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INTRODUCCIN

El principal impedimento en la observacin de bacterias en microscopio ptico

es la falta de contraste entre la clula en observacin y el medio que la rodea,
la manera ms simple de facilitar el contraste es la utilizacin de colorantes,
revelando la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad
respiratoria, etc. Para bacterias, el proceso de fijacin por calor es lo ms
habitual. Despus de esto se aade el colorante. La fijacin produce
habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace
que las clulas parezcan mayores de lo que son realmente. La mayora de los
colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad por los
materiales celulares.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido
tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta
sustancia se denomina mordiente; un mordiente o fijador habitual es el Lugol.
Este compuesto forma un complejo insoluble con el colorante impidiendo su
liberacin natural de la bacteria.
Una tcnica de coloracin y la ms conocida es la Tincin de Gram,
denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien desarrollo
esta tcnica en 1844. Sobre la base de la Tincin de Gram, las bacterias se
clasifican en dos grupos: Gram Positivos y Gram Negativos.
Las bacterias Gram positiva y Gram negativas tien de forma distinta debido a
las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La
pared de la clula bacteriana sirve para definir su tamao y su forma como
tambin para prevenir la lisis osmtica.
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La idea central de este laboratorio se centra ah, en identificar estos dos

grandes grupos de bacterias y evidenciar sus ms elementales diferencias
estructurales.

OBJETIVOS

Objetivo General

A travs de un proceso llamado Tincin de Gram, clasificar una colonia

de bacterias en uno de los dos grupos mayoritarios segn la estructura
de su pared celular.

Objetivos Especficos

Aplicacin de tcnica de coloracin diferencial para la identificacin de

bacteria Gram Positiva y Gram Negativa

Asociar los correctos resultados de una tincin de Gram
Aprender tcnicas fundamentalmente empleadas en la transferencia y

la aislacin de microorganismos
Conocer los medios de cultivo y su finalidad
Aplicar tcnicas de esterilizacin utilizadas en Microparasitologa
Desarrollar una metodologa de aprendizaje inductiva a partir de la
experimentacin

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXTRACCIN DE ADN DE PLTANO

1. Materiales:

ARNasa 10 mg/ml
1/3 de Pltano
Detergente Antigrasas 10 ml
Mortero
HO Destilada Autoclavada
Probeta de 60 ml
NaCl 5M 600 L
Varilla de agitacin
1 Vaso Precipitado de 100 ml
1 Tubo de Ensayo de vifrio con
tapa
Bao Termoregulado a 50C

Etanol Puro Calidad Anlisis Fro 4

ml
Proteinasa K 10 mg/ml
ARNasa 10 mg/ml
Embudo
Matraz Kitasato
Bomba de vaco
Papel Filtro
Micropipeta de 1000 L
Puntas de Micropipeta de 1000 L
Micropipetas 200 L
Puntas de Micropipeta de 20 200
L
Varilla de Agitacin

2. Procedimiento:

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Se vertieron 20 ml de agua destilada y la mitad de un pltano sin cascara, en

un mortero. En l, se comenz a moler todo junto, terminando por agregar 15
ml de agua destilada y moliendo hasta obtener una pasta homognea. Una vez
que se termin este proceso, se traspas todo a un matraz de 100 ml, se
agregaron 60 ml de solucin de Lisis y se revolvi todo, sin formar espuma, por
3 minutos. Luego se tom un embudo, en l se introdujo un papel filtro y se
procedi a filtrar la mezcla preparada, la cual se deposit directamente en un
tubo de ensayo, ayudando al proceso con una varilla de agitacin (proceso se
realiz con mucho cuidado procurando que solo cayeran gotas de lquido al
tubo).
Al obtener 1,5 ml de la preparacin filtrada en el tubo de ensayo; en primer
lugar, se aplic 30 L de ARNasa y se dej reposar por unos minutos, luego se
aplic 30 L de Proteinasa K y nuevamente se dej reposar por unos minutos
ms, y finalmente se aplic 600 L de Cloruro de Sodio (NaCl) y se revolvi la
solucin. Despus de este procedimiento se aplic, 4 ml de Etanol Puro muy
fro, a la solucin y se dej reposar la mezcla hasta que se comenz a observar
la aparicin del ovillo de ADN, el cual se vio claramente flotando en la
preparacin (Fig. 1.1).

