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Mestrado Profissional
Programa de Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade
Fundao Oswaldo Cruz
Rio de Janeiro
2009
FOLHA DE APROVAO
Estudo interlaboratorial para o estabelecimento do veneno botrpico e do soro
antibotrpico de referncia nacional
Aprovado:
Prof. _______________________________________ (INCQS/FIOCRUZ)
Dr. Helena Pereira Zamith
Rio de Janeiro
2009
ii
FICHA CATALOGRFICA
Estudo
iii
Roberto Shinyashiki
v
AGRADECIMENTOS
vi
RESUMO
A segurana e a eficcia da imunoterapia antienvenenamento ofdico esto
intimamente relacionadas pureza e a uma cuidadosa determinao da potncia do soro
(atividade biolgica). A metodologia atualmente utilizada apresenta importantes
limitaes, as quais este trabalho objetiva contribuir. A mesma adotada como oficial
pela Farmacopia Brasileira, tendo sido preconizada em 1996 pela Portaria n 174/MS.
Observaes preliminares deste estudo identificaram, principalmente, um alto ndice de
invalidao de ensaios e uma baixa repetibilidade e reprodutibilidade, representado por
diferenas significativas no ensaio de potncia nos resultados obtidos pelo INCQS e
pelos laboratrios produtores, enfatizando a necessidade de aperfeioar a metodologia
analtica para a determinao da potncia do soro antibotrpico. De acordo com as
recomendaes do Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms,
coordenado pela Quality Assurance and Safety of Biologicals Unit da OMS em 2001,
o estabelecimento de venenos e antivenenos de referncia essencial para a
padronizao destes ensaios e para permitir a comparao lote a lote, assim como a
comparao entre laboratrios.
Neste trabalho, apresentamos os resultados de um estudo interlaboratorial para
o estabelecimento de veneno e antiveneno botrpico de referncia, visando o
aperfeioamento do controle da qualidade dos soros antibotrpicos, com nfase na
metodologia analtica para a determinao da potncia, com a participao de todos os
laboratrios brasileiros produtores de soro antibotrpico. Este estudo foi realizado em
duas etapas. A primeira compreendeu a reavaliao da potncia do lote n 05 do Veneno
Botrpico de Referncia BRA/BOT/05, a avaliao da potncia do candidato a Soro
Antibotrpico de Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01, e a avaliao da
aplicabilidade de um controle da dose desafio de veneno referente a cinco vezes o valor
de dose letal mdia (5 DL50). A segunda etapa compreender a comparao da
metodologia de determinao da potncia do Soro Antibotrpico pela determinao da
Dose Efetiva Mdia DE50 (Potncia Absoluta) com a metodologia da Potncia
Relativa frente ao Soro Antibotrpico de Referncia, atravs da determinao da
potncia de amostras codificadas. Esta monografia, entretanto ir tratar apenas do
estabelecimento do veneno e antiveneno de referncia.
Os resultados obtidos permitiram a avaliao das precises intraensaios,
interensaios e interlaboratorial, a freqncia de ensaios invlidos assim como as
diferentes interpretaes dos laboratrios, INCQS e produtores nacionais monografia
do Soro Antibotrpico da Farmacopia Brasileira.
vii
ABSTRACT
Safety and efficacy of antivenom immunotherapy are closely related with
purity and an accurate potency determination (biological activity) of the antivenom. The
murine lethality assay, still in use, present several limitations and is not a fully validated
methodology. Preliminary data shows a high incidence of invalid assays and a low
repeatability and reproducibility of potency assays, evidenced by significant differences
between INCQS and manufacturers, indicating the need for improvement of the
analytical methodology. According to the recommendations of the Workshop on the
Standardization and Control of Antivenoms, sponsored by the Quality Assurance and
Safety of Biologicals Unit of WHO at 2001, the establishment of local venom reference
preparations and standard antivenom preparations are essential to standardize these
assays and to allow batch to batch comparisons as well as comparisons between
different laboratories.
In this work, we present the results of an interlaboratorial study - with the
participation of all Brazilian manufacturers - for the establishment of the lot 05 of the
Brazilian Bothropic Reference Venom and lot 01 of the Brazilian Reference Antivenom,
looking forward the improvement of quality control of Bothrops antivenom.
This study was done in two steps. The first one consisted in the potency
evaluation of the lot 05 of the Brazilian Bothropic Reference Venom, the potency
evaluation of the lot 01 of the Brazilian Bothropic Reference Antivenom and the
evaluation of the use of a control of the challenge dose of five times the median lethal
dose (5 LD50). The second step consisted on the comparison between the absolute and
the relative (parallel line assay) potency evaluation of commercial Bothrops antivenom,
using the Brazilian Bothropic Reference Antivenom, in a blind assay. This monograph
will focus only in the establishment of Brazilian Reference Bothropic Venom and
Antivenom.
These results allowed us to evaluate the intra-assay; inter-assay and interlaboratorial precision, the incidence of invalid assays, and showed that each laboratory
interpret differently the Bothrops Antivenom monograph of Brazilian Pharmacopoeia.
viii
CECAL
CENEPI
CEUA
CGPNI
CPPI
CV
Coeficiente de Variao
DE50
DL50
DP
Desvio Padro
EMBRAPA
FUNED
GTPB
NR
No realizado
IB
Instituto Butantan
INCQS
INV
Invlido
IP
Intraperitoneal
IVB
POP
SAL
SES-RJ
SGA
SINITOX
WHO
ix
LISTA DE QUADROS
Quadro 1
Quadro 2
Quadro 3
Quadro 4
Quadro 5
Quadro 6
Quadro 7
Quadro 8
Quadro 9
Quadro 10
Quadro 11
Quadro 12
Quadro 13
Quadro 14
Quadro 15
Quadro 16
Quadro 17
Quadro 18
Quadro 19
06
06
07
10
17
18
20
26
28
29
30
31
43
44
45
65
66
66
67
LISTA DE GRFICOS
Grfico 1
Grfico 2
Grfico 3
Grfico 4
Grfico 5
07
08
28
45
67
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Bothrops alternatus
Bothrops atrox
Bothrops erytromelas
Bothrops jararaca
Bothrops jararacussu
Bothrops moojeni
Bothrops neuwiedi
Processamento do plasma para obteno de soro
Perfil eletrofortico do Veneno Botrpico de Referncia lote 05
BRA/BOT/05.
