Mycobacterium, so resistentes
colorao por tais mtodos, podendo, entretanto, ser visualizadas pelo mtodo de ZiehlNeelsen.
As micobactrias possuem fina camada de cera de natureza lipdica, denominada de
cera D, envolvendo a parede celular. A cera D dificulta a penetrao de corantes, tais como o
cristal violeta e o azul de metileno.
A fucsina carblica (corante primrio) um derivado fenlico que solvel em material
lipdico da parede celular de micobactrias. A penetrao desse corante, atravs da camada
lipdica (cera) em direo ao citoplasma, facilitada pela aplicao de calor. Aps esse
tratamento, todas as clulas bacterianas, possuindo ou no cera D, so coradas de vermelho.
A fucsina carblica no pode ser removida das micobactrias, mesmo que sejam utilizados
processos drsticos, tal como o tratamento com solues lcool-cidas (descorante). Devido a
essa propriedade, estes micro-organismos so denominados de bacilos lcool-cido
resistentes (BAAR) e continuam corados de vermelho. Porm, a aplicao de mistura de lcool
etlico e cido clordrico (descorante) remove o corante de todas as bactrias que no
possuem a camada de cera D, tornando-as incolores. Para a visualizao dessas bactrias
utilizado um corante de contraste, o azul de metileno, que cora as clulas de azul.
Atividade Prtica
Preparar esfregaos empregando clulas mortas de BCG (Bacilos de Calmete Guerin)
Cobrir o esfregao com soluo de fucsina carblica (Ziehl). Com auxlio de chumao de
algodo embebido em lcool, aquecer a lmina at a emisso de vapores, no deixando
a lmina secar, adicionando mais corante. O processo de aquecimento dever durar
cerca de 5 minutos;
Lavar a lmina em gua corrente;
Descorar o esfregao com soluo de lcool-cido clordrico, adicionando o descorante

gota a gota, at que no remova mais corante;
Lavar novamente a lmina em gua corrente;
Cobrir o esfregao com soluo de azul de metileno durante 2 minutos;
Lavar a lmina, secar e observar em microscopia de imerso (objetiva 100X), conforme

instrues do roteiro de normas para a observao de micro-organismo ao microscpio
ptico.
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Interpretao dos resultados observados na lmina

Bacilos corados em vermelho: Positivo para a tcnica de BAAR
Bacilos corados em azul: Negativo para a tcnica de BAAR
Forma
Arranjo
Colorao
Anexos
Reagentes
1 - Fucsina carblica (Fucsina de Ziehl)
Soluo A
Fucsina bsica
lcool etlico
0,3 g
10 mL
Soluo B
Fenol
gua destilada
5g
10 mL
Misturar as solues A e B.
2 - Mistura lcool-cido (Descorante)

lcool etlico 95%
cido clordrico concentrado
97 mL
3 mL
3 - Azul de Metileno
Azul de metileno
gua destilada
0,3 g
100 mL
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6- PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
A composio dos meios de cultura utilizados para o crescimento dos micro-organismos

no laboratrio, normalmente, possui grande parte dos nutrientes disponveis no habitat natural
dos mesmos e devem possuir todos os elementos que compem a clula, tais como C, N, P,
O, H, S, etc.
Alguns micro-organismos podem viver da matria orgnica morta (saprfitas), outros
parasitando os organismos vivos.
Os meios podem ser slidos, lquidos, semi-slidos ou bifsicos. Os lquidos so usados
para produo de biomassa, em fermentao e em estudos de crescimento. Os slidos para
isolamento do micro-organismo e contagem do nmero de clulas. Os semi-slidos para
estudos de motilidade e para deteco de placas de lise em culturas bacterianas infectadas
por vrus. Os bifsicos para hemocultura (tcnica destinada a evidenciar os micrbios acaso
existentes no sangue, e que consiste em pr certa quantidade de sangue em meio nutritivo
apropriado proliferao deles). O agente solidificante do meio de cultura o gar, que possui
a propriedade de se fundir a 96C e solidificar a 45C.
So encontradas algumas denominaes especiais dos meios de cultura, relacionadas
sua composio ou funo. Temos meios sintticos, como o meio mnimo que fornece
somente os nutrientes essenciais ao desenvolvimento celular. O meio diferencial contm
substncias que permitem diferenciar grupos de micro-organismos. O meio de enriquecimento
favorece determinadas populaes que tero maior nmero de clulas, enquanto o meio
seletivo possui substncias (antibiticos) que inibem o crescimento de determinadas
populaes.
Alguns fatores fsicos interferem no crescimento microbiano: pH, temperatura, oxignio,
luz e salinidade. Esses devem ser considerados quando o micro-organismo for cultivado no
laboratrio. Para a maioria das bactrias o pH timo de crescimento varia entre 6,5 a 7,5.
Atividades Prticas
1. Preparo de alguns meios de cultura
Preparar os meios de cultura conforme demonstrado pelo instrutor e seguindo as instrues
abaixo:
Bancada 1 Preparar 100 mL de gar BHI (conforme instrues do rtulo) e distribuir 7 mL em
tubos mdios. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em um recipiente de
plstico. Embalar e identificar os materiais;
Bancada 2 Preparar 100 mL de gar nutriente (conforme instrues do rtulo) e transferir 16
mL para tubos grandes. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em um
recipiente de plstico. Embalar 6 placas de Petri. Embalar e identificar os materiais;
Bancada 3 Preparar 50 mL de caldo BHI (conforme instrues do rtulo) e distribuir 3 mL em
tubos pequenos. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em um recipiente
de plstico. Embalar e identificar os materiais;
Bancada 4 Preparar 100 mL de gar Nutriente (conforme instrues do rtulo). Colocar em
balo e fechar com tampo. Embalar 6 placas de Petri. Embalar e identificar os materiais;
17
2. Esterilizao dos meios

O meio de cultura e as placas de Petri sero esterilizados, em autoclave a 120 C por 15
minutos a 1 atmosfera. Posteriormente 15 mL de gar nutriente, preparado pelos alunos da
bancada 1, sero vertidos na placas de Petri. Os tubos preparados pelos alunos da bancada 4
sero colocados para solidificar na posio inclinada.
3. Armazenamento dos meios

O meio, aps seu preparo e esterilizao, deve ficar temperatura ambiente at seu
resfriamento e, posteriormente, ser armazenado em geladeira devidamente identificado (nome
do meio, data de fabricao, etc.) de uma forma clara a fim de que mesmo um estranho ao
laboratrio possa identific-lo.
Composio dos meios de cultura

a - gar Nutriente ou gar Simples
Peptona
Extrato de carne
gar
gua destilada
5,0 g
3,0 g
15,0 g
1.000 mL
1. Em balo acrescentar os componente do meio em 100 mL de gua destilada.

2. Aquecer com agitaes freqentes e ferver por 1 minuto para a dissoluo completa.
3. Distribuir em recipientes apropriados e autoclavar a 121C por 15 minutos.
b - Caldo Nutriente ou Caldo Simples
Composio e preparo como mencionado em a, sem a presena de gar.
c- Agar BHI
O meio comercialmente fornecido desidratado (p). Sua composio aproximada a
seguinte:
Frmula por litro
Infuso de crebro e corao
Tecido animal enzimaticamente digerido
Caseina hidrolizada
16 g
Dextrose
Cloreto de sdio
Fosfato dissdico
Agar
8g
5g
2g
5g
2.5 g
13.5 g
O pH final deve ser ajustado a 7.4 0.2 a 25C

A frmula pode ser ajustada e/ou suplementada de acordo com as exigncias da cultura..
1. Suspender do meio desidratado uma quantidade suficiente para 100 mL de gua destilada.
2. Aquecer com agitaes freqentes e ferver por 1 minuto para a dissoluo completa do
18

d - Caldo BHI
Composio e preparo como mencionado em c, sem a presena de gar.
e- Base para o Agar Sangue
Frmula por litro:
Peptona
Digesto de fgado bovino
Extrato de levedura
Cloreto de sdio
Agar
15 g
2,5 g
5g
5g
12 g
1. Pesar uma quantidade do meio desidratado suficiente para 100 mL de gua destilada.
2. Aquecer com agitaes freqentes e ferver por 1 minuto para a dissoluo completa do
19
7- MTODOS FSICOS DE CONTROLE MICROBIANO

1- Calor
1.1- mido: Autoclave
Materiais: Balo com meio slido, caixa de ponteira, balo com gua, tubo limpos.
Lminas usadas, tubos com micro-organismos - descarte.
1.2- Seco:
Estufa de esterilizao (ar quente)
Pipeta de vidro, placa de petri, utenslios (pina, esptula) limpos.
Chama direta
Bico de bunsen, ala de platina e balo.
2- Filtrao
Substncias liqudas
Material: membrana filtrante, seringa, gua contaminada, p (antibitico ou similar), eppendorf,
placas;
micro-organismos pelo sistema HEPA: cmara de fluxo;
gua pelo sistema milli-Q
3- Baixa temperatura: freezer e ultrafreezer
4- Alta presso
5- Dissecao: liofilizador
6- Presso osmtica
7- Radiao
7.1- Ionizante: raios gama, raio X - Material: placa de petri descartvel, seringa, luvas, cateter
7.2- No ionizante: raio U.V - Exemplo: cmara de fluxo laminar.
Mtodos Qumicos de Controle Microbiano

Tipos de desinfetantes
fenol
bifenol
biguanidas
halognios: PVPI
lcoois: etanol e isopropanol
metais pesados: nitrato de prata
antibiticos: tubo com antibitico
20
8 - TCNICA DE ESTERILIZAO POR FILTRAO

Exame microbiolgico da gua com membrana filtrante
Os mtodos de esterilizao empregados em microbiologia utilizam temperatura,
radiao ou filtrao para eliminao do micro-organismo de materiais, instrumentos, meios de
cultura, solues ou, ainda, para impedir sua liberao ou penetrao num determinado
ambiente.
Em 1884 Charles Chamberland descreveu o uso de um filtro de porcelana porosa para
remover bactrias da gua potvel.
Os filtros existentes so de porcelana porosa, vidro sinterizado ou de celulose.
Os filtros de partculas de ar de alta eficincia (HEPA) so usados nas cabines de
segurana biolgica e salas de cirurgia. So de celulose e foram desenvolvidos para promover
segurana contra aerossis contaminados, retendo quase 100% dos micro-organismos
manipulados na cmara.
Normalmente so usadas para a filtrao de substncias que so termolbeis como
soro, antibiticos, vitaminas, colrios, etc. Aps a filtrao, o liquido j estril deve ser coletado
em um recipiente limpo e estril. Como elas no conseguem reter os vrus, elas so usadas
para separ-los de outros micro-organismos, permitindo assim seu isolamento para estudos
posteriores.
A capacidade das membranas filtrantes de reterem os micro-organismos sem mat-los
faz com que elas possam ser utilizadas para exames microbiolgicos de lquidos. A membrana
concentra os micro-organismos de um grande volume de amostra. A tcnica sensvel para
lquidos com pequena contaminao.
Atividade Prtica
1.
2.
3.
4.
Esterilizar por autoclave um conjunto para filtrao de lquidos;

