COPROCULTIVOS

MSc. Dora Maurtua Torres

Microbiologa

COPROCULTIVO
- Procedimiento

microbiolgico
Enfermedad Diarreica Aguda.

relacionado

principalmente

con

- La diarrea, afecta a todos los grupos etarios, sin embargo, es una de

las principales causas de muertes infantil en el mundo, superada slo
por las infecciones respiratorias agudas (IRA).
-En nios menores de 2 aos la OMS, define la diarrea como la
produccin de 3 mas deposiciones lquidas o semilquidas en 12
horas, o bien una sola con moco, sangre o pus. En el caso de adultos
la definicin se extiende, aun, a las 24 hrs.
- Las causas ms frecuentes son las infecciosas: bacterias, virus o
parsitos. Tambin se presentan cuadros de intolerancia hacia hidratos
de carbono, y protenas.

AGENTES ETIOLOGICOS DE EDA

La diarrea infecciosa se origina por la multiplicacin de
microorganismos a nivel del tubo digestivo, los que actan
por mecanismos: invasivos, toxignicos, o mixto.
Diarrea Secretoria (No Inflamatoria)
Se caracteriza generalmente por deposiciones lquidas
abundantes, sin sangre, ni moco, ni pus:
- Vibrio cholerae O1
- Vibrio cholerae 0139
- E. coli Enteropatgena
- E. coli Enterotoxigenica
- Clostridium difficile
-Plesiomonas shigelloides

Diarrea Inflamatoria (Invasiva)

Se caracteriza por deposiciones muy frecuentes de escaso
volumen, con presencia de moco y/o sangre, por lo general
con abundantes leucocitos en las heces:
- Salmonella spp (mixta)
- Shigella flexneri
- Shigella dysenteriae
- Shigella sonnei
- Shigella boydii
- Vibrio cholerae no O1, no O139
- E. coli Enteroinvasiva
- Campylobacter spp
- Yersinia enterocolitica
- E. coli Enterohemorragica O157
- Aeromonas spp (mixta)
- Vibrio parahaemolyticus (mixta)

REQUERIMIENTOS DE LA ORDEN
- Fecha
- Nombre completo del paciente
- Edad (Importancia Ej: EPEC, antibiogramas)
- Ingestin de antibiticos (Examen directo patolgico,
cultivo negativo)
- Etapa de embarazo (antibiograma)

OBTENCION DE LA MUESTRA PARA CULTIVO

1.- HECES TOTALES
Examen directo, respuesta inflamatoria, coloracin Gram cultivo.
a. Las muestras fecales deben ser obtenidas, antes del suministro de
antimicrobianos o luego de tres das de haber dejado de tomarlo.
b. Emplear frascos estriles con boca ancha y tapa hermtica.
c. En lo posible colectar las heces directamente en el frasco.
d. Evitar usar papel higinico para la coleccin, este puede estar
impregnado con sales de bario que son inhibitorias para algunos
grmenes fecales.
e. Si se presume demora en la entrega de la muestra, recoger una
porcin de las heces con ayuda de un hisopo, principalmente aquellas
porciones que contengan moco y/o sangre, y colocarlas dentro de un
medio de transporte.
f. Remitir al laboratorio ambos envases hasta en 2 hrs.

OBTENCION DE LA MUESTRA PARA CULTIVO

g. En el caso de infantes se recomienda no usar paales absorbentes,

si no de tela, para obtener la muestra. Tomar una porcin de las heces,
escoger la que muestre moco y/o sangre y colocarla en medio de
transporte Cary and Blair. Enviar al laboratorio el paal y el medio de
transporte en menos de 2 horas.
h. Para la recoleccin de las heces de nios puede colocarse un
plstico nuevo y limpio, cubriendo el bacn y luego transvasar la muestra
a los recipientes antes mencionados.
- Las muestras en medio de transporte pueden aceptarse hasta en 4
hrs de la toma.