xii
10
11
11
11
12
12
12
19
24
NDICE
1
1.1
1.2
1.2.1
1.3
1.3.1
1.3.2
1.3.3
1.4
1.4.1
1.5
1.6
1.6.1
1.7
1.7.1
1.8
1.8.1
1.9
2
2.1
2.2
3
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.3.1
3.2.4
3.2.4.1
3.2.4.2
3.2.5
3.2.5.1
3.2.6
3.2.6.1
4
4.1
4.2
5
6
7
Introduo
Histrico
Epidemiologia
Distribuio geogrfica
Mecanismo de ao do veneno
Atividade inflamatria aguda
Atividade de coagulao
Atividade hemorrgica
Acidente botrpico
Gravidade do acidente
Soroterapia
Produo de soros antipeonhentos no Brasil
Etapas da Produo
Controle de qualidade de soros antipeonhentos
Testes de controle da qualidade do produto final
Relevncia do estudo
A insero do INCQS neste estudo
Estudo colaborativo
Objetivos
Objetivo geral
Objetivos especficos
Material e Mtodos
Material
Veneno Botrpico de Referncia (BRA/BOT/05)
Soro Antibotrpico de Referncia (BRA/ANTIBOT/01)
Animais utilizados
Mtodos
Soroneutralizao
Obteno do pool de soro antibotrpico e determinao da potncia do
soro candidato referncia
Determinao da Dose Letal Mdia (DL50) do veneno de referncia
Critrios para aceitao do ensaio
Determinao da potncia do soro antibotrpico
Critrios de validao do ensaio
Valores Aberrantes
Protocolo do Estudo Colaborativo utilizado (conforme enviado aos
produtores)
Material
Coleta e anlise dos dados
Critrios de aceitao
Resultados e Discusso
Resultados
Discusso
Concluso
Referncias
Anexo I
xiii
01
01
04
09
13
13
14
14
14
15
16
18
18
20
21
21
22
22
23
23
23
24
24
24
25
25
27
27
27
29
30
30
31
32
32
33
33
34
35
35
68
71
72
76
1. INTRODUO
1.1 HISTRICO
Instituto Butantan IB
1.2
EPIDEMIOLOGIA
severidade permanecem muito pouco conhecidas, com exceo de poucos pases onde
estes acidentes so corretamente notificados. Desde os estudos realizados por Swaroop &
Grab em 1954, nenhum levantamento global sobre a epidemiologia dos envenenamentos
ofdicos foi realizado.
No Brasil os acidentes ofdicos so um importante agravo sade desde o perodo
pr-colonial. Em 1560, Jos de Anchieta fez o primeiro registro sobre serpentes
peonhentas no Brasil com interessantes observaes clnico-epidemiolgicas, na clebre e
sempre citada carta de So Vicente:
[...] At aqui tenho falado dos animais que vivem na gua; tratarei agora dos
terrestres, h os que so desconhecidos nesta nessa parte do mundo. Primeiramente direi
das diversas espcies de cobras venenosas. Algumas, chamadas jararacas abundam nos
campos, nos matos e at mesmo nas casas, onde no raro as encontramos e cuja mordedura
mata no espao de vinte e quatro horas, ainda que s vezes aplicando-se-lhe remdio se
escapa morte, mordidos da por diante, no s no corre risco de vida, como at sentem
menos dor, como mais de uma vez experimentamos.
Outro gnero se chama boicininga, isto , cobra que tine que tem na cauda um
cascavel, que soa quando ataca algum. Vivem nos campos, em cavidades debaixo da
terra. No tempo da procriao atacam os homens, e rastejam pela erva com saltos to
rpidos que os ndios dizem que voam. Quando mordem acabou-se: paralisam o ouvido, a
vista, o andar e todos os movimentos, s fica a dor e o sentimento do veneno difundido por
todo o corpo, at que no espao de vinte e quatro se expira.
H outras admiravelmente pintadas de diversas cores, negras, brancas e vermelhas,
semelhante ao coral, que se chama ibiboboca, que quer dizer terra cavada, por que
rojando furam a terra como toupeiras. Estas so as mais peonhentas de todas e, portanto
as mais raras [...](CARDOSO & WEN, 2003).
As notificaes de acidentes ofdicos no Brasil sempre foram feitas de maneira
espordicas e no sistemtica. Em 1901, Vital Brazil ao iniciar a produo do soro
antiofdico no Brasil e visando a coleta de informaes sobre os acidentes ofdicos,
introduziu os Boletins para observao de accidentes ophidicos que enviados juntamente
com as ampolas de soro, deveriam ser preenchidos pelo usurio e devolvidos ao laboratrio
produtor. Esta estratgia foi adotada pelo Instituto Serumtherapico (hoje Butantan) e
posteriormente pelo Instituto Vital Brazil. Os dados originados por estas notificaes
possibilitaram inmeras publicaes sobre ofididismo no Brasil (CARDOSO & WEN,
2003).
NORDESTE
NORTE
SUDESTE
SUL
1232
101
503
1155
AGENTE
Medicamentos
Agrotxicos/Uso Agrcola
Agrotxicos/Uso Domstico
Produtos Veterinrios
Raticidas
Domissanitrios
Cosmticos
Produtos Qumicos Industriais
Metais
Drogas de Abuso
Plantas
Alimentos
Animais Peonhentos
Animais no Peonhentos
Desconhecido
Outro
TOTAL
Fonte: MS/Fiocruz/Sinitox
NMERO
33445
5690
3433
1218
4371
12441
1439
6524
599
3835
1641
1423
21606
4533
4441
1766
108405
30,9
5,3
3,2
1,1
4
11,5
1,3
6
0,6
3,5
1,5
1,3
19,9
4,2
4,1
1,6
100
6
M edicamento s
A nimais P eo nhento s
Do missanitrio s
P ro duto s Qumico s Industriais
A gro t xico s/Uso Agrco la
A nimais no P eo nhento s
AGENTE
Desco nhecido
Raticidas
Dro gas de A buso
A gro t xico s/Uso Do mstico
Outro
P lantas
Co smtico s
Alimento s
Pro duto s Veterinrio s
M etais
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
NMERO DE ACIDENTES
Nmero de Casos
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
Ano
NOMES POPULARES
Urutu
Urutu-cruzeiro
Cruzeira
Surucucurama
Jararaca-do-norte
Combia
Jararaca-do-rabo-branco
DISTRIBUIO GEOGRFICA
RS, SC, PR, SP, MS e MG
Jararaca-da-seca
Jararaca
BA, MG, ES, RJ, SP, PR, SC e RS
Jararaca-do-rabo-branco
Jararacuu
Jararaco
Jararaca
Caiara
Jararaca-pintada
1.Poucos relatos de casos. Acidentes graves; 2. Responsvel pela maioria dos registros de acidentes na
regio Amaznica; 3. Distrbios de coagulao so manifestaes mais comumente registradas. Acidentes
com poucas alteraes locais, geralmente benignos; 4. Principal agente em MG, ES, RJ e SP. Casos graves
ou bitos pouco freqentes; 5. Acidentes relatados, principalmente em SC. Acidentes graves ou casos fatais;
6. Responsvel pela maioria dos registros de acidentes no oeste de SP e de MG e dos atendimentos em
Goinia/GO; 7. Distribudas pelo territrio nacional, com exceo da Amaznia. Siglas: RS-Rio Grande do
Sul, SC-Santa Catarina, PR-Paran, SP-So Paulo, MS-Mato Grosso do Sul, MG-Minas Gerais, AC-Acre,
AM-Amazonas, RR-Roraima, PA-Par, AP-Amap, MA-Maranho, RO-Rondnia, TO-Tocantins, CECear, MT-Mato Grosso, PI-Piau, RN-Rio Grande do Norte, PB-Paraba, PE-Pernabuco, AL-Alagoas, SESergipe, BA-Bahia, ES-Esprito Santo, RJ-Rio de Janeiro, DF-Distrito Federal, GO-Gias.