Acoplar uma membrana filtrante 0,2 estril na base do conjunto;
Conectar o conjunto na bomba a vcuo;
Com auxilio de ala de platina transferir um pouco de gua (ou leite) no filtrado
para o meio de cultura fazendo estrias;
5. Colocar 100 ml de gua (leite) sobre o recipiente;
6. Ligar bomba de vcuo (presso negativa) e aps filtrao deslig-la;
7. Colocar a membrana filtrante sobre o meio de cultura de uma placa de petri;
8. Com auxilio de ala de platina transferir um pouco de gua (ou leite) filtrado para o
meio de cultura fazendo estrias;
9. Incubar as placas de petri a 37C por 28-24 h;
10. Observar resultados:
Membrana filtrante: crescimento de colnias de micro-organismos.
Placa com gua (leite) no filtrada: crescimento de colnias de microorganismos
Placa com gua (leite) filtrada: ausncia de crescimento.
21
9- AVALIAO DA EFICINCIA DA AUTOCLAVE NA ESTERILIZAO
O processo de esterilizao atravs do uso da autoclave obtido aps 15 minutos a

121C. O mtodo muito utilizado na esterilizao de materiais cirrgicos, meios de cultura
etc. Dada a sua constante utilizao no laboratrio, torna-se necessrio verificar
periodicamente a sua eficincia. Tal verificao pode ser realizada utilizando bioindicador.
Robert Koch utilizava como bioindicador, esporos de Bacillus anthracis, os quais so
destrudos a 121 C em 15 minutos. Na atualidade, utilizam-se espcies de bactrias no
patognicas com resistncia trmica conhecida, como por exemplo esporos do Geobacillus
sthearothermophilus que so destrudos em autoclave a 121 C aps 15 minutos.
STERIKONR, bioindicador da MERCK, composto por ampola que contm caldo
nutriente, acares (glicose), indicador de pH (prpura de bromocresol) e esporos do
Geobacillus sthearothermophilus (ATCC 7953) no patognico.
FUNDAMENTO: Devido a termo-resistncia dos esporos quando aquecidos em vapor
sob presso, s sero destrudos a temperatura de 121 C por 15 minutos. Se houver
esterilizao, no haver crescimento posterior do Geobacillus sthearothermophilus. Caso
contrrio, ocorrer seu desenvolvimento.
Procedimento:
colocar ampola contendo esporos de Geobacillus sthearothermophilus junto com o

material a esterilizar;
realizar o processo a 121 C por 15 minutos;
aps a autoclavagem, incubar a ampola, juntamente com uma ampola controle (que no
sofreu o processo de autoclavao), em banho-maria a 56 C; por 24-48 horas;
aps tal procedimento, realizar a interpretao do teste.
Interpretao
Ocorrendo a esterilizao, a soluo contida na ampola permanecer violeta, no
havendo mudana do indicador (prpura de bromocresol).
No ocorrendo esterilizao, os esporos se transformaro em bactrias ativas (formas
vegetativas), turvando o caldo. A fermentaro da glicose com a conseqente produo de
cido, modificar o indicador tornando a soluo amarela.
O uso de fitas reativas para verificar a autoclavao:
So fitas adesivas empregadas para selar volumes que sero submetidos ao da
autoclave. Estas fitas contem substncia qumica que muda da cor branca para vrios tons de
castanho, at ao negro, de acordo com o grau de aquecimento a que foi submetida. til para
nos revelar que o material atingiu certa temperatura, mas no indica que o mesmo est
estril. As fitas indicadoras auxiliam na diferenciao dos pacotes que j passaram pelo
processo de esterilizao, evitando que pacotes no processados sejam utilizados.
Ao trmino de um procedimento correto de esterilizao, os produtos no interior da
autoclave estaro esterilizados. O ar da sala contm partculas de poeira que podem conter
micro-organismos. Logo, ao remover a carga da autoclave, esta ser superficialmente
contaminada. Alm do mais, normalmente os artigos esterilizados so armazenados por algum
tempo antes de serem utilizados. O material deve ser acondicionado em embalagens para
evitar a recontaminao aps a esterilizao. Ao mesmo tempo, o material da embalagem
deve ser adequado para permitir a esterilizao dos artigos contidos dentro da mesma.
22
10 - LAVAGEM DAS MOS

As mos devem ser lavadas antes e aps todo e qualquer procedimento. a lavagem
das mos que evita a infeco cruzada, ou seja, a veiculao de micro-organismos. A lavagem
das mos, tem por finalidade: diminuir o nmero de micro-organismos; eliminar sujidade,
substncias txicas e medicamentosas; evitar a disseminao de doenas; proteger a sade
do profissional.
As mos devem ser lavadas: sempre que entrar ou sair da Unidade de Internao;
sempre que estiverem sujas; antes e aps contato com o paciente; aps contato com fonte de
micro-organismo (secrees e fluidos corporais); sempre que manipular materiais ou
equipamentos que esto ou estiveram conectados a pacientes; antes e aps o preparo de
medicaes, de materiais ou equipamentos.
O Iodo um agente microbicida de alta eficincia contra todas as espcies de bactrias,
e tambm esporicida, fungicida, viricida e amebicida. utilizado como um agente anti-sptico
na forma de tintura de iodo. tambm utilizado na forma de substncias denominadas
iodforos, que so complexos de iodo com compostos que atuam como carreadores e agentes
solubilizadores do iodo, como a polivinilpirrolidona. Os iodforos so germicidas e no coram e
nem irritam a pele. O filme protetor proporcionado pelo PVPI faz com que o iodo seja liberado
gradativamente, tornando seu efeito germicida mais prolongado. Mesmo aps vrias
aplicaes, o efeito residual no provoca irritao. Indicado na anti-sepsia e degermao das
mos e dos antebraos da equipe cirrgica, laboratorial, ambulatorial e no preparo do campo
operatrio.
O Mecanismo de ao no completamente conhecido, mas acredita-se na
halogenao da tirosina e inativao de enzimas.
O lcool um desinfetante e anti-sptico, que possui de 70 a 90 % de eficincia contra
clulas vegetativas. As propriedades bactericidas aumentam com a cadeia de C. No
eficiente contra esporos (Bacillus anthracis). Mecanismo de ao: solvente de lipdeos,
desnaturao e coagulao de protenas.
Tcnica da lavagem das mos com gua e detergente
1- abrir a torneira;
2- molhar as mos;
3- passar o sabo;
4- friccionar bem;
5- passar as mos ensaboadas sobre a torneira;
6- conserva-la aberta;
7- proceder assim:
- palma com palma
- palma no dorso da mo (incluso entre os dedos)
- dorso na palma (incluso os dedos)
- ponta dos dedos
- polegares
- costas das mos
- unhas.
8- esfregar os punhos de maneira circular, at a metade do antebrao;
9- Enxaguar as mos e com as mos em concha, jogar gua sobre a torneira;
10- pegar o papel toalha estril e secar as mos;
11- com o mesmo papel, secar a torneira e fech-la.
23
Tcnica da lavagem das mos com Polivinilpirrolidona-Iodo 10% (PVPI)

Proceder conforme tcnica de lavagem das mos, porm, usar PVPI em vez de detergente.
Tcnica da lavagem das mos com lcool

Proceder conforme tcnica de lavagem das mos, porm, usar lcool em vez de detergente.
Atividade prtica:
Aluno da bancada 1:
1- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (gar nutriente) da placa de petri;
2- Lavar as mos com gua corrente e gua destilada, enxugar com papel toalha estril;
3- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (gar nutriente) da placa de petri.
Aluno da bancada 2:
5- Lavar as mos com gua e detergente conforme tcnica descrita acima;
Aluno da bancada 3:
8- Lavar as mos com PVPI conforme tcnica descrita acima;
Aluno da bancada 4:
11- Lavar as mos com lcool 70 conforme tcnica descrita acima;
Incubar as placas invertidas em estufa a 37C/ 18 a 24 h. Observar os resultados.
24
11- AVALIAO DA AO ANTIMICROBIANA DE ANTISSPTICOS E DESINFETANTES

As substncias qumicas utilizadas para desinfeco ou anti-sepsia so divididas em
vrios grupos: fenol e compostos fenlicos, lcoois, halognios (iodo e cloro), metais pesados
e seus compostos e detergentes.
Um agente qumico ideal deve ter as seguintes caractersticas: atividade antimicrobiana,
solubilidade em gua ou solventes, estabilidade durante armazenamento, ausncia de
toxicidade para homem e animais, inativao mnima por material estranho, atividade em
temperaturas ambiente, poder de penetrao limitado ao local de aplicao, ausncia de
poderes corrosivos e tintoriais, poder desodorizante, capacidade detergente, disponibilidade e
baixo custo.
A seleo de uma substncia qumica antimicrobiana deve levar em considerao:
1. Natureza do material a ser tratado: tecido vivo ou objeto inanimado
2. Tipo de micro-organismo
3. Condies ambientais: tempo de contato, temperatura, pH, presena de matria
orgnica, presena de gua, etc.
Principais grupos de desinfetantes e anti-spticos

FENIS: Mata rapidamente as clulas vegetativas. So muito txicos para os tecidos.
Mecanismo de ao: desnaturao de protenas; agente ativo de superfcie (surfactante)
precipita protenas celulares e rompe a membrana citoplasmtica.
LCOOIS: 70 a 90 % eficientes contra clulas. vegetativas. Propriedades bactericidas
aumentam com a cadeia de C. No eficiente contra esporos (Bacillus anthracis). Mecanismo
de ao:solvente de lipdeos, desnaturao e coagulao de protenas.
HALOGNIOS: so fortes agentes oxidantes.
Iodo: bactericida, esporicida, fungicida, amebicida e viricida. Pouco solvel em gua e mais
solvel em lcool. Mecanismo de ao:no est completamente conhecido, mas acredita-se na
halogenao da tirosina e inativao de enzimas.
Cloro: desinfetante mais utilizado. Atuam sobre bactrias, fungos, vrus. Hipocloritos contm o
grupo qumico -OCl. Os mais usados so Ca(OCl)2 e NaOCl. Cloraminas so mais estveis
que os hipocloritos.
Mecanismo de ao:desnaturao de protenas; dissolvidos em gua hidrolisam originando
cido hipocloroso oxignio nascente (agente oxidante poderoso).
DETERGENTES ou SURFACTANTES: So compostos que diminuem a tenso superficial e
so utilizados para limpar superfcies.
Os detergentes so classificados em 3 grupos principais: aninicos (Duodecil sulfato de sdio),
catinicos (cloreto de cetilpiridnico), no-inicos (polissorbato 80)
Muitos detergentes antimicrobianos pertencem ao grupo catinico, sendo que os no-inicos
no possuem esta atividade.
A avaliao do poder antimicrobiano dos desinfetantes e anti-spticos pode ser feita em
laboratrio. So empregadas as tcnicas de diluio em tubo, inoculao em placas, e a do
coeficiente fenlico. Os micro-organismos usados para o teste so Staphylococcus aureus ou
Salmonella typhi
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Atividade prtica
Preparar placa de Petri com meio Agar nutriente. Aps solidificao fazer orifcios no
Agar para colocao do agente qumico a ser testado
Preparo da suspenso bacteriana em soro fisiolgico. Obter turvao equivalente ao
tubo 0,5 da escala de McFarland, feita com sulfato de brio. Isto , 10 5 a 106 UFC/ mL
(Unidades Formadoras de Colnias).
Espalhamento da suspenso bacteriana no meio slido com auxilio de swab (tcnica
de sementeira de superfcie)
Secagem da placa por 5 a 10 minutos em estufa a 37C
Colocar um pequeno volume das substncias a serem testadas nos orifcios
Incubar a placa por 24-48 h a 37C
Observar aparecimento de zona de inibio, isto ausncia de crescimento.
Resultados:
Substncias: fenol, Pinho, gua sanitria.
Tamanho do halo de inibio (mm)
Concentraes
100%
1:2 (50%) 1:4 (25%) 1:8 (12,5%) 1:16 (6,25%)
Fenol
Pinho
gua
sanitria
1:32 (3,125%)
Conceitos:
Anti-sepsia - eliminao de micro-organismos de tecidos vivos
Assepsia conjunto de medidas para evitar a contaminao de materiais, instrumentos, meios
de cultura, etc com micro-organismos.
Desinfeco eliminao de micro-organismos de tecidos mortos ou de objetos inanimados
26
12- TCNICAS DE INOCULAO DE BACTRIAS EM MEIOS DE CULTURAS

