Cultivo in Vitro en La Erradicacion de Patogenos.

Escuela Profesional de Ingeniera Biotecnolgica
UCSM
CULTIVO IN VITRO EN LA ERRADICACION DE

PATOGENOS
1. INTRODUCCION
Las plantas se mantienen sanas o normales cuando llevan a cabo sus funciones
fisiolgicas hasta donde les permite su potencial gentico. Las plantas presentaran
enfermedad cuando una o varias de sus funciones sean alteradas por los organismos
patgenos o por determinadas condiciones del medio.
Figura 1: Esquema en el que se muestran las funciones bsicas de una planta y la

interferencia que sobre ellas ocasionan algunos tipos comunes de enfermedades
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Biotecnologa Vegetal II Fase
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Las causas principales de enfermedad en las plantas son los organismos patgenos
y los factores del medio ambiente fsico.
Las clulas y los tejidos afectados de las plantas enfermas comnmente se debilitan
o destruyen a causa de los agentes que ocasionan la enfermedad, la capacidad que
tienen esas clulas y tejidos para llevar cabo sus funciones normales disminuye o se
anula por completo; como resultado la planta muere o detiene su crecimiento.
Entre las diferentes enfermedades que afectan a las plantas, las causadas por los
virus son las ms difciles de erradicar. Estos patgenos son considerados parsitos
obligatorios debido a que su multiplicacin depende del metabolismo celular del
hospedero. Esto los diferencia de otros patgenos, como bacterias, micoplasmas y
hongos, que en su multiplicacin utilizan en gran medida su propio metabolismo.
Por estas razones, y a diferencia de lo que ocurre con los insectos, nematodos y
caros, y la mayora de bacterias, micoplasmas y hongos, no pueden ser controlados
con la aplicacin de productos qumicos.
De ah que el cultivo in vitro para la erradicacin de patgenos y virus es muy
importante hasta se vuelve necesario.
2. CLASIFICACION DE LAS ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS:

Hay miles de enfermedades que afectan a las plantas cultivadas, En promedio cada
tipo de cultivo puede ser afectado por un centenar o ms enfermedades. Cada grupo
patgeno puede atacar desde una hasta varias docenas de variedades o incluso
cientos de especies vegetales.
Para facilitar el estudio de las enfermedades de las plantas es necesario agruparlas
en forma adecuada, esto es necesario para lograr la identificacin y el control
posterior de cualquier enfermedad de las plantas, el criterio ms til en la
clasificacin de una enfermedad es el tipo de agente patgeno que la ocasiona.
Esta clasificacin tiene la ventaja de que indica la causa de la enfermedad, lo cual
permite preveer su probable desarrollo y diseminacin, as como las posibles medidas
de control.
De acuerdo con lo mencionado, las enfermedades de las plantas se clasifican de la
manera siguiente:
I.
ENFERMEDADES INFECCIOSAS O BIOTICAS DE LAS PLANTAS:

1. Enfermedades ocasionadas por hongos
2. Enfermedades ocasionadas por procariontes (bacterias y micoplasmas)
3. Enfermedades ocasionadas por plantas superiores parasitas
4. Enfermedades ocasionadas por virus y viroides
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5. Enfermedades ocasionadas por nematodos

6. Enfermedades ocasionadas por protozoarios
II.
ENFERMEDADES NO INFECCIOSAS O ABIOTICAS DE LAS PLANTAS

DEBIDO A:
1. Temperaturas muy altas o muy bajas
2. Falta o exceso de humedad en el suelo
3. Falta o exceso de luz
4. Falta de oxigeno
5. Contaminacin atmosfrica
6. Deficiencia de nutrientes
7. Toxicidad Mineral
8. Acidez o alcalinidad (pH)
9. Toxicidad de los plaguicidas
10. Prcticas agrcolas inadecuadas
Figura 2: Morfologa y divisin de algunos de los grupos de Fitopatgenos

