Tecnologa del DNA

recombinante
Curso: Biologa Celular y Molecular
Oscar Nolasco Crdenas MSc.
oscarnol@hotmail.com
Diciembre 2013

Tecnologa del DNA recombinante

DNA recombinante: Es el DNA compuesto por
segmentos de DNA de diferentes orgenes

Dos importantes enzimas en la generacin de

DNA recombinate
Enzimas de restriccin:
Corta el DNA de un organismo en una secuencia
especifica.

DNA Ligasas:
Une fragmentos de DNA produciendo DNA
recombinates.

Enzima de
restriccin

Mecanismo para
cortar y unir DNA

Enzima de restriccin: EcoRI

Secuencia de reconocimiento
palindrome

5`

GAAT T C

3`

5`

AAT T C

3`

C T TAAG

5`

3`

C T TAA

Corte

DNA Ligasas
5`
3`

OH
T T A A

Unin por
complementaridad
P de pares de bases

+
5`
A
3`
B 5`

3`

C 5`

3`

OH
C G

5`
3`

A A T T
P

T T A A

3`
P

5`

OH

DNA
ligasas

OH
T A C G

5`

Extremos
cohesivos

OH

OH
T T A A

3`

5`

A A T T

3`

3`

T T A A

5`

Fragmentos
B y C no
apareados

Clonacin
Generar copias idnticas de un organismo,
clulas o secuencias de cidos nucleicos de un
organismo
La oveja Dolly

Genes clonados
Tecnologa desarrollada para clonar genes

Involucra la intervencin humana.

Origina una nueva generacin

Elementos necesarios para una clonacin

de secuencias
Vector
segmento de DNA con propiedad de replicarse y ser
funcional dentro de un organismo. Posee un
segmento de seleccin (antibitico) y otro de insercin
de un DNA forneo
Plasmidos, bacteriofagos,adenovirus, baculovirus,
El hospedero celular

Vector
Plasmido

organismo que sirve para albergar al vector y su

inserto.
E.coli, levadura, celulas humanas, celulas insecto
Secuencia a insertar INSERTO
segmento de DNA de inters que queremos reproducir
y/o expresar. Ejm. un segmento de genoma, gen,
cDNA, etc.

Fragmento de
DNA para ser
clonado

ORI

Las clulas que

no tienen el
plasmido
mueren en
placas con
ampicilina

Amp R.

ORI

Amp R.

Vector
Plasmido

Fragmento
DNA a ser
clonado

El vector es
cortado y
ligado al
inserto

Plasmido Transformacin de E.coli

Recombinante (CaCl2, electroporacin)
Cultivadas en placas
Cromosoma
conteniendo ampicilina
Bacteriano

Las clulas
transformadas
son las que
sobreviven

El plasmido
tiene una
replicacin
independiente

Multiplicacin
celular

Plasmidos

Permite insertos menores de 10 kb

Existen una gran variedad de plasmidos y son la base del desarrollo de los otros
sistemas de clonacin

Bacteriofagos

Permite insertos de 20 30 kb
Lambda es el bacteriofago comnmente empleado
Presenta mayor eficiencia en transformar clulas en comparacin a los plasmidos

Cosmidos

Permite la insercin de 40 Kb
Los cosmidos combinan los elementos esenciales de un plasmido y un bacteriofago

Bacterial Artificial Chromosomes(BACs)

BACs permiten la insercin de 300 kbs.

El factor F de E.coli es capaz de mantener fragmentos largos de DNA.

Yeast Artificial Chromosomes(YACs)

YACs permiten la insercin de 300-500 kbs.