Fonte: CENEPI, 1998
10
11
12
sua vez, definem os pontos estratgicos para atendimento dos acidentes e utilizao dos
antivenenos. Assim garante-se o acesso gratuito e universal ao tratamento soroterpico.
Todavia, faz-se necessrio o controle da distribuio e dos estoques nos Estados, de
modo a garantir a racionalidade na utilizao dos imunobiolgicos (BRASIL, 2007).
O quadro clnico local, no acidente botrpico se caracteriza por uma picada que se
constitui, na maioria dos casos, em uma inoculao subcutnea ou intramuscular de veneno
na vtima. O sangramento no stio de inoculao freqentemente observado, porm sua
presena nem sempre indica comprometimento sistmico. O edema ocorre precocemente,
sendo caracteristicamente tenso (ou firme), apresentando muitas vezes tonalidade violcea
em decorrncia do sangramento subcutneo. A equimose no local da picada pode acometer
poro extensa do membro. O edema inicialmente circunscrito pode em at 24 horas
estender-se a todo o membro. Em poucas horas desenvolve-se linfadenomegalia regional,
com gnglios aumentados e dolorosos, podendo apresentar equimose no trajeto dos vasos
que drenam a regio. Algumas horas aps o acidente podem aparecer bolhas em
quantidade e propores variveis, com contedo seroso, hemorrgico ou necrtico
(FRANA & MLAQUE, 2003).
principais
complicaes
locais
so:
abscesso,
necrose
sndrome
compartimental.
Abscesso, celulite e erisipela podem ser observadas no local da inoculao. Estas
infeces so freqentes, devido s condies propcias ao crescimento bacteriano
provocado pela reao inflamatria aguda, assim como pela presena de abundante flora
bucal nas serpentes (bactrias anaerbicas e gram-negativas). A incidncia de abscessos
pode variar de 1 a 17,2% dos casos. Os fenmenos inflamatrios inerentes ao acidente
botrpico dificultam a avaliao clnica da presena de infeco. O edema, o eritema, a dor
e o calor local podem tanto ser provocados pela ao do veneno, quanto pela infeco
local.
A incidncia de necrose bastante varivel (de 1 a 20,6%) geralmente limitada ao
tecido subcutneo, podendo comprometer estruturas mais profundas como tendes,
msculos e ossos. A intensidade e a extenso da necrose esto intimamente ligadas
utilizao de torniquetes e demora entre o acidente e a administrao da soroterapia. Em
casos extremos pode ser necessria a amputao de parte do membro acometido
(FRANA & MLAQUE, 2003).
15
1.5 SOROTERAPIA
16
Locais:
GRAVIDADE principalmente
edema
(avaliao inicial)
Leve (L)
Discreto
Moderada (M)
Evidente
Grave (G)
Intenso
MANIFESTAES E TRATAMENTO
Quantidade
Sistmicas:
aproximada
hemorragia
Tempo de
de veneno
grave,
Coagulao
a ser
choque,
(TC) *
neutralizada
anria
(mg)
Normal
Ausentes
ou
100
alterado
Ausentes
Normal
ou
ou
200
presentes
alterado
Normal
Evidentes
ou
300
alterado
Via de
administrao
IV **
IV
IV
17
TIPO DE SORO
LEVE
Bothrops jararaca
2-4
MODERADO
4-8
GRAVE
12
Soro Antibotrpico
Soro Antibotrpico-crotlico
Soro Antibotrpico-laqutico
Extrao do veneno.
Liofilizao
Tamponamento do
plasma
Purificao do
plasma
OBJETIVO
Melhorar a qualidade
Conservar e manter
estvel
MECANISMO
Adicionar tampo
cido ctrico pH 4,8
Adicionar fenol e
centrifugar
CONTROLE
DA
QUALIDADE
Verificar o pH
Analisar teor de
fenol
Analisar teor de
sulfato de
amnia
Desnaturao das
protenas
Tamponamento e
salinizao da
suspenso de
protenas
Otimizar a digesto
Filtrao molecular
Eliminar
imunoglobulinas
Adicionar cido
clordrico ou fosfato
de clcio pH 3,2 e
cloreto de sdio e
centrifugar
Purificar por
cromatografia
Dilise
Eliminar resduos de
sulfato de amnia
Filtrar em tubos de
hemodilise
Clarificao
Eliminar a turbidez
Adicionar hidrxido
de alumnio gel
Esterilizao
Purificar o produto
Adicionar etanol
Estabilizao e
preservao
Estabelecer a validade
Adicionar timerosal
do produto
Verificar a
turbidez
Analisar teor
de sulfato de
amnia
Analisar teor
de hidrxido de
alumnio
Analisar teor
de etanol
Analisar teor de
timerosal
10
Padronizao do
produto final
Verificar parmetros
de qualidade
Analisar o
bulk final
Coletar amostras do
bulk final
Verificar o pH
Determinao do volume mdio, teor de fenol, teor de sulfato de amnia, pH, teor
de cloreto de sdio, protenas e nitrognio protico.
ATIVIDADE BIOLGICA:
Um soro ideal deve ser seguro e eficaz, portanto no deve provocar efeitos adversos
quando administrado por via sistmica, alm de ter baixo custo. Bioquimicamente, o
melhor soro deve apresentar uma alta pureza e potncia, com um mnimo de contedo de
protenas totais. Clinicamente, aquele que apresente a melhor eficincia teraputica com
a menor dose e sem efeitos colaterais, e economicamente falando, aquele que oferece o
melhor balano entre eficcia teraputica e custos.
A segurana e eficcia da imunoterapia antienvenenamento esto intimamente
relacionadas pureza e a uma cuidadosa determinao da potncia do soro (WHO, 1969).