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Para el siguiente trabajo nos enfocaremos conocer un poco en las

enfermedades biticas de las plantas como son los hongos, bacterias,
micoplasmas y virus, para as poder plantear su erradicacin mediante el
cultivo in vitro, y as poder remarcar la importancia de estos para as evitar
cultivos infectados y promover la sanidad vegetal.
3. NATURALEZA DE LOS PATOGENOS

Los agentes patgenos ms comunes en las plantas son los hongos, aunque las
bacterias y los nematodos tambin son importantes. Las enfermedades causadas por
micoplasmas y virus no se registran a menudo, mayormente porque son muy difciles
de detectar.
El tamao relativo de los patgenos vegetales ya mencionados vara mucho.
Entre los patgenos vegetales los nematodos son los ms grandes y pueden
ser observados fcilmente con un microscopio estereoscpico.
Los virus y viroides son los ms pequeos y se requiere de un microscopio

electrnico para su observacin.
Figura 3: Esquema en el que se presentan la forma y el tamao de algunos de los

Fitopatgenos en relacin a una clula vegetal
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La ocurrencia de una enfermedad no solo depende de la presencia del hospedante y

del patgeno. Las condiciones ambientales, especialmente la humedad y la
temperatura, juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad.
As una enfermedad puede definirse como un producto de la interaccin del
hospedante, el patgeno y el ambiente. Este concepto de una enfermedad es conocido
como el tringulo de la enfermedad.
La distribucin de los diferentes patgenos dentro de la planta enferme varia tambin
mucho.
Pseudomonas solanacearum, el virus del enrollamiento de la hoja de la papa y los

micoplasmas estn restringidos al tejido vascular de una planta.
Erwinia carotovora y el virus X de la papa, invaden tanto el tejido vascular como

el resto de los tejidos de la planta.
No todas las clulas en una planta enferma se encuentran infectadas con

patgenos. Los tejidos meristematicos de la raz y brotes terminales de una planta
infectada estn, algunas veces, libres de virus.
En algunas ocasiones, tal como sucede en la papa con el PVX y el TRV (Tobacco
Rattle Virus), solamente la cpula y los primeros primordios foliares se
encuentran libres de virus. Se desconoce la razn exacta de este problema; sin
embargo, se cree que uno ms de los siguientes factores podran ser
responsables de ello:
Alta actividad metablica: Los virus se multiplican acompaando el

curso del metabolismo del husped. Debido y la gran actividad metablica
en las clulas meristemticas del husped, los virus no pueden tornar el
control de la maquinaria biosinttica del mismo.
Carencia de tejido vascular: Los virus se diseminan rpidamente y travs

del sistema vascular. Los virus que se ubican tan solo en el floema (PLRV)
no pueden invadir los tejidos meristemticos debido y la ausencia de
diferenciacin celular. En esta zona meristemtica, los virus que infectan
los tejidos no vasculares se diseminan de clula y clula y travs de los
conductos intercelulares (plasmodesmos). Este es un proceso lento por lo
que resulta relativamente difcil que los virus infecten en su totalidad y las
clulas que vienen dividindose rpidamente.
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Alta concentracin de auxinas: Los tejidos meristemticos de las

plantas tienen una concentracin ms alta de auxinas que los tejidos de
otras partes de las mismas. Algunos autores indican que estas auxinas
inhiben y multiplicacin de los virus.
4. PATOGENOS QUE ATACAN LOS CULTIVOS

I.
HONGOS:
Son organismos pequeos, generalmente microscpicos, que se reproducen
principalmente a travs de esporas. Las esporas son el equivalente a las
semillas en las plantas. La mayora de los hongos tiene un cuerpo vegetativo
filamentoso llamado micelio. El micelio da a los hongos una apariencia
algodonosa. sta es una caracterstica utilizada en el campo para distinguir
las enfermedades causadas por hongos de aquellas causadas por bacterias.
Se nombran los distintos grupos de hongos, con sus respectivos ejemplos,
para enfatizar que no todos los hongos son controlados por la totalidad de los
fungicidas, sino que es indispensable conocer el grupo de hongo al que
pertenece una enfermedad en particular para poder seleccionar y utilizar el
fungicida apropiado para su control qumico. Los principales hongos
fitopatgenos estn agrupados en las siguientes clases:
Ascomycetes: Pudricin del tallo o cncer (Ceratocystis sp.), mildiu

polvoso o blanco (Erysiphe sp.), sigatoka o mancha foliar del pltano
(Mycosphaerel/a sp.).
Figura 4: Ciclo de reproduccin de hongos Ascomycetes

