EVALUACIN DE LAS CONDICIONES DE DETOXIFICACI....

EVALUACIN DE LAS CONDICIONES DE DETOXIFICACIN DE LA TOXINA

TETNICA
EVALUATION OF DETOXIFICATION CONDITIONS OF TETANUS TOXIN
Rodrguez C, Rojas J, Gutirrez I1.

RESUMEN

INTRODUCCIN

La transformacin a toxoide de la toxina tetnica sin purificar y

libre de clulas, se evalu bajo condiciones variables de pH,
temperatura de incubacin inicial (primera semana), potencial
de xido-reduccin, concentracin de toxina tetnica y
concentracin de formaldehdo. Al tratar la toxina tetnica en
un medio de reaccin neutro existe menor porcentaje de prdida
de la protena tetnica. Para las condiciones actuales de
detoxificacin, no existe dependencia de la concentracin de
formaldehdo y la concentracin de protena tetnica inicial,
variando de forma independiente el valor floculante. La reaccin
formaldehdo-toxina es lenta a bajas temperaturas, con menor
disminucin del valor floculante y sin influencia del potencial
redox en el valor floculante y en la prdida de toxicidad.

El ttanos es una enfermedad aguda inducida por una

exotoxina (tetanoespasmina), producida por el Clostridium
tetani, cuya tasa de mortalidad vara entre 20 y 60%,
presentndose la tasa ms alta en recin nacidos, ttanos
neonatal (Reyes y Flores, 1986 ; Shiavo et al., 1996). El
ttanos se ha denominado "Enfermedad sin Excusas", ya
que es completamente prevenible por vacunacin y la
Organizacin Mundial de la Salud ha puesto en
funcionamiento un programa de vacunacin masiva para
eliminarla (Shiavo et al., 1996). En Colombia, el Instituto
Nacional de Salud es la entidad encargada de la produccin
del Toxoide Tetnico necesario para cubrir las necesidades
del Programa Ampliado de Inmunizaciones (PAI). El
toxoide se encuentra adsorbido en hidrxido de aluminio
(Vacuna TT), asociado al Toxoide Diftrico (Vacunas Td y
TD) y/o asociado a Toxoide Diftrico y a grmenes muertos
de Bordetella pertussis (Vacuna DPT).

Palabras Claves: detoxificacin, toxoide tetnico, toxina

tetnica, formaldehdo
SUMMARY
The transformation to toxoid of tetanus toxin without
purification and cells free, was evaluated under variable
conditions such as pH, initial incubation temperature (first week),
potencial of oxidation-reduction, tetanus toxin concentration
and formaldehyde concentration. When tetanus toxin is treated
in a neutral reactional media there is a less lost of tetanus protein.
To the present detoxification conditions there is not
dependence between the formaldehyde concentration and the
initial tetanus protein concentration changing independtly the
flocculant value. The formaldehyde-toxin reaction is slow at
low temperatures, with a lower diminution of the flocculant
value and without the redox potential influence in the flocculant
value and in the lost of toxicity.

El toxoide consiste en toxina tetnica detoxificada con

formaldehdo y calor, este hecho fue reportado por primera
vez por Descomby en 1920, quien prepar el primer toxoide
tetnico combinado (toxina con aldehido frmico y calor) y
demostr que poda estimular la formacin de anticuerpos
en animales de experimentacin (Reyes y Flores, 1986).
En 1926, Ramn comprob este hecho, tras inocular toxoide
tetnico en animales y en s mismo e inducir un estado de
inmunidad activa, adems realiz la primera vacunacin
antitetnica en humanos, utilizando antitoxina tetnica,
demostrando as el valor de la profilaxia tetnica (Reyes y
Flores, 1986 ; Shiavo et al., 1996). En 1932 Velluz evalu la
concentracin de formaldehdo y pH en el proceso de
detoxificacin, encontrando una variacin significativa en el
valor floculante de la toxina (Cheyroux, 1954). El

