Questes de reviso da aula anterior

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Descreva sucintamente a evoluo da classificao dos seres

vivos.
Refira as principais diferenas na parede e membrana celulares
entre o Domnio Bacteria e Domnio Archea.
Escolha 3 caractersticas para distinguir clulas que pertenam ao
reino Fungi e ao reino Protista.
No filo Ascomicota encontram-se fungos com reproduo
assexuada por esporulao e por gemulao. Explique as
diferenas e d exemplos.
Os fungos tm um papel muito importante no desenvolvimento
sustentvel de processos biotecnolgicos. Comente, justifique e d
exemplos.
Selecione uma espcie de fungo e descreva-o: filogenia,
morfologia, reproduo, nutrio, interesse, etc.

Condies de cultura

Requisitos nutricionais
Meios de Cultura
Temperatura
Necessidades gasosas
pH
Presso osmtica
2

Requisitos nutricionais

Os microrganismos necessitam de assegurar

as suas funes vitais:

Produo de energia
Sntese de biomassa

NUTRIENTES

Principais requisitos nutricionais

gua: 80-90% peso

Macronutrientes:

C, O, H, N, P, S,

Micronutrientes:

Elementos mnimos

Mg, Co, Cu, Zn,

Cofactores - enzimas

Exigncias suplementares

Factores de crescimento
Nutrientes acessrios, no podem ser
sintetizados na clula

Necessrios a microrganismos auxotrficos

Aminocidos, purinas, vitaminas

(ex. Mutantes)

Microrganismos prototrficos - no requerem

factores de crescimento (maioria dos fungos)

Fontes de Carbono

Heterotrficos

Autotrficos

Carbono orgnico, principal fonte

Compostos utilizveis depende do tipo de
microrganismo
CO2 principal e exclusiva fonte de C
Converso de CO2 em compostos orgnicos,
processo reductor que requer energia.

Autotrficos facultativos

Ex. bactrias
6

Classificao dos microrganismos de acordo com as

fontes de carbono e energia

Fonte de Energia

Fonte de Carbono
CO2

LUZ

Composto inorgnico

Composto orgnico

Fotoautotrfico
Algas, bactrias fotossintticas

Quimiolitoautotrfico
Bactrias nitrificantes e
oxidantes de enxofre

Carbono orgnico

Fotoheterotrfico
Bactrias fotossintticas,
Archea halfilas

Quimiolitoheterotrfico
Archea metanotrficas

Quimioorganoautotrfico

Quimiorganoheterotrfico

Bactrias metilotrficas autotrficas

Fungos, protozorios,
Maioria das bactrias
7

Meios de cultura

Permitem promover o crescimento das clulas,

in vitro
Incluem nutrientes indispensveis sob forma
assimilvel
Nutrientes presentes em quantidades no
txicas e no limitantes
O meio de cultura deve simular o mais possvel
o meio de onde o microrganismo foi isolado
satisfazendo todos os requisitos nutricionais
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Meios de cultura

Constitudos por uma base mineral suplementados por uma fonte de:
Carbono
Energia
Azoto
Heterotrficos
Heterotrficos
Factores de crescimento

Autotrficos

Tipos de Meios

Estado Fsico

Composio qumica

Lquido
Slido
Semi-slido
Quimicamente definidos
Quimicamente complexos

Funcionalidade

Simples
Selectivos
Diferenciais
Enriquecidos
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Meios slidos

Adio de agar agente

solidificante.
Polissacrido complexo,
extrado de algas.
Solues a 1-1.5 % fundem
a 100 C e solidificam
quando T<42 C.
No biodegradvel, no
perde poder solidificante.
Permitem um meio firme ao
crescimento de colnias.
Relativa clareza permite
visualizao das colnias.
Muito til para isolamento
de microrganismos.
11

