Comparacin entre sistemas extractantes en extracciones de lpidos de semillas

Fundamento:
Como ensayo de optimizacin de la extraccin de los lpidos, se determinar la variacin en la
composicin de cidos grasos de los extractos de aceite de semillas, obtenidos con diferentes
mezclas extractantes.
Los sistemas extractantes empleados en estas pruebas sern:
A.
B.
C.
D.

Cloroformo/metanol/agua (1:2:0,8, v/v/v)

Hexano/etanol (1:2,5, v/v)
n-Butanol
Etanol (96%)

Con los sistemas A y B se utilizar el mtodo de Kates (1988), que consiste en una
modificacin del de Bligh y Dyer (1959). Mediante este procedimiento, los lpidos son extrados
primeramente en un sistema monofsico a partir del cual se forma seguidamente un sistema bifsico
para la separacin y purificacin final. Este sistema bifsico est compuesto por dos fases: una rica
en lpidos (extracto) y otra fase hidroalcohlica pobre en lpidos (refinado). Para los sistemas Cy D
no es preciso este ltimo paso de purificacin final en sistema bifsico.
Los cidos grasos se determinan como steres metlicos tras una reaccin de metilacin, para
a continuacin ser inyectados en el C.G., y mediante comparacin de sus tiempos de retencin con
otros obtenidos de patrones puros, cuantificar e identificar el contenido.
La reaccin de metilacin se produce con cloruro de acetilo y metanol. Se trata de una
catlisis cida:
CH3-COCl +

cloruro de acetilo

CH3OH (exceso) CH3-COO-CH3 + HCl

El cido clorhdrico queda disuelto en el exceso de metanol. En medio cido fuerte, los
cidos grasos se esterifican para producir los steres metlicos:
H+
R-COOH + CH3-COO-CH3 R-COO-CH3 + CH3-COOH
Material:
- Pipetas de 5 y 1 mL
- Pipetas Pasteur
- Soluciones extractantes
- Tubos de rosca
- Cloruro de acetilo
- Metanol
- Patrn interno
- Cromatgrago de gases
Procedimiento:
En estas pruebas, se usarn 1 mL de cada uno de los sistemas extractantes por cada 50 mg de
biomasa liofilizada y homogeneizada y se realizar la extraccin a 60/C durante 10 min bajo
constante agitacin y en atmsfera de nitrgeno. La mezcla obtenida se filtrar mediante filtros de

fibra de vidrio (100-160 mm). El residuo se lavar con el sistema extractante ensayado, aadiendo
seguidamente este lavado al filtrado anterior.
El sistema A (cloroformo/metanol/agua, 1:2:0,8), monofsico, se transforma en bifsico
aadiendo 1,9 ml de cloroformo y 1,9 mL de agua, resultando el sistema bifsico
cloroformo/metanol/agua 1:1:0,9, (v/v/v), compuesto por una capa superior hidroalcohlica
(refinado) y una capa inferior clorofrmica (extracto) donde quedan disueltos la mayora de los
lpidos.
El sistema B aparece representados en el diagrama de fases hexano/etanol/agua (Figura)
basado en los datos de equilibrio para este sistema (Bonner, 1910). El sistema B se transformar en
el bifsico B' aadiendo 0,5 mL de hexano y 0,5 mL de agua, de manera que puedan separarse un
refinado o capa inferior hidroetanlica y una capa superior hexnica (extracto) con la mayora de
lpidos.
Las disoluciones lipdicas finales son evaporadas en corriente de nitrgeno y metiladas para
su anlisis mediante cromatografa gaseosa.
Metilacin de los cidos grasos
En un tubo de ensayo de rosca, ubicar aproximadamente 1 mg de aceite, y 5 :L patrn interno
C19:0 (25 mg/mL tolueno) 1 mL mezcla metilante 1:20 (CH3COCl: CH3OH). Observar toda
precaucin al formar la mezcla metilante, se trata de una reaccin muy exotrmica.
Realizar la metilacin a 100 C durante 1h, con agitacin cada 10 minutos. A continuacin,
enfriar e interrumpir el proceso.
Cuando los tubos estn fros, aadir 1 mL de H2O. Realizar la extraccin: 3x1 mL de
hexano: extracto conjunto (steres metlicos-hexano), reservar el extracto. A continuacin, llevar a
sequedad, con N2, a continuacin, resuspender en 0,5 mL de hexano, y ubicar esta solucin en un
vial, con pipeta Pasteur..
La muestra del vial que se inyecta en el cromatgrafo es 5 :l; por lo que debe de haber 1,25
:g de patrn.
Condiciones de operacin en el cromatgrafo de gases:
El mtodo para analizar los cidos grasos requiere unas condiciones especiales. El programa debe
de adquirir los siguientes datos:
Columna capilar usada: Supelco, alta polaridad (SP2330).
Flujo del gas portador (N2): 0,75 L, min-1.
T inyector: 220 C
T inicial del horno: 150 C
T detector: 260 C
T final del horno: 206 C
Programa de temperaturas en el horno:
T inicio:205 C
rampa: 6 C/min
T final: 240 C
tiempo final a Tf = 205 C: 10 min.

210
200
190
180

T C
170
160

150

lculos:

140
1

13

17

Re
tiempo (min.)
co
ret
est Programa de temperaturas en el horno del cromatgrafo
co

solver el cromatograma por

mparacin de los tiempos de
encin de cada pico con otros
ndar de tiempo de retencin
nocido.

rea total de picos: A

rea del patrn: B
rea real: a-b = C
lpidos saponificables (p/p): 0,00125 x (C u.a./B u.a.) x (0,5 mL hexano/0,005 mL hexano)
% de un cido graso en particular de rea d: d x A/C

Esquema simplificado de un cromatgrafo de gases

3000

4000

5
9.882

10
Tiempo ( min .)
15

Cromatograma de aceite de oliva

Diagrama de Fases para las mezclas hexano-Etanol-Agua

17.690

15.651
15.922
16.498
16.782

13.618
14.164
20.562 14.423
14.962

13.999

18:2n6
18:1n9
19:0 (patrn interno)
18:0
15.305

14.589

13.441
13.798

10.584

16:0

12.527

10.875

1.0e4

11.224
11.421
11.653
11.863
12.074
12.178
12.625
18.067

9.139

7.661

14:0

10.798

9.456

8.444

5000
8.206
8.661

4.614

2.856

12:0

6.917

6000

6.097

8000
10:0

5.206
5.373

7000

3.196

9000

2.099

1.2e4

3.552

2.230

Seal del detector

1.1e4

2000
20

tados y clculos:

Resul
- Representar grficamente en el diagrama ternario los sistemas monofsico y bifsico,
respectivamente
- Realizar tablas con porcentajes de pureza y recuperacin para cada cido graso en cada sistema
extractante.