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Basiodiomyccetes: Roya del maz (Puccinia sp ), mustia hilachosa

del frijol (Thanatephours cucumeris).
Figura 4: Ciclo de reproduccin de hongos Ascomycetes
Figura 5: Ciclo de reproduccin de hongos Basidiomycetes

Oomycetes: Tizn tardo (Phytophthora infestans), mildiu velloso
(Peronospora sp.), mal del talluelo (Phytium sp. ).
Figura 6: Ciclo de reproduccin de hongos Oomycetes
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Deuteromycetes: Tizn temprano (Alternara solant), moho gris

(Botrytis
sp.),
Antracnosis
(Colletotrichum
sp.),
Fusarium
(Fusarium sp.).
Figura 7: Ciclo de reproduccin de hongos Deuteromycetes
Sobrevivencia de los hongos fitopatgenos:

Los hongos pueden sobrevivir entre ciclos agrcolas como: micelio, esclerocios
(masas compactas de hifas), clamidiosporas (esporas endurecidas) y esporas
sobre tejidos infectados, hojas y frutos cados, en rastrojos de cultivos, en el suelo
y dentro o sobre semillas y material vegetativo. Por ejemplo, el hongo Fusarium
oxysporum f.sp. lycopersici, organismo causal del marchitamiento por fusarium
en tomate, puede producir clamidiosporas para sobrevivir por mucho tiempo en
el suelo.
Origen y diseminacin de las enfermedades causadas por hongos:
Las enfermedades no son de aparicin espontnea sino que tienen fuente de
origen (hospederos alternos, material infectado en descomposicin, esporas
latentes en el suelo, etc.). Debido a que las esporas de hongos son muy pequeas
y livianas. stas pueden diseminarse por:
o
El viento.
El agua (salpique por lluvia, riego por aspersin o escorrentas).
Los organismos pequeos como insectos y caros.

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o
El movimiento de gente, maquinaria o animales.
Rango de hospederos de los hongos fitopatgenos
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Los hongos que atacan el follaje suelen tener un estrecho rango de hospederos,
generalmente comprendido dentro de una sola familia botnica de plantas;
mientras que los que atacan races o frutos suelen tener amplio rango de
hospederos. As, el tizn tardo de tomate o papa (Phytophthora infestans) es
especfico de las solanceas y no afecta cucrbitas (meln, sanda o pepino),
crucferas (repollo, brcoli, coliflor, etc.), ni otras hojas anchas u hojas
angostas (maz, sorgo o caa de azcar) cultivadas. Por el contrario, los hongos
que atacan races, como Fusarium, Pythium, y Rhizoctonia, suelen atacar un
amplio rango de hospederos: cucrbitas, solanceas, crucferas y compuestas,
los hospederos estn comprendidos dentro de grupos especficos de plantas
(hojas anchas en este caso).
Enfermedades y sntomas comunes mostrados por las plantas atacadas por
hongos:
o
Tizones. Empardecimiento general y extremadamente rpido de las hojas,

ramas y rganos florales de una planta, que dan como resultado la muerte
de esos rganos.
Pata seca o mal del talluelo. Muerte rpida y colapso de plantas muy
jvenes que se cultivan en el campo o almcigo.
Antracnosis. Lesin que se asemeja a una ulcera profunda y se produce

en todos los rganos de la planta.
Marchitamiento. Las plantas pierden su turgencia.
Roya. Lesiones pequeas de coloracin amarillenta o rojiza que aparecen