Tcnicas de isolamento em agar

12

Tcnicas de isolamento em agar

Para microrganismos
anaerbios

13

Meios semi-slidos

Consistncia pouco firme

Agente solificante 0.3 a 0.5 % (agar)

Permite motilidade

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Composio qumica

Quimicamente definido

Composio qumica rigorosamente conhecida

Utiliza-se para microrganismos cujas exigncias
nutricionais so claramente conhecidas

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Meios complexos

No se conhece a composio exacta

Nutrientes complexos

Extracto de carne
Extracto de levedura
Peptona
Leite
Extracto de solo

Substncias complexas contendo:

Aucares, aminocidos, vitaminas, sais,...

Aplica-se a uma gama alargada de

microrganismos

Factores de crescimento no conhecidos

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Tipos de Meios

Exemplo: O meio LB (Luria-Bertani

broth) utilizado para crescimento e
manuteno de bactrias.
Composio:
Triptona 10 g/L;
Extracto de levedura 5 g/L;
Cloreto de sdio 10 g/L.

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Constituintes dos meios complexos

Extractos:

Tecidos eucariotas (levedura, bife, fgado, corao, plantas,

etc) so extrados por fervura e depois concentrados e secos
at consistncia de pasta ou p. So fonte de amino cidos,
vitaminas, coenzimas...

Peptonas:

Misturas complexas de componentes orgnicos e inorgnicos

obtidos por digesto de tecidos que contm protenas de
animais, tais como musculo de bife, gelatina, casena, cerais,
etc... So productos comercializados em p. As peptonas
contm principalmente peptidos e amino cidos.
Ex: Triptona: resulta da digesto da casena
Ex: Fitona: resulta da digesto de soja
Ex: Peptona: Resulta da digesto de musculo de bife.

Peptona numa concentrao de 0.1% tambm usado como

diluente.
18

Meios selectivos

Suprimem o crescimento de microrganismos

indesejveis
Permitem isolamento de culturas puras ou
axnicas a partir de culturas mistas

Ex: sais biliares inibem crescimento de bactrias

Gram+
Outros agentes:

Antibiticos, cidos, oxignio, pH,...

19

Meios selectivos
Exemplo: Sabouraud Dextrose Agar (SDA) inibe o crescimento de muitas
bactrias, selectivo para leveduras e fungos

20

Meios diferenciais

Meios que no inibem o crescimento mas

permitem distinguir tipos de microrganismos

Diferenciao:

Cor e tamanho das colnias, cor do meio, etc

Ex: agar MacConkey usa-se para isolar

enterobactrias patognicas; permite tambm
distinguir entre microrganismos que fermentam a
lactose.

Meio selectivo-diferencial

21

Meios diferenciais
Exemplo: CNA (agar com sangue) permite diferenciar
Estafilococos de Estreptococos

Staphylococcus (growth, yellow colonies) vs.

Streptococcus (growth, white colonies)

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Meios diferenciais e selectivos

Exemplo: MSA permite
seleccionar o gnero
Estafilococos e diferenciar
entre fermentativos e no
fermentativos

Exemplo: MAC selectivo

para gram negativas e
diferencia entre
fermentativos e no
fermentativos

MSA: crescimento/fermentao

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Meios enriquecidos

Permitem o crescimento de uma espcie em

detrimento de outras
So muito nutritivos

Favorecem crescimento de microrganismos de

crescimento fastidioso

Ex: Strepcoccus pyogenes; Haemophillus influenza

Ex: meios de agar/sangue; agar/chocolate,...

24

Meios enriquecidos

Exemplo: Agar Sangue

Exemplo Agar chocolate

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Temperatura

O microrganismo apresenta a sua temperatura

ptima, mas tambm sobrevive a temperaturas
mais altas ou mais baixas. De acordo com a
temperatura, os microrganismos podem ser
classificadas em:

- psicrfilos: cresce abaixo de 15 C (latente);

- mesfilos: entre 20 - 40 C;
- termfilos: entre 45 - 55 C;
- estenotermfilos: entre 65 - 80 C.