22
2 OBJETIVOS
23
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 MATERIAL
3.1.1 VENENO BOTRPICO DE REFERNCIA (BRA/BOT/05)
O lote n 05 do Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05, uma preparao
liofilizada com 4.398 frascos de veneno de Bothrops jararaca estocado a 20 C, contendo
30 mg/frasco, com uma DL50 de 47,8 g/0,5 mL, determinada pelo INCQS e uma DL50 de
33,1g/0,5 mL determinada pelo Instituto Butantan no momento de sua preparao.
Consiste em um pool obtido partir de 4.430 extraes de veneno de Bothrops jararaca
coletadas em diferentes regies do Brasil. Este pool foi obtido por 2.180 extraes de
serpentes coletadas no estado de So Paulo (49,2%); 1.073 coletadas no Esprito Santo
(24,2%); 691 em Santa Catarina (15,6%); 448 no Paran (10,1%); 34 em Minas Gerais
(0,77%) e 04 no Rio de Janeiro (0,09%). Possui 907,60 40,30 g de protena/mg de
veneno e um perfil eletrofortico em SDS-PAGE (gradiente de 7,5% a 17,5%, corado por
Azul de Coomassie), com 12 bandas de protenas, sendo cinco bandas predominantes, com
pesos moleculares de 62, 32, 28 e 14,4 kDa (Figura 9). Este lote foi preparado e
caracterizado em 2002 pelo Instituto Butantan e utilizado pelo INCQS e todos os
laboratrios produtores at a presente data.
24
25
LOTE
0004052-A
0004052-B
0004052-C
9807070-A
9807070-B
9807070-C
980043-A
980043-B
980043-C
9808078-A
9808078-B
9808078-C
980201
980604-A
980604-B
980707
980909
991113
000801
000905
000902
001110
97070815
971015/20
980929/05-B
980929/05-C
990504-18
990517-22
990915-45
B02/99
PRODUTOR
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Butantan
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
I. Vital Brazil
FUNED
FUNED
FUNED
FUNED
FUNED
FUNED
FUNED
CPPI
TOTAL
QUANTIDADE
10
10
10
15
15
15
10
15
15
15
15
15
18
14
14
21
26
19
03
03
02
03
10
15
15
23
21
16
19
21
TOTAL
160
123
119
21
423*
*Foram utilizadas 384 ampolas. Das 423, inicialmente propostas, 39 ampolas dos diferentes produtores, foram quebradas na confeco do pool.
26
3.2 MTODOS
3.2.1 SORONEUTRALIZAO
O mtodo utilizado teve como base a soroneutralizao in vitro e posterior
inoculao em camundongos, como preconizado pela Farmacopia Brasileira 4 edio,
parte II, 5 fascculo.
3.2.2
OBTENO
DO
POOL
DE
SORO
ANTIBOTRPICO
27
LI
22,85
23,23
23,25
27,15
22,25
21,66
22,97
27,92
LS
33,48
30,96
32,78
41,29
32,18
28,71
29,28
37,24
Teste de Homogeneidade
p
X2 calc
X2 tab
12,479 0,0859
14,067
Dados homogneos
DE50
LI
LS
27,63
26,22
29,11
g/dose
g/dose
g/dose
6,92
6,57
7,29
Potncia
LI
LS
mg/mL
mg/mL
mg/mL
DE50: dose efetiva mdia; LI: limite inferior; LS: limite superior; Xcalc: qui-quadrado
calculado; Xtab: qui-quadrado tabelado e p: valor de probabilidade.
Grfico 3 Determinao das doses efetivas mdias (DE50) do Soro Antibotrpico
candidato a Referncia - combinao de 8 ensaios.
Intervalos de confiana
45
Ttulo
40
35
30
25
20
1
4
Resultado n
LS
LI
Resultados
28
26,22
DE50
g/dose
27,63
LIMITE SUPERIOR
g/dose
29,11
29
SOLUO DE VENENO
SALINA
(1 mg/mL)
62,2 g
0.74 mL
5,26 mL
51,8 g
0,62 mL
5,38 mL
43,2 g
0,51 mL
5,49 mL
36,0 g
0,43 mL
5,57 mL
30,0 g
0.36 mL
5,64 mL
A DL50 do veneno deve estar dentro dos limites de confiana compreendidos entre
50 e 200% do valor nominal do veneno de referncia. O clculo para a
determinao da DL50 foi feito atravs do mtodo estatstico de probitos (FINNEY,
1971) utilizando programa fornecido pela OMS (WHOPROG, 1997).
30
SORO
SALINA
2,8 mL
0,50 mL
2,70 mL
2,8 mL
0,38 mL
2,82 mL
2,8 mL
0,29 mL
2,91 mL
2,8 mL
0,22 mL
2,98 mL
Para o clculo da DE50 deve-se levar em conta: o limite de confiana deve estar
compreendido entre 50 e 200% da potncia estimada; a faixa de resposta
(porcentagem de sobrevivncia) deve estar compreendida entre 10 e 90%, obtendo
a curva de regresso que deve apresentar relao linear (p>0,05) utilizando-se o
resultado de, pelo menos, trs diluies consecutivas, sendo que a dose que protege
50% deve estar no intervalo compreendido entre a maior e a menor diluio do
ensaio.
32
3.2.5.1 MATERIAL
A determinao da DL50 e DE50 foi feita pelo mtodo dos probitos. A preciso
intraensaio (repetibilidade), interensaios (preciso intermediria) e interlaboratrios
(reprodutibilidade) dos ensaios de potncia do Veneno Botrpico e do Soro Antibotrpico
33
34
4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 RESULTADOS
Este estudo foi inicialmente proposto para ser realizado em duas etapas, porm
devido ao prazo de defesa desta dissertao de Mestrado Profissional (24 meses), e tendo
em vista que todos os resultados no foram remetidos em tempo hbil para a incluso neste
trabalho, iremos abordar somente os resultados referentes primeira etapa do estudo.
A primeira etapa compreendeu a reavaliao da potncia do lote n 05 do Veneno
Botrpico de Referncia Nacional BRA/BOT/05 e a avaliao da potncia do candidato a
Soro Antibotrpico de Referncia Nacional BRA/ANTIBOT/01. Da segunda etapa s
foram utilizados, para efeito dos clculos os valores mdios referentes s potncias
determinadas do soro BRA/ANTIBOT/01.
Este estudo ainda mostrou que os resultados obtidos permitiram a avaliao das
precises intraensaios, interensaios e interlaboratrios dos ensaios de potncia do veneno
botrpico e do soro antibotrpico, a freqncia e causas dos ensaios invlidos assim como
as diferentes interpretaes dos laboratrios monografia do Soro Antibotrpico da
Farmacopia Brasileira (BRASIL, 2004).
