Revista de anlisis farmacutico y biomdico:

El aislamiento dirigido por la actividad, la identificacin y el requisito de compuestos

isomericos biolgicamente activo componen de la gente la planta medicinal Desmodium
adscendens usando la cromatografa lquida de alto rendimiento con detector de la serie del
diodo, espectrometra de masas y espectroscopia de la resonancia magntica nuclear
multidimensional.
RESUMEN
La actividad de antioxidante del extracto ordinario (etanol del 60%) de las hojas de
Desmodium adscendens (Sw). DC. (Fabaceae) fue observado en DPPH, xantina/xantina
oxidasa, peroxidacin lipdica y pruebas del estallido de neu-trophils. Otra actividad en
Fraccionamiento adelante dirigido por la actividad en la columna C18 (agua, metanol del
20%, 50%methanol y metanol del 100%) caus la separacin de la fraccin (metanol del
50%) con la capacidad de antioxidante ms alta. El anlisis del HPLC-DAD de la fraccin
biolgicamente activa revel la presencia de twopairs de isomeros de flavonoides como los
componentes dominantes. Aquellos compuestos fueron aislados y columna lquida
multipaso purifiedby chromatography (Sephadex LH20). Sus estructuras fueron elucidadas
por varias tcnicas espectroscpicas, incluidas NMR, UV y MS. Basado en 1D y 2dos
espectros NMR como tambin fragmentacin del in, los flavonoides fueron identificados
como: isovitexin 2-O-xyloside (1), vitexina 2-O-xyloside (2), vitexina (3) e isovitexina (4).
La tcnica del HSQC-DEPARTAMENTO hbrida proporcion determinacin muy
rpidamente las posiciones de glicosilacion en la aglicona y el tipo de enlace glucosdico en
los flavonoides ismeros. Este estudio proporciona la informacin nueva acerca de la
identidad de los compuestos principales presentes en ofD. adscendens de hojas cultivado en
Ghana, que ensancha el conocimiento sobre el antiinflamatorio, antiallergicand las
propiedades de antioxidante de sus extractos.
1). INTRODUCCIN
Desmodium adscendens (SW.) DC. (Fabaceae) es una planta perenne que ocurre
comnmente en las reas tropicales de frica, Amrica del sur, Australia y Oceana. Se ha
utilizado durante muchos aos debido a sus propiedades farmacolgicas y se ha valorado en
las prcticas de medicina popular [1]. D. adscendens se acredita con muchas propiedades
beneficiosas, pero su uso difiere segn la regin donde se culti-Nectar [2]. En Camern, el
jugo de las hojas jvenes, aplicado por va tpica, sirve como un antdoto para el veneno de
la serpiente [3]. Tiene un uso similar en Nicaragua, pero en este caso las infusiones y
decocciones se administran por va oral [4]. En la regin de la selva, las preparaciones de
D. adscendens se usa para tratar trastornos del sistema digestivo o abdominal y dolor de
espalda [5]. En la medicina tradicional ghans se utiliza comnmente para aliviar
condiciones asociadas con la contraccin excesiva del msculo liso, especialmente el asma.
Sin embargo, en el Congo, D. adscendens se valora principalmente por sus propiedades
analgsica, Antipirtica y anticonvulsivo.

Debido a la gran variedad de actividades farmacolgicas, D. adscedens ha sido objeto de

numerosos estudios in vitro y experimentos con animales, verificar la validez de su uso,
especialmente en el tratamiento de: (i) las enfermedades causadas por el estrs oxidativo [79], (ii) Estados de aumento de la actividad del SNC (epilepsia, dolor) [10], (iii) hgada
disfuncin causada por envenenamiento [11] y (iv) trastornos asociados con la contraccin
del msculo liso (asma) [12, 17]. Como se mencion anteriormente, una de las bien
documentadas propiedades de D. adscendens, que sin duda contribuye a su efecto
farmacolgico, es la actividad antioxidante. En una investigacin reciente Muanda et al [9]
evaluaron las propiedades de depuracin radical del agua y los extractos de metanol/agua
(50/50; v/v) de D. adscendens en Nigeria. Los resultados confirmaron que la planta
discutida es una fuente importante de antioxidantes naturales.
Publicaciones sobre D. adscendens se centran principalmente en la actividad
farmacolgica de sus diversas preparaciones (p. ej., decocciones, infusiones, extractos y
tinturas). Relativamente poco se sabe sobre los compuestos qumicos responsables de su
actividad biolgica. Basado en cromatografa en capa fina (TLC), se ha encontrado que los
principales metabolitos secundarios en D. adscendens incluyen triterpenos saponinas,
flavonoides y alcaloides, aminas. Saponinas se encuentran principalmente en hojas y
flavonoides flores, alcaloides, en hojas y tallos [18]. La composicin cualitativa de D.
adscendens depende del lugar de su cultivo. Pothier et al [18] aportando con la presencia de
rutina en muestras procedentes de Ghana y Nigeria. Alta resolucin espectrometra de
masas (HRMS), una tcnica usada por Baiocchi et al [19] para el estudio cualitativo de la
composicin D. adscendens, era un sistema muy til en la deteccin de alcaloides y
saponinas, pero era de modesta utilidad en la identificacin de flavonoides. Los autores
concluyen que la nica manera para la aclaracin de la estructura inequvoca de un nmero
de ismeros de flavonoides es espectroscopia de la resonancia magntica nuclear (RMN),
precedida por el aislamiento de compuestos puros. Hay algunos informes sobre mtodos
para la separacin de la extraccin y de las sustancias activas de D. adscendens, sin
embargo estn limitados slo a ciertos soyasaponins.
En nuestra opinin, los estudios sobre los componentes qumicos presentes en
adscendens D. han sido an incompletos. Hay un vaco de informacin sobre la
composicin del material vegetal de pases africanos y sudamericanos. As, el objetivo de
este trabajo fue aislar e identificar los principales componentes del extracto de D.
adscendens cultivado en Ghana. Durante el aislamiento de actividad guiada, el efecto
antioxidante del extracto de D. adscendens, as como sus fracciones subsecuentes, se evalu
utilizando cuatro ensayos, a saber: radical (i) 2, 2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH), (ii)
xantina/xantina oxidasa, peroxidacin lipdica (iii) y (iv) neutrfilos explosin pruebas. Las
estructuras de componentes aislados fueron acladas sobre la base de Espectroscopia
ultravioleta (UV), tratar de spectrome masa (MS) y multidimensional de resonancia
magntica espectroscopia (NMR) datos. Un alto rendimiento validado junto mtodo de
cromatografa lquida (HPLC) con deteccin de arreglo de diodos (DAD) se estableci para
el anlisis cuantitativo de los cuatro flavonoides bioactivos. La coherencia cuntica hbrido
en heteronuclear (HSQC) menor distorsin de realce por tcnica de NMR de transferencia
(Departamento) de polarizacin fue utilizada para la determinacin rpida de las posiciones
de glicosilacin en aglicona y el tipo de enlace glucosdico en los ismeros de flavonoides.