Fungos: mesfilos (filamentosos (20 a 25oC) < leveduras (25 a 30 0C)

26

Necessidades gasosas

De acordo com o a necessidade de oxignio:

- aerbios: crescem na presena de O2;

Aerbios estritos dependem totalmente da respirao aerbia

- anaerbios: crescem na ausncia de O2;

Anaerbios estritos- O2 letal

Anaerbios aerotolerantes- metabolismo exclusivamente
anaerbio, mas O2 no letal

- anaerbios facultativos: crescem tanto com ou sem O2;

- microaerfilos: crescem em concentrao de O2 menor do
que a do ar atmosfrico (5% O2).
Fungos so em geral aerbios e alguns so anaerbios facultativos

Podem suportar altas concentraes de CO2 e baixas de O2

Exemplo: Penicillium roqueforti suporta dentro de queijo 80 % CO2 e 4% O2

27

Necessidades gasosa

Anaerobiose ou microaerofilia

Jarro de anaerobiose

Catalisador: paldio

Pacote
gerador de
gs
Indicator de anaerobiose

28

pH

Microrganismos acidfilos pH entre 1.0 e 5.5

Microrganismos alcalfilos pH entre 8.5 e 11.5
Microrganismos neutrfilos pH entre 5.5 e 8.0

Fungos preferem meios cidos, pH 5-6 mas toleram uma ampla

gama de pH: 2,5 a 9,5
Bactrias preferem meios neutros

Substncias tampo

Adicionadas ao meio para manter o pH dentro da gama ptima de pH de

crescimento do microrganismo. Ex: fosfatos de potssio e sdio, e carbonato de
clcio. Impedem variaes bruscas de pH resultantes da produo metablica de
cidos e bases. Nota: Peptona poder tamponante.

Indicadores de pH

So adicionados ao meio para detectar alteraes na concentrao de H+

durante o crescimento de um microrganismo, como por exemplo para avaliar a
fermentao de hidratos de carbono. Muito utilizados em meios diferenciais. Ex:
Prpura bromo-cresol, azul de bromo-tiomol e vermelho de fenol

29

Presso osmtica

Usam-se substncias para manter o equilbrio do

meio, impedem que a clula se rompa (NaCl 0.5 %
ou sacarose 0.1 %) .
Atividade da gua, 0<aw<1

Em geral >0.98

Fungos so em geral xerfilos (amigo do seco); Conseguem

crescer em condies de aw< 0,84
Fungos filamentosos<leveduras<bactrias

Microrganismos halfilos

Adaptados a concentraes de sal elevadas >0.2 M

5.5 M NaCl aw = 0.75 Archaebacteria

Microrganismos osmoflicos

Adaptados a concentraes de acar elevadas ou elevado

ndice de desidratao
30

Meios de cultura
Fungos filamentosos

Meios de cultura ricos e complexos

Meio de agar com batata e dextrose PDA (rico em aucar)

Meios ricos em acar favorecem crescimento vegetativo

Meios menos ricos em acar favorecem esporulao

Exemplo PCA- batata, cenoura e agar.

Agar de Extrato de Malte (MEA)

Agar de Czapek (CZ)

Meio CZ apenas permite crescimento de espcies

capazes de utilizar o nitrato como fonte de azoto

Cultura de Fungos filamentosos

Crescimento em meio liquido

Inoculao

Suspenso de espros
Suspenso de miclio

Agitao

Quebra das hifas

Miclio mais disperso e homogneo

Fungos filamentosos- Prtica (MB)

Crescimento em meio slido PDA

Inoculao do agar em caixa

Soluo de espros em Tween 80 (0.05%)

Poro de miclio

Incubao

Medir crescimento (dimetro)