Keywords : detoxification, tetanus toxoid, tetanus toxin,

formaldehyde
1

Laboratorio de Ttanos, Subdireccin Industrial, Instituto Nacional de

Salud. Santaf de Bogot, D.C.,Colombia.
lgutierrez@hemagogus.ins.gov.co

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REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGA

formaldehdo acta como un agente de entrecruzamiento,

formando enlaces metilnicos intra e intermoleculares que
resulta en polimerizacin, lo cual podra explicar la
disminucin en la actividad floculante especfica (Fraenkel
y Olcott, 1948). Segn Murphy, esta polimerizacin es
directamente proporcional a la concentracin de protena y
de formaldehdo, es decir que a mayor concentracin de
protena mayor polimerizacin, mayor peso molecular del
polmero obtenido y por ende mayor disminucin en la
actividad floculante, lo mismo sucede cuando se mantiene
constante la concentracin de protena y se vara la de
formaldehdo. Murphy, analiz la formacin de toxoide
tetnico bajo diferentes condiciones, determinando que el
producto de la reaccin depende de la concentracin de
protena y de formaldehdo (Murphy, 1967). El valor floculante
tambin se encuentra influenciado por el contenido de
proteasas presentes en el medio de cultivo y su actividad
depende de la temperatura de incubacin (Amoureux, 1945).
En el presente trabajo se evalu la influencia del pH, la
concentracin de formaldehdo, la concentracin de toxina
tetnica y la temperatura de incubacin inicial en el proceso
de detoxificacin utilizado actualmente en el Instituto
Nacional de Salud y en el cual se reduce en un 30% la
concentracin de protena (dada en Lfs1 totales por mL), el
cual se considera como porcentaje de prdida en proceso.
MATERIALES Y MTODOS
Para este estudio la toxina empleada fue obtenida por
cultivo esttico, en jarros con 10 I de medio LathamMueller, incubados a 35C por 7 das (Gutirrez, 1995).
Se utiliz la cepa de Clostridium tetani Massachussetts,
la cual es altamente toxignica y no esporula en
condiciones normales de laboratorio. La toxina fue
centrifugada en vnulas estriles a 4000 r.p.m. durante 30
minutos, en una centrfuga SORVALL RC3B. Los ratones
empleados para la prueba de toxicidad son de la cepa
NIH, con un peso de 18 a 20g, de aproximadamente 21
das de nacidos, suministrados por la Divisin de Animales
de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud, los cuales
son inoculados con 1 ml de la toxina tetnica en estudio y
observados durante 28 das para detectar signos de
ttanos. Para evaluar los diferentes ensayos se realiza la
floculacin de Ramn y Toxicidad en ratn de acuerdo al
manual para la Produccin y Control de Vacunas: Toxoide
Tetnico (WHO, 1997).
Determinacin del pH ptimo de reaccin.
Se utilizaron una serie de frascos taparrosca de 250 ml,
conteniendo 200 ml de toxina tetnica (70 Lf/ml), con un
gradiente creciente de pH (entre 5.5 y 8.0) y 0.5% v/v de

Lf: Lmite Floculante, cantidad de toxina o toxoide que mezclada

con 1 Ul de antitoxina flocula en el ms corto tiempo (no superior a 60
minutos).

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formaldehdo (comercial en solucin al 37%, estabilizado con