OBTENCION DE LA MUESTRA PARA CULTIVO

2. HISOPADO RECTAL
a. Si el hisopo no es comercial, retirar el papel que lo cubre.
b. El paciente deber estar inclinado. La persona que toma la muestra,
usando guantes, deber:
- Expandir los glteos del paciente con la mano izquierda para mostrar el
ano.
- Con la mano derecha, deber introducir la parte algodonosa del hisopo
aproximadamente 1 cm en el recto,
- Haciendo girar el hisopo suavemente para recoger la muestra de las
criptas anales y retirar el hisopo.
- Colocar el hisopo dentro del medio de transporte
- Enviar al laboratorio hasta en 4 horas o menos.

RECEPCIN DE LA MUESTRA
a. Anotar la hora de recepcin de la muestra
b. Anotar la hora de coleccin de la muestra
c. Verificar que la identificacin del paciente sea la misma
en la orden y en el envase.
d. Revisar que la muestra recibida concuerde con la orden.
e. Determinar si el envase es apropiado, Incluyendo el
medio que lo contiene y s el envase est intacto.
f. Examinar la muestra visualmente

CRITERIOS DE RECHAZO
a. Una muestra sin rotulo o mal rotulada es inaceptable.
b. Rechazar las muestras Fecales de ms de dos horas de
coleccin; a menos que se encuentren en un medio de
transporte como Cary Blair.
c. Las muestras de heces no deben estar contaminadas
con orina.
d. No acepte muestras de heces de pacientes despus del
tercer da de hospitalizacin, sin antes de consultar.
e. Hisopos rectales secos, son inaceptables.

PROCEDIMIENTO EN CASO DE RECHAZO Y

SOLICITUD DE NUEVA MUESTRA.
a. No descarte la muestra hasta que el paciente, el
medico o enfermera confirme que se puede colectar una
nueva muestra. Colocar las heces totales en medio de
transporte y mantener en refrigeracin a 4C mientras
tanto.
b. En caso e pacientes hospitalizados, documentar la
razn para el rechazo de la muestra y la solicitud de
nueva muestra
c. Documente el nombre de la persona a quien se le dio
el reporte, la fecha, la hora.
d. Si el paciente ya empez a tomar antibiticos o no se
puede colectar nueva muestra, procesar, indicando en el
resultado el problema de la muestra

EXAMEN MACROSCPICO DE HECES

1. Color: Marrn, amarilla, verdosa, etc.
2. Forma:
- Acuosa: Lquida
- Pastosa: Cremosa, blanda
- Formada: Retiene su forma
3. Aspecto: Brillante, seca, sanguinolenta, agua
de arroz
4. Moco: Presente (+) o ausente (-)
5. Sangre: Presente (+) o ausente (-)
6. pH : cido, alcalino.

Sangre Oculta
- Hemoccult test
- Thevenon

Deteccin de Fecales Leucocitos

1. Lactoferrina fecal (Prueba de latex)
2. Coloracin de azul de metileno: Los
leucocitos se colorean de azul profundo, con
un ligero fondo gris.

Heces

Sangre

EXAMEN MICROSCPICO DE HECES

1. Directo en fresco
- En caso de muestras lquidas colocar dos porciones de la
muestra en un lamina porta objetos, cubrir una con lugol y la
otra con suero fisiolgico. Colocar una laminilla sobre cada
una.
- Muestras formadas: Homogeneizar en 1 mL de solucin
salina y proceder como en el caso anterior.
Observar al microscopio con el objetivo 40X y anotar:
a) Nmero de leucocitos por campo
b) Nmero de Hemates por campo
c) Presencia de hifas o levaduras
d) Parsitos.

2. Directo con coloracin Gram

a) Con la ayuda de una varilla de madera estril, realizar un
extendido fino en lamina y fijar al calor de la llama.
b) Realizar la coloracin Gram, como se indica en el
presente manual.
c) Observar al microscopio con aceite de inmersin y
anotar:
- Presencia de bacilos curvos Gram negativos sugestivos
de Campylobacter.
- Respuesta inflamatoria
- Estado de la flora bacteriana (X)
- Presencia de cocos en racimo
- Presencia de levaduras gemantes e hifas.

