Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

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PRCTICA
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLTICAS
MTODO DE KUNITZ.

Nombre: Rodrguez Elizarraras Miguel ngel

Grupo: 5QM1
Seccin: 2
Maestra: LARIOS SERRATO VIOLETA
Fecha de entrega: 13-oct-15

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Objetivos
Elaborar una curva estndar de actividad enzimtica
Determinar la actividad proteoltica de la bromelana, papana y
otras proteasas.

Introduccin
Las enzimas son macromolculas que sirven de biocatalizadores para las
reacciones que se llevan a cabo dentro de una clula eucariote como
procariote. Las enzimas funcionan disminuyendo la energa de
activacin (G) de una reaccin, de forma que se acelera
sustancialmente la tasa de reaccin. Las enzimas no alteran el balance
energtico de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo
tanto, el equilibrio de la reaccin, pero consiguen acelerar el proceso
incluso millones de veces. Una reaccin que se produce bajo el control
de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio
mucho ms deprisa que la correspondiente reaccin no catalizada. Para
llevar a cabo su funcin las enzimas tienen un sitio activo en donde
ingresa el sustrato para formar un complejo enzima sustrato y despus
tener la enzima y el producto.
Las enzimas se pueden clasificar en:
-Liasas
-Oxidoreductasas
-Isomerasas
-Transferasas
-Hidrolasas
-Isomerasas
Las enzimas proteolticas o proteasas son un grupo de enzimas que
descompone en unidades ms pequeas las protenas.
Estas rompen la cadena larga de molculas que forman las protenas
formando fragmentos ms cortos llamados pptidos que son molculas
formadas por aminocidos. Estn presentes en bacterias y plantas pero
son ms abundandantes en los animales. Las enzimas proteolticas o
proteasas
se
denominan
tambin
proteinasas.
Las proteasas se producen de manera natural en el organismo y
constituyen entre el 1% y el 5% del contenido gentico. Estas enzimas
juegan en la descomposicin de largas cadenas proteicas en fragmentos
cortos partiendo el enlace peptdico que une dos aminocidos, as como
tambin determinan el tiempo de vida de otras protenas que juegan un
papel fisiolgico importante como son las hormonas, los anticuerpos u
otras enzimas.

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Resultados
Tubo
T1
T2
T3
T4
T5

y
y
y
y
y

1
2
3
4
5

Concentracin de
Tripsina (mg/mL)
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20

TI
TII
TIII
TIV

y
y
y
y

I
II
III
IV

Bromelana 1:10
Bromelana 1:20
Papana 1:2
Papana 1:4

A280
Problema
0.397
0.192
0.216
0.293
0.419

Se toma la
absorbanci
a del
testigo 1
como
referencia
para las
otras
absorbacias
.

Testigo
0.089
-0.248
-0.243
-0.247
-0.228

PROBLEMAS
0.975
0.580
0.546
1.387

-0.239
-0.113
0.213
0.552

A280 corregida
0.308
0.103
0.127
0.204
0.33

0.886
0.491
0.457
1.298

Curva de la actividad enzimtica de tripsina.

f(x) = 0.01x + 0
R = 0.92

0
0
0
0

Linear ()
0
0
0
0
0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Cuntas unidades Tripticas hay por mg de tripsina?

R= 0.00044 UT/mg
[UT]mg= m/tiempo
[UT]mg= 0.0088/20
[UT]mg= 0.0181
Tubo

Unidades Tripticas

A280 corregida

Fig. 1 Curva de la actividad enzimtica de la tripsina sobre la protena casena.

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1
7.04x10-4
0.308
-3
2
1.448x10
0.103
3
2.172x10-3
0.127
4
2.89x10-3
0.204
-3
5
3.62x10
0.33

Curva de actividad enzimtica especifica

0.35

0.3

f(x) = 1.9x - 0.07

R = 0.92

0.25

0.2
Linear ()

0.15

0.1

0.05

0
0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

a) Indique la actividad especfica, en unidades trpticas por gramo de muestra de

la pia (bromelana) y la papaya (papana)
Fig. 2 Curva de la actividad enzimtica especfica para la digestin de casena por
tripsina. X y sustituimos: X=yUtilizando la ecuacin de la recta despejamos
b/m
Bromelana 1:10 A 280= 0.886, X=0.886-0.1709/0.3625=
1.9726x10(dilucin)/25(g de pia) =0.7890UT
Utilizando la ecuacin de la recta despejamos X y sustituimos: X=yb/m
Bromelana 1:10 A 280= 0.491, X=0.491-0.1709/0.3625=
0.8830x20(dilucin)/25(g de pia) =0.7064UT
Utilizando la ecuacin de la recta despejamos X y sustituimos: X=yb/m