Meios de cultura
Leveduras

Meios de cultura ricos e complexos

Meio YPD Extrato de levedura, peptona, dextrose

Peptona 20 g/L
Extracto de levedura 10 g/L
Glucose 20 g/L
YPDA- adiciona-se 20 g/L de agar

Meio de Sabourough Meio rico em carbohidratos, favorece o

crescimento de fungos e leveduras em detrimento das bactrias

Adicionando cloranfenicol e cicloheximida permite isolar dermatfitos

Meio YNB- Yeast Nitrogen Base

sem/com aminocidos; sem/com sulfato de amnio

Utiliza-se para estudar a utilizao de fontes de carbono

Cultura de leveduras
Colnias bem definidas em meio slido

Turvao do meio lquido indicando

crescimento celular suspenso
homgenea

Engenharia Clnica
Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica
Introduo Bioengenharia I
Mestrado em Biotecnologia
2014-2015

Isabel Belo/DEB

Tecnologia de cultura de
clulas microbianas
Mdulo II

Tcnicas de Preservao de microrganismos

Tcnicas de esterilizao e desinfeco

Preservao

Objectivo

Conservar material biolgico garantindo:

ausncia de contaminao
perdas de viabilidade
ausncia de alteraes genticas

Culturas stock

Industria:

Laboratrios acadmicos:

estirpes referncia para testes de patologia

Taxonomistas:

manter estirpes que desempenham determinadas

reaes

Laboratrios mdicos:

manter as estirpes de produo

grande n de culturas para fins comparativos

Investigao:

Culturas puras com caractersticas inalterveis

Mtodos de preservao
Aspectos a ter em conta

Manuteno da viabilidade
Alterao da populao
Alterao gentica
Pureza
Custo
N de culturas
Valor da culturas
Fornecimento e transporte
Frequncia de uso das culturas

Mtodos de preservao
Armazenamento no frio (Sub-cultura)

Inoculao de meio fresco em tubo ou frasco

Incubao a T adequado

Armazenamento (ex. 5 C)

Reduzir entrada de ar parafina liquida

Baixo custo de equipamento

Elevado trabalho manual (repicagens
frequentes)
Tempo de armazenagem < 1 semana

Mtodos de preservao
Armazenamento no frio (Sub-cultura)

Inoculao de meio fresco slido

Caixa de agar ou agar em tubo inclinado

Armazenamento (ex. 5 C)
Baixo custo de equipamento
Elevado trabalho manual (repicagens
frequentes)
Risco de desidratao e contanimao
Risco de alterao da populao aumenta com
o n de sub-culturas
Tempo de armazenagem 1 a 3 meses

Secagem

Desidratao

Remoo de gua e preveno da rehidratao

Aplicvel a fungos e algumas bactrias

Ex. secagem em slica gel (5 anos)

Secagem em papel, armazenamento em caixas
hermticas
Em suportes pr-secos de amido, dextrano, ,
Em discos de gelatina

Liofilizao (Freeze drying)

A gua removida por sublimao de uma

amostra congelada

Liofilizao

A gua removida por sublimao de uma

amostra congelada

Os organismos so suspensos num meio adequado,

congelados e expostos a vcuo.
Aps liofilizao as clulas so guardadas em vcuo ou num
gs inerte em ampolas individuais.

Liofilizao

Armazenagem do produto liofilizado

temperatura ambiente ou 4C 8C
Humidade residual 1 a 3%
Facilidade de transporte e
armazenamento
Durabilidade alta

Vrios anos

Pode ocorrer perda de

viabilidade celular
(mantem at ~30 %)

Desvantagens: equipamento caro

Reativao das clulas

Abrir as ampolas em
ambiente assptico

Usar uma pequena

quantidade de meio para
hidratar as clulas

Inocular meios slidos

e lquidos

Avaliar a viabilidade
celular

Criopreservao

A gua torna-se inacessvel por congelao

Pode ocorrer danos celulares no processo de

congelamento/descongelamento
Adio de crioprotectores

Ex: glicerol (10% v/v) e DMSO (5% v/v)