35
LABORATRIO: INCQS
Ensaio de DL50 n: 1
Data: 15/04/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
8
8
7
5
0
Ensaio de DL50 n: 2
Data: 30/04/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
9
8
5
4
0
Ensaio de DL50 n: 3
Data: 14/05/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
9
9
5
3
1
LABORATRIO: 01
Ensaio de DL50 n: 1
Data: 08/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
6
9
8
7
5
DL50 Invlido
Ensaio de DL50 n: 2
Data: 12/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50
Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
9
5
7
4
1
38,49 g/0,5 mL
Ensaio de DL50 n: 3
Data: 13/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
DL50
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
09
10
6
7
8
4
2
36,78 g/0,5 mL
37
Ensaio de DL50 n: 4
Data: 14/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50
Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
9
9
5
6
7
Invlido
Ensaio de DL50 n: 5
Data: 03/04/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50
Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
10
8
6
8
2
Invlido
38
LABORATRIO: 02
Data: 02/2008
Ensaio de DL50 n: 1
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
DL50
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
6
8
4
3
0
43,62 g/0,5 mL
Ensaio de DL50 n: 2
Data: 02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
DL50
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
7
1
1
1
0
59,76 g/0,5 mL
Ensaio de DL50 n: 3
Data: 03/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50
Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
2
5
3
1
0
Invlido
39
Ensaio de DL50 n: 4
Data: 14/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50
Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
7
7
4
8
1
Invlido
Ensaio de DL50 n: 5
Data: 05/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
DL50
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
7
4
9
2
0
38,72 g/0,5 mL
40
LABORATRIO 03
Ensaio de DL50 n: 1
Data: 20/03/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Concentrao
de Veneno
Diluio
(g)
1
62,2
2
51,8
3
43,2
4
36,0
5
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
9
8
6
3
1
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
9
8
7
5
1
Diluio
1
2
3
4
5
Concentrao
de Veneno
(g)
62,2
51,8
43,2
36,0
30,0
Salina
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
N de mortos
em 48 horas
5,26
5,38
5,49
5,57
5,64
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
10
10
10
10
10
9
8
6
2
1
41
a) o valor da DL50 do veneno testado deve estar dentro dos limites de confiana (p
= 0,95) compreendidos entre 50 e 200% do valor nominal do veneno de
referncia;
b) os animais utilizados no ensaio devem morrer proporcionalmente quantidade
de veneno presente nas diluies, em pelo menos trs diluies consecutivas;
c) a dose que mata 50% dos animais deve estar no intervalo compreendido entre a
maior e a menor diluio do ensaio;
d) a faixa de resposta (porcentagem de sobrevivncia) deve estar compreendida
entre 10 e 90% formando a curva de regresso que deve apresentar relao
linear, ou seja, desvio de linearidade no significativo (p>0,05).
Obs: a interpretao dos critrios preconizados pela Farmacopia Brasileira para a
aceitao dos ensaios de DL50 e DE50 foi estabelecida pelo INCQS, com a colaborao
do Dr. Bertrand Poirier estatstico da Agence Franaise de Scurit Sanitaire des
Produits de Sant Afssaps, em 2005, quando visitou o Instituto.
42
dos
critrios
recomendados
pela
Farmacopia
Brasileira
nas
determinaes da DL50.
43
INTERLABORATORIAL
42,14
6,20
14,71
44
LI
35,87
38,3
37,01
34,59
33,09
39,37
36,56
37,16
34,39
38,13
LS
43,91
47,23
45,34
42,83
40,89
48,32
41
46,5
44,25
47,19
Teste de Homogeneidade
p
X2 calc
X2 tab
0,2387
11,570
16,919
Dados homogneos
DL50
LI
LS
40,05
38,92
41,21
g/dose
g/dose
g/dose
Ttulo
44
42
40
38
36
34
32
30
1
10
Resultado n
LS
LI
Resultados
45
LABORATRIO: INCQS
Ensaio de potncia n: IA Data: 15/04/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
8
5
2
2
28,63 g
6,69 mg/mL
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
5
1
1
29,70 g
6,44 mg/mL
46
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
8
1
1
0
Invlido (p<0,05)
Invlido
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
2
2
1
Invlido (p<0,05)
Invlido
47
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
8
5
1
1
29,70 g
6,44 mg/mL
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
2
7
2
0
27,04 g
7,08 mg/mL
48
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
8
6
1
0
DE50: 28,82 g
Potncia: 6,64 mg/mL
Diluio
1
2
3
4
Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
4
2
2
DE50: 29,52 g
Potncia: 6,48 mg/mL
49
LABORATRIO: 01
Ensaio de potncia n: IA Data: 08/02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
8
6
4
3
22,79 g
8,40 g/0,5 mL
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
7
5
0
0
32,12 g
5,96 g/0,5 mL
50
4,61
6,00
7,80
10,14
DE50
Potncia
Invlido
Invlido
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
4
5
0
0
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
7
2
1
1
33,94 g
5,64 mg/mL
51
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
6
3
2
1
33,10 g
5,78 mg/mL
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
5
2
4
28,63 g
6,69 mg/mL
52
Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes
com 48 horas
7
2
2
3
Invlido
Invlido
Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes
com 48 horas
4
3
2
4
Invlido
Invlido
53
Ttulo Soro/Animal
Diluio do Soro
(g)
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
10
10
10
10
N de sobreviventes
com 48 horas
10
4
4
0
29,32 g
6,53 mg/mL
Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes
com 48 horas
6
4
0
0
34,32 g
5,58 mg/mL
(R) - repetio
54
Diluio
1
2
3
4
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
7
0
0
1
DE50: Invlido
Potncia: Invlido
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
6
7
1
3
DE50: Invlido
Potncia: Invlido
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
6
4
4
1
DE50: 38,09 g
Potncia: 5,02 mg
55
LABORATRIO: 02
Ensaio de potncia n: IA
Data: 02/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
8
7
2
2
26,97 g
7,10 mg/mL
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
(g)
Soro
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
6
0
0
30,37 g
6,30 mg/mL
56
Diluio
1
2
3
4
DE50
Potncia
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
7
7
3
2
24,37 g
7,85 mg/mL