2). MATERIALES Y MTODOS

2.1) Materiales de las plantas.
Se obtuvieron las hojas de D. adscendens, recogido (marzo de 2009) en la regin de
Brong-Ahafo en Ghana del sur, de Vctor (Lieja, Blgica). Todos los materiales de planta se
secaron a temperatura ambiente, molida, cernida en un tamiz (1 mm) y almacenado en 4C.
2.2) Reactivos analticos.
Metanol y acetonitrilo grado cromatogrfico fueron adquiridos de Merck (Darmstadt,
Alemania). Agua se purific con el sistema de simplicidad de Millipore (Millipore Corp.,
Bedford, MA, USA). Todos los otros productos qumicos utilizados para los
procedimientos experimentales fueron de grado analtico. Metanol, etanol, cloruro de
aluminio, ftalato de anilina, cloruro de cobre (II), carbonato de potasio, nitrito de sodio,
cido frmico, acetato de etilo y cido trifluoroactico fueron comprados de POCH
(Gliwice, Polonia). Disolventes deuterados (DMSO-d6, MeOD) para el anlisis de NMR se
adquirieron en Glazer (Basilea, Suiza). Luminol, f-MLP (formil-met-leu-fenilalanina),
radical 1, 1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH), cido ascrbico, xantina oxidasa, xantina,
solucin salina equilibrada de Hanks (HSSB) se adquirieron en Sigma-Aldrich Chemie
GmbH (Munich, Alemania). Hierro (II) sulfato, cido linoleico, nitrobluetetrazolium
(NBT), cido tiobarbituric, tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) se adquirieron en
Sigma-Aldrich de Fluka Chemie GmbH (Munich, Alemania). cido glico fue adquirido a
ChromaDex (Santa Ana, Estados Unidos). Normas para HPLC-DAD medidas cualitativas
as como anlisis de TLC (apigenina, luteolina, keampferol, quercetina, vitexina, isovitexin,
vitexina 2-O-rhamnoside, 7-O-glucsido de apigenina, apigenina 7-O-diglucoside y
apigenina 7-O-rhamnoglucoside, l-xilosa, d-xilosa, d-arabinosa, l-arabinosa, d-glucosa, dramnosa, d-galactosa) se adquirieron en Sigma-Aldrich de Fluka Chemie GmbH (Munich,
Alemania).
2.3) Extraccin, fraccionamiento y aislamiento de los componentes qumicos de D.
adscendens.
Las hojas secas y en polvo de D. adscendens (200 g) fueron extradas con una solucin
de etanol: agua (v/v) de 60% (700 mL 3, durante 5 h, 90C). Despus de la filtracin, se
obtuvo el extracto etanlico seco (EE, 20 g) eliminando el solvente con evaporador
rotatorio. El extracto fue disuelto con 500 mL de agua caliente y mantener en nevera
durante 24 h para quitar la clorofila. El agua fue filtrada la fraccin soluble y lyophilizated
a 10,2 g de residuo. Despus de la disolucin, la fraccin acuosa sucesivamente fue
repartida en RP-18 (40 m, Merck; Darmstadt, Alemania) columna preparativa ( 50 mm
50 m m) con 250 mL de soluciones de metanol, produccin (despus de la liofilizacin): F1
(0% MeOH) 1.0 g, F2 (20% MeOH) 1,8 g, F3 (50% MeOH) 1,5 g y F4 (100%
MeOH) fracciones solubles 1.2 g. Repite la cromatografa en columna ( 30 mm 500 m
m) en Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) de la fraccin F3
(50% MeOH) con 100%, 50% y 20% MeOH permiti el aislamiento de cuatro compuestos:
1 (135 mg), 2 (102 mg), 3 (27 mg) y 4 (14 mg). Proceso de aislamiento fue supervisado por
la cromatografa en capa fina y la pureza de los compuestos > 95%) fue probado por el