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RESULTADOS

NOMBRE DE LA PREPARACIN:
ADN DE PLTANO
TINCIN: SIN TINCIN
OBSERVACIONES: Se observ un ovillo
de filamentos de ADN de color
blanquecino el cual precipit por la
accin del Etanol, entre la interfase de
la preparacin y este alcohol. El ovillo
se distingua claramente del resto de la

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preparacin, pudiendo incluso

extraerlo con alguna pinza.

DISCUSIN

En el presente informe se muestran los resultados obtenidos de una serie de

intervenciones realizadas en laboratorio a una colonia de bacterias, las
Echerichia Coli, sin embargo, los resultados obtenidos no fueron
completamente favorables debido a que la colonia de bacterias no reaccion
bajo los estndares esperados.

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Primero que todo, el procedimiento al

cual fue sometida la colonia de
bacterias (E. Coli) es comnmente
llamado Tincin de Gram. Este
procedimiento permite separar las
Fig. 1 Envoltura de una bacteria Gram Negativa

bacterias en dos grandes grupos, Gram

Positivas y Gram Negativas. Las

bacterias positivas se tien de un color morado, y las negativas se tien de un

color rosa (sin safranina) o rojo (con safranina).
El problema en s se present en la coloracin final de las bacterias estudiadas,
vistas en el microscopio. La mayora de ellas presentaba una coloracin ms
bien cercana al morado, y muy pocas de ellas presentaban tonalidades rosas.
Cabe tambin mencionar que ninguna de ellas present una tonalidad propia
de la safranina. Por tanto, todo esto indicaba que se trataba de un resultado
pseudo Gram Positiva.
La Tincin de Gram, como se mencion anteriormente, clasifica en dos grandes
grupos a la mayora de las bacterias descubiertas. Este procedimiento basa su
fiabilidad en las claras diferencias estructurales existentes en estos dos grupos.
Especficamente, estas diferencias se presentan en la pared celular bacteriana.
La pared celular de una bacteria Gram Positiva est exclusivamente constituida
por una gruesa capa de peptidoglicano entrelazada por cidos teicoicos y
lipoteicoicos, que se cree que ayudan a mantener la estructura de la pared.
En cambio, la pared celular de una bacteria Gram Negativa es mucho ms
compleja, primero que todo porque la componen tres capas generales, una
muy delgada de peptidoglicano, otra algo ms gruesa llamada membrana
externa, y un espacio intermedio periplsmico.
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Cuando se realiza la Tincin, las bacterias (E. Coli) absorben el cristal violeta,
luego se fijan con la aplicacin de Lugol (yodo en solucin de yoduro de
potasio) a las protenas ribonucleares dentro de la clula, y la diferencia antes
mencionada entre estos dos grupos de Gram, permite que en estas bacterias,
al aplicarles solventes de alcohol y acetona, se logre penetrar la dbil pared
celular que las protege, extrayendo el colorante desde el interior de la clula,
permitiendo la decoloracin propia en este procedimiento.
El problema se presenta ah, y a
continuacin se definen algunas
causas que pudieran ocasionar el
error antes mencionado:
1. Exceso en el tiempo y en la
cantidad aplicada de cristal
Fig. 2 Curva de proliferacin bacteriana

violeta
2. Exceso en el tiempo y en la

cantidad aplicada de Lugol

3. Exceso en el tiempo de aplicacin de solventes a base de alcohol y
acetona
4. Poca informacin del cultivo de bacterias manipulado (trazabilidad)
Encontrar los argumentos exactos para explicar el resultado de la Tincin de
Gram realizada es muy difcil, sin embargo, claramente es una combinacin de
todas aquellas causas mencionadas que explicaran en un gran porcentaje la
problemtica.
Si bien al investigar acerca del tema, existe una convencin popular en que no
se debe aplicar el procedimiento a cultivos de colonias de E. Coli antiguas, que
se encuentren en su fase estacionaria, esto porque en aquellos cultivos, los
nutrientes son escasos, existe gran cantidad de material residual producto del
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metabolismo propio de las bacterias que interrumpe la proliferacin celular.

