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Resumen
El glutatin (GSH) es una molcula nica que participa en aspectos
esenciales de la homeostasis celular, teniendo un rol central en la defensa
contra el dao oxidativo. El GSH (L-g-glutamil-L-cisteinil-glicina) es un
tripptido hidrosoluble formado por los aminocidos cido glutmico, cistena
y glicina que se encuentra presente en el citoplasma de todas las clulas. La
forma oxidada de la molcula, GSSG, se encuentra principalmente en forma
extracelular. Las concentraciones de GSH y GSSG y su relacin molar son
indicadores de la funcionalidad celular y su alteracin est relacionada con
varios procesos patolgicos en el hombre y en los animales de compaa.
En esta revisin se abordan importantes aspectos de la homeostasis, las
principales funciones biolgicas y las metodologas analticas disponibles
para el anlisis de GSH en sangre y plasma.
Palabras clave: glutatin * glutatin oxidado * estrs oxidativo * ciclo g-glutamil
Summary
Resumo
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Introduccin
Glutatin: una molcula central en la
homeostasis celular
El glutatin (GSH) es una molcula nica que participa en aspectos esenciales de la homeostasis celular.
Fue descubierta en 1888 por Joseph de Rey-Pailhade en
Francia. Este cientfico describi que las clulas de levadura contenan una sustancia que formaba sulfuro de
hidrgeno cuando eran trituradas en presencia de azufre (1). De Rey-Pailhade tambin hall la sustancia en
msculo, hgado, cerebro, msculo de pescado, sangre
y esprragos y la llam philothione (del griego amante
del azufre). La estructura de la molcula fue estudiada
por Hopkings en Cambridge, quien propuso que se trataba de un dipptido formado por glutamato y cistena
e introdujo el nombre de glutatin en 1921. Harring
y Mead finalmente describen la estructura qumica correcta del tripptido en 1935 (1)(2). Luego, la molcula fue virtualmente olvidada durante 40 aos hasta que
en 1969 se public el artculo Lest I Forget Thee Glutathione.. en Nature (3); el ttulo del artculo indica la
escasa investigacin sobre la molcula en aquellos das.
La investigacin sobre glutatin tuvo un gran impulso
especialmente en la dcada del 80, fue llevada a cabo
por Meister y sus colaboradores quienes contribuyeron
en el entendimiento de las funciones fisiolgicas y el
metabolismo de esta molcula central para la supervivencia celular.
1. Estructura qumica
El glutatin (L-g-glutamil-L-cisteinil-glicina) es un
tripptido hidrosoluble formado por los aminocidos
cido glutmico, cistena y glicina (1-4). Esta molcula
es un antioxidante celular esencial, que est presente
en todos los rganos y tejidos, especialmente en el hgado, donde se encuentran las mayores concentraciones
(1)(4-6). La molcula se encuentra libre y unida a protenas. La concentracin total de glutatin (GSHt) es la
suma de la fraccin de glutatin libre y la fraccin de
glutatin unida a protenas. A su vez, la fraccin libre
est integrada por la forma tiol reducida llamada glutatin reducido (GSH) y la forma oxidada o disulfuro
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La sntesis enzimtica de GSH est controlada a travs de la induccin de los genes Gclcy Gclm que conducen a la sntesis de las subunidades de la enzima GCL.
Estos genes son estimulados principalmente cuando la
clula debe aumentar sus sistemas de defensa ante el
estrs oxidativo, ya que poseen en su promotor un sitio
de reconocimiento comn para los factores de transcripcin kappa (NF-kB), Sp-1, AP-1 AP-2, respuesta
antioxidante (ARE) y elementos de respuesta electroflica (EpRE) (15).
La insulina es otro factor que estimula la sntesis de
GSH, ya que induce selectivamente la transcripcin de
la subunidad cataltica de la GCL. Esta situacin es de
gran relevancia en los pacientes diabticos, donde la
disminucin de la hormona produce una disminucin
de GSH eritrocitario haciendo a estas clulas ms susceptibles al estrs oxidativo (16).