Os micro-organismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu
crescimento in vitro. Alm dos componentes presentes no meio, existem outros fatores
ambientais que interferem no seu desenvolvimento, tais como temperatura (psicrfilas,
mesfilas, termfilas e termfilas extremas), tenso de oxignio (aerbias, anaerbias
obrigatrias, microaerfilas e anaerbias facultativas), pH, intensidade luminosa, presso
osmtica e salina.
A inoculao de um micro-organismo em um meio de cultura que possua todos os
requisitos fsico-qumicos favorveis permite que o mesmo inicie seu desenvolvimento. Neste
desenvolvimento da cultura ocorrem todas as fases do crescimento (fase de latncia ou
adaptao, fase logartmica, fase estacionria, e morte). Estas fases podem ser plotadas em
um grfico em funo do tempo de incubao, gerando a curva de crescimento.
A fase logartmica (exponencial) caracterizada por divises sucessivas (cissiparidade),
originando a formao de um agrupamento de bactrias da mesma espcie, que em meio
slido, denominada colnia. Teoricamente a colnia se origina a partir de uma clula,
podendo ser visualizada sem o auxlio de microscpio, sendo, portanto, considerada como
caracterstica macroscpica das bactrias.
Como cada espcie possui um tipo morfolgico colonial diferente, estas devero ser
analisadas quanto elevao, forma, tamanho, bordas e pigmentao, sendo, portanto mais
um critrio a ser empregado na identificao da cultura bacteriana.
Culturas puras propiciam o desenvolvimento de um nico tipo de colnia, ao contrrio
do resultado do crescimento de tipos variados de colnias em culturas mistas. Em
microbiologia, h vrias tcnicas de inoculao de micro-organismos; algumas so utilizadas
para exames qualitativos e outras para exames quantitativos (contagem de bactrias).
TCNICAS DE INOCULAO
NORMAS UTILIZADAS
A) O fio e a ala de platina devem sempre ser esterilizados antes e depois de qualquer
inoculao. Para a coleta de material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com o
meio, antes de tocar na cultura.
B) Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc) com meio de cultura devem ser
sempre abertos prximo ao bico de Bunsen;
C) A boca do tubo de ensaio deve ser flambada na chama do bico de Bunsen aps a retirada e
antes da colocao da tampa(algodo ou plstico). A tampa nunca deve ser colocada sobre o
balco, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mnimo da mo direita durante o processo
de inoculao.
TCNICAS DE SEMEADURA EM MEIOS LQUIDOS (CALDOS)
Com auxilio de ala de platina, retirar inculo de E. coli do meio liquido e transferir para
meio liquido.
TCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SLIDO INCLINADO

Com auxlio da ala de platina, retirar inculo de Serratia marcescens do meio slido e
fazer estrias na superfcie do gar.
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TCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SLIDO EM TUBO (PICAGEM PROFUNDA)

Inocular a cultura em meio slido utilizando a agulha de platina. A inoculao dever ter
a profundidade de 2/3 do meio e no dever ser mais do que uma nica picada.
TCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SLIDO EM PLACA (TCNICA DE ESGOTAMENTO)
Consiste em depositar sobre um ponto da superfcie do meio de cultura uma alquota do
inculo e depois espalh-lo em dois ou trs setores, por meio de ala de platina, sem
recarreg-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do inculo. Temos
que obter rarefao suficiente do inculo, de modo a formar colnias perfeitamente isoladas.
O sucesso da semeadura depende:
- tomada de pequena quantidade de inculo para semear;
- grande nmero de estrias;
- no perfurar o meio;
- no voltar a ala sobre a estria.
Com auxilio de ala de platina, transferir o inculo de Micrococcus luteus do meio liquido para
placa de Petri fazendo estrias compostas.
TCNICA DE SEMEADURA EM PLACA EM PROFUNDIDADE (POUR-PLATE)

Pode ser realizada com o objetivo de se obter colnias isoladas (estudo qualitativo) ou para
realizar a contagem de colnias em placa (estudo quantitativo):
Realizar diluies de um cultivo bacteriano:

1. Retirar 0,1 ml de inculo de S. epidermidis do meio liquido e transferir para tubo
contendo 0,9 ml de salina. Retirar 0,1 ml do tubo 1 (diluio 10 -1) e transferir para tubo
2, e assim sucessivamente at o tubo 8.
2. Transferir 0,1 mL dos tubos de diluio para a placa de Petri vazia e estril; (bancada
1: diluio 10-5, bancada 2: diluio 10-6, bancada 3: diluio 10-7, bancada 4: diluio
10-8);
3. Depositar na placa 15 a 20 mL de gar fundido (+/- 45C);
4. Realizar movimentos circulares para que ocorra a incorporao do inculo diludo no
meio;
5. Esperar solidificar e inverter a placa.
28
0,1 mL
0,9 mL
0,1 mL
Placa aps
incubao
TCNICA DE INOCULAO POR SEMENTEIRA DE SUPERFCIE
realizada com swabs contendo o inculo do micro-organismo, sendo este espalhado
por toda a superfcie do meio de cultura slido contido em placa de Petri.
Observao: Geralmente, o inculo padronizado segundo o tubo 1 da escala de Macfarland.
IDENTIFICAO DAS PLACAS E TUBOS:
Identifique seu material com as siglas do curso, bancada, bactria e tcnica.
CONDIES DE INCUBAO
Aps a inoculao, as bactrias devero ser incubadas em ambiente com tenso de
oxignio e temperatura ideais para o seu desenvolvimento. Como as bactrias que estamos
trabalhando so aerbias ou anaerbias facultativas e mesfilas, elas devem ser incubadas
entre 35oC e 37C (estufa bacteriolgica) com tenso de oxignio ambiental. O perodo de
incubao deve ser de 18 a 24 horas porque estas bactrias possuem tempo de gerao de
cerca de 20 a 30 minutos; isto significa que aps este perodo estaro na fase logartmica de
crescimento, sendo visveis macroscopicamente.
29
13- IDENTIFICAO DE COCOS GRAM-POSITIVOS

Os cocos Gram-positivos so divididos em grupos de acordo com as diferenas de
arranjo e tipo de metabolismo celular. Um de seus subgrupos contm os cocos aerbios e um
gnero comum o Micrococcus, cujas clulas esto dispostas irregularmente ou em ttrades.
As espcies de Micrococcus so saprfitas que vivem no solo e na gua. Outro subgrupo de
cocos Gram-positivos contm aqueles que so facultativos em relao necessidade de
oxignio. As espcies do gnero Staphylococcus, com suas clulas agrupadas so os mais
conhecidos. Os estafilococos vivem na pele e nas membranas das mucosas do homem e de
outros animais de sangue quente. A principal espcie patognica o Staphylococcus aureus,
que pode causar infeces ps-operatrias, sndrome do choque txico e intoxicao alimentar
no homem. Outro gnero conhecido o Streptococcus, cujas clulas esto arranjadas em
pares ou cadeias. O Streptococcus pyogenes a espcie mais importante sendo o agente da
angina estreptoccica, da escarlatina e da febre reumtica. Outro patgeno importante o S.
pneumoniae, que constitui a principal causa de pneumonia bacteriana no homem. Outras
espcies como o E. faecalis, fazem parte da flora normal do trato intestinal do homem e dos
animais. Um terceiro grupo de cocos Gram-positivos inclui gneros de bactrias anaerbias
tais como os Peptococcus, Peptostreptococcus e Coprococcus. Muitas espcies fazem parte
da flora normal do homem e de outros animais de sangue quente.
Estafilococos e Estreptococos
Os estafilococos so cocos Gram-positivos (0,5 a 1,5 m de dimetro), que se
encontram isolados, aos pares, em ttrades ou em agrupamentos irregulares, semelhantes a
um cacho de uvas. So imveis, no esporulados, geralmente CATALASE positivos e no
encapsulados. A maioria das espcies OXIDASE negativa. As espcies de maior interesse
clnico (homem: Staphylococcus aureus; animais: S. intermedius) so COAGULASE positivos.
A coagulase uma enzima que reage com um co-fator existente no plasma de algumas
espcies (coelho, cavalo, humano), transformando o fibrinognio em fibrina. O co-fator
indistinguvel da protrombina, porm a enzima se diferencia da tromboquinase, pois, ao
contrrio desta, no requer a presena de ons Ca 2+, nem os fatores 5, 6 e 7 para a sua
ativao. A capacidade de coagular o plasma continua sendo o critrio mais amplamente
utilizado para a identificao dos estafilococos patognicos.
Os estreptococos so bactrias cocides Gram-positivas, OXIDASE negativas, que
geralmente crescem em forma de cadeias. A principal diferena bioqumica com os
estafilococos a enzima CATALASE, caracteristicamente AUSENTE nos estreptococos
(CATALASE negativos). A catalase uma enzima capaz de desidrogenar o perxido de
hidrognio segundo a reao:
2H2O2
2H2O + O2
catalase
A ao ou atividade HEMOLTICA dos estreptococos tambm til para a identificao
desses micro-organismos. Dependendo da espcie, diferentes tipos de hemlise podem ser
observados:
1. Hemlise alfa () leva a destruio parcial dos eritrcitos presentes no meio de cultivo,
sendo muitas vezes acompanhada de uma colorao esverdeada.
2. Hemlise beta () leva a formao de uma zona clara, incolor, ao redor da colnia,
indicando destruio total dos eritrcitos. Um exemplo de estreptococos -hemoltico o
Streptococcus pyogenes, agente etiolgico de faringites, amigdalites, sinusites,
erisipela, endocardites e febre reumtica.
30
ATIVIDADE PRTICA
Prova da Catalase
A prova pode ser feita em lmina ou em tubo. Cultivar o micro-organismo a testar em
gar inclinado, por 18 a 24 horas a 37C.
Tcnica da Prova em lmina: retirar uma colnia do meio de cultivo e transferir para uma
lmina contendo uma gota de perxido de hidrognio a 30%. Neste caso, deve-se evitar retirar
colnias de meios contendo sangue para este teste, pois a enzima catalase est presente em
eritrcitos e o transporte de eritrcitos para o local da reao pode resultar em resultados
falso-positivos.
Tcnica da Prova em tubo: Adicionar sobre o material cultivado 1 ml de uma soluo de
perxido de hidrognio (gua oxigenada) a 30%.
O desprendimento de bolhas de gs indica uma prova positiva.
Observao:
Esta prova no especfica para catalase, e sua interpretao deve ser feita levando-se
em considerao demais aspectos de crescimento do micro-organismo. Microorganismos produtores de uma outra enzima, a PEROXIDASE (tambm atua sobre o
perxido de hidrognio), como alguns Streptococcus e Aerococcus podem oferecer
resultados falsos. Neste caso, pode-se usar a prova da benzidina, especfica para a
determinao da peroxidase.
Prova da Coagulase
A prova pode ser feita em lmina ou em tubo. Contudo a prova em lmina menos
precisa e recomendada apenas para se realizar uma triagem, devendo a prova em tubo ser
realizada para confirmao do resultado.
Tcnica da Prova em Lmina: em lmina de vidro bem limpa, adicionar uma gota da
suspenso bacteriana (densa) a testar, e uma gota de plasma. Misturar com auxlio de uma
esptula plstica e observar o aparecimento de grumos nos primeiros 10 segundos.
Tcnica da Prova em Tubo: retirar 0,1 ml do meio lquido ou uma colnia isolada do meio
slido de uma cultura da bactria (a partir de meio BHI, aps 24 horas de cultivo) e transferir
para tubo de ensaio contendo 0,5 ml de plasma (ver observaes). Incubar em banho-maria a
37C, por 1 a 4 horas. Observar a formao de um cogulo no tubo.
Observaes:
Qualquer plasma pode ser usado, porm o plasma de coelho (obtido usando-se
CITRATO ou EDTA como anticoagulantes) o mais recomendado.
10 a 15 % das cepas podem produzir resultados negativos em lmina. Reaes aps 10
segundos, assim como o uso de clulas provenientes de meio com alta concentrao
salina (Ex: gar manitol salgado), podem dar resultados falso-positivos.
Organismos contaminantes, incluindo bactrias Gram-negativas podem dar resultados