G-

G+

Gram negativos (G -) y Gram

positivos (G+)

Formas de Campylobacter

Levaduras e Hifas

Cultivos de rutina:
Siembra Primaria
a) Con ayuda de un hisopo colocar una porcin de las heces,
especialmente aquella que muestre moco y/o sangre, en
cada uno de los primeros cuadrante de las placas con agar
MacConkey, SS (Salmonella y Shigella), TCBS, agar XLD y
agar Sangre Ampicilina. Sembrar por agotamiento. Incubar
las palcas invertidas a 35 - 37C por 18 a 24 hrs.

MC

SS

TCBS

XLD

ASA

b) Colocar aproximadamente 1 gr. de muestra en tubos

conteniendo 10 mL de Caldo Selenito y Agua peptonada
alcalina. Incubar el primero a 35-37C por 12 24 hrs y el
segundo por 18 hrs a temperatura ambiente a 35-37C por
8 horas.
Sub-cultivos
Subcultivar el crecimiento bacteriano de los tubos de Selenito
y APW, en los medios de cultivo apropiados:
- Caldo Selenito: Agar SS.
- Agua Peptona Alcalina: Agar TCBS y Agar Sangre
Ampicilina. Incubar por 18 a 24 hrs y 35-37C.

LECTURA DE PLACAS
1. Crecimiento en agar MacConkey:
Observar por la presencia de colonias aisladas rojas (lactosa
positivas) y colonias translucidas (lactosa negativas). (Rojo
neutro)
Salmonella, Shigella,
Vibrio, EIEC,
Aeromonas y
Plesiomonas: Lactosa
negativa
E. coli, Aeromonas:
Lactosa positiva

2) Crecimiento en Agar SS
Medio empleado para la deteccin de Salmonella y Shigella,
ambos lactosa negativa. (Rojo de Fenol)
La mayora de cepas de Salmonella presentaran el centro de
sus colonias de color negro debido a la produccin de H2S.

Salmonella

Las colonias sospechosas de Shigella, son

transparentes, translcidas u opacas y
suelen ser lisas.

3. Crecimiento en agar XLD

Modo de Accin
- La degradacin de la Xylosa, lactosa y sucrosa a cidos
causa el cambio de color del indicador Rojo de fenol
a color amarillo.
-La produccin de hidrgeno sulfurado se observa como un
precipitado de color negro en el colonia.
-Las bacterias que descarboxilan la lisina a cadaverina
pueden ser reconocidas por la apariencia de una coloracin
prpura alrededor de las colonias debido a un incremento en
el pH.
Estas reacciones pueden producirse simultneamente o
sucesivamente, esto puede causar que el indicador de pH
exhiba varias sombras de color o puede cambiar su color de
amarillo a rojo con incubacin prolongada. El medio de
cultivo es ligeramente inhibitorio.

E. coli
Aeromonas

Amarillas, rodeadas por zonas

amarillas. Opacas con zonas de
precipitacin
.

Las colonias son del mismo color

del medio de cultivo, translucidas.
Shigella

Salmonella

Las colonias son del mismo color

que el medio de cultivo,
translucidas, algunas veces con un
centro negro
.

Apariencia de las colonias

Microorganismos

Amarillas, rodeadas por zonas amarillas. Opacas con

zonas de precipitacin.

E. coli, Enterobacter spp, Aeromonas spp

Amarillas, rodeadas por una zona amarilla, opacas,

mucoides con zona de precipitacin.

Klebsiella

Amarilla rodeada por una zona amarilla, opacas, algunas

veces con centro negro.

Citrobacter (cepas lactosa positivas)

Amarillas rodeadas por una zona amarilla, opacas

Serratia, Hafnia

Amarillas rodeadas por una zona amarilla, translucidas,

con centro negro

Proteus vulgaris, la mayora de P. mirabilis.

Las colonias son del mismo color que el medio de cultivo,

translucidas, algunas veces con un centro negro.

Salmonella

Las colonias son del mismo color del medio de cultivo,

translucidas.

Shigella, Providencia, Pseudomonas.

Naranja, ligeramente opacas

Salmonella typhi (cepa xylosa positiva).

4) Crecimiento en Agar Sangre Ampicilina 20 ug/mL

Especificamente para el aislamiento de Aeromonas, aunque
crecen en agar MacConkey, podra haber confusin pues A.
hydrophyla es lactosa negativa y muchas cepa de A. caviae
son positivas.