10% de metano!). Para obtener el nivel de pH deseado se
utiliz NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.2H20 y para mantenerlo se
emple buffer fosfato 0.1 M. Una vez se ajust el pH, los
frascos se incubaron a 37 C por 28 das, se tom una
muestra de 10 mL semanalmente para evaluar concentracin
de protena tetnica (toxina o toxoide) mediante la prueba de
floculacin de Ramn y toxicidad en ratn (WHO , 1997).
Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
Variacin de la concentracin de toxina tetnica y
formaldehdo.
Se utilizaron las siguientes concentraciones de toxina
tetnica: 20,40,60,80 y 100 Lf/ml, con un volumen de toxina
de 200 mL en frascos taparrosca de 250 mi. Cada
concentracin de toxina se enfrent a diferentes
concentraciones de formaldehdo, 0.3,0.35,0.4,0.45,0.5,
0.55,0.6,0.8,1.0 y 1.2 % v/v, en un pH de reaccin de 7.0,
valor ptimo determinado en el primer ensayo.
Posteriormente se incub a 37C por 28 das en el transcurso
de los cuales se tom muestra a los 8,16,23 y 28 das, a
las cuales se les realiz la prueba de floculacin de Ramn
y al da 28 toxicidad en ratn (WHO, 1997). Todos los
ensayos se realizaron por duplicado.
Variacin de la temperatura de incubacin inicial.
Para este estudio se emple toxina tetnica (55 Lf/ml)
adicionada con 0.5 % v/v de formaldehdo a un pH de 7.0 y
se someti a diferentes temperaturas de incubacin inicial
(Amoureux, 1945). Se colect un volumen de toxina de 200
mL en frascos de 250 mi, el frasco No 1 se incub a una
temperatura de 4C por una semana, el frasco No 2 se
mantuvo a una temperatura de 37C por 28 das y el frasco
No 3 se conserv por una semana a 22 C. Posteriormente
los frascos 1 y 3 fueron incubados a 37 C hasta completar
los 28 das de detoxificacin, se tom muestra a los 8,16,
23 y 28 das, a las cuales se les realiz las pruebas de
floculacin de Ramn y toxicidad en ratn (WHO, 1997).
Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
Variacin de la temperatura de incubacin inicial
con la presencia de oxgeno o nitrgeno en el medio.
La toxina tetnica (50 Lf/ml) fue detoxificada con 0.5% v/v
de formaldehdo a un pH de 7.0, a diferentes condiciones
de xido-reduccin y temperatura de incubacin inicial
(Amoureux, 1945). La toxina fue repartida en frascos de
250 mi (200 mi por frasco) divididos en dos grupos, cada
uno de los cuales contena tres frascos. El primer grupo se
burbuje con oxgeno (O2) durante 5 minutos y se cerraron
los frascos hermticamente, posteriormente se incubaron
a 4,22 y 37 C respectivamente durante una semana, al
cabo de la cual se continu la incubacin a 37 C hasta
completar 28 das de detoxificacin. El segundo grupo se
burbuje con nitrgeno (N2) durante 5 minutos y se cerraron
los frascos hermticamente, posteriormente se incubaron
en las mismas condiciones del primer grupo. El da 28 se

EVALUACIN DE LAS CONDICIONES DE DETOXIFICACI....

tom muestra para realizar pruebas de floculacin de

Ramn y toxicidad en ratn (WHO, 1997). Todos los
ensayos se realizaron por duplicado.

siendo la prueba no satisfactoria al da 28. Al observar el

valor de pH 8.0 se encontr que tena un porcentaje
constante de mortalidad del 100% en todos los das de
observacin (Figura 2).

RESULTADOS
Correlacin del pH frente a la protena tetnica. Al evaluar
la influencia del pH en el porcentaje de prdida al da 28, se
observ que los ensayos a pH 7.0 presentan una menor
disminucin en el ttulo, con un porcentaje de prdida de
28.5% y en los ensayos a pH 8.0 se present mayor
prdida con un porcentaje de 64.27%. (Figura 1).
En la prueba de toxicidad, al observar la distribucin
porcentual de mortalidad se encontr una mortalidad de
100% en el da O, en todos los valores de pH; a partir del
octavo da hasta el da 28 de detoxificacin, la prueba de
toxicidad fue satisfactoria para los valores de pH entre
5.5 y 7.0 puesto que el porcentaje de mortalidad fue de
0%. El valor de pH 7.5 present variaciones en el
porcentaje de mortalidad durante los das de observacin,

Variacin de la concentracin de toxina tetnica y de

formaldehdo.
En la Tabla 1 se presentan las observaciones al da 28 de
detoxificacin de las diferentes concentraciones de
formaldehdo frente a diferentes concentraciones de
protena inicial. La concentracin inicial de 20 Lf/mL
present mayor porcentaje de prdida en las diferentes
concentraciones de formaldehdo y la de 80 Lf/mL mostr un
comportamiento constante con menor porcentaje de
prdida. Adems se observa una ligera tendencia en donde a
mayor concentracin de formaldehdo mayor prdida, pero
no para todas las concentraciones de protena. Al realizar
la prueba de toxicidad sta fue satisfactoria para las
concentraciones de formaldehdo iguales o mayores a 0.35%
v/v, siendo 0.30% de formaldehdo no satisfactoria con 100%
de mortalidad (Figura 3).

