Ingeniera Gentica

Enzimas

Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodrguez, Facundo Temprana

Universidad Nacional de Quilmes

Ingeniera gentica

Construcciones
genticas

Construcciones genticas
La generacin de construcciones genticas nos introduce en el clonado
molecular.

El clonado molecular consiste en multiplicar copias idnticas de una

molcula.

En nuestro caso, las molculas son cidos nucleicos, y la multiplicacin la

logramos utilizando materia viva.

Construcciones genticas
Plano

Softwares

Plataforma

Vectores de clonado

Insumos

cidos nucleicos naturales y

artificiales

Herramientas

Enzimas

Equipamiento

Electroforesis/incubadores/PCR

Procedimientos

Estrategias y protocolos

Construcciones genticas
Plano

Softwares

Plataforma

Vectores de clonado

Insumos

cidos nucleicos naturales y

artificiales

Herramientas

Enzimas

Equipamiento

Electroforesis/incubadores/PCR

Procedimientos

Estrategias y protocolos

Clonado molecular
Identificar objetivo
In silico
Diseo in silico
Aislar la plataforma

Aislar el inserto
Apertura de la plataforma

In vitro

Compatibilizacin de extremos
Ligacin
Transferencia horizontal
Seleccin de ORG/plataforma
Seleccin de ORG/plataforma Recombinante

In vivo

Enzimas
Protenas globulares

Solubles en entornos acuosos

Catalizadores de reacciones qumicas

Enzimas

Definicin de unidad enzimtica

(cantidad de protena necesaria para generar una concentracin de
producto determinada a partir de una cantidad de sustrato
establecida y en condiciones de reaccin fijas)

Condiciones de reaccin qumicas y fsicas

(Entorno fsico-qumico en los que se realiza la reaccin)

Enzimas

Buffer de almacenamiento

Criopreservante

Buffer de reaccin

Tampn de pH
Fuerza inica
Cofactores
Otros

Enzimas
Reactivos

Volmenes

Buffer de reaccin NX

1X

cidos nucleicos

n ng

Enzima ( n U/ul)

Unidades deseadas

otros

n ul

H2O

c.s.p.

Vf

Tiempo:

10-20 ul

Temperatura:

Presin:

Enzimas
Incubacin

Inactivacin

Cambio de condiciones de reaccin

Enzimas
Clasificacin

Nucleasas

Enzimas
modificadoras

Ligasas

Polimerasas

Enzimas: Nucleasas
Son enzimas que catalizan la hidrlisis de enlaces fosfodister
DNAsas
Segn sustrato

RNAsas
Endonucleasas
Segn actividad

Exonucleasas

Enzimas: nucleasas
A-G-C-T-T-T-G-G-C-A-T-G-C-T
T-C-G-A-A-A-C-C-G-T-A-C-G-A

Endonucleasas

A-G-C-T-T-T-G-G-C-A-T-G-C-T
T-C-G-A-A-A-C-C-G-T-A-C-G-A
Exonucleasas

Enzimas: Endonucleasas
Endonucleasas dependientes de secuencia
Endonucleasas de Restriccin

Endonucleasas independientes de secuencia

DNAsa I
Nucleasa SI
RNAsa T1
RNAsa T2
RNAsa A
RNAsa H

Endonucleasas de Restriccin
Origen de estas enzimas

Clasificacin de estas enzimas

Caractersticas de las Endonucleasas de Restriccin Tipo II

Otras Endonucleasas
DNAsa I
Nucleasa SI
RNAsa T1
RNAsa T2
RNAsa A
RNAsa H

Enzimas: Endonucleasas
Especficas de
secuencia

5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5

3
5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
3
5
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
5
5
5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
3
3
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
5

Enzimas: Endonucleasas
No especficas
de
secuencia

5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5

3
5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
5
3
5
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
3
5
5
5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
3
3
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
5

Enzimas: Exonucleasas
Exonucleasas con direccin de hidrlisis 3 a 5
Exonucleasa I
Exonucleasa III

Exonucleasas con direccin de hidrlisis 5 a 3

Exonucleasa Lambda
Exonucleasa T7

Exonucleasas con direccin de hidrlisis 3 a 5 y 5 a 3

Nucleasa Bal31

Enzimas: Modificadoras
Enzimas que catalizan modificaciones de las bases nitrogenadas
y enzimas que catalizan la modificacin de los extremos de un
polinucletido

Metilasas

Fosfatasas

Quinasas

Enzimas: Metilasas
5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5
3
5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
3
5
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
5
5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
5
3
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
3
5
CH3

CH3

5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5
CH3

CH3

CH3

CH3

5 A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3
3 T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5
CH3

CH3

Enzimas: Fosfatasa alcalina

Enzima que cataliza la eliminacin de grupos fosfato de los
extremos de un DNA/RNA

Enzimas: Polinucletido quinasa

Enzima que cataliza la incorporacin de grupos fosfato a los
extremos 5 de un DNA/RNA

Enzimas: Ligasas
Enzimas que catalizan la formacin de enlaces fosfodister
DNA ligasa
RNA ligasa

Requieren cidos nucleicos con un extremo 5 fosforilado y un extremo

3 con OH
Requieren ATP

Enzimas: DNA Ligasas

Enzimas que catalizan la formacin de enlaces fosfodister entre
2 dsDNA lineales
con un extremo 5 fosforilado y un
extremo 3 con OH
con extremos romos o cohesivos
compatibles

Enzimas: DNA Ligasas

PO4 -A-G-C-T-T-A-G-OH
OH -T-C-G-A-A-T-C- PO4

PO4 -T-C-A-T-G-A-C-OH
OH -A-C-T-A-C-T-G- PO4

PO4 -A-G-C-T-T-A-G -T-C-A-T-G-A-C-OH

OH -T-C-G-A-A-T-C -A-C-T-A-C-T-G- PO4

Enzimas: RNA Ligasas

Enzimas que catalizan la formacin de enlaces fosfodister entre
2 ssDNA lineales o 2 ssRNA
con un extremo 5 fosforilado y un
extremo 3 con OH

Enzimas: Polimerasas
Enzimas que catalizan la polimerizacin de cidos nucleicos
DNA pol I de Escherichia coli
Fragmento Klenow
Taq DNA polimerasa
Pfu DNA polimerasa
Transferasa Terminal
PolyA polimerasa
Transcriptasa Reversa
RNA polimerasa

Enzimas: Polimerasas
Necesidad de molde
Necesidad de cebador
Direccin de sntesis
Tipo de Producto

Procesividad
Actividad nucleasa
Tasa de error