Aeromonas hydrophyla

5. Crecimiento en Agar TCBS

El medio es de color verde, la presencia de colonias sucrosa
positivas (colonias amarillas) indica sospecha de V. cholerae
principalmente, o de V. alginolyticus en algunos casos. Con
la presencia de colonias verde azuladas (sucrosa negativa),
se sospechara principalmente de V. parahaemolyticus. (ABT)

IDENTIFICACION
Identificacin Bioqumica Convencional:
Las colonias sospechosas que crecen en las diferentes
placas, se inoculan en medios de diferenciacin
bioqumica
TSI (KIA), LIA, SIM, Agar Citrato de Simmons, MR-VP,
Urea.

TSI AGAR

Rojo de fenol, Lactosa, glucosa, sacarosa, Tiosulfato de sodio, Sales ferricas.

LIA AGAR

LDC +: Cadaverina-amina = Purpura de bromocresol vira a violeta

MEDIO SIM

Control

Movilidad negativa

H2S y movilidad positivos

Indol positivo

Indol negativo

Adicin de Reactivo de Kovacs

Agar Citrato de Simmons

Citrato +: Alcalinizacin y viraje del

azul de bromotimol de verde hacia
azul

Urea

la urea se hidroliza con

formacin de CO2 y
Amonaco. Indicador
Rojo de Fenol.

Medio MR-VP
Este medio contiene peptona, glucosa, y buffer fosfato.
Prueba de Rojo de Metilo:
Los microorganismos que producen una alta acidez al
fermentar glucosa (pH menor de 4.4) se tornan de color rojo
al agregarse el reactivo rojo de Metilo.

Prueba de Voges Proskauer (VP):

Algunos microorganismos fermentadores no producen
suficiente cantidad de cidos estables para bajar el pH del
medio. Para estos microorganismos el producto final del
metabolismo de glucosa es la Acetona.
Despus de 48 horas de incubacin se le agrega de alphanapthol e hidrxido de potasio. Se agita suavemente el tubo
para airearlo. La formacin de un color rojo indica una
reaccin positiva. .

Bacilos Gram Negativos Entericos - Reacciones Bioqumicas ms Comunes

Microorganismo

KIA

LIA

Lac/glu

GAS

H2S

Salmonella typhi

K/A

N*

P**

S. paratiphy A

K/A

S. gallinarum

K/A

S. pullorum

SIM

CIT

MR

OX

K/K

P**

N*

K/A

K/K

K/A

K/K

Salmonella spp

K/A

K/K

P-N

Shigella sonnei

K/A-A/A

K/A

Shigella flexneri

K/A

N-P

K/A

P-N

Shigella dysenteriae

K/A

K/A

N-P

Shigella boydii

K/A

K/A

N-P

E. coli EPEC

A/A

P-n

K/K

E. coli EIEC

A/A-K/A

P-N

K/A

P-N

N-p

Yersinia enterocolitica

K/A

K/A

P-N

P-N

Vibrio cholerae

K/A

K/K

P-N

V. parahaemolyticus

K/A

N***

K/K

N-p

P-N

N-p

Aeromonas hydrophyla

K/A a/a

K/K-K/A

Aeromonas caviae

A/A

K/A

Aeromonas sobria

K/A

K/K

P. shigelloides

K/A

K/K

F. Vibriostatico
Especie

O129
10 ug/150 ug

Cto

O
x

TCBS

TSI
Rx

Gas

H2S

LIA

HE

mInositol

A. hidrophyla

R/R

K/A

K/K

A. caviae

R/R

A/A

K/A

A. sobria bv
sobria

R/R

K/A

K/K

A. veronii bv
veronii

R/R

K/A

K/K

P. shigelloides

S/S

K/A

K/K

A. hydrophyla betahemoltica

V. cholerae

V. parahaemolyticus

Sensibilidad al compuesto Vibriostatico

O129 (500 ug)
Inhibe Vibrio pero no Aeromonas (>15 mm)