sobre las hojas o tallos de las plantas.
Mildi. Zonas necrticas que por lo comn se cubren con el micelio y los
cuerpos fructferos del hongo.
II.
VIRUS FITOPATGENOS
Los virus no tienen rganos reproductivos, sino que utilizan a las plantas que
infectan para replicarse. Los virus tienen una estructura sencilla compuesta
nicamente de cido nuclico (ADN o ARN) y una capa proteica, y son tan
pequeos que no pueden ser vistos utilizando microscopios convencionales.
Las caractersticas ms importantes de los virus son las siguientes:
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Los virus son tan pequeos que se necesitan tcnicas especiales

para su deteccin.
Para el diagnstico de los virus se necesitan mtodos de anlisis de
laboratorio de mayor sensibilidad (anlisis ELISA, PCR y de inoculacin
de plantas sensibles a determinados virus) que los utilizados con otros
tito patgenos como bacterias y hongos.
Los virus pueden ser de transmisin mecnica o necesitar vectores
para su diseminacin y transmisin.
Los virus no pueden moverse y/o penetrar tejido de una planta por s
solos, por lo que necesitan de un vector que los transporte o disemine.
Los insectos son los vectores de virus ms importantes y, entre ellos,
los fidos son responsables de la transmisin de alrededor del 60% de
todos los virus de plantas transmitidos por insectos.
Los virus pueden ser de transmisin mecnica o necesitar vectores
para su diseminacin y transmisin.
Los virus no pueden moverse y/o penetrar tejido de una planta por s
solos, por lo que necesitan de un vector que los transporte o disemine.
Los insectos son los vectores de virus ms importantes y, entre ellos,
los fidos son responsables de la transmisin de alrededor del 60% de
todos los virus de plantas transmitidos por insectos. Los animales y el
hombre transmiten virus mecnicamente (por contacto y uso de
herramientas). El material vegetativo obtenido de plantas enfermas
(esquejes, injertos, cormos, rizomas) y utilizados para reproduccin de
plantas es un medio muy comn y efectivo para la transmisin de virus.
Los virus son parsitos obligados.
Para multiplicarse o sobrevivir necesitan de un hospedero vivo. Los
virus que necesitan de un vector sobreviven nicamente en plantas
infectadas o en sus respectivos vectores mientras stos vivan o
permanezcan infectados (mosca blanca o thrips), pero no pueden
sobrevivir en material vegetal muerto. Esto implica que la eliminacin
de plantas con virus de transmisin por vector dentro de una
plantacin no necesita de arreglos especiales como el uso de
desinfectantes, la quema o entierro de plantas virticas.
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En contraste, los virus de transmisin mecnica son muy estables y

pueden sobrevivir, aunque sin reproducirse, fuera de un ser vivo, como
en el suelo, en material vegetal en descomposicin, herramientas,
cigarrillos, cabuya y estacas durante mucho tiempo. Por ello, debe
disponerse de las plantas virticas apropiadamente y desinfectar a los
operarios que trabajan en la plantacin. Los virus de transmisin
mecnica (Tobamovirus} son especficos de las solanceas (tomate,
chile, papa, tabaco, berenjena}.
Los sntomas causados por virus son de tipo sistmico.
Es decir se presentan en todos los brotes, en contraste con la mayora
de sntomas causados por otros fitopatgenos que suelen ser
localizados. El caro blanco causa sntomas muy parecidos a aquellos
causados por virus en chile y en otras solanceas, pero su dao raras
veces afecta todos los brotels. Adicionalmente, una vez controlado el
caro, el crecimiento de los brotes vuelve a ser normal, no as en la
virosis.
Los virus causan enfermedades que no pueden curarse y causan
prdida en rendimiento.
A diferencia de la mayora de las enfermedades causadas por otros
fitopatgenos, toxicidad por qumicos, daos de caros, nematodos,
insectos y deficiencias nutricionales, las plantas infectadas por virus
tienen reducciones en rendimiento y sntomas que no pueden revertirse
(no pueden curarse). Al no tener alternativas curativas para el control
de virus, es necesario manejar los virus de manera preventiva. Las
reducciones en rendimiento pueden ser muy severas si la infeccin
ocurre a temprana edad de la planta (antes de fructificacin).
Los virus son especficos.
Suelen atacar plantas con caractersticas similares: hojas anchas
anuales o herbceas, hojas angostas o zacates, plantas perennes, pero
rara vez un virus es capaz de atacar ms de un grupo de plantas. Para
utilidad prctica, esto implica que los virus que atacan cultivos de
importancia econmica, como tomate, chile, meln, sanda, pueden
ocurrir 13n plantas solanceas o cucurbitceas, en otras herbceas
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cultivadas o no, de otras familias, pero no en maz, sorgo, zacates o