Tabla 1. Porcentaje de prdida de diferentes concentraciones de protena tetnica sometidas a proceso

de detoxificacin con concentraciones variables de formaldehdo durante 28 das a 37c

Figura 1. Distribucin porcentual de prdida de

una protena tetnica inicial de 70 IF/rnL, 37OC de
temperatura y 28 das de incubacin.

Figura 2. Distribucin porcentual de mortalidad

segn pH y das de observacin, protena inicial 70
Lf/mL, temperatura 37QC
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REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGA

Figura 3. Porcentaje de mortalidad de diferentes

concentraciones de protena tetnica detoxificada con
diferentes concentraciones de formaldehdo al da 28

Figura 4. % de prdida a diferentes temperaturas

de incubacin inicial durante 28 das de
observacin, pH 7.0, 0.5 % de formaldehdo

Tabla 2. Porcentaje de prdida de una protena tetnica sometida al proceso de detoxificacin a

diferentes temperaturas de incubacin inicial durante 28 das a 37C y 0.5 % de formaldehdo

Variacin de la temperatura de incubacin inicial.

La toxina incubada inicialmente a 4C present menor
prdida (13.5%), a la primera semana de incubacin y al
completar el tiempo de detoxificacin se present menor
porcentaje de prdida en la toxina incubada a 37C (36.3%)
y un mayor porcentaje de perdida en 4C (47.27%), como
se observa en la tabla 2 y la figura 4.
Al evaluar la distribucin porcentual de mortalidad en la prueba
de toxicidad, se observa un 100% de mortalidad para el da 8
a las temperaturas iniciales de 4C y 37C, mientras que la
de 37C present 0% de mortalidad. A partir del da 15 no

se present mortalidad en ninguna de las temperaturas de

incubacin inicial, siendo la prueba satisfactoria.
Variacin de la temperatura de incubacin inicial
en presencia de oxgeno o nitrgeno en el medio.
Al evaluar la concentracin de la protena tetnica con la
temperatura en presencia de oxgeno y nitrgeno no se
encontr influencia sobre el ttulo (porcentaje de prdida
entre 40 y 44%), (Tablas 3, 4 y Figura 5). Al realizar la
prueba de toxicidad a los 28 das de detoxificacin, fue
satisfactoria tanto para el oxgeno como para nitrgeno a
las diferentes temperaturas de incubacin inicial.

Tabla No 3. Porcentaje de prdida de una protena tetnica Inicial de 50 Lf/ml en presencia de Oxgeno,
detoxificada por 28 das a 37gC y 0.5 % de formaldehdo

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EVALUACIN DE LAS CONDICIONES DE DETOXIFICACI.

depende de la concentracin de formaldehdo ni toxina

inicial, lo contrario sucede cuando se utiliza toxina
purificada. Murphy demostr que la concentracin de
formaldehdo necesaria para detoxificar una toxina
purificada es directamente proporcional a la concentracin
de toxina inicial, pudindose obtener una concentracin
de formaldehdo para cada concentracin de toxina inicial
en donde la disminucin del valor floculante sea mnima
sin afectar la estabilidad del toxoide.
Tabla No 4. Porcentaje de prdida de una protena
tetnica inicial de 50 Lf/ml en presencia de
Nitrgeno, detoxificada por 28 das a 37C y 0.5 %
de formaldehdo

