UNIVERSIDAD REGIONAL AUTONOMA DE LOS

ANDES
UNIANDES
FACULTAD D CIENCIAS MDICAS
CARRERA DE ODONTOLOGIA

ENDODONCI
DIFERENTES ROLES DE ODONTOBLASTOS
Y FIBROBLASTOS DE INMUNIDAD

NOMBRE: CAROLINA ESTRADA

DOCENTE: DRA SARA SILVA
NIVEL: QUINTO SEMESTRE

INTRODUCCIN

La pulpa dental se compone principalmente de 2 TIPOS DE CLULAS

MESENQUIMALES,ODONTOBLASTOS Y FIBROBLASTOS, que difieren tanto en
ubicacin y funcin.
Los ODONTOBLASTOS estn organizados como una capa de clulas densamente
empaquetados en la periferia de la pulpa y son responsables de la formacin de
dentina.
Los fibroblastos se encuentran ms en el centro y llevar a cabo la sntesis y el volumen
de negocio de la matriz extracelular del ncleo pulpa.
Ambas

poblaciones de clulas se exponen a las BACTERIAS ORALES

CARIOGNICASya que estos desmineralizar progresivamente esmalte y la dentina y
entrar en los tejidos alterados para tener acceso a la pulpa.
Debido a su situacin perifrica, los odontoblastos son las primeras clulas que
encuentran los patgenos orales que estn representados en la dentina cariada
esencialmente por bacterias Gram-positivas (Streptococcus, Lactobacillus, y
Actinomycesspp.) (Amor y Jenkinson, 2002).

Como la infeccin de caries progresa a la interfaz de pulpa-dentina, LOS CAMBIOS EN

LA MICROFLORA se producen, caracterizado por:

DISMINUCIN de la proporcin de bacterias aerobias Gram-positivas

AUMENTO de los anaerobios Gram-negativas (principalmente
Fusobacterium, Prevotella y Tannerellaspp.) (Hamilton, 2000).
Este ltimo lo tanto vienen rpidamente en contacto con fibroblastos
presentes en la regin sub-odontoblastos.

Esta modificacin de la microfloracariognico nos llev a la HIPTESIS de que

los odontoblastos y fibroblastos subyacentes pueden poseer diferentes
habilidades para reconocer y para ayudar a las clulas inmunes patgenos
orales de combate antes de que stos se convierten en perjudiciales para la
vitalidad de la pulpa dental.

Ambos tipos de clulas tambin pueden RECONOCER

LOS VIRUSpresentes en la pulpa dental (Glick et al.,
1991).

Exitosa defensa contra los patgenos invasores implica

su rpida deteccin a travs de molculas de reconocimiento de patrones
especializados expresadas por clulas inmunes y no inmunes, entre los que los
RECEPTORES TIPO TOLL (TLRS) son participantes clave(Iwasaki y Medzhitov,
2004; Akira et al., 2006).
Diez TLRs humanos se han descrito hasta el momento. Estn involucrados en
la RESPUESTA INMUNE INNATA Y DETECTAR UNA AMPLIA GAMA DE
MOLCULAScuyo origen puede ser bacteriana, viral, fngica, o parasitaria.
Entre ellos:

TLR2 es crucial para el reconocimiento de los componentes de las

bacterias
Gram-positivas,
incluyendo
LTA,
lipopptidos,
y
peptidoglicano.

TLR3 se acopla mediante ARN de doble cadena (dsRNA), que constituye

el genoma viral o se genera durante la replicacin viral, y por el dsRNA
cido polyinosinedeoxycytidylic anlogo sinttico (poli [I: C]).

TLR4 es el receptor predominante para LPS, un componente

caracterstico de la pared celular de las bacterias Gram-negativas.

La activacin de TLR inicia la produccin de citoquinas pro-inflamatorias y

quimiocinas que reclutan clulas inmunes.

Clulas dendrticas presentadoras de antgenos inmaduros (PED) son

objetivos esenciales de quimioquinas, especialmente en la pulpa dental
se inflama, donde son reclutados temprano y migran a travs del ncleo
de pasta de fibroblastos ricos a acumularse en la capa de
odontoblastos(Yoshiba et al., 1996; Jontell et al., 1998).