Adems muchas clulas yacen muertas junto a las otras. Todo esto provoca
una alteracin en las paredes celulares de aquellas bacterias, producto de la
inanicin, el contacto con residuos nocivos y pares muertos.
El solvente aplicado podra verse afectado por estos residuos nocivos y
retardar, o derechamente, no provocar su efecto decolorante. O por el
contrario, una mayor exposicin a las bacterias, de lo normal, al solvente
podra haber resecado en extremo todas las protenas responsables de la
permeabilidad celular, provocando un efecto de cierre de la clula
manteniendo el complejo colorante dentro de la clula.
Por otro lado, al observar al microscopio la muestra estudiada, se pudo
evidenciar que algunas bacterias si presentaban una decoloracin, un
porcentaje mnimo por cierto pero que evidencian, por qu no, una
irregularidad en las concentraciones de cristal violeta y Lugol combinados
aumentando este fenmeno en conjunto antes descrito.
Por ltimo, debemos destacar que se desconoca en el momento, la
trazabilidad del cultivo estudiado, desconociendo la fase en la que la colonia
se encontraba, por tanto todas estas variables podran haber jugado en contra
en el resultado de este procedimiento.

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CONCLUSIONES

Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se
presentan morfolgicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar
tincin de Gram en estas para identificar su grupo taxonmico, las Gram
positivas se tien de color violeta mientras que las Gram negativas se tien de
color rosado.
Mediante la tincin de Gram se identifican bacterias Gram positivas y Gram
negativas gracias al color que tornan despus de ser teidas; en el caso de las
bacterias Gram positivas se tien de violeta, esto se debe a que gracias a que
contienen una pared gruesa de peptidoglicano y gran cantidad de cidos
teicicos que permiten fijar y retener rpidamente el colorante inicial llamado
cristal violeta, y adems son resistentes a la decoloracin. Lo contrario ocurre
con el caso de las Gram negativas, las cuales poseen una pared delgada con
menos cantidad de peptidoglicano y lpidos, la cual requiere de un colorante
de contraste como la safranina en este caso, ya que el colorante inicial es
fcilmente retirado en la decoloracin con alcohol, debido a que por su
delgada pared celular no lo retienen.
A partir de la experimentacin, se consolidan los conceptos ya sabidos por la
mayora de los que estudian esta rama de la medicina. Se pudieron ampliar
tambin estos conocimientos y fomentar una perspectiva real de cada uno de
los elementos estudiados.

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El mtodo de extraccin celular realizado se aprendi completamente,

entendiendo cada uno de los procesos que fueron dando paso al resultado
final.
Este laboratorio tambin logro incentivar un estudio ms detallado y especfico
de la morfologa bacteriana. Adems, de la comprensin de la interaccin de
los procesos qumicos usados sobre los elementos orgnicos vivos estudiados.
Finalmente, para obtener mejores resultados siempre se debe confirmar la
trazabilidad de las colonias estudiadas, repasar minuciosamente cada uno de
los componentes a usar en el procedimiento como tambin priorizar la
esterilizacin de cada una de las herramientas necesarias para realizar la
Tincin de Gram.

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BIBLIOGRAFA

Karp, Gerald. Biologa Celular y Molecular. Quinta Edicin. Mxico. Mc Graw-

Hill. 2008.
Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologa Mdica. Vigesimoquinta Edicin.

Mxico. Mc Graw-Hill. 2011.

Murray, Patrick. Microbiologa Mdica. Sexta Edicin. Espaa. Elsevier.

2009.
Ryan, Kenneth. Microbiologa Mdica. Quinta Edicin. Mxico. Mc Graw-Hill.
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NOTAS

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