Congelao

De -20 C a -196C
-80 C (arcas) vials com esferas e glicerol
-140 C (Nitrognio em fase vapor)
-196C (Nitrognio em fase lquida)

Criopreservao

Em tubos especficos

Com esferas para adeso celular

Com crioprotetores

Equipamento caro
Elevada manuteno da viabilidade celular
Grande durabilidade da estabilidade das
culturas

Tubos criognicos

Coleces

Colees de culturas de microrganismos

instrues especficas para aquisio, manuteno e

distribuio

tcnicas de preservao utilizadas devem garantir a

manuteno do potencial do microrganismo

material biolgico microbiano certificado garantia de

qualidade e autenticidade

Coleces de culturas de microrganismos

Funes

Coleccionar e catalogar
Manter
Fornecer

Desenvolvimento de bases de dados

Regulamentao dos depositrios e clientes
Regulamentao do transporte

Requisitos

Definio da natureza do material biolgico e do

grupo de risco

Equipa qualificada e treinada

competncia para trabalhar com os microrganismos da coleo

conhecimento dos procedimentos de higiene e biossegurana evitar contaminao de amostras e riscos de infeco

Dependncias fsicas adequadas ao manuseio de

microrganismos do grupo de risco definido pela
coleo

ECCO

European Culture Collections Organization

Coleces

Clulas

DSM Deutsche sammlung

Bactrias, plasmdeos, fungos, leveduras, clulas de

plantas e animais

vom mikroornismen

Alemanha
CBS- centraalbureau voor
schimmelcultures

Holanda
MUM- Micoteca da
Universidade do Minho

Fungos e leveduras
http://www.cbs.knaw.nl/
Fungos
http://www.micoteca.deb.uminho.pt/

Coleces de culturas de microrganismos

Exemplos das maiores do mundo

ATCC American Type Culture Collection, EUA

JCM Japan Collection of Microorganisms, Japo

https://www.atcc.org

http://www.jcm.riken.go.jp/JCM/catalogue.shtml

WFCC World Federation for Culture Collections

http://wdcm.nig.ac.jp/wfcc/index.html

Tcnicas de esterilizao e
desinfeco
Esterilizao e desinfeco
Mtodos Fsicos
Calor
Filtrao
Mtodos qumicos
Agentes antimicrobianos

Esterilizao e desinfeco

Permitem o controlo do desenvolvimento dos

microrganismos
Mtodos essenciais

Tratamento e preveno de infeces

Preveno de contaminaes de culturas puras

Controlo de microrganismos

Esterilizao

Desinfeco

Completa destruio ou remoo de todas as

formas de vida, patognicas ou no.
Eliminao ou remoo de microrganismos
causadores de doenas

Sanitizao

Reduo da carga bacteriana a nveis seguros

para a sade pblica.

Mtodos fsicos-Calor
Mtodo

Temperatura

Eficincia

Incinerao

>500 C

Vaporiza o material orgnico em superficies no

inflamveis.

gua ebulio

100 C

30 min de fervura mata formas vegetativas.

No destroi endsporos nem toxinas.

Fervura intermitente

100 C

3 ciclos de 30min
Destri endsporos bacterianos.

Autoclave
(vapor sobre presso)

121 C
15 min.

Mata todas as formas de vida, incluindo endsporos

bacterianos.
Material cirrgico, roupas, meios de cultura, materiais
carbonizveis, etc.

Calor seco
(ar seco em estufa)

160 C
2h

Oxidao dos constituintes da clula

Material que deve ser mantido seco.
Ex: Vidro e metal

Calor seco
(ar seco em estufa)

170 C
1h

idem. Notar que o aumento de temperatura de 10 C

diminui 50 % o tempo de esterilizao.