Mtodos de Identificacin Comerciales

API 20E - Vibrio

COPROCULTIVOS ESPECIALES
1. Cultivo de Campylobacter
- Sembrar por agotamiento en dos placas con
suplementado con antibiticos, segn Butzler o Skirrow

agar

sangre,

* Butzler: Bacitracin 2500 u/L, Cefazolin 0,015 g/L, Colimycin 10000

Cycloheximide
0,05
g/L,
Novobiocin
0,005
* Skirrow: Polymyxin B 2500 u/L, Trimethoprim Lactate 0,005
Vancomycin
0,01

u/L,
g/L
g/L,
g/L

- Colocar en atmsfera apropiada para su crecimiento (5% O2, 10% CO2,

85% N2), en sistema Anaerocul C mini (Merck) u otro equivalente.
Alternativamente emplear campana con vela.
-Incubar a 37 y 42C por 72 hrs
Identificacin: Las colonias grises, planas e irregulares, que

se aslan en medio selectivo, a 42C, bajo condiciones

microaerbicas, son oxidasa positivas y en el Gram
aparecen como bacilos Gram negativos, curvos o en forma
de S (gaviotas), pueden reportarse como Campylobacter
spp.
Tcnica de Membrana: Se coloca una membrana estril de
acetato de celulosa (0.65 0.45 um de poro) sobre el agar,
depositndose sobre ella 6 gotas de la muestra de heces, e
incubar por 45 minutos a 35-37C.
Retirar el filtro e incubar a 42C por 48 hrs en ambiente
apropiado (5% de O2, 10% CO2, 85% N2).
-Existen antisueros especficos para la identificacin
definitiva de las especies de Campylobacter.

Campylobacter jejuni

2. Cultivo de Yersinia enterocolitica

Las muestras se siembran en agar Salmonella Shigella con
Deoxycholato de Sodio y Cloruro de Calcio (SSDC).
Incubandose por 24-48 hours at 30C
Modo de accin: La biota acompaante Lactosa positiva se
observa de color rojo, por la fermentacin de lactosa (rojo
neutro).
Las colonias de Y. enterocolitica son incoloras. Muestran una
alta tolerancia a las sales biliares y especialmente al
desoxycholato, mientras la biota acompaante es casi
completamente inhibida, debido a las sales biliares en
combinacin con las altas concentraciones de citrato de
sodio y el contenido de verde brillante.

Agar SSDC Yersinia

Las colonias de Yersinia

enterocolitica son redondas,
incoloras, con un diametro de
1 mm. En un estereoscopio a
una magnificacion de 10X, se
puede observar el centro con
granulaciones finas.

3. Cultivo de E. coli Enterohemorragica EHEC

Sembrar por agotamiento en agar MacConkey Sorbitol e
Incubar a 35-37C por 18 a 24 hrs.
- Una mezcla de sales biliares y cristal violeta
inhibe el crecimiento de la biota Gram. positiva.
- La adicin del suplementos como Telurito
de
potasio Cefixime, incrementa la selectividad para
el aislamiento de E. coli 0157:H7 y suprime la
biota acompaante.
- El indicador de pH rojo neutro, se usa para
detectar las colonias sorbitol-positivas, que se
tornan rojas. Las colonias Sorbitol-negativas, son
incoloras.
- La identificacin definitiva del microorganismo se
realiza en base a los antisueros comerciales
somticos y flagelares.

E.coli O157:H7,
sorbitol negativas.

Otros:
1. E. coli enterotoxigenica (ETEC): Su identificacin requiere de la
deteccin de las toxinas LT o ST, procedimientos costosos, que
implican pruebas de ELISA o de Latex.
2. En el caso en que la diarrea haya sido precedida en los 2 meses
previos por un tratamiento antibitico, tratamiento quimioterpico u
hospitalizacin, deber adems descartarse Clostridium difficile
como causante de colitis seudomembranosa. La tardanza en
disponer de este resultado hace que sea de utilidad la
determinacin en heces de las toxinas A y B de este
microorganismo mediante un enzimoinmunoanlisis.

Clostridium difficile

REPORTE DE RESULTADOS
1. Informe preliminar
2. Resultado Final: Formato, revisin.