Figura 5. Comparacin entre protena tetnica final y

temperatura de incubacin inicial segn presencia de
oxigeno o nitrgeno en el medio al da 28 de
observacin
ANLISIS DE RESULTADOS
Al variar el valor de pH se encontr que entre ms alcalino
el medio, hay una tendencia a aumentar la prdida de
concentracin de protena tetnica. Estos resultados
corresponden con los obtenidos por Cheyroux en 1954,
quien afirma que cuando el pH es ms alcalino, la fijacin
de formaldehdo es ms rpida, disminuyendo de manera
considerable el valor floculante, adems afirma que un pH
alcalino activa la detoxificacin ; sin embargo en los
ensayos realizados a un valor de pH de 7.5 y 8.0 la toxina
tetnica no detoxific, probablemente porque la reaccin
de formaldehdo-toxina no es estable.
El formaldehdo afecta el porcentaje de prdida,
disminuyendo la concentracin de protena tetnica en el
proceso de detoxificacin, observndose una ligera
tendencia en donde a mayor concentracin de formaldehdo
mayor prdida, pero no para todas las concentraciones
de protena tetnica utilizadas. La variabilidad de los
resultados se debe posiblemente a la presencia de otras
protenas en el medio que pueden participar en la reaccin
formaldehdo-toxina y por lo tanto afectar de manera
considerable la especificidad de la reaccin. Cuando se
detoxifica toxina no purificada, como en este caso, la
cantidad de formaldehdo necesaria para detoxificar no

Cuando se somete la toxina tetnica a detoxificacin a

4C no se disminuye de manera considerable el valor
floculante debido a que la accin del formaldehdo es lenta
o posiblemente debido a que las proteasas tienen una
baja actividad a esta temperatura. La toxina detoxificada
a 37C mostr disminucin considerable del valor floculante
debido probablemente a que aumenta la accin del
formaldehdo y de las proteasas, ratificando as lo expuesto
por Cheyroux. Sin embargo, la accin del formaldehdo
fue insuficiente a los ocho das de incubacin a
temperaturas de 37 y 4C , pero a 22C su accin fue
satisfactoria. Estos resultados muestran que existe
influencia de la temperatura en la detoxificacin, ya sea
en la reaccin formaldehdo-toxina o en la actividad de las
proteasas; es necesario realizar un estudio ms detallado,
para evaluar si esta influencia es significativa o no.
En todos los ensayos, cuya prueba de toxicidad fue
satisfactoria, se observ que la detoxificacin ocurra entre
el da 8 y el da 15, teniendo en cuenta que le correlacin
entre el tiempo de observacin y el porcentaje de perdida
es representativa, se puede suponer que la disminucin
en el tiempo de incubacin conlleva a disminucin en el
porcentaje de perdida. De lo anterior se desprende otro
trabajo en el cual se estudiar la influencia del tiempo de
incubacin en el porcentaje de perdida.
CONCLUSIONES
Al detoxificar la toxina tetnica en un medio de reaccin
neutro (pH 7.0), el rendimiento en trminos de produccin
mejora debido a que hay un menor porcentaje de prdida
de la protena tetnica. En un medio alcalino (pH 7.5 8.5), no existe reaccin ptima entre la toxina tetnica y
una concentracin de formaldehdo 0.5% v/v.
En las condiciones actuales de produccin del toxoide tetnico
en el Instituto Nacional de Salud, no existe relacin entre la
concentracin de formaldehdo y la concentracin de toxina
tetnica inicial para llevar a cabo la detoxificacin, requirindose
no menos de 0.35% v/v de formaldehdo sin tener en cuenta la
concentracin de toxina tetnica inicial (dada en Lf/mL).
Una toxina incubada a 4C presenta reaccin lenta con
formaldehdo, mientras que incubada a 37 y 22C la
reaccin siempre es activa.

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REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGA

El potencial de xido reduccin en el medio de reaccin

no influye en el valor floculante ni en la prdida de toxicidad
de la protena tetnica.

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Nacional de Salud como entidad que auspici

la investigacin, al Dr. Jos Manuel Granados por su
colaboracin y orientacin al grupo de DPT y a la Divisin
de Animales de Laboratorio.

BIBLIOGRAFA
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