YACs : un centromero de levadura con dos telomeros de levadura. Un origen de
replicacion bacteriano marcadores de seleccion.
YAC plasmidoCromosoma de levadura

Multiple cloning site (Polylinker)

Blue/White Seleccin

Bibliotecas de DNA:
Colleccin de secuencias diferentes de DNA de
un organismo cada cual ha sido clonada en un
vector para su purificacin, almacenamiento y
Bibliotecas genomicas
analisis
Bibliotecas de DNA

(Hechas a partir de DNA

Genomico total o de cromosomas )
Usos secuenciamiento
anlisis de secuencias

Bibliotecas de expresin o de cDNA

(Hechas de cDNA- copia de mRNA)
Usos anlisis de protenas
Expresin de genes, los vectores para esta finalidad
tienen que tener un promotor fuerte de expresion

Complejidad del genoma y banco genmico

Genoma completo (23 pares de
cromosomas) alrededor de mil libros3,200 millones de letras, 1 milln de
pginas.
1 cromosoma promedio, equivalente
a 30 libros grandes (30,000 pginas,
100 milllones de letras, 700 genes).
Demasiado grande

1 pgina 3000 letras

1 libro grande mil
pginas
3 millones letras

Necesidad de DNA recombinante:

Banco genmico: Genoma compilado
en coleccin de 30,000 separatas de
30-50 pginas. Cada uno con espacio
para uno o pocos genes. Permite
anlisis detallado de cualquier lugar
del genoma. Facilita identificacin de
genes y marcadores.

Clonacin de cromosoma en diferentes clones

a diferentes escalas segn su tamao

33,000 clones BAC por

juego haploide (entre 57X veces el tamao
completo de DNA)
para cubrir 95-98%
genoma

BAC plsmido secuencia

Separatas

pginas

prrafos

Digestin Parcial

Digestion Incompleta
Baja concentracin de la enzima
EcoR I

EcoR I

EcoR I

EcoR I

EcoR I

EcoR I

Digestin Completa
Alta concentracin de la enzima

EcoR I

EcoR I Digestion Parcial

Celulas infectadas

Biblioteca Genomica

Miles de clones
BACs en placas
Petri

Trasladadas a placas de
microarreglos (microarrays)
4 arreglos de 384 (16X24) BACs

Bibliotecas de expresin
Aislacin de mRNA
Porque expresar?
Cuando el producto de la secuencia clonada es
una protena.
La identificacin de un gen en una libreria o
biblioteca requiere de su expresin.
Para sobreproducir una protena y purificarla.
Para estudios in vivo de la protena.

La mayora de mRNAs eucariotes son

poliadenilados en el 3

5 cap

AAAAAAAAAAn

Oligo (dT) pueden enlazarse a poli(A) y

pueden usarse para recuperar mRNA.

Sintesis de cDNA :

Sintesis de la primera hebra:

transcriptasa reversa
Screening por Expresin
Identificacin del producto proteico
del gen de interes

1. Actividad de la protena
2. Western blotting empleando un
anticuerpo especifico

Screening o buscado una

clona recombinante en
una biblioteca de cDNA
con un anticuerpo como
sonda

Algunas protenas recombinantes en

salud humana

Insulina
Interfern Alfa
Interleukinas
Factores VIII, IX de coagulacin
Activador tisular del plasmingeno
Hormona del crecimiento HGH
Vacunas (anticuerpos y antgenos)

Diabetis
Cancer
Cancer

Dwarfism Estatura corta

Herpes,
Hepatitis B vacuna
Malaria
AIDS

Animales transgnicos
Animales que portan genes o secuencias de
DNAexgeno, introducidos por intervencin
humana (Ejm. ratones con insulina humana).
Procedimiento: microinyeccin de ovocitos (lento
e ineficaz para incorporar el DNA)
Son utilizados para generar Modelos animales:
comportamiento de un gen in vivo
Son utilizados como animales bioreactores:
Como produccin de leche con proteinas
adicionales.
Posibilidad de uso en xenotransplantes
Mas difcil que procariotes pero expresin mas
correcta: splicing, glicosilacin, pptido seal,
etc.