Recientemente hemos demostrado que odontoblastos similares a las

clulas estimuladas con LTA iniciar una respuesta inmune mediante la
produccin de quimiocinas y el reclutamiento de inmaduros DC
(Durand et al., 2006).
LPS tambin hasta reguladas varios marcadores de la inmunidad
innata en estas clulas (Veerayutthwilaiet al., 2007 ) .
Por lo tanto, ODONTOBLASTOSrepresentan, en el diente, la primera
lnea de DEFENSA para el anfitrin .Hasta la fecha, el papel de los
fibroblastos de pulpa en la primera activacin de la respuesta inmune
innata a patgenos orales queda especificado.
En este estudio , se realiz un anlisis comparativo sistemtico de las
respuestas de las clulas de fibroblastos y pulpa odontoblastos como
para TLR2 , TLR3- y TLR4 especficos agonistas ( LTA , poli [ I: C ] , y
LPS , respectivamente) , para determinar la funciones respectivas de estas
clulas en la pulpa dental inmunidad innata , incluyendo la medida en que
influyen en la migracin de DC inmaduro.

MATERIALES Y MTODOS
Cultivo De Clulas
Veinte
terceros
molares
humanos
sanos
no
erupcionado se recogieron con el consentimiento
informado de los donantes, de acuerdo con el Cdigo
de Salud Pblica francs y siguiendo un protocolo
aprobado por el comit de tica local
Se obtuvieron las clulas y los fibroblastos de
odontoblastos- como mediante el cultivo de ex plantes
de pulpa como se describe anteriormente ( Couble et
al., 2000 ) .

Despus de 4 semanas , los cultivos se estimularon durante 8 horas con 1 g /

mL altamente purificado Staphylococcusaureus cido lipoteicoico (LTA ) , 25
g / ml de poli (I: C) , o 1 g / mLultrapuraEscherichiacoli LPS (cepa 0111 : B4 )
( Invivogen , San Diego , CA , EE.UU. )

Real-time PCR
RNA extraction from cultured cells, reverse transcription, and real-time PCR were
performed as described (Durand et al., 2006). Primer sets and annealing temperatures
were:
TLR2
(forward,CCCATTGCTCTTTCACTGCT;
reverse,
CTTCCTTGGAGAGGCTGATG;
annealing
temperature,
60C),
TLR3
(forward,TGGTTGGGCCACCTAGAAGTA; reverse, TCTCCATTCCTGGCCTGTG; 60C),
TLR4
(forward,
CTGCAATGGATCAAGG
ACCA;
reverse,
TTATCTGAAGGTGTTGCACATTCC;
60C),CCL2
(forward,
GATCTCAGTGCAGAGGCTCG; reverse, AAGCAATTTCCCCAAGTCTC; 68C), CCL7
(forward,GCACTTCTGTGTCTGCTGCT; reverse, TAGCTCTCCAGCCTCTGCTT; 66C),
CCL26
(forward,
ACCTGCTGCTTCCAA
TACAGC;
reverse,
CATAGCTTCGCACCCAGGTC;
61C),
andcyclophilin
A
(forward,
ATGGCACTGGTGGCAAGTCC; reverse, TTGCCATTCCTGGACCCAAA; 58C). Results
wereexpressed as fold-change values relative to unstimulated control odontoblast-like
cell or fibroblast samples.

Citometra De Flujo
Las clulas se obtuvieron despus de un tratamiento
de tripsina / EDTA de culturas y se incubaron durante
30 min con anticuerpos monoclonales de ratn para
TLR2 ( TL2.1 clon , Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz , CA , EE.UU. ) , TLR3 ( 619F7 clon , una especie
de regalo de la Schering Instituto -Plough Investigacin,
Dardilly , Francia ) , o TLR4 ( HTA125 clon ,Santa Cruz
de Biotecnologa ) .
La tincin se revel por cabra anti-ratn F (ab ) 2 de
IgG - FITC ( Invitrogen Life Technologies, GranIsland,
NY , EE.UU. ) .
Para la deteccin intracitoplasmticaTLR3 , las clulas
se tieron de Fix& Perm reactivo ( Invitrogen Life
Technologies).
Controles negativos se realizaron con IgG de ratn isotipo( Sigma- Aldrich , St. Louis, MO ,
EE.UU. ) . Los datos fueron adquiridos en un citmetro de Dako y analizados con WinMDI 2,8
software ( InstitutoScripps , La Jolla , CA , EE.UU. ) .