rboles de los alrededores. Esta caracterstica permite prevenir posibles
fuentes de virus antes de la siembra, identificar el posible origen de las
enfermedades virales en la vecindad del cultivo e inclusive planificar
medidas de manejo de virosis, como el uso de barreras de sorgo, maz
o zacates en permetros de cultivos.
Sntomas mostrados por las plantas con virosis:
i.
Cambios permanentes y sistmicos (se presentan en todo nuevo

crecimiento) en la coloracin del follaje (mosaicos verdes o
amarillos, venas oscuras o aclaradas).
ii.
iii.
Ocurrencia de malformaciones.
Subdesarrollo u otra inhibicin del crecimiento.
Figuras : Montaje fotogrfico de sntomas viroticos
III.
BACTERIAS FITOPATGENAS
Entre los principales gneros de bacterias que atacan a los cultivos se
encuentran:
Xanthomonas,
Pseudomonas,
Erwinia,
Agrobacterium
Ralstonia.
Reproduccin
Las bacterias son organismos unicelulares que se reproducen por
fisin binaria (una clula se parte y se convierte en dos clulas
idnticas) y generalmente necesitan de un medio de crecimiento rico
en protenas y con ambiente de alta humedad relativa para su
infeccin,
reproduccin
diseminacin.
Bajo
condiciones
ambientales favorables de temperatura, humedad y nutrientes, las

bacterias pueden dividirse cada 20 minutos. Sin embargo, este
exagerado ritmo de crecimiento puede verse limitado por la falta de
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nutrientes, acumulacin de desechos metablicos y otros factores

limitantes. Las bacterias se diferencian de los hongos por no ser
capaces de penetrar directamente tejidos de las plantas, sino que
necesitan de heridas provocadas por insectos, pjaros, nematodos y
por los Foto 53. Fisin binaria. Humanos durante prcticas
culturales como el trasplante, poda, etc. Las aberturas naturales de
las plantas tambin son puerta de entradas aprovechadas por las
bacterias.
Sobrevivencia de las bacterias
La mayora de las bacterias fitopatgenas se desarrollan dentro de
sus plantas hospederas, en la superficie de las plantas, en rastrojos
de y en el suelo. En el suelo, las bacterias viven preferiblemente en
material vegetal y con menor frecuencia libre o saprofticamente. Las
bacterias pueden tambin sobrevivir dentro o sobre semillas o en
insectos encontrados en el suelo.
Sntomas mostrados por las plantas atacadas por bacterias.
Las bacterias fitopatgenas tienden a atacar follaje y frutos (por
ejemplo mancha y peca bacteriana en solanceas como chile) o a ser
problema en races (por ejemplo Ralstonia en tomate). A diferencia
de los hongos, producen lesiones (manchas, pecas, podlredumbres
hmedas que despiden un mal olor, ch8incros, moteados, roas y
costras), pero nunca presentan micelios y son predominantes
nicamente
bajo
encharcamiento
condiciones
del
suelo.
de
alta
humedad
Adicionalmente,
con
relativa
condiciones
favorables (alta humedad relativa o encharcamiento), el avance de

las enfermedades causadas por bacterias puede ser sumamente
rpido
debido
su
extremadamente
rpida
multiplicacin
(minutos). Por esa misma razn, el uso de antibiticos para su