Pasteurizao
(metdo batch)

63-66 C
30 min

Mata a maioria da clulas vegetativas de

microrganismos patognicos.
Industria alimentar. Evita alteraes pela temperatura.

Pasteurizao
(metdo flash)

72 C
15 s

Idntico ao batch. Para o leite, os efeitos indesejveis

na qualidade e sabor so menores.

Mtodos fsicos-Calor

autoclave
Esterilizao T> 100C

Bico de bunsen
Incinerao (anas, agulhas)
Ambiente asstico

Susceptibilidade microbiana a temperaturas

elevadas

Ponto trmico letal

Tempo trmico letal

Temperatura mnima que mata todos os

microrganismos ao fim de 10 min
Tempo mnimo necessrio para matar todos os
microrganismos, a uma dada temperatura

Tempo de reduo decimal, D

Tempo necessrio para reduzir 90% a populao

microbiana, a uma dada temperatura

Susceptibilidade microbiana a temperaturas

elevadas
N/No = e (-K t)

99.9% de inativao
Reduo 3 log

Sabendo que o
tempo de reduo
decimal de
tratamento trmico
a 110 oC 20 min
determine a
constante cintica
de inativao
trmica.

Mtodos Fsicos - Filtrao

Remoo de microrganismos de fluidos

Gases e lquidos termo-lbeis

Soro, plasma, vitaminas, antibiticos, etc

Discos ou membranas de celulose ou policarbonato com

poros de 0,05 m a 0,8 m

Mtodos Fsicos - Filtrao

Atmosferas isentas de microrganismos

Cmaras de fluxo laminar

Filtros de elevada eficincia
Remoo de partculas e microrganismos do ar

Mtodos Fsicos

Radiaes
Aco directa sobre os constituintes da clula, ex DNA

Radiaes ionizantes

Raios g, raios X

Termo-lbeis, ex. Injectveis

Radiaes no ionizantes

Ultravioleta (240 a 280 nm)

Impede ou altera a replicao de DNA

Agente microbiocida ou mutante
Existe em cmaras de fluxo, laboratrios, blocos
operatrios

Agentes qumicos

Diversos agentes qumicos matam ou inibem o

crescimento de microrganismos
Agentes antimicrobianos

Eficcia depende de:

Dimenso da populao microbiana

Composio da populao microbiana
Concentrao do agente antimicrobiano
Durao da exposio
Temperatura
Envolvente local (biofilme, matria orgnica).

Agentes antimicrobianos

Agentes antimicrobianos

Resistncia a agentes qumicos

Escala crescente

Formas vegetativas de bactrias

Formas vegetativas de fungos e esporos fngicos
Vrus
Micobactrias
Esporos bacterianos
Pries

Testes de sensibilidade

Avalia a capacidade de um microrganismo de

se multiplicar in vitro na presena do agente
antimicrobiano.

Mtodos de diluio:

Meios de cultura lquidos ou slidos com crescentes

concentraes do agente, com a mesma concentrao
de inculo.

Permite determinar concentrao mnima inibitria

a mais fraca concentrao de antibitico capaz de inibir
completamente in vitro o crescimento visvel de um
microrganismo.

Determinao da CMI e da CMB de um antibitico

em meio liquido

Normas NCCLS - Clinical and Laboratory Standards Institute

Concentrao Mnima Bactericida (CMB)
A mais fraca concentrao de antibitico que, aps 18 horas de contacto,
elimina 99,9% de uma populao bacteriana.

Outros mtodos de controlo anti-microbiano

Homogeneizao por alta presso

Utiliza sistemas de compresso de fluidos a

presses superiores a 100 MPa (1000 bar)
Leva rutura celular, aplica-se a produtos
alimentares

Fototerapia dinmica

Agente fotossensibilizador (FS)

Irradiao: comprimento de onda de luz especfico
Ativao do FS na presena de oxignio gera
espcies reativas de oxignio

Morte celular