Las matrices de genes

Arrays de genes que contienen fragmentos de ADNc de quimiocinas humanos y

receptores fueron adquiridos de SuperArrayBioscience Corp. ( Frederick, MD, EE.UU. )
, y 3 experimentos independientes se realizaron como se ha descrito previamente
( Durand et al., 2006 ) .
Los resultados se expresaron como un porcentaje de la ciclofilina A la expresin
gnica.
Los datos se presentan slo para los genes que se detectaron en las 3 muestras analizadas . Los
datos de la matriz completas se han depositado en el NCBI Gene ExpressionOmnibus( GEO ,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) ( Nmero de acceso GSE9560 ) .

Los arrays de anticuerpos

Kits de matriz Human AntibodyQuimioquinas I fueron adquiridos de RayBiotech Inc.

( Norcross, GA , EE.UU. ) y se utilizaron tal como se indica por el fabricante. Las
membranas se incubaron durante 16 horas a 4 C con sobrenadantes recuperados de
3 cultivos de clulas diferentes . Fueron desarrollados con una solucin de tipo de
quimioluminiscencia
y
escaneadas
con
un
sistema
de
imgenes
VersaDoc( BioRadLaboratories, Hercules, CA , EE.UU. ) . Anlisis semi- cuantitativo de
la intensidad comparativo de las manchas se realiz con software QuantityOne 4.4.1
(BioRad) .
Generacin de clulas dendrticas inmaduras
Inmaduros pases en desarrollo se generaron a partir de progenitores hematopoyticos
CD34 + humanas aisladas de fraccin umbilical humana mononuclear de sangre de
cordn
por
seleccin
inmunomagntica
miniMACS(
MiltenyiBiotec
,
BergischGladbach , Alemania), como se describi previamente ( Noirey et al., 2003 ) .

Ensayo de quimiotaxis
La migracin celular se evalu por medio de dispositivos Costar transwell con 8 - m de tamao
de poro .

Los sobrenadantes recuperados de cultivos de clulas se

aadieron a placas de 24 pocillos . Inmaduros pases en
desarrollo ( 1,5 x 105 ) ,
suspendido en medio RPMI suplementado con 5 % de suero de
ternera fetal, se aplicaron a transwell insertos durante 4 horas a
37 C .
Los insertos se retiraron entonces , y las clulas migradas se
recuperaron y se contaron. Los sobrenadantes se analizaron por
triplicado. Medios solos o que contienen LTA , LPS, o poli (I: C) se
utilizaron como controles . Los resultados se expresaron como

el nmero de migrado DCs inmaduras en porcentaje del

nmero de clulas de entrada introducida en el inserto.

Anlisis Estadstico
Los resultados se expresaron como valores medios desviacin estndar ( SD )
obtenida de 3 experimentos independientes. El anlisis estadstico se determin con la
prueba t de Student.

RESULTADOS
Usando PCR en tiempo real, hemos demostrado que tanto las clulas y los fibroblastos
de odontoblastos-expresaron como TLR2, TLR3, TLR4 y genes .
La estimulacin de cultivos celulares con agonistas especficos (LTA para TLR2,
dsRNA para TLR3 y TLR4 LPS para) diferencialmente regulada genes TLR.
LTA aument TLR2 en clulas-odontoblastos como, pero no en fibroblastos, y no para
modificar los niveles de expresin de TLR3 y TLR4 en cualquier tipo de clula.
El poli (I: C) aument TLR2, TLR3 y TLR4 en clulas y fibroblastos-odontoblastos
similares. LPS aumentaron TLR3 tanto en las clulas y los fibroblastos de
odontoblastos-similares, y TLR4 en los fibroblastos.

LA CITOMETRA DE FLUJO CONFIRMla TLR regulacin detectado por PCR en

tiempo real, a excepcin de TLR4 y TLR3 en clulas estimuladas por
odontoblastos como poli (I: C) y LPS, respectivamente, y para TLR2 en
fibroblastos estimulados por poli (I: C ), que se mantuvo sin cambios
El ANLISIS conjunto de genes REVEL que las clulas no estimuladas
expresan varios genes de quimioquinas, incluyendo CCL2, CCL26, CXCL12, y
CXCL14, que se detectaron en ambos tipos de clulas,no detectado como est
expresado por las clulas y los fibroblastos-odontoblastos similares, o en una
forma no reproducible entre el 3 ensayaron muestras.