Otra condicin que est asociada a la transcripcin
de la subunidad cataltica de la GCL es un rpido crecimiento de hepatocitos. Este crecimiento puede estar
estimulado luego de una hepatectoma parcial o bien
por la muerte de hepatocitos luego de una lesin heptica aguda. Este aumento en la transcripcin se produce
por la accin del factor de crecimiento de hepatocitos
que acta como un mitgeno e induce la expresin de
ambas subunidades de la enzima GCL (17).
En condiciones fisiolgicas normales, la tasa de sntesis de GSH se encuentra determinada en gran parte
por dos factores: Uno de ellos es la actividad de GCL y
el otro es la disponibilidad del sustrato cistena. Por lo
tanto, los niveles intracelulares de GSH son regulados
por el feedback negativo del producto final (GHS) sobre
la enzima GCL (1)(4)(6-10) y por la disponibilidad del
aminocido L-cistena (1)(10)(11).
La enzima GCL es un heterodmero formado por dos
unidades: la subunidad pesada o cataltica (GCLC, Mr
73000) y la subunidad ligera o moduladora (GCLM,
Mr 30000). La subunidad pesada posee el sitio activo responsable de la unin entre el grupo amino de la
cistena y el grupo g-carboxilo del glutamato. La subunidad ligera no tiene actividad enzimtica, pero tiene
una importante funcin reguladora aumentando la eficiencia cataltica de GCLC. Esta subunidad disminuye
el Km para el glutamato y aumenta el Ki para el GSH
(12). El GSH inhibe GCL por competir con el glutamato en el sitio activo de GCLC (9-13). La enzima GS (Mr
118000) est formada por dos subunidades idnticas.
Esta enzima no est regulada por los niveles intracelulares de GSH. El sitio activo de la enzima que une la
Figura 2. Esquema de la sntesis de GSH. El primer paso en la sntesis de GSH es llevado a cabo por la enzima glutamato cistena ligasa
(GCL), que est compuesta por una subunidad cataltica (GCLC), y una subunidad moduladora (GCLM). 1. En un paso que limita la velocidad de la sntesis de GSH, GCL liga cistena y glutamato para formar el dipptido g-L-glutamil-L-cistena. 2. El segundo paso es llevado a
cabo por la enzima glutatin sintetasa (GS) que une glicina a g-L-glutamil-L-cistena. Ambos pasos son dependientes de ATP. 3. Feedback
negativo de GSH sobre la actividad de GCL.
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namiento celular, debido a que durante el procesamiento GHS se escapa del ncleo (21). El segundo factor es
que los niveles de GSH varan durante el ciclo celular
dada su importancia en la regulacin de la proliferacin
celular. As, los estudios dirigidos a determinar la distribucin de GSH nuclear deben tener en cuenta la fase
del ciclo celular en que se encuentra la poblacin celular
que est siendo evaluada. Usando tcnicas de microscopa confocal se evalu la distribucin de GSH durante
diferentes etapas del ciclo celular. Cuando las clulas comienzan con la fase de proliferacin, se observan niveles
altos de GSH en el ncleo, en tanto que las clulas en
reposo tienen niveles de GSH similares o ms bajos en el
ncleo respecto al citoplasma (22).
5. Homeostasis del GSH: El ciclo g-glutamil
Figura 3. Transporte mitocondrial de GSH. El anin GS- atraviesa libremente la membrana mitocondrial externa. El pasaje de GSH desde
la membrana mitocondrial interna hacia la matriz se realiza mediante
dos transportadores de aniones. El transportador dicarboxilato (DIC)
que intercambia fosfato inorgnico (Pi) por GSH y el transportador
2-oxoglutarato (OGC) que intercambia 2oxoglutarato (2-OG) por GSH.
citoplasmtica externa; GGT acta sobre GSH formando
dos fracciones: La fraccin g-glutamil y la fraccin cisteinil-glicina transfiriendo la fraccin g-glutamil a un aminocido aceptor, formando g-glutamil-aminocido. Una
vez dentro de la clula, el g-glutamil-aminocido puede
ser metabolizado para liberar el aminocido y 5-oxoprolina, que luego puede ser convertido en glutamato para
ser usado en la sntesis de GSH.