anlisis HPLC. Todo aislado compuestos (1, 2, 3 y 4) fueron identificados luego por H, C y
2D NMR, anlisis de HPLC-DAD. Los compuestos aislados fueron almacenados en 4C.
2.4) Medicin de la actividad antioxidante
2.4.1) Ensayo fotomtrico DPPH*
Actividad secuestradora de radicales libres del extracto y fracciones se midi utilizando
el mtodo de Choi et al [21] con modificaciones. La mezcla contenida: 0,5 mL de etanolagua (1:1) solucin de extracto o fraccin y 0.5 mL solucin etanlico de 0,2 mM de
radicales DPPH. La mezcla se agit e izquierda reposar 30 min en un lugar oscuro,
despus de aquel momento la absorbancia se midi a 518 nm.
Control (sin extracto o fraccin) y en blanco (sin solucin de DPPH radical) las
soluciones de la reserva tambin estuvieron preparadas.
2.4.2) Generacin de anin superxido por el anlisis de sistema xantina/xantina
oxidasa
Actividad secuestradora de radicales libres de extractos y fracciones se midi utilizando
el mtodo de Choi et al [21] con modificaciones. La mezcla contenida: 0.25 mL de solucin
de extracto o fraccin de agua y 0,5 mL de solucin contenida 0,4 mM solucin de xantina
y solucin NBT de 0,24 mM en tampn de fosfato de 0,1 M (pH 8). La reaccin fue
iniciada por la adicin de solucin de la oxidasa de xantina (0.014 U mL1) en el tampn
de fosfato de 0,1 M (pH 8). Las mezclas se incubaron en bao de agua a 37C por 30 min.
Despus de que el tiempo 0, 1 mL de 6 mM CuCl2 se aadi solucin para detener la
reaccin y se midi la absorbancia a 560 nm. Control (con extracto o fraccin) y en blanco
(con solucin de xantina oxidasa) tambin se prepararon soluciones madre.
2.4.3) Ensayo de inhibicin de peroxidacin de cido linoleico
Inhibicin de la peroxidacin del cido linoleico por extractos y fracciones se midi
utilizando el mtodo de Choi et al [21] con modificaciones. La mezcla contenida: 0,3 mL
de solucin de extracto o fraccin, solucin de cido linoleico 0.5 mL 20 mM, 0,5 mL 100
mM TRIS-HCl (pH 7,5) tampn, 0,1 mL de solucin de FeSO4 de 4 mM y 0,1 mL 2 mM
cido ascrbico solucin. Las muestras se incubaron durante 30 min a 37C en bao de
agua. Despus de que el tiempo la reaccin fue parada por la adicin de 0,1 mL de solucin
de cido tricloroactico (C = 0,88 g/mL). 1 mL de la mezcla fue tomado y aadido a 0,250
mL de solucin cido tiobarbitrico de 50 mM en 50 mM NaOH. Las muestras fueron
calentadas durante 10 minutos, se centrifug por 10 min y se midi la absorbancia en el
sobrenadante a 532 nm. Se prepararon soluciones stock control (sin extracto o fraccin) y
en blanco (sin la solucin de cido tiobarbitrico).
2.4.4) Evaluacin de la produccin de ROS por f-MLP estimula neutrfilos
Aislamiento de los neutrfilos humanos. Sangre venosa perifrica fue tomada de
donante humano sano (20 35 aos) en el centro de donacin de sangre de Varsovia. Los

donantes no fumar ni tomar medicamentos. Fueron confirmados clnicamente saludables y