control debe tener una frecuencia de aplicacin ms corta (no mayor
a 4 das) que la normalmente acostumbrada para fungicidas o
insecticidas (alrededor de 7 das).
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Fitoplasmas
Las enfermedades causadas por fitoplasmas son relativamente
nuevas y poco conocidas. El caso ms conocido y econmicamente
importante de este tipo de enfermedad en Honduras ha sido el
amarillamiento letal del coco, que termin con la poblacin de
cocoteros de toda la zona de la costa Atlntica. Otros casos recientes
es el del madreado en todo el pas, el de maracuy en la zona
occidental del pas, y el de cundeamor y otros vegetales orientales
en el valle de Comayagua. Los fitoplasmas son bacterias modificadas
que carecen de pared celular y que estn generalmente presentes en
el floema. Los fitoplasmas son diseminados por insectos chupadores
de la familia Cicadelidae que actan como vectores. Su reproduccin
en medios artificiales no es posible, lo que ha hecho de su estudio
lento y difcil.
Los insectos vectores pueden adquirir el patgeno despus de
alimentarse en plantas infectadas por tiempo prolongado (das). El
vector no puede transmitir al fitoplasma inmediatamente despus
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de su contagio, sino que empieza a transmitirlo despus de un

perodo de incubacin que puede durar das. Se cree que los vectores
permanecen infectados de por vida y que la infeccin puede pasar
por medio de la madre a la siguiente generacin mediante la
infeccin de los huevos. La transmisin mecnica y por semilla
parece probable pero an no se ha probado de manera consistente
en todos los casos. Los fitoplasmas causan sntomas, en algunos
casos, parecidos a aquellos causados por virus (amarillamiento)
pero se distinguen de los virus por causar consistentemente
sobrebrotamiento y floracin anormal (flores deformes y de color
verde). Las plantas infectadas no presentan sntomas sistmicos,
sino localizados, es decir, slo en algunas ramas.
Nematodos fitopatgenos
Los nematodos son muy parecidos a los gusanos; sin embargo, su
tamao microscpico, sus hbitos alimenticios, su reproduccin y
modo de vida, los diferencia grandemente.
Caractersticas generales de los nematodos:
o
Son organismos pluricelulares .
No presentan segmentacin, aunque algunas especies lo

aparenten.
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No presentan sistema circulatorio ni respiratorio.
Poseen sexo bien diferenciado, especialmente en hembras.
Poseen estilete.
Sobrevivencia y reproduccin de los nematodos fitopatgenos:

Generalmente, las hembras adultas depositan al menos 500 huevos
unicelulares envueltos en una sustancia gelatinosa y las larvas que
nacen buscan alimento inmediatamente. Los nematodos se mueven
lentamente a travs de los espacios que se forman entre las
partculas del suelo, aprovechando la humedad del mismo para
desplazarse mediante movimientos ondulantes. Los nematodos se
mueven lentamente en el suelo, de unos pocos centmetros a un
metro por temporada. Sin embargo, pueden moverse a travs de
cualquier medio que mueva suelo, tales como maquinarias,
animales, herramientas agrcolas, adems del agua de riego, lluvia
y escorrentas. El exceso de humedad reduce el contenido de oxgeno
y los nematodos pueden morir por asfixia. La falta de humedad en
el suelo evita que los nematodos se desplacen para buscar alimento,
pudiendo stos morir de hambre. Esta es una de las principales
causas de reduccin de las poblaciones.
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5. VAS DE OBTENCIN DE MATERIAL DE PROPAGACIN LIBRE DE

PATGENOS
I.
MICROINJERTO DE APICES CAULINARES IN VITRO
II.
TERMOTERAPIA Y CULTIVO DE MERISTEMAS
III.
QUIMIOTERAPIA Y CULTIVO DE MERISTEMAS
6. ERRADICACION DE AGENTES CONTAMINANTES Y PATOGENOS EN LOS