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
6
2
2
27,78 g
6,89 mg/mL
57
Diluio
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
1
2
3
4
4,61
6,00
7,80
10,14
DE50
Potncia
Invlido
Invlido
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
8
8
4
4
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
5
3
1
26,82 g
7,14 mg/mL
58
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
8
8
2
8
DE50: Invlido
Potncia: Invlido
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
4
0
2
DE50: 31,80 g
Potncia: 6,02 mg/mL
59
LABORATRIO 03
Ensaio de potncia n: IA Data: 20/03/2008
Veneno de referncia (BRA/BOT/05): 1 mg/mL
Fator de diluio do soro: 1,3
Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes
com 48 horas
8
6
4
3
22,79 g
8,40 mg/mL
Ttulo Soro/Animal
Diluio do Soro
(g)
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes
com 48 horas
8
6
3
1
25,97 g
7,40 mg/mL
60
Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes
com 48 horas
8
7
3
1
25,14 g
7,61 mg/mL
Diluio
1
2
3
4
41,4
31,8
24,5
18,8
2,70
2,82
2,91
2,98
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
N de sobreN de
viventes com
animais
48 horas
8
8
8
8
8
6
8
3
DE50:20,44
Potncia 9,36 mg/mL
61
Ttulo Soro/Animal
(g)
Diluio do Soro
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes
com 48 horas
8
2
1
0
32,49 g
5,89 mg/mL
Ttulo Soro/Animal
Diluio do Soro
(g)
1
2
3
4
DE50
Potncia
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes
com 48 horas
8
3
1
1
31,52 g
6,00 mg/mL
62
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
Salina
(mL)
Soro
(mL)
Veneno
(mL)
N de
animais
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
2,8
2,8
2,8
2,8
8
8
8
8
N de sobreviventes com
48 horas
7
2
0
4
DE50: 35,15 g
Potncia: 5,45 mg/mL
Diluio
1
2
3
4
Ttulo do Soro/Animal
Soro
(g)
4,61
6,00
7,80
10,14
41,4
31,8
24,5
18,8
N de sobreviventes com
48 horas
8
7
2
1
DE50: 25,91 g
Potncia: 7,39 mg/mL
63
64
INTERLABORATORIAL
6,73
1,01
12,26
15,03
66
LI
25,31
26,76
26,76
24,51
26,16
25,99
28,77
29,71
26,25
25,31
30,19
28,13
24,75
23,23
28,24
LS
32,38
32,96
32,96
29,83
31,76
33,53
35,86
38,77
41,73
32,38
39,01
32,78
31,19
30,96
35,18
Teste de Homogeneidade
p
X2 tab
X2 calc
0,0538
23,420
23,685
Dados homogneos
29,84
29,03
30,67
DE50
LI
LS
g/dose
g/dose
g/dose
6,41
6,24
6,59
Potncia
LI
LS
mg/mL
mg/mL
mg/mL
45
40
35
30
25
20
1
10
11
12
13
14
15
Resultado n
LS
LI
Resultados
67
4.2 DISCUSSO
Sob a responsabilidade do INCQS foi realizada uma reunio em maio de 2002, com
todas as entidades relacionadas com a produo, controle e distribuio dos soros
antipeonhentos no Brasil, aonde vimos o interesse pela implantao de melhorias nas
metodologias analticas para o controle da qualidade dos soros antipeonhentos assim
como a necessidade de se produzir novo lote de veneno de referncia, e que o ttulo
deste veneno fosse estabelecido atravs de um estudo colaborativo interlaboratorial. At
hoje a potncia (em DL50) do veneno botrpico (lote 05) foi estabelecido unicamente
pelo INCQS o valor de 47,8 g/0,5mL, sendo este utilizado por todos os laboratrios
produtores.
O trabalho recente de Arajo e cols, (2008) constitui um dos poucos onde
realizada a avaliao de metodologias para determinao da potncia do soro
antibotpico no Brasil. Neste proposto, a metodologia da potncia relativa para
determinao da potncia do soro antibotrpico.
Desta forma esperamos que nossa linha de trabalho possa contribuir para a rea de
controle da qualidade de soros antiofdicos, rea esta to carente de publicaes em
nosso pas.
Um estudo colaborativo visando determinar a potncia do veneno e do soro
antibotrpico de referncia foi realizado no ano de 2007 e contou com a participao
dos produtores nacionais, onde, na realizao de uma primeira etapa, foi reavaliada a
potncia do veneno botrpico e avaliada a potncia do soro antibotrpico de referncia.
Os resultados obtidos mostraram uma homogeneidade e padronizao na realizao dos
ensaios necessrios.
De acordo com os critrios de aceitao previamente estabelecidos para este estudo
(ANEXO I), que previa que os materiais de referncia (soro e veneno) seriam
considerados aptos, caso a preciso interlaboratorial (reprodutibilidade) apresentasse
coeficientes de variao inferiores (CV) a 50 %, vimos que a potncia declarada em
DL50 do lote 05 do veneno botrpico de referncia deve passar a ser de 40,0 g/0,5 mL,
este valor dever ser adotado por todos os laboratrios em substituio ao valor de
47,85 g/0,5 mL, tendo em vista que a preciso interlaboratrios (CV) foi de 14,71 %,
resultado considerado excelente. Tendo em vista que um (CV) de at 20 % para
imunoensaios como ELISA um valor aceitvel (van der ARK et al., 2000) e um (CV)
maior de 50 % pode ser obtido em ensaios com o uso de animais e clulas como
substrato (WHO, 1997).
69
Coube ao INCQS, rgo da Vigilncia Sanitria como funo por ser tambm o
organizador deste estudo, o estabelecimento de um soro antibotrpico de referncia.
Foram utilizadas amostras de soros enviadas e previamente analisadas pelos
laboratrios produtores nacionais. Estas amostras constituram um pool, dando
origem ao lote de soro antibotrpico candidato a referncia, conforme descrito na parte
da obteno do pool de soro antibotrpico (3.2.2). Os resultados encontrados de DE50
foram 27,63 g/0,5 mL, com um limite inferior de 26,22 g/0,5 mL, e um limite
superior de 29,11 g/0,5 mL e a sua potncia de 6,92 mg/mL, estando este valor dentro
do limite aceito pela Farmacopia Brasileira (BRASIL, 2004). Alquotas desse pool do
soro antibotrpico candidato referncia foram utilizadas no presente estudo
interlaboratorial.
Como resultado desse estudo o valor da DE50 obtida foi de 29,84 g/0,5 mL,
com um limite inferior de 29,03 g/0,5 mL, e um limite superior de 30,67 g/0,5 mL,
sendo sua potncia de 6,41 mg/mL, com um limite inferior de 6,24 mg/mL e limite
superior de 6,59 mg/mL (Quadro19), o que estaria de acordo com a potncia mnima
para liberao de lote de soro antibotrpico segundo a Farmacopia Brasileira de 5,0
mg/mL. O CV interlaboratorial obtido foi de 15,04 % (Quadro 18) menor do que os 50
% - valor aceitvel pela OMS - estando apto, para o objetivo proposto.
Todos os experimentos foram avaliados seguindo os critrios de aceitao de
ensaios adotados pelo INCQS e calculados pelo programa (WHOPROG, 1997), sendo o
mesmo procedimento adotado para a determinao da potncia do Veneno de
Referncia, assim como para a determinao da potncia do soro antibotrpico de
referncia.