una prueba de laboratorio de rutina se mostraron valores dentro de rango normal. El estudio
se conform con los principios de la declaracin de Helsinki. Neutrfilos se aislaron con un
mtodo estndar de sedimentacin dextrano antes hipotnica lisis de eritrocitos y
centrifugacin en un gradiente de Ficoll Hypaque [22]. La pureza de la preparacin de
neutrfilos fue > 97% y viabilidad por exclusin tryptan azul fue > 98%. Neutrfilos se
resuspendi en una HSSB gratis (Ca2) y se mantuvieron en 4C antes del uso.
Generacin de oxidantes por f-MLP estimula neutrfilos se midi usando
quimioluminiscencia dependiente de luminol. Suspensin de clulas (3,5 105) se incub
con 50 L de la fraccin de extracto y luminol (100 M) o lucigenina (200 M) en placa de
96 pozos. La produccin de ROS fue iniciada por la adicin de f-MLP (0,1 g/mL) para
obtener un 200 L/bien. Cambios en quimioluminiscencia a 37C se midieron
inmediatamente por 45 min a intervalos de 2 min en lector de microplacas (Biotek, Bad
Friedrichshall, Alemania). Tambin se determin la quimioluminescencia de fondo
producida por las clulas no estimuladas.
2.5) Anlisis cualitativo y cuantitativo de HPLC-DAD
2.5.1) Sistema HPLC-DAD
Se realiz anlisis de HPLC de fase inversa en un Dionex (Sunnyvale, Estados Unidos)
sistema consisti en la bomba de gradiente 7580, detector de UVD 340S y JetStream II plus
termostato de columna (Electrnica Industrial WO) fue controlado por el software
Chromeleon. En orden de separacin cromatogrfica que logramos en una analtica C18
Luna reversa columna de fase (Phenomenex, 4.6 250 mm, 5 m) con C-18 precolumn
(Phenomenex, 3 4 m m, 5 m). Inyeccin de la muestra se realiz a travs de la vlvula
del inyector Rheodyne con un bucle de muestra de 20 L.
2.5.2) Condiciones cromatogrficas de HPLC-DAD
La Resolucin cromatogrfica adecuada se logr en el mvil fase que consiste en agua
0,1% TFA (v/v) (solvente A) y acetonitrilo, 0.1% TFA (v/v) (solvente B). El sistema de
gradiente de 15% isocrtica disolvente B (0-10 min), 15 20% disolvente B (10 20 min),
20% isocrtica disolvente B (20-25 min), 20-90% solvente B (25-45 min), 90% isocrtica
disolvente B (45 a 55 minutos), 90 15% disolvente B (55-65 min) con un caudal de 0,75
mL/min temperatura de la columna se ha fijado en 30C. Despus de la filtracin a travs
de filtro de membrana Millipore (Millex LCR PTFE hydrophill 0,45 m) 20 L de muestra se
inyect. La longitud de onda de deteccin UV fue monitoreado a 214 nm, 224 nm, 270 nm
y 336 nm.
2.5.3) Preparacin de soluciones estndar y muestra para el anlisis de HPLC-DAD
3 mg del crudo etanlico 60% extracto (despus de la liofilizacin) as como de
fracciones particulares (0% MeOH, 20% MeOH, 50% MeOH y 100% MeOH; despus de
la liofilizacin) se disolvi en metanol (2 mL) y filtrada a travs de filtro de membrana
Millipore antes de la inyeccin directa al sistema de HPLC.

Las soluciones individuales se prepararon disolviendo 2.0 mg de cada compuesto puro

con precisin ponderada (1, 2, 3, 4) en 10 mL de solucin de metanol 50% (v/v). Las
cantidades apropiadas de las soluciones madre se diluyeron en 100% metanol para obtener
las soluciones estndar que contienen 50 g/mL, 25 g/mL, 12,5 g/mL, 6,25 g/mL, 3,125
g/mL y 1 g/mL de cada uno de ellos.
2.6) Identificacin por resonancia magntica nuclear (RMN) y mtodos MS
Los espectros NMR de DMSO-d6 y soluciones MeOD, conteniendo 10 mg (1 y 2) y 5
mg (3 y 4) de cada compuesto se midieron en un Varian VNMRS 300 Oxford
espectrmetro (Agilent Technologies, Santa Clara, Estados Unidos) operando a 299.61 (1H)
y 75.13 (13C) MHz, equipado con el cabezal de sonda directa AutoSw PFG 4 Nuc 5 mm.
Desplazamientos qumicos fueron cotizados en relacin con TMS interna. Se registraron los
espectros de 1H con 512 exploraciones, retraso de relajacin s 2, sacquisition 2 tiempo,
0,252 Hz digital resolucin FID (decaimiento libre de la induccin), 32 k tiempo con
dominio 8250 Hz anchura espectral. La C 13 espectros fueron registrados con un vals de
desacoplamiento de banda ancha 161H, 10 k exploraciones, retraso de relajacin de 5 s, 1 s
tiempo de adquisicin, 0,755 Hz digital resolucin FID, dominio de tiempo de 32 k y Hz
24.752 ancho espectral. Todos los experimentos 2D fueron funcionados usando los
programas de la biblioteca de software de Varian. Spectrawere The1H-1H COSY
(Espectroscopia de la correlacin) grabado en anchura espectral de 5 kHz en f2 y f1; 2 k
512 los puntos de datos fueron adquiridos con 8 exploraciones por incremento y los retrasos
de relajacin 1 s. de procesamiento de datos fue realizada en una matriz de datos 2, k x 1 k.
Heteronuclear 2D espectros correlacionados se midieron ms de 2k puntos complejos en f2
y 512 incrementos en la f1, que recoge 32 exploraciones por incremento con un retardo de
la relajacin de 1.5 s. Las anchuras espectrales fueron de 5 y 25 kHz en dimensiones f2 y
f1, respectivamente. Los experimentos DEPT HSQC fueron optimizados para
acoplamientos de H de C de 145 Hz; los experimentos HMBC (coherencia de enlace
mltiple Heteronuclear) fueron optimizados para largo alcance acoplamientos de H de C de
10 Hz. Se registraron los espectros NOESY (Nuclear Overhauser espectroscopia de efecto)
en el ancho espectral de 5 kHz en f2 y f1; 1 k 512 los puntos de datos se adquirieron con
16 exploraciones por incremento y los retrasos de la relajacin de 1,5 s; el tiempo de la
adquisicin fue 0.213 s y el tiempo de mezclado Sra. 500 procesamiento de datos fue
realizada en 2 k x 2 k datos matriz.
Espectros de masas fueron realizados en el espectrmetro de masas de trampa de iones
MS AmaZon SL con una interfaz de origen (ESI) de ion electrospray (Bruker Daltonik
GmbH, Alemania). Todos los compuestos fueron analizados en el modo de iones negativos.
La presin del nebulizador se establece en 40 psi y el flujo de gas seco fue de 9 L/min. La
temperatura de secado fue 300C y la tensin capilar 4,5 kV. Todos los anlisis se llevaron a
cabo con una exploracin de 200 a 2200 m/z.
2.7) Hidrlisis cida y el anlisis de los azcares terminales
La solucin acuosa de HCl (1 M, 1 mL) fue aadida a 1 mg de purificado compuesto 1 y
2. Las probetas fueron colocadas en el bao de agua hirviendo durante 1 hora. Despus de