falso-positivos. Por isso, antes de se testar uma cepa bacteriana, deve-se assegurar
que esse micro-organismo possui caractersticas morfo-tintoriais compatveis com
estafilococos.
31
Pesquisa de estreptococos -hemolticos na garganta

As melhores placas de gar sangue para um isolamento primrio contm 5% de sangue
de carneiro.
Com auxlio de um swab estril coletar material na regio das amgdalas e orofaringe
(evitar tocar na lngua e na vula). Realizar estrias em meio de gar sangue (pH 7,3 a 7,4) e
incubar a 37C. Aps 24 horas de cultivo, observar o aparecimento de halos de hemlise ao
redor das colnias.
Observao: O halo hemoltico visvel, sendo que o crescimento de colnias em meio gar
sangue no indicativo de hemlise.
Preparo do Meio Agar Sangue:
a) Base para gar-Sangue
Extrato de Carne
Triptose
Cloreto de Sdio
Agar
gua destilada
3,0
5,0
5,0
15,0
1000 ml
b) Preparo do Agar Sangue

Base para gar sangue fundido e resfriado a aproximadamente 50C
Sangue total ou desfibrinado de coelho ou carneiro
95 ml
05 ml
Prova de fermentao do Manitol

S. aureus, ao contrrio de S. epidermidis e de outras espcies coagulase-negativas,
capaz de fermentar o manitol. A alta concentrao de sais presente no meio gar-manitol inibe
o crescimento de outros micro-organismos (exceto enterococos) e permite isolar, de modo
seletivo, estafilococos.
gar-Manitol
Peptona de carne
Extrato de carne
D-Manitol
Cloreto de sdio
Vermelho de fenol
gar
gua destilada
10 g
1g
10 g
75 g
0,025 g
15 g
1000 mL
pH a 25C = 7.4
32
ATIVIDADE PRTICA:
Primeira aula: inoculao da bactria a ser identificada pelos testes bioqumicos
Alunos da Bancada 1, 3 e 5 inocular bactria A conforme procedimento tcnico descrito no
roteiro para cada teste
Alunos da Bancada 2 e 4 inocular bactria B conforme procedimento tcnico descrito no
roteiro para cada teste
Segunda aula:
Execuo e avaliao dos testes conforme procedimento descrito no roteiro.
Identificao da bactria inoculada a partir dos testes bioqumicos.
RESULTADOS DOS TESTES E IDENTIFICAO DAS BACTRIAS
Bancada
Gram
Clula
Forma
Arranjo
Testes
Catalase
Bactria
Coagulase Manitol
1
2
3
4
33
14- IDENTIFICAO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS PROVAS BIOQUMICAS

1 - Provas do IMViC
A identificao de bacilos entricos de grande importncia para determinar a etiologia
de infeces intestinais e outras infeces, bem como contaminaes de guas e alimentos.
Este grupo de bactrias pode ser encontrado nos intestinos do homem e de certos animais,
sendo as mesmas classificadas como pertencentes famlia Enterobacteriaceae. So
bactrias em forma de bastonete, Gram negativas, e sem capacidade de esporulao.
Encontramos os seguintes gneros dentro desta famlia: Salmonella, Shigella, Proteus,
Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Serratia, etc.
A diferenciao das enterobactrias pode ser feita com base em suas propriedades
bioqumicas, em presena de substratos especficos. Um conjunto de provas que auxilia a
identificao e classificao destas bactrias, so as provas do IMViC (Indol, Vermelho de
Metila, Voges Proskauer e Citrato).
Neta prtica sero utilizadas, na identificao das bactrias, alguns testes bioqumicos
incluindo as provas do IMVIC.
A - Prova de Produo do Indol
Objetivo: Determinar a habilidade de certos micro-organismos em decompor o aminocido
triptofano. A oxidao do referido aminocido catalisada pela enzima triptofanase;
CH
CH
COOH
triptofanase
amnia
NH2
triptofano
Indol
cidopirvico
A presena do indol detectada pela adio do reativo de Kovacs ao meio de cultura. O

reagente composto por p-dimetilaminobenzaldeido, lcool amlico e cido clordrico. O indol
forma complexo com o p-dimetilamino-benzaldeido, o qual tm cor vermelha. Culturas que
desenvolvem a cor vermelha, aps adio do reativo de Kovacs, so consideradas indol
positivas.
Procedimento tcnico:
Cultivar a bactria em tubo de ensaio contendo gua de peptona, durante 4 dias a 37

C. Adicionar 0,5 mL (10 gotas) do reativo de Kovacs atravs da parede interna do tubo. Agitar
suavemente e observar. A formao de um anel de colorao vermelha indicativo de
positividade do teste.
B - Reao do Vermelho de Metila (V. M.).
Objetivo: Determinar a capacidade de certos micro-organismos, em utilizar a glicose com a
produo e estabilizao de altas concentraes de cidos como produtos finais dos
processos fermentativos.
Nesta prova o vermelho de metila indica a presena de elevadas concentraes de
cidos como produtos finais. Em pH em torno de 4 o indicador se torna vermelho, o qual
indicativo de positividade do teste. Em pH 6, ainda indicativo da presena de cidos em baixas
34
concentraes, o vermelho de metila assume a colorao amarela, o que indicativo da

negatividade do teste.
A prova til para separar a Escherichia coli de Enterobacter aerogenes. Ambos os
micro-organismos produzem inicialmente cidos orgnicos em estgio precoce da incubao
da cultura. O pH baixo estabilizado e mantido por E. coli at o final da incubao. Durante o
tempo que a cultura de E. aerogenes permanece na estufa, ocorre a converso enzimtica
destes cidos em produtos no acdicos, tais como o lcool etlico e a acetona (acetil metil
carbinol), resultando em elevao do pH (aproximadamente 6).
Cultivar a bactria durante 4 dias, em tubo de ensaio contendo meio de Clark & Lubs,
em estufa a 37C. Adicionar 8 gotas de soluo de vermelho de metila. Agitar e observar.
Colorao avermelhada indicativo de positividade do teste, j a cor amarela indica
negatividade do mesmo.
C - Teste de Voges-Proskauer (V.P.)
Objetivo: Deteco da acetona
Algumas bactrias fermentam a glicose com produo de cido actico que, posteriormente,
se transforma em produtos neutros como acetil-metil-carbinol (acetona).
Em presena de oxignio, acetona forma diacetil que, ao reagir com KOH, forma um
complexo de cor rseo-avermelhada.
Glicose acido actico (ac. orgnico) acetoina (neutro) +O2 diacetil +KOH complexo
rseo avermelhado
Cultivar a bactria durante 4 dias em tubo de ensaio contendo caldo Clark & Lubs, em
estufa a 37C. Adicionar ao tubo 10 gotas de soluo A de Barritt (alfa-naftol 5%) e agitar.
Imediatamente adicionar 10 gotas da soluo B de Barritt (KOH 40%) e deixar em repouso por
15 minutos. Examinar e registrar a cor do meio. O aparecimento de colorao rsea
indicativo da positividade do teste.
D - Prova de Assimilao do Citrato
Objetivo: Verificar a capacidade do micro-organismo em assimilar citrato como fonte de
carbono. detectada a presena da enzima citrato permease.
Alguns micro-organismos so capazes de utilizar citrato como nica fonte de carbono na
ausncia de glicose ou outro acar fermentvel. A enzima citrato permease, transporta o
citrato para o interior da clula, onde sofre a ao da enzima citrase, produzindo o cido
oxaloactico e o cido actico. Estes produtos so enzimaticamente convertidos em cido
pirvico e dixido de carbono. Durante esta reao o meio se torna alcalino, pois o dixido de
carbono combina com o sdio do meio formando carbonato de sdio, um produto alcalino. A
presena do carbonato de sdio muda a cor do indicador azul de bromotimol incorporado ao
meio, do verde para o azul.
As culturas citrato-positivas so identificadas pela presena de crescimento de colnias
na superfcie do meio que possui colorao azul.
35
Inocular a bactria na superfcie inclinada de um tubo contendo gar citrato de Simmons
(pH=7,3-verde). Incubar a cultura a 37C durante 24 a 48 horas. Observar os tubos para
verificar ou no a presena de crescimento e cor azul.
2 - Produo de cido Sulfdrico (H2S)
Objetivo: deteco da produo de cido sulfdrico
Alguns micro-organismos so capazes de produzir cido sulfdrico atravs da utilizao
de substratos que contm aminocidos com enxofre, ou compostos inorgnicos de enxofre.
O cido sulfdrico pode ser produzido pela reduo do enxofre orgnico presente na
cistena, a qual componente das peptonas incorporadas ao meio de cultura. As peptonas so
degradadas por enzimas microbianas em aminocidos, incluindo a cistena. Este aminocido,
em presena da enzima cistena desulfurase, perde o enxofre, o qual reduzido para formar o
cido sulfdrico, segundo a equao abaixo representada.
HS-CH2 -CHNH2-COOH
cistena
H3C-CO-COOH
cido pirvico
+
NH3 +
H2S
amnia
cido sulfdrico
O cido sulfdrico produzido liberado do meio e reage com o acetato de chumbo

contido em tira de papel de filtro colocada na parte inferior da boca do tubo de cultura. A
formao de colorao negra indica a presena de H2S, de acordo com a seguinte equao:
H2S
+
(H3C-COO)2Pb
cido sulfdrico acetato de chumbo
PbS
+
sulfeto de chumbo
2 H3C-COOH
cido actico
O sulfeto de chumbo um precipitado de cor negra.