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papana 1:2 A 280= 0.457, X=0.457-0.1709/0.3625=0.7892

x2(dilucin)/25(g de pia) =0.0631UT
Utilizando la ecuacin de la recta despejamos X y sustituimos: X=yb/m
papana 1:4 A 280= 1.298, X=1.298-0.1709/0.3625=3.109
x4(dilucin)/25(g de pia) =0.4974UT
Preguntas adicionales

a) Defina actividad enzimtica y actividad enzimtica especifica

Se define la unidad de actividad enzimtica (U) como la cantidad de
enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto.
La actividad enzimtica especfica es el nmero de unidades de enzima
por miligramo de protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin
(U/ml).
b) Escriba la clasificacin de las proteasas, en funcin de su
mecanismo de accin y diga en que grupo se ubican las
determinadas en la prctica
-Oxidorreductasas (Catalizan reacciones de oxidorreduccin, es decir,
transferencia de hidrgeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro)
-Transferasas (Catalizan la transferencia de un grupo qumico (distinto
del hidrgeno) de un sustrato a otro)
-Hidrolasas (Catalizan las reacciones de hidrlisis)
-Liasas (Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos)
-Isomerasas (Catalizan la interconversin de ismeros)
-Ligasas (Catalizan la unin de dos sustratos con hidrlisis simultnea de
un nucletido trifosfato, ATP, GTP, etc.)
-Proteasas ( Endopeptidicas, Exopeptidicas )
c) para que se adiciona cistena en las muestras de pia, y de
ablandador? (ver preparacin de reactivos)
Este se adiciona ya que la bromelna y la papana contienen en su
composicin en sus residuos terminales cistena y al agregar ms de
esta se efecta la reaccin y poco ms rpido al favorecer la
actividad enzimtica
d) cul es la especificidad de enlace de la tripsina?
La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces
peptdicos de las protenas mediante hidrlisis para formar pptidos
de menor tamao y aminocidos. La especificidad de sustrato de la
tripsina es la Lisina y la Arginina.
Discusiones

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Para realizar esta prctica se hizo uso de 3 enzimas con

actividad proteoltica diferente, se determin la actividad de dos de
estas a partir de la construccin de una curva de actividad especfica.
Esto se logr al trazar una recta tangente sobre la curva, con cuya
pendiente es posible calcular las UT por mg para casena usando Tripsina
en
un
minuto
de
digestin.
El uso de casena y no otra protena es debido a que esta tiene un alto
contenido de aminocidos aromticos en su estructura (Phe. Tyr, Trp) lo
cual se desea ya que estos sern las especies absorbentes una vez que
la degradacin se lleve a cabo.
En la tabla se puede observar diferentes variaciones en los tubos
testigos aunque todos se realizaron de la misma manera hubo
diferencias en los tubos testigos los cuales salieron por debajo de lo
esperado, esto afecta en la absorbancia corregida lo cual nos va a dar
variaciones, y lo conveniente fue tomar el valor de absorbancia del
testigo 1 para las dems valoraciones.
En las grficas se tuvieron que eliminar los primeros valores ya que este
afectaba la lectura de la misma ya que este valor se sala del rango y
afecta la valoracin de la recta esto se piensa que fue debido a que el
analista no tomara el tiempo y pausas adecuadas en las temperatura a
las que se llev acabo su experimentacin, ya que el trabajar con
enzimas se debe de tener mucho cuidado ya que se pueden
desnaturalizar muy fcilmente. Las condiciones de 37 C y el hecho de
que fuera preparada en una matriz de HCl da una idea de las
condiciones a las cuales la enzima tiene una actividad optima, ya que si
la temperatura aumenta, la desnaturalizacin de la enzima sucede
principalmente en el sitio activo de esta (ya que es una protena globular
de 224 aminocidos), impidiendo la reaccin de catlisis que esta lleva a
cabo. La reaccin se detuvo con TCA debido a que la casena, al
acidificarse el medio por debido de un pH de 4.7, esta precipita, lo cual
impide que la reaccin siga llevndose a cabo, en conjunto con el
proceso de refrigeracin de los tubos en donde se llev a cabo la
reaccin, en el cual se remueve la energa calorfica que funciona como
energa de activacin de la reaccin.
La lectura a 280 nm (regin UV) se llev a cabo en celdas de cuarzo, ya
que las de plstico comunes o de vidrio no son capaces de transmitir
estas longitudes de onda, debido a que desvan la radiacin en mucho
mayor proporcin que el cuarzo, se observ que el espectrofotmetro no

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contaba con las celdas adecuadas en cuanto a tamao, lo

cual provocaba que incidiera luz parasita en el detector, pero en este
caso no tiene influencia alguna, ya que se trata de luz visible la cual no
es registrada.
Al comparar la actividad de estas dos enzimas se observa que la
bromelaina tiene una actividad proteoltica mayor que la papana. Esto
puede deberse a que la papana tiene una concentracin muy baja, y
esta est contenida en sal yodada, la cual al entrar en contacto con la
solucin de protenas puede provocar debido a un efecto de salting out
la precipitacin de estas por exclusin de ellas de la matriz acuosa,
afectando de forma directa las absorbancias registradas.

Conclusiones

El efecto de la concentracin de la proteasa se refleja en la

cantidad de producto hidrolizado a mayor concentracin mayor
capacidad de hidrlisis y por ende mayor producto (a.a. y
pptidos). El factor de correccin es de gran relevancia pues evita
un incremento en el error experimental y analtico.
Las unidades trpticas permiten evaluar la cantidad de enzima
generada tras un aumento en la absorbancia en funcin del
tiempo de la digestin.
Se concluye que el mtodo de Kunitz es un mtodo confiable para
cuantificar actividad enzimtica

Referencias

Stryer L.. (1995). Bioqumica. Revert. Espaa.263-275.

Lenhninger A., Nelson D., Cox M., (1999), Principios de
Bioqumica. Ediciones Omega.115pp.
Buttle J. D., (1998), Handbook of Proteolytic Enzymes, Academic
Press London, 558pp.