ser refrescado, las soluciones se diluyeron en H2O (10 mL) y extrado repetidamente con
EtOAc (5 mL). Luego, las capas acuosas se concentraron con MeOH con un rotavapor y
sometieron a anlisis de TLC. Deteccin de azcares se realiz utilizando reactivo ftalato
de anilina-hidrgeno.
3). RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1) Medicin de la actividad antioxidante y la actividad de fraccionamiento del
extracto etanlico de D. adscendens
Como un potente neutralizador de especies reactivas del oxgeno (ROS), D. adscendens
puede servir como una posible intervencin preventiva para enfermedades mediadas por
radicales libres (asma, artritis reumatoide, skinaging, etc.) [23,24]. por lo tanto, las
propiedades antioxidantes del extracto etanlico 60% (EA) de D. adscendens fueron
evaluadas para su radical libre accin de rebuscar por interaccin con radicales 1, 1-difenil2-picrylhydrazyl (DPPH). Actividad antioxidante del extracto examinado tambin fue
probada mediante la inhibicin de la actividad de xantina/xantina oxidasa y la inhibicin de
las pruebas de la peroxidacin de cido linoleico. Se realizaron mediciones adicionales de
la produccin de especies reactivas de oxgeno por quimioluminiscencia dependiente de
luminol en neutrfilos humanos activados. Efectos inhibitorios del extracto etanlico 60%
(EE) y fracciones (F1 0% MeOH; F2 20% MeOH; F3 50% MeOH; F4 100%
MeOH) se evaluaron en comparacin con el cido glico (GA) en concentracin de 50
g/mL. Los datos se expresaron como media SD; n = 3, analizadas por triplicado. La
reduccin de la quimioluminescencia por fracciones de extracto probados fue demostrada
en la luminiscencia mxima de clulas estimuladas. Se realizaron experimentos utilizando
clulas de donantes distintos; = 0.05 vs. No clulas estimuladas, *p = < 0.05 vs. Clulas
estimuladas.
El EE de D. adscendens (5 100 g/mL) mostr significativa, pero ms dbil que el cido
glico (33,4 2.5 86,4 5.4 vs 43.4 4.0 90,8 3.2, respectivamente), actividad
antioxidante en pruebas libre de clulas (cuadro 1). Por el contrario, la reduccin de la
produccin de especies reactivas de oxgeno por los neutrfilos estimulados (10 50 g/mL)
fue comparable con el cido glico de control positivo (Fig. 1). El anlisis de HPLC-DAD
revel que el crudo adscendens EE de D. contiene tres principales grupos de metabolitos
secundarios: flavonoides, cidos fenlicos y saponinas (Fig. 2). Con el fin de determinar
cul de ellos tiene la mayor contribucin a la actividad antioxidante biolgico, el extracto
fue fraccionado con diferentes porcentajes de metanol como se describe en la seccin 2.3.
Se encontr que 0% MeOH fraccin (F1) compuesta principalmente por azcares, 20%
MeOH fraccin (F2) compuesta principalmente por compuestos no flavonoidal (cidos
fenlicos), 50% MeOH fraccin (F3) contiene flavonoides y 100% MeOH (F4)
principalmente saponinas.
En todo anlisis libre de la clula, as como en el estallido oxidativo de neutrfilos
modelo, fraccin F2 y F3 mostr la mayor actividad (tabla 1, Fig. 1). Sin embargo la
actividad de la fraccin MeOH de 50% (F3) fue ligeramente superior (45,8 4.5 80.2
1,5 vs 32,8 2.5 78,3 1.4), especialmente en la prueba de la peroxidacin de cido