A LTA estimulacin,CCL2 , CCL7 , CXCL2 y CXCL10 fueron significativamente hasta

reguladas en las clulas - como odontoblastos (Tabla) , lo que confirma nuestros
resultados anteriores ( Durand et al. , 2006 ) . CCL2 y CCL7 fueron los nicos
quimiocinas aumento en los fibroblastos . LPS significativamente hasta regulados
CCL2 y CXCL10 en las clulas - odontoblastos similar, y CCL2 , CCL7 , CCL26 ,
CXCL10 , y CXCL11 en fibroblastos . El poli ( I: C ) fue el inductor ms potente de
quimioquinas y aument la expresin de 11 y 13 genes de quimioquinas en las clulas
y los fibroblastos - odontoblastos como , respectivamente.
A

continuacin,

EXAMIN QUIMIOCINAS ESTIMULADAS POR LOS

COMPONENTES BACTERIANOS LTA Y LPSpara la verificacin por PCR en
tiempo real, ya que las bacterias, los virus, y no gatillo caries dependientes de
pulpa patognesis (Hamilton, 2000).

Nos centramos nuestro anlisis en CCL2, CCL7 y CCL26, 3 quimiocinas hasta

reguladas en condiciones infecciosas / inflamatorias y conocido por promover la
migracin DC inmaduras (Mantovani et al., 2004), ya que este ltimo es un
acontecimiento fundamental temprano en la pulpa respuesta inmune a las bacterias
cariognicasintradentinal.

Los resultados CONFIRMARON LA ESTIMULACIN DE GENES QUE CODIFICAN

ESTAS QUIMIOCINASAnlisis de matriz de anticuerpos mostr CCL2 liberacin
de protenas por las clulas y los fibroblastos-odontoblastos similares, y su
aumento en LTA, poli (I: C), y la estimulacin con LPS (Fig3B.). CCL7 y CCL26
no se detectaron en las matrices

Se evalu la relevancia biolgica de las respuestas de las clulas de fibroblastos y de

quimioquinas-odontoblastos como por pruebas de los sobrenadantes del cultivo para
su efecto quimiotctico sobre las CD inmaduras.
En transwell ensayos de migracin con sobrenadantes de clulas-odontoblastos como
no estimuladas y fibroblastos, una media de 32% 5.0 y 27.4 10.7% DCs
inmaduras migrado, respectivamente .
El uso de medio solo o medio + agonista de TLR revel un nivel de migracin similar a
la de los sobrenadantes de cultivo de control (no mostrado).
LA RESPUESTA MIGRATORIA FUE SIGNIFICATIVAMENTE CXCL4, que fue detectado slo
en las clulas - odontoblastos similar, y CCL7 y CXCL2 , que fueron detectados slo en
fibroblastos .
Otros genes identificados en la membrana se mejoraron cuando los sobrenadantes de
LTA- , poli (I: C ) -, o estimulada por LPS - odontoblastos como las clulas o
fibroblastos se aadieron en el compartimiento inferior . Odontoblasto - como las
clulas eran atrayentes ms potentes que los fibroblastos cuando ambos tipos de
clulas fueron estimuladas por el mismo agonista de TLR .

DISCUSIN

INTRADENTINAL PROGRESIN DE LAS BACTERIAS DURANTE EL PROCESO DE

CARIESinduce eventos inflamatorios e inmunes en la pulpa dental humana,los
efectores moleculares de los cuales siguen siendo en gran parte desconocido.
Recientemente hemos demostrado que odontoblasto similares a las clulas
estimuladas por LTA, un componente de bacterias especficas Gram-positivas, iniciar
una respuesta inmune innata MEDIANTE LA PRODUCCIN DE QUIMIOCINAS Y EL
RECLUTAMIENTO DE CD INMADURAS que presentan antgenos (Durand et al., 2006).