Este estudo mostrou alm dos resultados significativos, a necessidade da
continuidade desta linha com estudos interlaboratorial, desenvolvendo e validando uma
metodologia de avaliao da Potncia Relativa do soro antibotrpico frente a um soro
padro de referncia nacional, possivelmente seria a estratgia mais adequada no
sentido de se obter resultados mais confiveis e precisos, em curto e mdio prazo.
70
5 CONCLUSO
71
6 REFERNCIAS
ACIDENTES por Animais Peonhentos. Instituto Butantan. Disponvel em:
http://www.butantan.gov.br/novapagina/perguntas.htm . Acesso em: 20 abr 2006
ARAJO, H.P,; BOURGUIGNON, S.C.; BOLLER, M.A.A.; DIAS, A.A.S.O.;
LUCAS, E.P.R.; SANTOS, I.C.; DELGADO, I.F. Potency evalution of antivenenoms in
Brazil: The national control laboratory experience between 2000 and 2006. Toxicon, v.
51, p. 502-514, 2008.
BJARNASON, J.B. & FOX, J.W. Hemorrhagic toxins from snake venoms. J Toxicol
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BJARNASON, J.B. & FOX, J.W. Hemorrhagic metalloproteinases from snake venoms.
Pharmacology and Therapeutics, v. 62, p. 325-372, 1994.
BOAS Prticas em Experimentao Animal. In: MANUAL da Qualidade. Rio de
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tratamento de acidentes ofdicos. Braslia: Fundao Nacional de Sade, 1987, 53 p.
BRASIL. Portaria n 174 de 11 de novembro de 1996. Aprova as normas tcnicas de
produo e controle de qualidade dos Soros Antiofdicos, Antitxicos e Antirbico.
Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Braslia n. 220, p. 23491, 12 nov.
1996 seo 1.
BRASIL, Fundao Nacional de Sade, Ministrio da Sade. Manual de diagnstico e
tratamento de acidentes por animais peonhentos. 2 ed. Braslia: Fundao Nacional de
Sade, 2001, 120 p.
BRASIL. Fundao Nacional de Sade, Ministrio da Sade. Ofidismo 1999-2000.
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http://www.funasa.gov.br/guia_epi/htm/doencas/acidentes_peconhentos/ofidismo.htm
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BRASIL. Farmacopia Brasileira. 4 ed. fasc. 5, parte II. So Paulo: Atheneu, 2004.
BRASIL.
Ministrio
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Sade,
Braslia.
Disponvel
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72
CARDOSO, J.L.C.; WEN F.H. Introduo ao ofidismo. In: Cardoso, J.L.C. (Coord.)
Animais peonhentos no Brasil: biologia, clnica e teraputica dos acidentes. So
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CASTRO, H., C.; FERNANDES, M.; ZINGALI, R.B. Identification of Bothrojaracinlike proteins in snake venoms from Bothrops species and Lachesis muta. Toxicon, v.
37, p. 1403-1416, 1999.
CENEPI. Fundao Nacional de Sade, Ministrio da Sade. Guia de Vigilncia
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DETERMINAO da Dose Letal 50 dos Venenos Crotalus durissus terrificus e
Bothrops jararaca - In Vivo. In: MANUAL da Qualidade. Rio de Janeiro:
INCQS/FIOCRUZ, 2009. seo 10. (65.3440.006).
DIAS, MV. Lacerda Fisiologista. Comemorao do Centenrio de Nascimento de Joo
Batista de Lacerda, 1846 1915. Museu Nacional, Rio de Janeiro, Primordia
Pharmacologiae in Braslia, Sancti Pauli, MCMLXVI; 89-123.
ENSAIO de Potencia para o Soro Antibotrpico- in vivo. In: MANUAL da Qualidade.
Rio de Janeiro: INCQS/FIOCRUZ, 2008. seo 10. (65.3440.004).
FINNEY, D.J., 1971. Probit analysis 3 rd ed: Cambridge University Press. 333 p.
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So Paulo: Sarvier, 2003. p. 73-86.
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interference in platelet functions. Comparative Biochemistry and Physiology, v.
119C, n. (1), p. 21-29, 1998.
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animais peonhentos. 1 ed. So Paulo, 2001, 49 p.
GUTIRREZ, J. M.; LOMONTE, B. Phospholipase A2 Myotoxins from Bothrops
snake venoms. Toxicon, v. 33, n. 11, p. 1405-1424, 1995.
GUTIRREZ, J.M.; LEON, G.; ROJAS, G. et al. Neutralization of local tissue damage
induced by Bothrops asper (terciopelo) snake venom. Toxicon, v. 36 n. 11, p. 15291538, 1998.
73
Rio de Janeiro:
em:
74
aux
em:
immunesrums
75
ANEXO I
ESTUDO COLABORATIVO:
DETERMINAO DA POTNCIA
DE UM CANDIDATO A SORO ANTIBOTRPICO NACIONAL
BRA/ANTIBOT/01, PARA A AVALIAO DA METODOLOGIA DA POTNCIA RELATIVA E PARA
REAVALIAO DA POTNCIA DO
LOTE N 05 DO VENENO BOTRPICO DE REFERNCIA BRA/BOT/05
76
I.
INTRODUO:
2.
Comparar a metodologia de determinao da Potncia do Soro Antibotrpico pela determinao da Dose Efetiva 50% (DE50) com a metodologia da Potncia Relativa.
77
Com o objetivo de discutir as questes relacionadas produo e controle da qualidade dos soros antipeonhentos produzidos no pas o INCQS
convocou uma oficina de trabalho nos dias 22 e 23 de maio de 2002, intitulada: Situao atual e perspectivas futuras para a produo e controle
de soros antipeonhentos utilizados no Brasil. Esta reunio contou com a
participao das seguintes entidades: Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Sade - INCQS/FIOCRUZ, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA, Fundao Nacional de Sade FUNASA, Centro de Produo de Pesquisa de Imunobiolgicos CPPI, Fundao Ezequiel Dias FUNED, Indstria Qumica do Estado de Gois IQUEGO,
Instituto de Biologia do Exrcito IBEx, Instituto Butantan IB e Instituto Vital Brasil IVB. Dentre vrias deliberaes resultantes da reunio,
podemos destacar a disposio de todos os envolvidos em trabalhar conjuntamente na avaliao e implementao de melhorias nas metodologias
analticas para o controle da qualidade destes produtos. Foi ponto consensual que o desenvolvimento e validao de uma metodologia de avaliao da potncia relativa do soro antibotrpico frente a um soro padro
de referncia nacional, possivelmente seja a estratgia mais adequada no
sentido de se obter resultados mais confiveis, em curto prazo.
3.
78
4.
II. PARTICIPANTES
III. MATERIAL
79
IV. MTODO
inferiores a 50% (WHO. 1997. A WHO guide to good manufacturing practice (GMP)
requirements, Part 2: Validation. Chp. 15. Validation of analytical assays. p. 65- 69.