Por otra parte, tambin en el espacio extracelular,
la fraccin cisteinil-glicina es desdoblada por la enzima
dipeptidasa generando cistena y glicina. Las clulas incorporan cistena y la mayor parte de la cistena que
ingresa es incorporada en la sntesis de GSH. Dependiendo de las necesidades metablicas de la clula, la
cistena puede ser usada para la sntesis de protenas y
parte puede ser degradada a sulfato y taurina. El ciclo
g-glutamil permite que el GSH pueda ser usado como
una fuente continua de cistena (Fig. 4).
La mayor parte de GSH sintetizado por las clulas es
exportado al espacio extracelular (23). La velocidad de
rotacin de GSH es muy rpida en la mayora de las clulas, con una vida media de slo 2 a 6 horas (10); esto est
indicando que existe una rpida sntesis y exportacin del
tripptido. Si bien gran cantidad de GSH es exportado de
las clulas al plasma, las concentraciones de GSH en este
compartimento son relativamente bajas, en el orden de
los micromoles, debido al rpido catabolismo del tripptido en la circulacin. La vida media del GSH en plasma
se encuentra en el orden de segundos a minutos (10).
GGT es la nica enzima que puede iniciar el catabolismo de GSH ya que tiene la capacidad de hidrolizar la
particular unin peptdica g-glutamil del tripptido. Esta
Figura 4. Ciclo g-glutamil. GSH es sintetizado en el citosol y es transportado hacia el espacio extracelular donde ocurre su degradacin
(1), la ectoenzima g-glutamiltranspeptidasa (GGT) transfiere la fraccin g-glutamil a un aminocido formando g-glutamilaminocido (2)
que es transportado dentro de la clula para completar el ciclo formando glutamato para la sntesis de GSH. La fraccin cisteinilglicina
es desdoblada por dipeptidasas (DP) extracelulares en los aminocidos cistena y glicina (3). La cistena ingresa en la clula y puede ser
utilizada nuevamente en la sntesis de GSH (4).
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Figura 5. Metabolismo de GSSG. GSH es oxidado a GSSG (1). GSSG es degradado por GGT, formndose mono (desGlu)-GSSG. Este metabolito, tiene dos productos de degradacin, uno de los cuales, CySS-bis-Gly se forma por la accin de GGT, y otro, CySSG es formado por
la accin de cisteinilglicinadipeptidasa. Luego, CySSG es degradado por GGT y CySS-bis-Gly es degradado por cisteinilglicinadipeptidasa.
El nmero 2 indica reacciones catalizadas por GGT y el nmero 3, reacciones en las que interviene DP.
Las clulas son impermeables a GSH; hasta la fecha no ha sido identificado ningn transportador
que permita el ingreso de GSH al espacio intracelular (24-28). Todo el GSH que se encuentra dentro de
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Figura 6. Mecanismos de transporte GSH y de cido glutmico (Glu), cistena (Cis) y glicina (Gly) en el hepatocito. La figura muestra el
ingreso de los aminocidos desde el espacio extracelular por medio de transporte activo. GSH es exportado tanto al espacio sinusoidal como
al canalculo biliar, por los transportados Mrp1, Mrp2 y el transportador de solutos orgnicos (Oatp1).