linoleico y la produccin de ROS por modelo de neutrfilos. As partiendo de los

resultados, se puede concluir que la fraccin MeOH de 50% (F3) posey la actividad
antioxidante ms potente en comparacin con otras fracciones (0% MeOH, 20% MeOH,
100% MeOH) y por lo tanto, ser objeto de otro estudio.
3.2) Aislamiento y purificacin de compuestos fenlicos principales
El anlisis realizado por el mtodo de HPLC-DAD demostr que F3 contiene al menos
cuatro principales compuestos con los espectros Ultravioleta tpicos de flavonoides (figs. 3
y 4). Para determinar las estructuras de estas sustancias, se llev a cabo su aislamiento en
columna de Sephadex LH20 usando mezclas de metanol: agua en diferentes
concentraciones como se ilustra en la figura 5. Como resultado, rindi la cromatografa de
columna lquida multi-step: flavonoide 1 (135 mg, Rt = 20.11), Flavonoide 2 (102 mg, Rt =
20,63), Flavonoide 3 (27 mg, Rt = 22.02) y flavonoides 4 (14 mg, Rt = 22.72). Se presentan
los cromatogramas de los compuestos purificados.
3.3) Identificacin de flavonoides aislados
Anlisis preliminar realizado por el mtodo de HPLC-DAD mostr que los espectros
UV de los pares de compuestos 1 y 4, 2 y 3 areidentical (Fig. 4). Debido a que la mayora
de los azcares pertenece a los cromforos dbiles, la posicin de mximos de la absorcin
depende principalmente de la parte de la aglicona. Los valores de los mximos de la banda
de la longitud de onda en la gama de 267.9 270.5 nm (correspondiente al anillo A) y en la
gama de 335.7 338.1 nm (correspondiente al anillo C) indican que las agliconas de los
compuestos analizados pertenecen a flavonas o flavonoles [25]. Para determinarlo
exactamente, los espectros Ultravioleta obtenidos fueron comparados con los derivados de
estndares comercialmente disponibles, incluyendo: apigenina, luteolina, kaempferol y
quercetina. Se encontr que los espectros UV de los compuestos 2 y 3 instalado
perfectamente en el espectro de apigenina, mientras que los derivan de los compuestos 1 y
4 son muy similares a la aglicona mencionado. Basado en estos resultados se concluy que
los flavonoides analizados comprenden la apigenina como aglicona. La mayor polaridad de
los compuestos probados en comparacin con apigenina (como fue evidenciado por su
tiempo mucho ms corto de la retencin en columna RP18) indica su estructura glicosdico.
Para determinar el nmero de azcares ligados, los tiempos de retencin de los
flavonoides aislados entonces fueron comparados con un conjunto de varios apigenina O y C-glicsidos, a saber: apigenina-7-O-glucsido de apigenina-7-O-diglucoside, apigenina7-O-rhamnoglucoside, apigenina-8-C-glucsido (vitexina), apigenina-6-C-glucsido
(isovitexin) y apigenina-8-C-rhamnoglucoside (vitexina 2-O-rhamnoside). Basado en estos
resultados, compuestos de 3 y 4 han sido identificados como vitexina y isovitexin,
respectivamente. Los datos obtenidos para los compuestos 1 y 2 no cupo en cualquiera de
los estndares disponibles. Sus espectros UV eran idnticos a isovitexin (flavonoides 4) y
vitexina (flavonoide 3), pero los tiempos de retencin eran ligeramente ms cortos (2.5
min y 1,5 min, respectivamente). Segn Puodziunene et al [26] el tiempo de retencin de
monoglucoside de apigenina (glicosilada en la posicin C-8), es ms corto que el de
apigenina sustituido, aproximadamente 15,7 min mientras que la diferencia entre los
tiempos de retencin de monoglicoside y diglicoside es slo unos minutos. El compuesto 2

fue eluida de la columna en casi el mismo tiempo como apigenina-2-O-rhamnoglucoside,

que conducen a la conclusin de que probablemente es disacrido.
Con el fin de proporcionar una identificacin inequvoca de los compuestos 1 y 2 y
confirmar las conclusiones anteriores sobre las estructuras de los flavonoides 3 y 4, the1H,
13 C y 2D NMR, as como los espectros MS en modo positivo y negativo fueron
analizados. La espectroscopia de RMN es un mtodo nico que permite para trazar el
esqueleto entero de la molcula y permite para determinar las posiciones de glicosilacin en
aglicona, el tipo de enlace glucosdico, as como el nmero y tipo de azcares ligados
[27,28]. A continuacin se presentan los NMR y MS espectrales datos completos obtenidos
de compuestos discutidos.
Como se supona previamente, la qumica y la cantidad de cambios de valores de seales
en la regin de azcar de 13C NMR y sus correlaciones con los protones apropiados en
espectros hbridos HSQC-departamento (figs. 6 y 7) as como valores de m/z (563 en el
modo de iones negativos) y fragmentacin de MS/MS, patrones indicaron que los
compuestos 1 y 2 son flavonoides isomrica excedentes compuesto por molculas de
pentosa y hexosa vinculadas a la aglicona de apigenina. Baiocchi et al [19] inform sobre
seis varios C-glicosidic derivados de apigenina con masas molares iguales a 564, sustituir
por la pentosa y hexosa en posicin 6 y 8. Sin embargo, los autores encontraron que incluso
usando HRMS azcares mtodo de distinguir los tipos exactos de sus posiciones de
sustitucin definitiva (6-pentosa y hexosa 8 o a la inversa) es imposible. Segn nuestra
investigacin, azcares en compuestos 1 y 2 no ocupan simultneamente los puestos 6 y 8,
pero estn vinculados a 6 o a 8 posiciones de tal manera que la hexosa (azcar en la
primera) se une con enlace C-glicosdico a la aglicona y una pentosa (azcar de la segunda)
se une a hexosa con enlace O-glucosdico. El hecho de que la aglicona se substituye
solamente en una posicin (6 en compuesto 1 y 8 en 2 compuestos) es demostrado por las
seales del protn H-8 ( 6.54) o H-6 ( 6.27), que no ocurriran si existe el enlace
glucosdico (Figs. S1 y S2 en materiales suplementarios). Adems, basado en los cambios
qumicos caractersticos, se identificaron los azcares como glucosa y xilosa. La identidad
de azcar terminal (es decir, xilosa) tambin fue confirmada por la hidrlisis cida del
enlace O-glucosdico seguida por anlisis del TLC como se describe en la seccin 2.6. El
producto qumico cambia de carbonos anomricos de la glucosa C-1(1 71.23 and 2
71.50) y las correlaciones de largo alcance de los correspondientes protones H-1 (1- 4.66 y
2 4.78) con respectivamente: C-6 o C-8 carbonos de apigenina (1 107.97 y 2
103.68) en espectros HMBC indicaron que la glucosa est conectada directamente a la
aglicona con enlace C-glicosdico. Mientras que los desplazamientos qumicos de los
carbonos anomricos de xilosa C-1(1 105.97 and 2 105.75) y las correlaciones de los
correspondientes protones anomrico H-1(1 4.13 and 2 3.88) con espectros de C-2
glucosa carbonin HMBC indicaron que este azcar terminal est ligada a la glucosa con
enlace O-glucosdico. La naturaleza de los enlaces glucosdicos (o) est determinada por el
valor constante de acoplamiento vecinales del doblete de protn anomrico [31]. The3J
valor de protones anomricos implicados en - enlace glucosdico estn en el rango de 7-12
Hz, mientras que en - glicosdico bond3J valor disminuye a 3-4 Hz. En el caso de glucosa y
xilosa en compuestos discutidos, eran iguales a las constantes de acoplamiento: 9,8 Hz y
7,2 Hz, respectivamente. Basado en esto se encontr que ambos azcares en compuestos 1
y 2 representan anomrico. Las correlaciones de 1H y 13C directa discutido arriba en el