Mtodos de transferencia de genes

Microinyeccion directa
Mediada por virus
Embrionica stem cells
Transferencia Nuclear
Sperm-mediated gene transfer
Transferencia de genes mediante
cromosomas artificiales

Transgenesis in Mice
Microinjection

Transgenesis in Mice
Retroviral Vector

 Embrionicas stem cells

Derivada del embrion en estado de blastocito
Dividida in vitro indefinidamente sin diferenciacion
Pueden ser transfectados con transgenes o con
remosion de genes (knockout)

 Transferencia nuclear
Dolly 1997
Las clulas somticas pueden ser
transfectadas o geneticamente alteradas
antes de la transferencia nuclear

Biorreactores de protenas humanas

(No en bacterias porque no
realizan modificaciones
postranscripcionales ni
postraduccionales)

Cabra transgnica con TPA humano

(tissue plasminogen activator) en leche

Transgnico con lactoferrina humana

Biofortificacin
GOLDEN RICE
Arroz fuente de alimento para mayor
parte de pases pobres de Asia y
frica
Falta Vitam. A: Ceguera y
problemas corneales hasta 40%
poblacin
Vitamina A se encuentra en cscara
y partes verdes ; pero no en grano
Golden rice: arroz transgnico con
Vit A en granos, meta dosis diaria
de Vit A en un plato: conseguida
(150ug/100g arroz)
Profesores Peter Beyer (U. Freiburg,
Alemania) e Ingo Portrykus (Inst Tec.
Fed Suiza), con compaa Syngenta
(patentado), donacin a pases en
desarrollo.

Genoma Humano
46 cromosomas: 22 pares autosomas + XX/XY
3.2 X 109 pares de bases (bp) haploide
Menos de 25,000 genes traducidos a protenas (vs 120,000 a 70,000
inicial). Drosophila 14,000, C. elegans 18,000
Humanos: ms de 300,000 protenas. Genes segmentados => Splicing
alternativo: 1 gen varias protenas segn el tejido
Catlogo de genes humanos y sus secuencias para genes candidatos a
enfermedades.
Inmensas cantidades de secuencias repetidas (40% del total), muchas
polimrficas. Ejm. Alu (cicatriz de transposones), microsatlites.
Desarrollo de databases genmicas y de expresin en otras especies,
acceso libre Internet.
Logros
Genmica => transcriptoma, protema, metaboloma.
Evolucion entre organismos
Modelos: bacterias, levaduras, Arabidopsis, drosophila, ratn.
Correlacin de SNPs con los estados de salud y enfermedad
Susceptibilidad y prediccin de enfermedades

Genoma Mitocondrial
Mitocondrial:
1 cromosoma circular X 100s
16, 569 bp
37 genes: 13 prot, tRNAs
Enfermedades raras neurodegenerativas,
musculares y pticas
Enfermedades degenerativas comunes:
diabetes, Alzheimer, cncer

Variabilidad del Genoma

Humano
Identidad 99.9% => 0.1% variabilidad (3 millones de bases)
Variabilidad en casi todos los genes y regiones -5 millones de mutaciones
puntuales polimrficas (SNPs) hasta ahora.
Miles de marcadores genticos en todas las regiones cromosmicas (facilita
estudio de mapeo de genes y diagnstico en familias y en poblaciones)
Algunos genes inactivos o ausentes en individuos normales: CCR5
Otros genes duplicados: CYP2D6 (40% de frmacos)
Inters por poblaciones no estudiadas previamente (ejm. Sudamericanas)

Aplicacin Prctica
Identificacin de genes causales de enfermedades
3, 500 - 5, 000 enfermedades hereditarias, estados
previos asintomticos, intermedios, alternativos
Conocimiento de procesos normales y enfermedades.
Reconsideracin conceptual de enfermedades raras,
comunes, propensiones
Tests de diagnstico (comparacin de genes normales
vs afectados)
Anlisis del material gentico para factores de riesgo
Prevencin (multifactoriales)
Conocimiento de protenas
Protenas recombinantes
Farmacoterapia molecular
Farmacogentica
Terapia gnica

Diagnstico Molecular
Caracterizacin de mutaciones causales en
genes o marcadores asociados a
enfermedades.
Diagnstico en pacientes, prenatal
(microvillosidades corinicas 8-11 sem,
amniocentesis 12-18 sem), presintomtico,
preimplantacional.
Sirve para determinar la enfermedad:
pronstico, prevencin, tratamiento, terapia,
consejo gentico en posibles portadores, etc.