Inocular a bactria em estudo em tubo de ensaio contendo gua de peptona. Aps a
inoculao colocar no interior do tubo, na parte superior e fixa na tampa, uma tira de papel de
filtro impregnada com soluo de acetato de chumbo. Cultivar a bactria durante 4 dias a
37C. O aparecimento de cor negra no papel indica positividade do teste.
3 - Cultivo em Agar-Eosina Azul de Metileno (EMB, Eosin Methylene Blue Agar)
Os meios diferenciais so utilizados para caracterizar grupos de micro-organismos,
baseando-se em modificaes visuais que podem ocorrer nas colnias ou no meio de cultura.
O gar EMB contendo lactose e os corantes eosina azul de metileno permite a diferenciao
entre micro-organismos entricos que fermentam e que no fermentam a lactose, bem como
identificar colnias de Escherichia coli, a qual produz colnias azul-escuras com brilho metlico
devido a grande quantidade de cido que ela produz.
Inocular as bactrias em estudo em placas contendo gar EMB. Incubar a 37C por 48
horas. Observar o aparecimento de colnias e a cor das mesmas.
36
4 Hidrlise do amido
Objetivo: deteco da atividade da enzima amilase
O amido um polmero composto de molculas de glicose unidas entre si por ligaes
glicosdicas. Esse precisa ser hidrolisado antes de ser transportado para o interior da clula
bacteriana. A enzima extracelular responsvel pela hidrlise do amido a amilase. A ao
dessa enzima evidenciada pela ausncia de amido ao redor da colnia crescida em meio
slido contendo amido (0,2%), aps adio de iodo (lugol) sobre o meio.
Se o iodo reagir com o amido, ser formado um complexo de cor azul, indicando teste
negativo para a amilase. O aparecimento de zonas claras ao redor das colnias indica teste
positivo para a presena de amilase.
Inocular as bactrias em estudo, fazendo estrias simples sobre a superfcie do meio
gar amido. Incubar as placas por 48 horas a 37C.
Aps incubao, adicionar soluo saturada de iodo (Lugol) sobre o meio de cultura.
ATIVIDADE PRTICA:
Primeira aula: inoculao da bactria a ser identificada pelos testes bioqumicos
- Alunos da Bancada 1 e 3 inocular bactria A conforme procedimento tcnico descrito no
roteiro para cada teste;
- Alunos da Bancada 2 e 4 inocular bactria B conforme procedimento tcnico descrito no
roteiro para cada teste;
- Alunos da Bancada 5 inocular bactria C conforme procedimento tcnico descrito no roteiro
para cada teste.
Segunda aula:
1. Execuo e avaliao dos testes conforme procedimento descrito no roteiro.
2. Identificao da bactria inoculada a tabela de diferenciao de Enterobacteriaceae por
testes bioqumicos.
37
ANEXOS
Meios de Cultura e Reagentes.
1 - gua de peptona
Peptona
Cloreto de sdio
gua destilada
2g
0,5 g
100 ml
Ajustar o pH entre 7,4 e 7,6. Distribuir em tubos e esterilizar a 120 C durante 15

minutos.
2 - Agar Eosina Azul de Metileno (EMB Agar).
Peptona
Lactose
Sacarose
Fosfato monocido de potssio
Eosina amarela
Azul de metileno
Agar
gua destilada
10 g
5g
5g
2g
0,4 g
0,065 g
13,5 g
1000 mL
Fundir o gar na gua destilada e, a seguir, acrescentar os outros componentes. Acertar

o pH em 7,2. Autoclavar a 120 C por 15 minutos.
3 - Meio de Clark & Lubs
Glicose
Peptona
Fosfato dibsico de potssio
gua destilada
0,5 g
0,5 g
0,5 g
100 ml
Autoclavar a 120 C durante 15 minutos. Deixar esfriar e acrescentar 5 ml de soluo de

glicose a 10 % previamente esterilizada por filtrao. Distribuir o meio em tubos de ensaio em
pores de 10 ml.
4 - Agar Citrato de Simmons.
Fosfato bicido de amnio
Fosfato monocido de potssio
Cloreto de sdio
Citrato de sdio
Sulfato de magnsio
Azul de bromotimol
Agar
gua destilada
1g
1g
5g
2g
0,2 g
0,08 g
15 g
100 mL
Fundir o gar na gua destilada. Dissolver os outros componentes e acertar o pH em

6,9. Distribuir o meio em tubos de ensaio em volume suficiente para uma placa de Petri.
Autoclavar a 120C por 15 minutos.
38
5 - Soluo de Barrit A.
- naftol
Alcool etlico absoluto
5g
95 mL
6 - Soluo de Barrit B.
Hidrxido de potssio
Creatina
gua destilada
40 g
0,3 g
100 mL
Dissolver o hidrxido de potssio na gua destilada.

7 - Soluo de vermelho de metila.
Vermelho de metila
lcool etlico 95 %
gua destilada
0,1 g
300 mL
200 mL
Dissolver o vermelho de metila no lcool. Acrescentar a gua destilada.

8 - Reativo de Kovacs.
lcool amlico
p-dimetilaminobenzaldeido
cido clordrico concentrado
75 mL
5g
25 mL
Dissolver o p-dimetilaminobenzaldeido no lcool amlico e, a seguir, acrescentar o cido

clordrico.
9- gar amido
Peptona
Extrato de carne
Amido solvel
gar
gua destilada qsp
15 g
3g
2g
15
1000 ml
39
15- ANTIBIOGRAMA
Introduo
O antibiograma uma prova laboratorial para avaliar a sensibilidade ou resistncia de
determinado micro-organismo frente a diferentes antimicrobianos.
A proposta primria deste teste guiar o clnico na escolha do agente apropriado para a
terapia. Alm disso, estes testes so utilizados para avaliar in vitro a atividade de novos
agentes, e auxiliar no mapeamento bactrias resistentes emergentes. A suscetibilidade
antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensvel, intermedirio ou resistente;
ou quantitativamente em termos de MIC (minimum inhibitory concentration) ou MBC (minimum
bactericidal concentration).
1. Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Mtodo de diluio: consiste
em preparar sucessivas diluies dos antibiticos em meio slido ou lquido e em
seguida semear a bactria em estudo. Aps incubao determina-se MIC e/ou MBC.
2. Mtodo de difuso de Bawer e Kirby: um teste qualitativo, no qual discos de papel
impregnados com o antibitico so colocados na superfcie do gar uniformemente
semeado com o micro-organismo. A droga se difunde no gar e produz inibio do
agente sensvel, formando um halo de inibio que deve ser medido e comparado com
tabelas padronizadas.
O mtodo dever ser executado a partir de culturas puras, pois o padro de
sensibilidade ou resistncia dos micro-organismos muito variado. Se em determinado
material biolgico encontrarmos tipos de bactrias diferentes, temos que realizar um
antibiograma para cada espcie de micro-organismo isolado.
O resultado do antibiograma s vlido para o micro-organismo em estudo. Assim
temos, por exemplo, que os resultados para determinada amostra de Staphylococcus aureus
isolado de uma urocultura no serve para um Staphylococcus aureus isolado de uma
coprocultura.
Realizao do antibiograma
Tcnica do mtodo de difuso:
O inculo bacteriano tem que ser padronizado devendo conter de 10 5 a 106 UFC/mL
(Unidades Formadoras de Colnias por mL). Padronizar suspenso da bactria em soluo
fisiolgica, com turvao equivalente ao tubo n 0,5 da Escala de McFarland. A Escala de
McFarland constitui-se de 10 tubos numerados onde temos volumes crescentes de mistura de
cido sulfrico e hidrxido de brio, a qual dar um precipitado de sulfato de brio, produzindo
turbidez caracterstica.
SWAB
1. Sature um swab de algodo com a suspenso bacteriana.
2. Remova o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo.
Figura 1
3. Semeie a suspenso por espalhamento, em placa contendo gar Muller-Hinton,
utilizando sucessivamente trs direes para obter um inculo uniformemente
espalhado sobre toda a superfcie do gar (Fig 2).
O gar Mueller Hinton contm baixos teores de timina e timidina, substncias que so
antagonistas das sulfas. As sulfas bloqueiam na bactria a sntese do cido flico, no
40
ocorrendo assim sntese de cidos nuclicos e, tendo como conseqncia, a morte da

bactria. Altos nveis de timina e timidina favorecem a formao de cidos nuclicos por outra
via impedindo a ao das sulfas. O meio contm ainda baixos teores de ons clcio e
magnsio, os quais, quando em concentraes elevadas, interferem na ao dos
aminoglicosdeos.
Figura 2
Com auxlio de uma pina, distribua cinco discos de diferentes antibiticos sobre a
superfcie do gar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). A seleo dos discos deve
levar em considerao o tipo de bactria e a procedncia do material biolgico (local da
infeco). Os discos sero colocados distncia considervel uns dos outros e da borda da
placa, a fim de evitar a confluncia dos halos de inibio.
Figura 3
4. Pressione levemente os discos para que no se desprendam durante a incubao.