CULTIVOS IN VITRO
I.
ELIMINACIN DE LOS CONTAMINANTES DE LOS EXPLANTES

La mayora de los esfuerzos en este aspecto han estado concentrados en la
prevencin y tratamiento de los contaminantes que son introducidos con los
explantes tomados de las plantas in vivo. Los tres puntos fundamentales hacia
los que debe estar dirigido el control y prevencin de los contaminantes son:
A. Tratamiento a las plantas madres
Las plantas madres deben mantenerse libres de enfermedades por
estrictos mtodos de control biolgico y qumico. El nmero de bacterias y
hongos en el tejido areo de las plantas usadas como explantes debe ser
reducido mediante el mantenimiento de stas lo ms secas posibles en
casa de cristal. El tomar explantes de rganos subterrneos de la planta,
de muy cerca del suelo o de plantas con riego excesivo, reduce la eficiencia
de los subsecuentes procesos de desinfeccin.
Los explantes que usualmente son tomados de tejidos areos jvenes de
las plantas (meristemos, ndulos, botones florales, discos de hojas,
anteras, polen, etc.) estn por lo general libres de poblaciones internas
detectables de viroides, virus, micoplasmas, bacterias y hongos.
B. Desinfeccin de los explantes
Los contaminantes microbianos en la superficie de los explantes son
generalmente eliminados por la inmersin de estos en un amplio espectro
de biocidas tales como: hipoclorito, alcoholes, cloruro de mercurio u otros
productos qumicos con actividad ms selectiva como son los fungicidas,
insecticidas y antibiticos.
La mayora de los biocidas de amplio espectro son no sistmicos, pero los
explantes mueren si se les permite que penetren en sus tejidos internos.
El xito de la desinfeccin utilizando estos compuestos est en que el tejido
interno de la planta est libre de microorganismos contaminantes, sin
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embargo, si este est infestado por hongos, bacterias, micoplasmas, virus

o viroides, estos son inevitablemente transferidos al cultivo de tejidos.
En estudio realizado se ensay un mtodo fsico de separacin de
microorganismos de las clulas y protoplastos mediante un gradiente de
centrifugacin de la sucrosa. Posteriormente se plante que este mtodo
puede ser combinado con diluciones de hipoclorito y/o tratamientos
antibiticos de las clulas antes y despus de la centrifugacin con muy
buenos resultados.
C. Deteccin de contaminantes latentes
Los explantes tomados de las plantas madres deben ser testados para la
presencia de contaminantes latentes en todos los subcultivos al menos seis
meses despus de la desinfeccin, y testados para las bacterias
vitropatgenas a intervalos regulares de dos a tres meses. Nuevas
contaminaciones bacterianas son permanentemente introducidas en el
laboratorio.
En la mayora de los laboratorios el test de rutina para bacterias latentes
se lleva a cabo mediante transferencias del material de la planta y/o el uso
de medios de cultivo de tejidos con test de esterilidad bacteriolgica o
medios index. El uso de medios bacteriolgicos tiene la ventaja de que
estos permiten el crecimiento y deteccin de un amplio rango de especies
bacterianas que causan severos daos en el cultivo de tejidos de plantas.
Sin embargo, tienen algunas limitaciones como que las bacterias con
requerimientos nutricionales especiales no crecen en los medios de rutina,
en las etapas 1 y 2 de los index los residuos de desinfectantes pueden
inhibir el crecimiento del material vegetal y con ello prevenir el crecimiento
y deteccin de bacterias, adems, algunas bacterias necesitan estar en un
elevado nmero para que se expresen en el index, los materiales de
algunas plantas pueden excretar sustancias antimicrobianas y la mayora
de los micoplasmas, spiroplasmas y rickettsias no crecen en medios
comunes.
Los micoplasmas, virus y viroides pueden ser detectados solamente
mediante inoculacin de plantas indicadoras y/o con el uso de mtodos
serolgicos, microscpio electrnico o hibridizacin de cidos nucleicos.
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II.
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USO DE ANTIBITICOS
En cultivo de tejidos vegetales, los antibiticos solo son empleados cuando los
microorganismos no pueden ser eliminados par otros mtodos. Estos
compuestos son caros y no existe ninguno que ser efectivo para controlar
todos los organismos contaminantes. Antes de decidir utilizar antibiticos se
recomienda eliminar todas las posibles fuentes de contaminacin (Reed and
Tanprasert, 1995).
Las siguientes combinaciones de antibiticos se han aplicado con xito en
cultivo de tejidos de plantas:
Cefotaxima
Gentamicina
Rifampicina
Nistaina + Carbenecilina
Gentamicina + Amfotericina B
Vancomicina HCl + Micostatina
Estreptomicina + Carbenecilina
En algunos cultivos se ha encontrado fitotoxicidad causada por:
Penicilina
Estreptomicina
Bactericina
Esparsomicina
III.
PREVENCION
TRATAMIENTO
DE
LA
CONTAMINACION
EN
EL
LABORATORIO.
En el cultivo de tejidos de plantas comercial, la prevencin y tratamiento de
la contaminacin ha conducido a la implementacin de sistemas detallados
de control de la produccin microbiolgica en un intento de prevenir la
contaminacin mediante el monitoreo y control de todas las posibles fuentes
de contaminantes.
Los parmetros probados y los mtodos microbiolgicos utilizados son
similares a los empleados en otras industrias que elaboran productos
aspticos o libres de contaminacin, esto incluye:
El monitoreo de diferentes fuentes de contaminacin mediante el
testaje regular del aire del laboratorio, la esterilidad del medio
preparado y el funcionamiento de autoclaves, flujos laminares e
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instrumentales, adems, la determinacin de tasas de contaminacin