 TECNOLOGIAS DE DIAGNOSTICO
Tecnologas de diagnostico basadas en
cidos nucleicos (NAT)
Tecnologas de diagnostico NO basadas
en NAT

 Tecnologas de diagnostico
basadas en cidos nucleicos
(NAT)
PCR: Mtodos basados en amplificacin
FISH : Mtodos basados en hibridacin

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Tcnica desarrollada por el Premio Nobel Kary Mullis
Basada en el descubrimiento de la actividad biolgica a altas
temperaturas de las DNA polimerasas encontradas en
bacterias termfilas.

Kary Mullis 1983

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullisautobio.html
Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain
reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.

PCR - Aplicaciones
La tcnica de PCR es una herramienta esencial dentro de la
biologa molecular:

clonacin
secuenciacin
diagnstico
Mutagnesis sitio-dirigida
Anlisis de mutaciones
Cuantificacin de diferencias en expresin gnica (RTPCR)
Pruebas de paternidad
Anlisis forense
Control de calidad a nivel industrial

 PCR: Mtodos basados en

amplificacin
Pruebas de amplio rango genes altamente
conservados y polimrficos: Genes
Ribosomales
Pruebas mltiples que permiten la
deteccin paralela de especies

 De PCR clsico a PCR en tiempo real

basado en la deteccin de fluorescencia.
Mayor robustez del sistema, menos
laboriosa, menos contaminacin.
Cuantificacin relativa y absoluta
PCR en tiempo real son mas costosas y
los sistemas todava no alcanzan su
desarrollado para su masificacin.
Presencia de inhibidores en la muestra

Real-Time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp.

Kathy A. Mangold,1,2 Rebecca U. Manson,2 Evelyn S. C. Koay,3,4 Lindsey
Stephens,1
MaryAnn Regner,1 Richard B. Thomson, Jr.,1,2 Lance R. Peterson,1,2
and Karen L. Kaul1,2*
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2005, p. 24352440 Vol. 43, No. 5

Xpert MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular
diagnostic
for
tuberculosis and rifampicin resistance. Stephen D Lawn and Mark P Nicol

Mtodos basados en
hibridacin
PNA FISH
Evolucin de una sonda de nucletidos a una
sonda de acido nucleico peptdico PNA es un
oligomero sinttico que imita la estructura del DNA
o el RNA, la carga negativa del esqueleto azcar
fosfato es remplazada por una molcula sin carga
N-(2 aminoetil) glicina al cual se une la base
nitrogenada por un enlace metilen carbonil
Son menos susceptibles de inhibicin por
impurezas en diferentes muestras clnicas a
comparacin de los mtodos basados en
amplificacin

 Tecnologas de diagnostico NO
basadas en NAT
Uso de anticuerpos
Uso de bacteriofagos (MicroPhage)
Herramientas de proteomica:
matrix-assisted laser desorptionionization
time-offlight mass spectrometry (MALDITOF MS)

SECUENCIAMIENTO DE ADN
Determinar el ordenamiento de los nucletidos
en un fragmento de ADN

Dos Mtodos desarrollados a fines de los

70s:
Mtodo Qumico Maxam y Gilbert
Mtodo Enzimtico Sanger de anlisis post
reaccin
Ambos basados en la obtencin de molculas con
terminaciones en A, G, C y T; para separar estos
fragmentos en geles de poliacrilamida denaturantes.

Radioactividad
reemplazado
a
partir de
1987
Dideoxinucleotidos
marcados
fluorescentemente

Diciembre 2000
Un consorcio internacional completa el secuenciamiento del genoma de la
primera planta Arabidopsis thaliana de125 Mb.
Febrero 2001
El consorcio HGP publica su borrador en Nature (15 Febrero), y Celera lo
publica en Science (16 Febrero)

Nuevos mtodos de secuenciamiento

Pirosecuenciamiento

Secuenciamiento Masivo permite

obtener genomas en menor tiempo
Load beads into
PicoTiterPlate

Load Enzyme
Beads

Centrifuge Step

44 m

MICROARRAYS