5. Incube as placas por 24 horas a 37C.
Anlise dos Resultados
Medir o halo de inibio do crescimento (em milmetros) e comparar com tabelas
padronizadas. A simples formao do halo no indicativo de sensibilidade da bactria ao
antibitico, em nveis teraputicos. Temos que levar em considerao o tamanho do halo, tipo
de bactria e a concentrao do antibitico. Deve-se observar halos ntidos e bem definidos. O
tamanho do halo no indica necessariamente que uma bactria mais sensvel a um
determinado antibitico que a outro.
Os valores das tabelas vo se alterando medida que as bactrias vo se tornando
mais resistentes.
Atravs da anlise dos resultados poderemos classificar os micro-organismos testados
em: resistente, intermedirio, moderadamente sensvel, e sensvel, dependendo da
formao ou no de halo inibitrio e tambm de seu dimetro.
No caso de formao de um halo inibitrio, este deve ter seu dimetro medido, e a
medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas (Fig 5) . De modo geral,
estas tabelas determinam medidas de dimetro, e dessa forma a medida encontrada em cada
caso pode ento ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas.
41
Figura 4
Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade

Cdig
Antimicrobiano
[g]
o
Bacitracina
Cefotaxima
Gentamicina
Tetraciclina
Vancomicina
BAC
CTX
GEN
TET
VAN
10
30
10
30
30
Halos de Inibio (mm)

Resistente Intermedirio
<8
< 14
< 12
< 14
<9
9 a 12
13 a 14
15 a 18
10 a 11
Moderadament
e sensvel
15 a 22
-
Sensvel
> 13
> 23
> 15
> 19
> 12
Exemplo: Se para um determinado micro-organismo, utilizando-se o antimicrobiano

Gentamicina, foi medido o dimetro de um halo de inibio e constatou-se que este era de 16
mm, tal micro-organismo deve ser classificado como sensvel para a Gentamicina. Entretanto
se o dimetro do halo fosse de 13 mm o micro-organismo seria classificado como intermedirio
a Gentamicina. No caso de no formao de um halo de inibio, o micro-organismo seria
considerado resistente.
Observaes
1) Na leitura do halo de inibio, pode-se observar o aparecimento de vu dentro do mesmo
(Pseudomonas e Proteus). Fazer a leitura normalmente, ignorando o vu. Esse fato ocorre
porque estes micro-organismos so extremamente mveis.
2) Poucas colnias dentro do halo sugerem mutantes, os quais devem ser ignorados.
42
16 - PROPRIEDADE OLIGODINMICA DE METAIS

Alguns metais pesados so muito txicos e altamente reativos, como por exemplo, Hg
(mercrio), Ag (prata), Pb (chumbo), Zn (zinco) e Cu (cobre). Eles possuem capacidade
oligodinmica, isto capacidade de exercer efeito letal sobre as bactrias mesmo em
quantidades extremamente pequenas.
No inicio do XX o cloreto de mercrio era amplamente usado como um desinfetante
geral, porm pelo seu efeito txico foi substitudo por outros agentes.
Compostos de Mercrio
Compostos Inorgnicos de Mercrio - HgCl2: So irritantes de tecidos, txicos para
os rgos, inativados por matria orgnica e no tm ao sobre esporos Mecanismo de ao:
ocorre inativao de enzimas com grupo sulfidrila (SH) - precipitao de protenas celulares.
SH
SH
Enzima
SH
Enzima ativa
+ HgCl 2
Enzima - Hg
cloreto de mercrio
2HCl
SH
Enzima inativa
Compostos Orgnicos de Mercrio: Eram usados para tratamento de pequenos

cortes, feridas e infeces de pele. So menos irritantes e menos txicos que os inorgnicos.
No matam esporos. So eles: mertiolate (timerosal), mercurocromo (merbromin), metafen
(nitromersol). Mecanismo de ao semelhante aos compostos inorgnicos.
Compostos de Prata
Nitrato de prata (AgNO3): usado para prevenir infeces oculares por gonococos em
recm-nascidos. usado para prevenir infeces em queimaduras. Mecanismo de ao:
precipita protenas celulares, interfere nas atividades metablicas das clulas microbianas.
Possui efeito germicida.
Metal: usado em filtros de gua
Compostos a base de cobre
Sulfatos (CuSO4): Efetivo como um algicida em reservatrios de gua e piscinas.
Usado como fungicida em plantas.
Metal: usado no dispositivo intrauterino (D.I.U), possuindo ao txica contra os
espermatozides.
Atividade prtica
1. Preparo da suspenso bacteriana, de Staphylococcus aureus, em soro fisiolgico. Obter
turvao equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, feita com sulfato de brio.
Isto , 105 a 106 UFC/ mL (Unidades Formadoras de Colnias);
2. Espalhamento da suspenso bacteriana no meio slido de agar nutriente com auxilio de
swab (tcnica de sementeira de superfcie) em duas placas de petri;
3. Colocar uma moeda de prata estril sobre o meio de cultura de uma placa. Colocar uma
moeda de cobre estril sobre o meio de cultura da outra placa. Identificar as placas;
4. Incubar as placas, sem inverter, em estufa a 37C por 18/24 h;
5. Observar os resultados.
43
17- ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS DO SOLO

A microbiota do solo compreende uma grande diversidade de micro-organismos
incluindo bactrias, fungos, algas, protozorios e vrus. Desses, as bactrias - actinomicetos e
cianobactrias - juntamente com os fungos, constituem os grupos predominantes nos diversos
tipos de solo. Esses micro-organismos efetuam a ciclagem e a transformao de elementos
qumicos essenciais para a natureza.
Os actinomicetos so bactrias aerbias do solo que formam um miclio composto de
hifas ramificadas, multiplicam-se por fragmentao ou por produo de esporos e so
importantes produtores de antibiticos.
A metodologia a ser utilizada para o isolamento desses micro-organismos ser a tcnica
de Pour Plate (placa derramada) e o meio de cultura que ser usado, tm a caracterstica de
seletividade, mas no exclusivo para actinomicetos.
Metodologia
Pesar uma poro de solo de 10 gramas e colocar em placa de Petri. Colocar em estufa
a 56C e deixar por 24 horas, para determinao do peso seco do solo.
Pesar uma poro de solo sem secar de 10 gramas para a contagem global de acordo
com o mtodo descrito a seguir:
Fazer suspenso de 0,5 grama de solo em 4,5 mL de salina estril (10-1). Pipetar 0,5 mL
da diluio 10-1 e transferir para um tubo de ensaio contendo 4,5 mL de salina estril
(10-2). Repetir o processo em mais 06 tubos (at 10 -8)
Em oito placas de Petri, estreis (identificadas de 10 -1 a 10-8), pipetar 1 mL das
respectivas diluies da suspenso do solo.
Fundir oito tubos contendo 16 mL do meio de cultura esterilizado e resfriado a
aproximadamente 56 C. Verter o meio em cada uma das placas e homogeneizar
rapidamente por Pour Plate. Esperar o meio solidificar e incubar as placas invertidas
temperatura ambiente por 48-72 horas.
Meio de cultura para o isolamento de actinomicetos do solo

Glicerol
10 mL
MgSO4
0,25g
K2HPO4
1,25g
KNO3
2,10g
CaCO3
1,00g
Extrato de leveduras
0,10g
Aferir o pH (7,0), distribuir em tubos de ensaio (15 mL)
Oligoelementos (sais) 0,10 mL
e esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
gar
15,0g
gua destilada
1000mL
Realizar a leitura e interpretao dos resultados
Determinao do peso seco do solo
Pesar o solo seco e fazer o seguinte clculo
% gua = (PI-PS)/ PI x 100
PI= Peso inicial do solo
PS= Peso seco do solo
Observar as caractersticas (formato, colorao, borda) das colnias e o processo de antibiose
entre micro-organismos de diferentes grupos.
44
18- ALTERAES FENOTPICAS E GENOTPICAS

O grande desenvolvimento da gentica nos ltimos anos se deve, em grande parte,
utilizao dos micro-organismos nas pesquisas. Dentre os micro-organismos empregados em
estudos genticos, as bactrias merecem destaque especial, dado o curto tempo de gerao e
o grande nmero de clulas que podem ser obtidas em reduzido espao. Alm disso,
alteraes causadas por mutaes podem ser facilmente identificadas nesses organismos. A
mutao, juntamente com a recombinao, geradora de variabilidade gentica. Ela pode ser
definida como uma alterao hereditria na seqncia de bases do DNA de um organismo. O
indivduo que carrega essa alterao denominado mutante.
Mutao pode ocorrer espontaneamente ou pode ser induzida por agentes fsicos e
qumicos. Mutantes resistentes a antibiticos podem ser selecionados pelo plaqueamento
direto das bactrias em meio contendo o antibitico apropriado. O mutante apresenta o
gentipo diferente da linhagem parental. O gentipo representa o conjunto completo de genes
de um organismo Bactrias recombinantes podem ser obtidas naturalmente por transformao,
conjugao e transduo.
Por tcnicas de engenharia gentica, podemos introduzir plasmdeos recombinantes em
bactrias competentes, tratadas artificialmente. O mtodo de produo de bactrias
quimiocompetentes mais utilizado o do cloreto de clcio. O plasmdeo introduzido nas
clulas quimiocompetentes (transformao) por choque trmico. Assim, essas bactrias
transformadas possuem alteraes genotipicas quando comparadas as bactrias selvagens.
As alteraes genotpicas so alteraes no DNA e so transmitidas de uma gerao a
outra.
O gentipo associado ao meio ambiente determina o fentipo de um organismo. Tanto
modificaes genotipicas quanto ambientais podem provocar alteraes fenotipicas. Porm, as
modificaes fenotipicas causadas pelas modificaes ambientais so reversveis. O efeito da
temperatura de incubao sobre a produo de pigmentos por Serratia marcescens um
exemplo de alterao fenotpica.
OBJETIVOS
1. Observe as alteraes na produo de pigmentos por Serratia marcescens cultivada em
diferentes temperaturas.
2. Isolamento de mutantes resistentes ampicilina pela tcnica da placa gradiente
3. Observao de colnias mutantes resistentes ampicilina
4. Observao do crescimento de cepas de E. coli sensveis (selvagem) ampicilina em
meio LB sem ampicilina, e, a ausncia de crescimento em meio LB acrescido de
ampicilina.
MATERIAL
Micro-organismos:
Serratia marcescens
E. coli selvagem - sensvel a ampicilina.
Meios e solues:
Meio Luria Broth liquido e slido. Meio BHI lquido e slido.
Soluo de ampicilina (100 mg/ml).
45
Equipamentos: estufas a 37C e 40C