espectro hbrido HSQC-Departamento as como correlaciones de largo alcance en espectros

HMBC (coherencia de enlace mltiple Heteronuclear) permitidos identificar compuestos
analizados como ismeros de Flavonoide, es decir: apigenina 6-C--d-xylopyranosyl(1 2)d-glucopyranoside = isovitexin-2-O-xyloside (1) y apigenina 8-C - d-xylopyranosyl(1 2)d-glucopyranoside = vitexina-2-O-xyloside (2)
En conclusin, sobre la base de los resultados obtenidos por mtodos cromatogrficos y
espectroscpicos, hemos sido capaces de aislar e identificar simultneamente los dos pares
de ismeros: vitexina/isovitexin y vitexin-2-O-xyloside/isovitexin-2-O-xyloside. Mientras
que los dos primeros compuestos se encuentran a menudo en varias plantas, estos dos
ltimos son raramente encontrados flavonoides. Vitexina y isovitexin fueron previamente
aislados e identificados simultneamente por ejemplo, de haba de mung [32] y hojas de
bamb Phyllostachys nigra [33], pero hay no hay informes cientficos en el aislamiento del
par de la 2-O-xilsidos de material vegetal hasta ahora. Los derivados solamente 2-Oglucosdico de vitexina y isovitexin aislado al mismo tiempo, eran sus glucsidos por
Rabelo et al [34]. Adems, nuestros estudios proporcionan datos espectrales inditos,
incluidos los valores de cambio qumica NMR isovitexin y vitexina 2-O-xilsidos, que
pueden utilizarse para identificar estos compuestos. Aislamiento de compuestos puros
permite el anlisis cuantitativo de extracto crudo (EE) y 50% MeOH fraccin (F3) de D.
adscendens, que era previamente imposible debido a la falta de estndares puros de
corriente. Adems, flavonoides puros en nuestro estudio pueden utilizarse para
investigacin en mecanismos desconocidos de la actividad biolgica de D. adscendens.
3.4) Cuantificacin de flavonoides identificados
Anlisis de contenido se realiz para determinar la concentracin de compuestos 1, 4 en
EE y F3 por HPLC-DAD. Como estndares se utilizaron los flavonoides aislados y
purificados 1 4
3.4.1) Validacin del mtodo de cuantificacin
Linealidad del mtodo desarrollado fue validado mediante el anlisis de las cinco
concentraciones de cada analito que oscilan entre 1 y 50 g/mL. El rango de concentracin
generalmente fue elegido segn las directrices de la ICH (Conferencia Internacional de
armonizacin) [35] es decir, 70% y 130% de la concentracin nominal. La accin apropiada
y soluciones estndar se prepararon como se describe en la seccin 2.5.3. Las ecuaciones de
regresin, coeficientes de correlacin como lmites de deteccin (LOD) y cuantificacin
(LOQ) de cada uno de ellos fueron dados en la tabla 2. Se realiz el anlisis por triplicado
para cada solucin estndar. Se construyeron las curvas de calibracin por regresin lineal
de la relacin de rea de pico (y) de cada analito, versus las concentraciones (x). Se
calcularon los lmites de deteccin (LOD) y cuantificacin (LOQ) por el uso de ecuaciones
LOD = 3.3SD / a y LOQ = 10SD/a, respectivamente, donde SD es la desviacin estndar de
la intercepcin de la respuesta (y) y a es la pendiente de la curva de calibracin segn las
directrices de la ICH [35]. Se observaron buenos coeficientes de correlacin entre 0.9998 y
0.9999. Las curvas de calibracin estndar eran todo lineales en las gamas de prueba. Los
LODs y LOQs de compuestos 1, 4 eran 0.4924 0.5749 y 1.4921 1.7420 g/mL,
respectivamente (tabla 2), indicando que el mtodo desarrollado exhibi buena sensibilidad.