GSSG+2H+ + 2e-
a) Detoxificacin de xenobiticos
La funcin ms importante del GSH es la detoxificacin de xenobiticos y sus metabolitos. El tripptido tiene un rol importante en la detoxificacin de una gran
variedad de compuestos, conjugndose con estos para
luego ser excretados por orina o heces bajo la forma de
derivados de cidos mercaptricos (7). Estos compuestos
se caracterizan por ser electroflicos y forman conjugados
con GSH en reacciones espontneas o bien en reacciones enzimticas que estn mediadas por la enzima GSH-
Figura 7. Estructura de GSH relacionada con sus funciones biolgicas. 1)Enlace g-glutamil entre el grupo amino de la cistena y el
g-carboxilo del glutamato. Esta particular unin, promueve la estabilidad intracelular ya que el tripptido slo puede ser degradado
extracelularmente por la enzima GGT. 2) Grupo sulfidrilo del residuo
de cistena. Este grupo es altamente reactivo facilitando la participacin de GSH en las funciones celulares.
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El GSH es el mayor determinante del potencial redox intracelular. Tanto la concentracin de GSH como
la relacin molar GSH/GSSG contribuyen a mantener
el balance redox dentro de la clula. Este equilibrio
redox regula diversos procesos metablicos intracelulares que incluyen la actividad enzimtica, el transporte
celular, transduccin de seales y la expresin gnica
mediada por la transcripcin de factores entre los que
se destacan el activador de protena (AP-1), el factor
nuclear kappa-b ( NF -B) y el p53 (4)(26)(33).
c) Funcin antioxidante
Las clulas estn sujetas a niveles fisiolgicos de estrs oxidativo derivado de la respiracin mitocondrial.
Los intermediarios formados tales como el anin superxido (O2-) y el perxido de hidrgeno (H2O2) pueden llevar a la formacin de formas txicas del oxgeno
que causan peroxidacin lipdica y dao celular. Del
mismo modo, GSH reacciona con los intermediarios
reactivos del nitrgeno (32).
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El almacenamiento de cistena es otra de las funciones de GSH (7). El aminocido cistena es altamente
inestable en el espacio extracelular sufriendo una rpida auto-oxidacin a cistina. Este proceso produce
radicales libres potencialmente txicos (1). El ciclo
g-glutamil descripto previamente hace del GSH una
continua fuente de cistena para las clulas.
e) Regulacin del crecimiento y la muerte celular
Figura 9. Funcin antioxidante de GSH. 1) El perxido de hidrgeno formado por el metabolismo aerbico es metabolizado por la enzima
GSH peroxidasa formando GSSG. 2) GSSG formado en la reaccin anterior es reducido por la enzima GSH reductasa utilizando NADPH
como cofactor. 3) Los perxidos orgnicos formados pueden ser reducidos por GSH peroxidasa. 4) El GSSG formado durante el estrs oxidativo que no puede ser reducido a GSH es exportado de la clula para mantener el equilibrio redox.
con la patognesis de varias enfermedades en el humano, entre ellas, la enfermedad de Parkinson, formacin
de cataratas, diabetes, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntigton, artritis reumatoidea, sndrome
de inmunodeficiencia adquirida, enfermedad heptica
crnica por alcohol, sndrome de estrs respiratorio y
distrofia muscular (7)( 34).
En medicina veterinaria de animales de compaa
tambin se ha relacionado a los niveles disminuidos de
GSH con ciertos procesos patolgicos. La particular dificultad del gato domstico para restaurar los niveles de
GSH cuando se agotan las reservas ante el estrs oxidativo, est relacionada con la susceptibilidad de la especie a
los efectos txicos del paracetamol. En esta especie tambin se han encontrado niveles de GSH bajos en la enfermedad renal crnica (35)(36), en gatos infectados con el
virus de la inmunodeficiencia felina (36) y en gatos con
enfermedad heptica (37). Se ha reportado la disminucin de GSH en sangre en un grupo de perros enfermos
comparados con un grupo de perros normales, en un
estudio que incluy en el grupo de animales enfermos
distintos procesos patolgicos tales como neoplasias, enfermedad cardiovascular, enfermedad renal, micosis sistmica, trastornos neurolgicos y endcrinos (38).
Por lo expuesto anteriormente, la determinacin de
la concentracin de GSH en sangre podra ser utilizada
como un indicador del status de la homeostasis de GSH
y de riesgo de enfermedad (34). Las concentraciones
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