Fibroblastos de pulpa subyacente a la capa de odontoblastos son tambin en una

etapa temprana en contacto conpatgenos de entrar en la pulpa dental perifrica, y la
HIPTESIS DE QUE TAMBIN PODRAN ESTAR IMPLICADOS EN LA DETECCIN
BACTERIANA, segn lo sugerido por la activacin de las clulas de la pulpa dental no
diferenciadas estimuladas con LPS o LTA (Matsushita et al, 1999;.. Telles et al, 2003) .
Presentamos aqu que los fibroblastos de pulpa expresan TLR2, TLR3 y TLR4 in vitro y
fueron capaces de responder a LTA de las bacterias Gram-positivas (a travs de TLR2),
dsRNA viral (a travs de TLR3), y LPS de las bacterias Gram-negativas (a travs de
TLR4)

Estos componentes diferencialmente regulados los niveles de TLR en clulas y

fibroblastos odontoblasto similares. Se detect Sobre regulacin tanto a nivel de genes
y protenas, excepto en 3 casos en que la cantidad de protena se mantuvo sin
cambios.
La ausencia de deteccin de protenas TLR en estos casos es probablemente porque la
protena est presente a un nivel por debajo del umbral de sensibilidad de la
citometra de flujo( Durand et al., 2006 ) .

CURIOSAMENTE, LTA AUMENT SU RECEPTOR ESPECFICO TLR2 SLO EN LAS

CLULAS - ODONTOBLASTOS SIMILARES, lo que sugiere que estas clulas no slo se
adaptan para el reconocimiento de bacterias Gram- positiva que alcanzan los tbulos
dentinales durante la infeccin caries , pero tambin son capaces de amplificar su
respuesta a estas patgenos. Por el contrario , LPS aument su receptor especfico

TLR4 slo en fibroblastos. Esto podra reflejar una mayor capacidad para los
fibroblastos para reconocer bacterias Gram-negativas que sustituyen progresivamente
los Gram- positivos como la infeccin caries alcanza la pulpa dental sub odontoblastos .
Clulas y fibroblastos odontoblasto similares respondieron a los agonistas TLR por
diferencial sobre regulacin de la expresin gnica de quimioquinas. CXCL2 y CXCL10
fueron as aumentaron un LTA slo en las clulas-como odontoblastos, mientras
CCL7, CCL26, y CXCL11 se incrementaron en LPS slo en fibroblastos. Esta
activacin puede inducir odontoblastos y fibroblastos para montar respuestas
inmunes especficas al influir diferencialmente los diversos tipos de clulas inmunes
presentes en el tejido de la pulpa.
Curiosamente, poli (I: C) hasta reguladas TLR2, TLR3, TLR4, y muchas quimiocinas
tanto en las clulas y los fibroblastos de odontoblastos similares.
Esto sugiere que estas clulas poseen la capacidad de montar respuestas inmunitarias
muy potentes y diversas, y que los virus tambin podra desencadenar una respuesta
inmune en la pulpa dental.
Cuando la dentina est siendo destruido por caries, CD inmaduras son reclutados a
principios de la pulpa y se acumulan en la capa de odontoblastos cerca de la lesin,
en un lugar estratgico para 'muestra' antgenos extraos
Anteriormente mostr que las clulas como odontoblasto-estimulados con LTA
reclutados CD inmaduras (Durand et al., 2006). Hemos observado, en el presente
estudio, que ese reclutamiento tambin se produjo cuando las clulas de
odontoblastos-como se estimularon con poli (I: C) o LPS, y cuando los fibroblastos se
estimularon con cada uno de estos 3 agonistas.
Aunque NO SE OBSERV DIFERENCIA ENTRE LOS 3 AGONISTASpara cada tipo de
clula, se encontraron clulas de odontoblastos-como para ser atrayentes ms
potentes que los fibroblastos cuando son estimuladas por el mismo producto
microbiano.
Esta PROPIEDAD PODRA SER NECESARIO PARA ODONTOBLASTOS PARA ASEGURAR
EL MOVIMIENTO DC A TRAVS DE LA PULPA NCLEO DE FIBROBLASTOS-RICO PARA
EL SITIO DE LA INVASINde patgenos en la interfaz de pulpa-dentina. CCL2 era la
nica quimiocina CC-atraer inmaduro identificado en el nivel de protena en los
sobrenadantes de las clulas estimuladas. Sin embargo, no se detect ninguna
diferencia significativa en la produccin de CCL2 entre clulas de odontoblastos como y fibroblastos estimulados con el mismo agonista.
Como se muestra en la dermis inflamadas , es posible que este quimioquinas participa
principalmente en el reclutamiento de circulacin DCs de sangre y su migracin a
travs de la barrera endotelial . El trfico a travs del parnquima pulpa al sitio de la
invasin de patgenos en la capa de odontoblastos por lo tanto sera regulado por
otras quimiocinas y / o gradientes moleculares que quedan por ser identificados.