Materiais: tubos de cultura pequenos, placas de Petri, ala de platina.
PROCEDIMENTO
II. A) Produo de pigmento por S. marcescens
Inocule, com ala de platina, o meio slido de dois tubos contendo gar inclinado fazendo
estrias.
Incube um dos tubos temperatura ambiente e outro a 40C, por 48 hs.
II. B) Confirmao da sensibilidade da E. coli selvagem penicilina
Com auxilio de ala de platina flambada e fria, inocule a cepa sensvel fazendo estrias simples
no meio LB acrescido de ampicilina (100 mg/ml)
Com auxilio de ala de platina flambada e fria, inocule a cepa sensvel fazendo estrias simples
no meio LB sem ampicilina.
Incube as placas invertidas em estufa a 37C, por 18 - 24hs;
Observe os resultados.
II. C) Isolamento de mutantes resistentes ampicilina pela tcnica da placa gradiente
O Isolamento realizado aps confirmao da sensibilidade da E. coli selvagem
ampicilina.
Preparar placas de Petri segundo tcnica da placa gradiente (Figura abaixo). Usar tratamentos
contendo no meio de cultura acrescido de ampicilina nas seguintes concentraes: 25, 50, 75
e 100 mg/ml;
Aps solidificao espalhar com auxilio de swab, cultura pr-crescida (18 h) de E. coli sensvel
ampicilina sobre o meio de cultura dos tratamentos descritos no item a;
Incube as placas invertidas em estufa a 37C, por 18 - 24hs.
TCNICA DA PLACA GRADIENTE
Concentrao
mxima (+)
Adio de meio em placa com

ligeira inclinao
Adio de segunda camada de meio

com o antibitico penicilina, com a
placa na posio normal
Concentrao
mnima (-)
Difuso do antibitico
Semeadura de bactria
Mutantes resistentes
Crescimento total
Placa vista por cima
Fig. 1.20 A tcnica da placa gradiente no isolamento de mutantes resistentes penicilina
46
19- UROCULTURA
Princpio
Amostras de urina devem ser submetidas cultura quando existe suspeita de infeco
do trato urinrio, para controle de tratamento ou em pacientes assintomticos com alto risco de
infeco. Os agentes etiolgicos que mais freqentemente causam este tipo de infeco so
as enterobactrias, como Escherichia coli (70% dos casos), Klebsiella pneumoniae, Proteus
spp., Enterobacter spp., e entre os cocos gram-positivos os mais freqentes so os
estafilococos, destacando o Staphylococcus saprophyticus e o Enterococcus spp.
Material Clnico
a) Coleta
Colher, preferencialmente, a primeira urina da manh em frasco estril de tampa com
rosca e de boca larga, antes da antibioticoterapia. Outras amostras tambm podem ser obtidas
desde que o paciente retenha a urina por, pelo menos, 2 horas antes de realizar o exame.
b) Transporte
Amostras transportadas em temperatura ambiente (20 a 25C) devem ser processadas
em at 2 horas. Aps este tempo, a amostra deve ser refrigerada (2 a 8C) e processada em
at 24 horas. Se for colhida em tubo contendo preservativo (cido brico), a amostra pode
permanecer temperatura ambiente (20 a 25C) at 24 horas antes de ser processada.
c) Volume
O volume mnimo de urina que pode ser recebido vai depender do mtodo de cultura
empregado. Em geral, para cultura, 2 mL so suficientes.
Como Reportar o Resultado
Independente do tipo de coleta realizado, o resultado da cultura de urina deve sempre
ser quantitativo e reportado em unidades formadoras de colnias por mililitro de urina
(UFC/mL). Em casos de dvidas na interpretao, sugerir repetio do exame para
esclarecimento diagnstico.
Cultura negativa- no houve crescimento de micro-organismos.
Cultura positiva- 100.000 UFC/mL de Escherichia coli, p. ex.
Comentrios
A coleta e o transporte inadequados da amostra podem levar a resultado de difcil
interpretao. Portanto, a medida mais importante para realizar uma cultura de urina
estabelecer rgidos critrios de coleta e dar treinamento constante para os profissionais
envolvidos na realizao da coleta e do exame.
Para melhor interpretao da cultura de urina o ideal realizar a anlise do sedimento
urinrio para verificar o nmero de leuccitos e a presena ou no de micro-organismos.
Qualquer micro-organismo pode ser importante, mesmo se isolado em quantidades inferiores a
105 UFC/mL.
47
Atividade Prtica
1. Microscopia de Gram
Homogeneizar bem a amostra de urina (sem centrifugar).
Retirar 10 L da urina e colocar em uma lmina, sem espalhar.
Deixar secar ao ar.
Fixar no calor antes de corar.
Reportar o nmero de micro-organismos observados por campo de imerso (raros,
alguns ou numerosos).
Nota: a presena de um ou mais micro-organismos por campo correlaciona geralmente com
105UFC/mL. A presena de muitas clulas epiteliais e de mais de um tipo de micro-organismo
no Gram sugere contaminao da amostra de urina em decorrncia da coleta.
2. Cultura
A. Semear parte da amostra de urina em uma placa de agar EMB.
B. Tcnica de Pour-Plate: contagem de colnias
Retirar 0,1 mL da amostra de urina e transferir para tubo 1 contendo 0,9 mL de
salina. Retirar 0,1 mL do tubo 1 (diluio 10 -1) e transferir para o tubo 2 contendo 0,9
mL de salina (diluio 10-2) e assim sucessivamente at o tubo 6;
Transferir 0,1 mL dos tubos de diluio para a placa de Petri vazia e estril;
(bancada 1: diluio 10-3, bancada 2: diluio10-4, bancada 3: diluio 10-5, bancada
4: diluio 10-6);
Depositar na placa de 15 a 20 mL de agar casoy fundido (+/- 45C);
Realizar movimentos circulares para que ocorra a incorporao do inoculo diludo no
meio;
Esperar solidificar e inverter a placa.
Incubar a 37C durante 24 horas e aps este perodo, anotar as caractersticas de
colnias crescidas em cada um dos meios.
3. Sistema API 20 E
O API 20 E um sistema para a identificao das Enterobacteriaceae e outros bacilos
Gram negativos no fastidiosos que utiliza 21 mini-testes bioqumicos padronizados e uma
base de dados.
a) Princpio
A galeria API 20 E comporta 21 microtubos que contm substratos desidratados. Os
microtubos so inoculados com uma suspenso bacteriana que reconstitui os meios. As
reaes produzidas durante o perodo de incubao traduzem-se pelas mudanas de cor
espontneas ou reveladas atravs da adio de reagentes.
b) Tratamento das amostras
O API 20 E no deve ser utilizado diretamente em amostras de origem clnica. Os microorganismos a identificar devem primeiro ser isolados num meio de cultura adaptado cultura
de bacilos Gram negativos segundo as tcnicas habituais de bacteriologia.
c) Preparao da galeria
Reunir fundo e tampa de uma caixa de incubao e distribuir cerca de 5 mL gua
destilada nos alvolos para criar uma atmosfera mida.
Identificar a amostra na lingeta lateral da caixa
d) Preparao do inculo
Abrir uma ampola de NaCl 0,85% (5 mL) (prprio Kit) ou utilizar um tubo contendo 5 mL
de soro fisiolgico estril ou de gua destilada estril.
Coletar uma nica colnia bem isolada do micro-organismo
Preparar uma suspenso bacteriana homogeneizando cuidadosamente as bactrias no
meio.
48
e) Inoculao da galeria
Encher os tubos e cpulas dos testes CIT, VP, GEL com a suspenso bacteriana.
Encher unicamente os tubos ( e no as cpulas) dos outros testes.
Criar uma anaerobiose nos teste ADH, LDC, ODC, H 2S, URE enchendo as cpulas com
leo de parafina.
Fechar a caixa de incubao
Incubar a 35C-37C durante 18-24 horas.
f) Resultados
Realizar a leitura e anotar os resultados.
Se 3 ou mais testes forem positivos, revelar os testes que necessitam da adio de
reagentes (TDA, IND, VP, NO2).
Se o nmero de testes positivos for inferior a 3, no adicionar os reagentes mas incubar
a galeria por mais 24 horas e realizar testes adicionais.
g) Identificao
A identificao obtida a partir do perfil numrico. Na ficha de resultados, os testes so
separados por grupos de trs e um valor 1, 2 ou 4 indicado para cada teste. A soma dos
valores de cada teste positivo resultar num nmero final, representante de cada grupo de 3
testes. No final obtm-se um perfil numrico de 7 algarismos; estes algarismos so lanados
em uma planilha que nos remeter provvel espcie desta bactria.
Por exemplo:
+
1
ONPG
+ + +
ADH LDC ODC
CIT H2S
Resultado numrico: 5 315 173
URE TDA IND
banco de dados
Enterobacter gergoviae
49
20- ESTUDO DOS FUNGOS ANEMFILOS

O ar atmosfrico possui flora fngica muito rica. Encontramos os esporos que so as
formas de disseminao destes micro-organismos pelo meio ambiente. Os esporos dos fungos
constituem-se em unidades de propagao da espcie, semelhana das sementes das
plantas. Muitas vezes estes esporos so os responsveis pela transmisso de doenas como
as alergias.
Estes fungos encontrados no ar so denominados anemfilos, o que significa amigos
do ar. Os fungos esto no ar devido disperso pelos ventos, pois na realidade os mesmos
vivem no solo, nas plantas, ou em outras fontes de matria orgnica.
A umidade e a poeira so os principais responsveis pela presena desses microorganismos em locais tais como banheiros, bibliotecas, salas de aula, etc.
Muitas vezes fazemos a determinao da flora fngica presente no ar para verificarmos
se alguns dos fungos encontrados so capazes de transmitir doenas. A determinao da flora
fngica tambm tem importncia para verificarmos o ndice de poluio ambiental por fungos.
Pode-se encontrar no ar esporos e hifas, sendo estas isoladas com menos freqncia.
As classes encontradas com mais freqncia so: Zygomycotina e Deuteromycotina.
TCNICA
Deixar exposta ao ar atmosfrico por 20 minutos, placas de Petri contendo gar
Sabouraud;
Ao expor a placa, tomar o cuidado de manter a tampa com a face interna voltada para
baixo e apoiada nos bordos da placa. Neste perodo, no tocar mais na placa.
Incubar as mesmas por quatro a cinco dias. Examinar as placas, contando o nmero de
colnias de bolores e leveduras formadas.
Se houver necessidade de identificao dos fungos, isol-los para tubos contendo gar
Sabouraud.
Algumas informaes a respeito da micromorfologia dos fungos presentes na placa
podero ser obtidas atravs da microscopia de fragmento da colnia, corado com
lactofenol azul algodo.
MONTAGEM DE LMINA DE MICROCULTIVO
Cultivar o fungo em bloco de gar batata depositado na superfcie de lmina contida em
cmara mida. Lamnula dever ser colocada na superfcie do meio. Aps o desenvolvimento,
o fungo que cresceu aderido lamnula examinado microscopicamente (40x) com adio de
corantes (Lactofenol-azul algodo). As caractersticas que devero ser observadas na lmina
de microcultivo so basicamente as mesmas j descritas anteriormente. A vantagem do
microcultivo de que as estruturas de esporulao ficam bastante preservadas. Pode-se
organizar um laminrio (arquivo) com microcultivo de diferentes fungos.
MONTAGEM DE COLNIA GIGANTE
Inocular o fungo no centro de uma placa de Petri contendo gar Sabouraud. Manter a
placa em posio invertida, temperatura ambiente, at desenvolvimento do fungo
(geralmente de 5 a 20 dias).
50
Observar e anotar:
CARACTERSTICAS DA COLNIA
ASPECTOS DO
MICLIO
ASPECTOS GERAIS
TOPOGRAFIA DA
SUPERFCIE
CONTORNO
Cotonoso
Velocidade de crescimento
Dobras
Circular
Lanoso
Cor da colnia (verso e anverso)
Sulcos
Irregular
Amebide
Rizide
Elptico
Oval
Feltroso
Pulverulento
Consistncia:
Coricea
Branda
Cremosa
Pregas
Elevaes
Situao do miclio areo e profundo, Presena de pigmentos difusveis, etc.