Geneva).
A metodologia da potncia relativa ser considerada aplicvel, caso a preciso
interlaboratorial (reprodutibilidade) apresente coeficientes de variao do ensaio da
potncia relativa inferiores aqueles observados para a potncia absoluta. A
aplicabilidade da implantao da metodologia, caso seja considerada apta, dever ser
definida aps uma avaliao de custo benefcio.
VII. CRONOGRAMA
VIII. CORRESPONDNCIA
ESTUDO COLABORATIVO:
82
1 Etapa
1. Avaliao da potncia do candidato a Soro Antibotrpico de Referncia
Nacional. BRA/ANTIBOT/01.
Nome do Laboratrio
Ensaio de potncia n: IA Data:
Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4
4,61
6,00
7,80
10,14
DE50:
41,4
31,8
24,5
18,8
2,70
2,82
2,91
2,98
Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22
Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8
N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8
Potncia:
Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4
4,61
6,00
7,80
10,14
DE50:
Potncia:
41,4
31,8
24,5
18,8
2,70
2,82
2,91
2,98
Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22
Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8
N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8
83
1 Etapa:
Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4
4,61
6,00
7,80
10,14
DE50:
Potncia:
41,4
31,8
24,5
18,8
2,70
2,82
2,91
2,98
Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22
Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8
N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8
Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4
4,61
6,00
7,80
10,14
DE50:
Potncia:
41,4
31,8
24,5
18,8
2,70
2,82
2,91
2,98
Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22
Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8
N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8
84
1 Etapa:
Data:
Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4
4,61
6,00
7,80
10,14
DE50:
Potncia:
41,4
31,8
24,5
18,8
Soro
(mL)
2,70
2,82
2,91
2,98
0,50
0,38
0,29
0,22
Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8
N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8
Data:
Ttulo
Soro/Animal Salina
Diluio do Soro (g)
(mL)
1
2
3
4
4,61
6,00
7,80
10,14
DE50:
Potncia:
41,4
31,8
24,5
18,8
2,70
2,82
2,91
2,98
Soro
(mL)
0,50
0,38
0,29
0,22
Veneno
(mL)
2,8
2,8
2,8
2,8
N de soN
de breviventes
animais com 48 horas
8
8
8
8
85
1 Etapa:
2. Determinao da DL50 do Veneno Botrpico de Referncia BRA/BOT/05
Ensaio de DL50 n: 1
Data: / /
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50:
Concentrao
Salina
de Veneno
(mL)
(g)
62,2
5,26
51,8
5,38
43,2
5,49
36,0
5,57
30,0
5,64
Veneno
(mL)
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
N de sobreN de aviventes em
nimais
48 horas
10
10
10
10
10
Ensaio de DL50 n: 2
Data: / /
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50:
Concentrao
Salina
de Veneno
(mL)
(g)
62,2
5,26
51,8
5,38
43,2
5,49
36,0
5,57
30,0
5,64
Veneno
(mL)
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
N de sobreN de aviventes em
nimais
48 horas
10
10
10
10
10
Ensaio de DL50 n: 3
Data: / /
Veneno de referncia (BRA/BOT/05) 1 mg/mL
Fator de diluio do veneno: 1,2
Diluio
1
2
3
4
5
DL50:
Concentrao
Salina
de Veneno
(mL)
(g)
62,2
5,26
51,8
5,38
43,2
5,49
36,0
5,57
30,0
5,64
Veneno
(mL)
0,74
0,62
0,51
0,43
0,36
N de sobreN de aviventes em
nimais
48 horas
10
10
10
10
10
86
1 Etapa:
3. Avaliao da aplicabilidade de um controle de veneno
Experimento n: 1
Concentrao
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50
de
de
Data:
Salina
(mL)
3,2
Experimento n: 3
Concentrao
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50
Salina
(mL)
3,2
Experimento n: 2
Concentrao
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50
Data:
de
Data:
Salina
(mL)
3,2
Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8
N de sobreviventes em 48 horas
10
Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8
N de animais
N de animais
N de sobreviventes em 48 horas
10
Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8
N de animais
N de sobreviventes em 48 horas
10
87
2 Etapa: Comparao da metodologia de determinao da Potncia do Soro Antibotrpico pela determinao da Dose Efetiva 50% (DE50) com a metodologia da Potncia Relativa.
Ensaio de potncia n: 1
Data:
DE50:
Potncia:
Ttulo
Soro/Animal Salina
Amostra Diluio do
(g)
(mL)
Soro
1
4,61
41,4
2,70
2
6,00
31,8
2,82
Soro A
3
7,80
24,5
2,91
4
10,14
18,8
2,98
DE50:
Potncia:
Amostra
Soro B
DE50:
Potncia:
N de sobreSoro Veneno N de
viventes em
(mL) (mL)
animas
48 horas
0,50
2,8
8
0,38
2,8
8
0,29
2,8
8
0,22
2,8
8
.
N de soTtulo
Soro/Animal Salina Soro Veneno N de brevivendo
Diluio
(g)
(mL) (mL) (mL) animas tes em 48
Soro
horas
1
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
2
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
3
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
4
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
.
.
88
Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
viventes em
do
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
Amostra Diluio
Soro C
DE50:
1
2
3
4
.
Potncia:
Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
viventes em
Amostra Diluio do
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
1
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
2
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
Soro D
3
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
4
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
DE50:
Potncia:
Concentrao de
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50
Data:
Salina
(mL)
3,2
Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8
N de animais
N de sobreviventes em 48 horas
10
89
Ensaio de potncia n: 2
Data:
Potncia:
Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
do
viventes em
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
Amostra Diluio
Soro A
1
2
3
4
DE50:
.
.
Potncia:
Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
do
viventes em
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
Amostra Diluio
Soro B
DE50:
Potncia:
1
2
3
4
.
.
90
Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
viventes em
do
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
10,14
18,8
2,98 0,22
2,8
8
Amostra Diluio
Soro C
1
2
3
4
DE50:
.
.
Potncia:
Ttulo
N de sobreSoro/Animal Salina Soro Veneno N de
do
viventes em
(g)
(mL) (mL) (mL) animas
Soro
48 horas
4,61
41,4
2,70 0,50
2,8
8
6,00
31,8
2,82 0,38
2,8
8
7,80
24,5
2,91 0,29
2,8
8
18,8
2,98 0,22
2,8
8
10,14
Amostra Diluio
Soro D
DE50:
1
2
3
4
.
Potncia:
Concentrao de
veneno
(1 mg/mL)
5 DL 50
Data:
Salina
(mL)
3,2
Veneno
1 mg/mL
(mL)
2,8
N de animais
N de sobreviventes em 48 horas
10
91