Las precisiones das inter y intra-da, expresadas como las desviaciones estndar
relativas (RSD) para el tiempo de retencin y pico rea determinaron todo aislado
compuestos por anlisis por triplicado de mezcla de soluciones estndar durante el da y en
tres das consecutivos. Las variaciones intra y entre das de tiempos de retencin y
concentracin expresada en % RSD se enumeran en la tabla 3. Los valores de % RSD de
tiempos de retencin y reas de pico de los cuatro flavonoides fueron encontradas en el
rango de 1.02 1.30% y 1.04 1,92%, respectivamente en la prueba de precisin intra-da.
Se obtuvieron resultados similares (1.55-1.82% para la variacin del tiempo de retencin) y
1,72 2.15% para la variacin del rea pico en ensayo de precisin. Estos resultados
representan buena precisin del mtodo desarrollado.
La exactitud se determin en la prueba de recuperacin por el mtodo de adicin
estndar. Tres concentracin de cada solucin estndar del compuesto (1 g/mL, 12,5
g/mL y 50 g/mL) fueron agregados a la muestra de extracto crudo (0.5 mg/mL) y los
anlisis se realizaron por triplicado segn el procedimiento descrito en la seccin 2.5.3. La
recuperacin media se calcul segn la frmula siguiente: recuperacin (%) = [(cantidad
fundada cantidad original)/cantidad con picos] 100%. Las tasas de recuperacin de los
analitos entre 98.7 1,91 y 103.23 1.78 con desviaciones estndar relativas en el rango
de 1.14 1.98% lo que indica alta precisin del mtodo desarrollado (tabla 4).
3.4.2) Cuantificacin de los flavonoides identificados en etanol 60% Extracto de D.
adscendens (EE) y 50% fraccin metanlica (F3)
Los tiempos de retencin de los picos esperados de compuestos 1, 4 en EE y F3 fueron
igual a la de los compuestos aislados estndar. Isovitexin-2-O-xyloside (1) y vitexina-2-Oxyloside (2) fueron los principales flavonoides en ambos EE (21.428 y 12,188 mg/g
respectivamente) y F3 (206.020 y 142,026 mg/g, respectivamente) (tabla 5). Los dos
compuestos de este ltimo, vitexina (3) y isovitexin (4), se encontraron en menor
concentracin: 3.328 y 1,635 mg/g en EE y 17.443 y 6,363 mg/g en F3. Los valores RSD
% entre 0.5 a 2.6% confirman la buena repetibilidad del mtodo propuesto de
cuantificacin. La comparacin de cantidades de flavonoides por 1 g de EE y F3 permite
para monitorear el proceso de concentracin. El contenido total de flavonoides fue cerca de
diez veces mayor en F3 que en EE. Por otro lado, la estimacin de la cantidad de
flavonoides (en EE y F3) en relacin a 100 g de material vegetal permiti para evaluar la
prdida de las sustancias bioactivas durante la purificacin. Sobre esta base la prdida de
dos compuestos principales (1 y 2) se ha determinado como 28% y 14%, respectivamente.
En el caso de dos compuestos menores (3 y 4), la reduccin de las cantidades fue mayor y
equivalan a aproximadamente el 60% y 75%.
Los perfiles de HPLC-DAD de la EE y F3 indicaron que isovitexin-2-O-xyloside (1) y
vitexina-2-O-xyloside (2), como los componentes principales (>85% de la cantidad total de
flavonoides), podran jugar papeles cruciales en su accin antioxidante. Nuestros resultados
sugieren que los extractos de D. adscendens que contiene estos dos flavonoides podran ser
una til fuente natural de antioxidantes.

4). CONCLUSIN
En el estudio presentado, fraccionamiento actividad guiada y cromatografa de columna
de lquido multietapa dio lugar por primera vez en el aislamiento de dos pares de ismeros
de flavonoides de las hojas de D. adscendens. Isovitexin-2-O-xyloside (1) y vitexina-2-Oxyloside (2) se obtuvieron en cantidades sustanciales de 135 y 102 mg, respectivamente y
dos componentes menores, vitexina (3) y isovitexin (4), se obtuvieron en menor cantidad,
27 mg y 14 mg, respectivamente. Sus estructuras se probaron con xito por UV, MS y 1H,
13C, tcnicas de RMN 2D. Aislamiento de compuestos puros permiti el anlisis
cuantitativo de extracto crudo (EE) y 50% MeOH fraccin (F3) de D. adscendens, que era
previamente imposible debido a la falta de estndares puros comercialmente disponibles.
Adems, flavonoides puros en nuestro estudio pueden utilizarse para investigacin en
mecanismos desconocidos de la actividad biolgica de D. adscendens. Nuestros resultados
sugieren que extractos de D. adscendens con alto contenido de flavones C-glucsidos, con
propiedades biolgicas documentados podran ser una til fuente natural de antioxidantes y
pueden servir como valioso nutracutico producto o dieta suplemento de origen vegetal.