Meios de cultura mais comumente utilizados em micologia
Agar Sabouraud
Dextrose
Peptona
Agar
gua destilada
20g
10g
15g
1.000 mL
Ferver a gua e acrescentar ao gar e aps a dissoluo do mesmo, adicionar a

dextrose e a peptona. Distribuir em tubos ou bales e autoclavar.
Caldo Sabouraud
A composio em relao ao gar Sabouraud, difere somente em relao ausncia do
gar.
Agar sabouraud com penicilina
Agar Sabouraud estril
Penicilina G potssica
1.000 mL
40.000 Unidades
Homogeneizar e distribuir em tubos estreis.

Dermatophyte Teste Medium (DTM)
Phytone
Dextrose
Soluo de vermelho de fenol (1)
Soluo de cido clordrico 0,8 M
Cicloheximida (2)
Sulfato de gentamicina (3)
Tetraciclina (4)
Agar
gua destilada qsp
10 g
10 g
40 mL
6 mL
0,5 g
100 mg
100 mg
20 g
1.000 mL
51
Soluo de Vermelho de Fenol:

Vermelho de fenol
Hidrxido de sdio 0,1 M
gua destilada qsp
0,5 g
15 mL
100 mL
(2) A cicloheximida (Actidione) dever ser previamente solubilizada em 2 mL de acetona.

(3) Utilizar ampolas de Garamicina de 100 mg.
(4) Dissolver a tetraciclina (Clortetraciclina) em 10 mL de lcool absoluto e adicionar ao meio j
esterilizado.
OBS. A tetraciclina poder ser substituda por cloranfenicol. Neste caso, o antibitico poder
ser adicionado ao meio antes da autoclavagem.
Aps dissoluo de todos os componentes do meio, medir o pH, o mesmo dever ser 5,0 (O
meio dever ter colorao amarela).
Distribuir o meio em tubos de ensaio e autoclavar.
Agar Batata
Extrato de batatas *
Dextrose
Agar
gua destilada qsp
250 mL
20 g
20 g
1.000 mL
Preparo do extrato de batatas:

Batatas em pedaos (sem casca)
gua destilada
100 g
300 mL
Cozinhar as batatas em banho-maria fervente durante 1 hora. Filtrar o infuso atravs de

gaze. Completar o volume do filtrado para 300 mL.
O meio de cultura distribudo em tubos ou bales e, a seguir, autoclavado.
Agar Malte
Extrato de malte
Agar
gua destilada
30 g
15 g
1.000 mL
O meio distribudo em tubos de ensaio e autoclavado.
52
21- MTODOS PARA O ESTUDO DE LEVEDURAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

1- Isolar o fungo em cultura pura.
2- Cultivar o fungo em caldo Sabouraud e manter o tubo de cultura a 37C por 48 horas.
Observar: Formao de depsito, Turvao, Floculao, Bolhas, Pelcula na superfcie.
3- Pesquisar a formao de tubos germinativos atravs da inoculao de culturas recentes (2448 horas) em soluo de Bacto-peptona ou soro de cavalo. Incubar a suspenso a 37C
durante 3 a 4 horas (banho-maria).
4- Pesquisar a formao de clamidosporos em gar fub
Preparo do meio de cultura
Fub
Tween 80
Agar
gua destilada qsp
40 g
10 mL
20 g
1.000 mL
-maria
fervente.
Filtrar em gaze (5 camadas). Misturar o filtrado com os demais componentes.
Distribuir o meio de cultura em tubos e autoclavar.
Procedimento:
Colocar 2 mL de agar fub, fundido, em lmina apoiada em suporte de vidro, dentro
de placa de Petri (Todo o conjunto dever estar estril).
Inocular amostra da levedura, estrias finas, e cobrir o gar com lamnula estril. Colocar
dentro da placa chumao de algodo embebido em gua estril. Incubar o conjunto a
temperatura ambiente por 48 - 72 horas.
Fazer leitura microscpica empregando objetiva 40X.
5- Auxanograma - Utilizao de Fontes de Carbono.
Meio Basal:
Sulfato de amnio
Fosfato bicido de potssio
Sulfato de magnsio hepta hidratado
Agar
gua destilada
5g
1g
0,5 g
20 g
1.000 mL
Distribuir o meio em tubos de ensaio e autoclavar.
Procedimento tcnico do auxanograma:

Fazer suspenso da levedura em tubo contendo gua destilada estril (correspondncia
ao tubo no 1 da escala de MacFarland).
Colocar a suspenso da levedura no fundo da placa de Petri.

53
Colocar na placa, o meio basal fundido e resfriado a + 45C. Incorporar a suspenso ao

meio, atravs de movimentos rotatrios com a placa.
Aps solidificao, colocar pequenas pores de cada acar a ser testado, em pontos
pr-determinados da superfcie do meio. Anotar na parte externa do fundo da placa, a
posio correta de cada acar.
Deixar a placa temperatura ambiente por 48 horas.
Leitura e Interpretao:
Presena de halo opaco no local de deposio do acar indica assimilao positiva.
6- Auxanograma - Utilizao de Fontes de Nitrognio.

Meio Basal:
Dextrose
20 g
Fosfato bicido de potssio
1g
Sulfato de magnsio hepta hidratado
0,5 g
Agar
20 g
gua destilada
1.000 mL
A realizao do teste de assimilao de fontes de nitrognio feito fundamentalmente
da mesma maneira j descrita anteriormente, apenas substituindo as fontes de carbono por
fontes de nitrogenio (Ex: Nitratos, Nitritos, Uria, Sais de amnio, aminocidos, etc).
7 - Zimograma - Capacidade Fermentativa.
Meio Basal:
Peptona
2,5 g
Extrato de levedura 2,5 g
gua destilada
1.000 mL
Preparar o meio basal (vrios bales, de acordo com o nmero de acares) e esterilizar em
autoclave.
Em cada balo adicionar 10 mL de soluo a 10% de acar, esterilizada por filtrao.
Distribuir o meio assim preparado, em tubos de ensaio contendo tubo invertido de
Durhan (O volume de meio dever ser suficiente para cobrir o tubo de Durhan).
Inocular a levedura em estudo, em todos os tubos da srie que contem os diferentes
acares.
Deixar os tubos temperatura ambiente durante 5 - 14 dias.
Leitura e interpretao:
Presena de gs dentro do tubo de Durhan indica positividade do teste.
8 - Pesquisa da Presena de Cpsula.
Colocar pequena poro da levedura entre lmina e lamnula, com uma gota de tinta da
china, e examinar microscopicamente com objetiva 40X (colorao negativa).
54

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS UNIFAL-MG

INSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICAS

Professores da Disciplina no 2 Semestre de 2014

Amanda Latrcia Tranches Dias

Micro-organismo - Grupo de organismos, procariontes ou eucariontes, cujas estruturas

Esfregao - Camada de clulas de micro-organismos espalhada uniformemente na rea

Ala e agulha de platina

Leitor de Microplacas (Elisa)

2- NORMAS DE SEGURANA E TRABALHO NO LABORATRIO

3- MTODOS DE COLORAO EMPREGADOS EM BACTERIOLOGIA:

A visualizao de bactrias aps o emprego de mtodos de colorao foi introduzida por

Preparar o esfregao segundo tcnica acima, utilizando cultura de micro-organismo j

Preparar esfregao a partir da cultura de 48-72 horas de Bacillus cereus.

Materiais utilizados para execuo das tcnicas de colorao:

4 - MTODO DE COLORAO DIFERENCIAL DE GRAM

Preparar o esfregao em lmina de vidro, conforme procedimentos detalhados

Interpretao dos resultados: Observar a forma, o arranjo e o comportamento

Soluo de oxalato de amnio 1%

Soluo de uso do cristal violeta

Soluo de iodo-iodeto (lugol)

Soluo para descolorao

Soluo de uso da safranina

5- MTODO DE COLORAO PELA TCNICA DE ZIEHL-NEELSEN (LCOOL-CIDO

Preparar esfregaos empregando clulas mortas de BCG (Bacilos de Calmete Guerin)

Lavar a lmina em gua corrente;

Descorar o esfregao com soluo de lcool-cido clordrico, adicionando o descorante

Lavar novamente a lmina em gua corrente;

Cobrir o esfregao com soluo de azul de metileno durante 2 minutos;

Lavar a lmina, secar e observar em microscopia de imerso (objetiva 100X), conforme

Interpretao dos resultados observados na lmina

2 - Mistura lcool-cido (Descorante)

6- PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

A composio dos meios de cultura utilizados para o crescimento dos micro-organismos

2. Esterilizao dos meios

3. Armazenamento dos meios

Composio dos meios de cultura

1. Em balo acrescentar os componente do meio em 100 mL de gua destilada.

O pH final deve ser ajustado a 7.4 0.2 a 25C

3. Distribuir em recipientes apropriados e autoclavar a 121C por 15 minutos.

7- MTODOS FSICOS DE CONTROLE MICROBIANO

Mtodos Qumicos de Controle Microbiano

8 - TCNICA DE ESTERILIZAO POR FILTRAO

Esterilizar por autoclave um conjunto para filtrao de lquidos;

9- AVALIAO DA EFICINCIA DA AUTOCLAVE NA ESTERILIZAO

O processo de esterilizao atravs do uso da autoclave obtido aps 15 minutos a

colocar ampola contendo esporos de Geobacillus sthearothermophilus junto com o

10 - LAVAGEM DAS MOS

Tcnica da lavagem das mos com Polivinilpirrolidona-Iodo 10% (PVPI)

Tcnica da lavagem das mos com lcool

11- AVALIAO DA AO ANTIMICROBIANA DE ANTISSPTICOS E DESINFETANTES

Principais grupos de desinfetantes e anti-spticos

12- TCNICAS DE INOCULAO DE BACTRIAS EM MEIOS DE CULTURAS

TCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SLIDO INCLINADO

TCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SLIDO EM TUBO (PICAGEM PROFUNDA)

TCNICA DE SEMEADURA EM PLACA EM PROFUNDIDADE (POUR-PLATE)

Realizar diluies de um cultivo bacteriano:

13- IDENTIFICAO DE COCOS GRAM-POSITIVOS

Organismos contaminantes, incluindo bactrias Gram-negativas podem dar resultados

Pesquisa de estreptococos -hemolticos na garganta

b) Preparo do Agar Sangue

Prova de fermentao do Manitol

14- IDENTIFICAO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS PROVAS BIOQUMICAS

A presena do indol detectada pela adio do reativo de Kovacs ao meio de cultura. O