por lnea vegetal individual y operadores y por ltimo, la identificacin
de organismos indicadores.
El medio de cultivo puede contaminarse a causa de una insuficiente
esterilizacin y/o durante la manipulacin despus del autoclaveo.
Esto puede evitarse garantizando que cada ciclo de autoclaveo se lleve
a cabo con la temperatura adecuada.
Las levaduras y los hongos introducidos durante las manipulaciones
del medio de cultivo generalmente crecen en forma de colonias visibles
despus de una o dos semanas de incubacin a temperatura ambiente,
y el medio puede haber sido descartado antes de introducir las plantas
si se observaron aparentes colonias, sin embargo, los medios son
generalmente utilizados antes de que este crecimiento se haga visible
y/o son ubicados en locales fros donde las tasas de crecimiento
fungoso son limitadas.
La deteccin de las bacterias introducidas durante la preparacin del
medio es ms difcil de acuerdo a lo que se ha explicado en epgrafes
anteriores, aunque, el medio puede ser testado por adicin de
nutrientes extras en forma de caldo nutriente o caldo triptona-soya
despus de ser vertido. Esto permite el crecimiento bacterial y la
deteccin visible de colonias de microorganismos en el medio.
La adicin de reguladores del crecimiento sensitivos al calor mediante
la esterilizacin del filtro despus del autoclaveo, permiten que el medio
sea autoclaveado por ms tiempo. El xito de la esterilizacin de los
ciclos individuales de autoclaves puede ser monitoreado por la cinta
para autoclave u otros indicadores fsicos de temperatura o mediante
mtodos biolgicos ms precisos que son basados en la sobrevivencia
de esporas de Bacillus.
Como se describi anteriormente para el subcultivo del material vegetal, la
contaminacin durante el servido manual del medio puede ser evitada
mediante el entrenamiento de los operadores en tcnicas aspticas,
conjuntamente con la evaluacin de los medios servidos en busca de la
presencia de contaminantes.
Los sistemas de dosificacin de medios mecanizados y semimecanizados
usualmente resultan en ninguna contaminacin o en menor tasa de
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contaminantes que cuando esta operacin se hace manualmente, pero

costosos y necesitan mantenimiento peridico.
Existe poca informacin sobre el nmero y tipos de organismos que son
introducidos durante el subcultivo del material de las cabinas de flujo
laminar, pero las tasas en que los mismos aparecen estn en dependencia de
las tcnicas de asepsia y del equipamiento usado, adems, en esto influye
tambin el operador y si las plantas fueron subcultivadas hacia el frente del
flujo laminar.
7. BIBLIOGRAFIA
1. George N. Agrios. FITOPATOLOGIA. 3era Edicin 1998 .Editorial Limusa. S.A de
C.V Grupo Noriega Editores. Mxico D.F
2. Folgueras, Maryluz. La contaminacin microbiana en la micropropagacin in
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21

Cultivo in Vitro en La Erradicacion de Patogenos.

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